Genotypering van genen betrokken in DNA herstel en apoptose
advertisement
Genotypering van genen betrokken in DNA herstel en apoptose pathways in lymfocyten van borstkankerpatiënten in relatie tot individuele cellulaire en klinische radiosensitiviteit Charlotte DERPOORTER Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. H. Thierens Vakgroep Medische basiswetenschappen Academiejaar 2013-2014 Genotypering van genen betrokken in DNA herstel en apoptose pathways in lymfocyten van borstkankerpatiënten in relatie tot individuele cellulaire en klinische radiosensitiviteit Charlotte DERPOORTER Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. H. Thierens Vakgroep Medische basiswetenschappen Academiejaar 2013-2014 “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.” 16 mei 2014 Derpoorter Charlotte Prof. Dr. H. Thierens Voorwoord Met deze masterproef komt een einde aan mijn vijf jaar durende opleiding tot Master in de Biomedische Wetenschappen. Deze schriftelijke neerslag is het resultaat van een zeer boeiend onderzoek. En hoewel er veel werk in kruipt van diegene die het maakt, was dit nooit gelukt zonder de hulp van heel wat andere personen. Langs deze weg wil ik dan ook enkele mensen oprecht bedanken die bijgedragen hebben tot de realisatie van mijn masterproef. Prof. Dr. H. Thierens, bedankt voor de mogelijkheid om dit onderzoek bij u te kunnen starten en het vertrouwen in mijn (groeiende) capaciteiten. Uw kennis en enthousiasme waren een enorme motivatie om mijn masterproef tot een goed einde te brengen! Mijn begeleidsters, Sofie De Langhe en Charlot Vandevoorde, verdienen een speciaal dankwoordje. Onze inhoudelijke discussies hebben enorm bijgedragen tot het eindresultaat van deze thesis. Maar ook de persoonlijke gesprekken en oppeppende woorden konden wonderen doen! Sofie, mijn ‘eerste stappen’ in het labo waren samen met jou. Je hebt me in dit jaar leren ‘vallen en opstaan’ en zo de technieken volledig doen beheersen. Charlot, bij het finaliseren van mijn masterproef heb ik dan weer enorme steun van jou gekregen. Wanneer ik het even niet meer zag zitten, stond jij altijd klaar met een aanmoedigend woordje. Daarnaast wil ik ook alle medewerkers van de onderzoeksgroep ‘Straling en DNA repair’ bedanken. De positieve en aangename sfeer die in het labo aanwezig is, zorgt ervoor dat ook wij, studenten, graag in die richting fietsen. Een extra woordje wil ik hierbij aan Virginie richten. Bij jou kon ik steeds terecht met alle praktische en administratieve vragen. Deze studie was niet mogelijk geweest zonder de medewerking van de dienst Radiotherapie van het UZ Gent. Bedankt voor de hulp bij de patiëntenselectie en de bloedafnames. Ook de patiënten zelf verdienen een speciale vermelding voor hun medewerking. De leuke studententijd heb ik dan weer aan heel wat vrienden, binnen en buiten de opleiding, te danken. In het bijzonder Jolien en Bieke, waarmee ik al mijn ‘biomedische’ geheimen kon delen. Amber, Jeroen en Jan, jullie maakten de vele uren in het tel- of computerlokaal zoveel aangenamer! Ook Emma hoort hier, voor alle leuke babbelmomenten, zeker in het rijtje thuis. Langs deze weg wil ik ook graag mijn familie bedanken. Voor alles! Mama en papa, de –stil, Charlotte is aan het studeren– momenten zijn nu eindelijk voorbij! Ook mijn toekomstige schoonfamilie hoort hierbij. Bedankt om vijf jaar lang zoveel rekening met mij te houden. Gregory, merci voor alle toffe momenten, jouw steun en geduld tijdens de vele drukke periodes. Het afsluiten van deze pagina leidt voor ons des te meer het begin van een nieuw hoofdstuk in! Inhoudstafel Inhoudstafel Afkortingen Samenvatting ....................................................................................................................................... 1 Summary .............................................................................................................................................. 2 Inleiding ................................................................................................................................................ 3 1. BORSTKANKER ............................................................................................................................ 3 2. BEHANDELING ............................................................................................................................. 4 3. 4. 5. 6. 2.1. Chirurgie.............................................................................................................................. 4 2.2. Radiotherapie....................................................................................................................... 5 2.3. Systemische therapieën ....................................................................................................... 5 2.3.1. Chemotherapie ............................................................................................................ 6 2.3.2. Hormoontherapie ........................................................................................................ 6 2.3.3. Immunotherapie........................................................................................................... 6 2.3.4. Doelgerichte therapie .................................................................................................. 6 STRALINGSGEÏNDUCEERDE COMPLICATIES ................................................................................. 7 3.1. Pathogenese van normale weefseltoxiciteit ......................................................................... 8 3.2. Analyse van stralingsgeïnduceerde complicaties ................................................................ 9 3.3. Interindividuele radiosensitiviteit ........................................................................................ 9 DNA DAMAGE RESPONSE ......................................................................................................... 10 4.1. Effecten van ioniserende straling ...................................................................................... 10 4.2. Het cellulair antwoord op ioniserende straling .................................................................. 11 BIOMERKERS VOOR HET BEPALEN VAN DE INDIVIDUELE STRALINGSGEVOELIGHEID ............... 12 5.1. Gamma-H2AX foci test..................................................................................................... 13 5.2. Apoptose assay .................................................................................................................. 14 PROBLEEM- EN DOELSTELLING.................................................................................................. 15 Materialen en methoden.................................................................................................................. 16 1. INLEIDING .................................................................................................................................. 16 2. STUDIEPOPULATIE ..................................................................................................................... 16 3. IN VITRO BESTRALING ................................................................................................................ 17 4. GAMMA-H2AX FOCI TEST ......................................................................................................... 17 4.1. Isolatie van T-lymfocyten.................................................................................................. 17 4.2. Fixatie en immunofluorescentiekleuring ........................................................................... 19 4.3. Foci analyse ....................................................................................................................... 20 5. 6. APOPTOSE ASSAY ...................................................................................................................... 21 5.1. Voorbereiding voor flowcytometrie .................................................................................. 21 5.2. Flowcytometrische analyse ............................................................................................... 22 STATISTISCHE ANALYSE ............................................................................................................ 23 Resultaten ........................................................................................................................................... 24 1. 2. 3. GAMMA-H2AX FOCI TEST ......................................................................................................... 24 1.1. Vergelijking van Chromoscan en Metafer......................................................................... 24 1.2. Optimalisatie dubbele immunofluorescentiekleuring........................................................ 25 1.2.1. Concentraties............................................................................................................. 25 1.2.2. Vergelijking γH2AX en γH2AX/53BP1 scoring ......................................................... 27 1.2.3. Aspecifieke binding van secundaire antilichamen..................................................... 27 1.3. Intra-individuele variabiliteit ............................................................................................. 28 1.4. Apoptose bepaling met immunofluorescentie kleuring ..................................................... 29 APOPTOSE ASSAY ...................................................................................................................... 30 2.1. Bestralingstemperatuur ...................................................................................................... 30 2.2. Intra-individuele en interindividuele variabiliteit .............................................................. 32 PATIËNTEN RESULTATEN ........................................................................................................... 33 3.1. Geselecteerde cases en controles ....................................................................................... 33 3.2. GammaH2AX foci assay ................................................................................................... 34 3.3. Apoptose assay .................................................................................................................. 35 Bespreking .......................................................................................................................................... 36 Algemeen besluit ............................................................................................................................... 44 Referenties .......................................................................................................................................... 45 Afkortingen 53BP1 P53-binding protein 7-AAD 7-Aminoactinomycin D Al Aluminium AT Ataxia-telangiectasia ATM Ataxia-telangiectasia mutated ATR Ataxia telangiectasia and Rad3-related BCCT.core Breast Cancer Conservation. cosmetic results BMI Body mass index BSA Bovine serum albumin BRCA1 Breast cancer susceptibility protein 1 BRCT Breast cancer C-terminal Ca Calcium CD4, CD8, CD45 Cluster of differentiation 4, 8, 45 Chk2 Checkpoint kinase 2 CLE Consequential late effects CTCAE v3.0 Common Terminology Criteria for Adverse Effects version 3.0 cRPMI Complete Roswell Park Memorial Institute medium CV Coefficient of variation DAPI 4’,6-diamino-2 phenylindole DDR DNA damage response DNA Deoxyribonucleic acid D-PBS Dulbecco’s phosphate-buffered saline DSB Double-strand break EYA Eyes absent FCS Foetal calf serum FHA Forkhead-associated FITC Fluorescein isothiocyanate FWS Forward scatter GAM Goat anti-mouse Gln Glutamine GWAS Genome-wide association study Gy Gray HER2 Human epidermal growth factor receptor 2 HR Homologous recombination IMRT Intensity-modulated radiotherapy IR Ionizing radiation JNK1 c-Jun N-terminal protein kinase 1 kVp Peak kilovoltage LENT SOMA Late Effects Normal Tissues: Subjective, Objective, Management and Analytics MDC1 Mediator of DNA damage checkpoint 1 MRN Mre11-Rad50-Nbs1 NCI National Cancer Institute NHEJ Nonhomologous end joining PFA Paraformaldehyde PI3K Phosphoinositide-3 kinase RIA Radiation induced apoptosis RNOS Reactive nitrogen oxide species ROS Reactive oxygen species RT Radiation therapy SAR Swine anti-rabbit SDM Standard deviation on the mean Ser Serine SF Standaardfout SNP Single nucleotide polymorphism SPSS Statistical Package for Social Sciences SSB Single-strand break SSC Side scatter START B Standardisation of Breast Radiotherapy Trial B TRITC Tetramethyl rhodamine isothiocyanate Tyr Tyrosine UV Ultraviolet WICH WSTF-ISWI ATP-dependent chromatin-remodelling WSTF Williams-Beuren syndrome transcription factor Samenvatting Probleemstelling: Late stralingsgeïnduceerde complicaties zijn een belangrijke limitatie voor het succes van radiotherapie en hebben een sterke invloed op de levenskwaliteit van patiënten. Bovendien wordt een enorme variabiliteit vastgesteld in de incidentie en de ernst van deze neveneffecten. De mogelijkheid om individuele radiosensitiviteit te voorspellen maakt optimalisatie van de behandeling en dus minimalisatie van weefseltoxiciteit mogelijk. Onderzoek wordt verricht naar verschillende predictieve biomerkers, maar de klinische toepasbaarheid blijft beperkt. Deze studie onderzoekt de associatie van twee biologische merkers, residueel herstel van DNA DSB en stralingsgeïnduceerde apoptose, met late huidtoxiciteit bij borstkankerpatiënten. Methoden: Lymfocyten van borstkankerpatiënten zonder (controles) of met ernstige (cases) late huidtoxiciteit werden retrospectief geanalyseerd. Residuele DNA DSB werden microscopisch gescoord door kwantificatie van fluorescente γH2AX/53BP1 foci. Apoptose werd flowcytometrisch aan de hand van een FITC-annexine V/7-AAD kleuring bepaald. Resultaten: Het gemiddeld aantal residuele γH2AX/53BP1 foci/cel was, 24u na 4 Gy bestraling, gelijkaardig tussen cases (6,524) en controles (6,878). Er werd eveneens geen correlatie tussen apoptose levels, 48u na 8 Gy, en late complicaties aangetoond (cases: 24,85% en controles: 16,62%). Conclusies: Op heden kan de kwantificatie van residuele DNA DSB en apoptose levels na in vitro bestraling van T-lymfocyten niet als predictieve merker worden toegepast voor de ontwikkeling van late stralingsgeïnduceerde complicaties bij borstkankerpatiënten. 1 Summary Background: Radiation therapy is an important treatment modality for breast cancer after breast-conserving therapy. Despite the fact that the total dose is limited to the tolerance of normal tissues surrounding the tumor, late normal tissue complications influence the success of radiation therapy and the patients quality of life. In addition, patients experience a large interindividual variability in incidence and severity of the complications. Several biological assays have been proposed to predict individual radiation sensitivity, but so far clinical results are inconsistent. The purpose of this investigation is to test the association between residual DNA DSB repair and radiation-induced apoptosis in in vitro irradiated lymphocytes with late normal reactions after breast conserving therapy. Methods: Breast cancer patients with no (controls) or severe (cases) late tissue complications were retrospectively selected for this study. Residual DNA DSB were quantified 24h after 4 Gy exposure as γH2AX/53BP1 foci using immunofluorescence microscopy. Apoptosis was determined 48h after 8 Gy exposure in CD8 T-lymphocytes based on a FITC-annexin V/7AAD staining protocol. Results: A similar mean number of residual foci/cell was observed between cases (6,524) and controls (6,878). Also, no correlation was found for radiation-induced apoptosis and late tissue complications (cases: 24,85% and controls: 16,62%). Conclusions: Based on the current results, the γH2AX/53BP1 foci and apoptosis assay after in vitro irradiation of T-lymphocytes cannot be used for prediction of individual radiation sensitivity in breast cancer patients. 2 Inleiding 1. BORSTKANKER Borstkanker of mammacarcinoom is een kwaadaardig gezwel uitgaande van het melkklierweefsel in de borst (figuur 1). Het is de meest voorkomende kanker bij vrouwen in België en andere Westerse landen. In 2011 werden in België 10 565 nieuwe gevallen van borstkanker geregistreerd. Met minder dan 1% van die gevallen komt borstkanker veel minder frequent voor bij mannen (1, 2). Figuur 1. Anatomie van de vrouwelijke borst. De borst van een vrouw wordt opgebouwd uit melkklieren (lobuli), melkgangen (ducti) en vet- en bindweefsel dat het melkklierweefsel omringt. De meest voorkomende vorm van borstkanker ontstaat in de ducti (ductaal carcinoom) en een minderheid in de lobuli (lobulair carcinoom). Verder zijn ook bloed- en lymfevaten aanwezig. Bron: National Cancer Institute (3). In de meeste gevallen kan de specifieke oorzaak van borstkanker niet worden aangetoond. De voornaamste risicofactoren bij een vrouw zijn leeftijd, hoge borstdensiteit, familiale en persoonlijke anamnese en hormonale factoren, zoals vroege menarche, late menopauze en nullipariteit. Hiernaast zijn ook de omgeving en levensstijl, o.a. hoog alcohol- en vetgebruik, van belang (4-6). Slechts 5 tot 10% van de gevallen is erfelijk en wordt dus veroorzaakt door een germline mutatie in een kankerpredispositiegen. Het grootste deel is geassocieerd met de zogenaamde somatische mutaties, die een patiënt gedurende zijn/haar leven heeft opgelopen (7). Borstkanker kan worden behandeld door middel van chirurgie, radiotherapie (RT) en/of systemische therapieën. Meestal wordt een combinatie van verschillende behandelingen geadviseerd. De keuze is afhankelijk van verschillende factoren. De belangrijkste daarvan zijn: 3 kenmerken van de tumor (histologisch subtype, grootte, locatie), de graad van uitzaaiingen, aan- of afwezigheid van bepaalde hormoonreceptoren, de leeftijd en algemene gezondheidsconditie van de patiënt (3, 5, 6). Dankzij intensieve screeningsprogramma’s stijgt de kans om borstkanker in een vroeg stadium te ontdekken. Dit heeft een minder zware behandeling, een betere prognose en betere overlevingskansen tot gevolg (4). 2. BEHANDELING 2.1. Chirurgie Een chirurgische ingreep is meestal de eerste behandeling die bij de diagnose van borstkanker wordt gestart. Indien mogelijk wordt een borstsparende chirurgie (ook wel lumpectomie genoemd) uitgevoerd. Hierbij wordt de tumor en een deel van het omliggende borstweefsel verwijderd met verder behoud van de borst. Verschillende gerandomiseerde studies hebben aangetoond dat de overlevingscijfers na lumpectomie met radiotherapie gelijkwaardig zijn aan die na mastectomie (8-10). In sommige gevallen moet echter de volledige borst worden weggenomen. Mastectomie of borstamputatie wordt verkozen bij patiënten met grotere tumoren, bij erfelijke borstkanker, bij tegenaanwijzingen voor radiotherapie of op expliciete vraag van de patiënten zelf (10). Indien noodzakelijk worden ook de lymfeklieren in de oksel verwijderd, waarbij meestal wordt gestart met het verwijderen van de sentinelklier of schildwachtklier. Microscopisch onderzoek van deze klier moet vervolgens uitwijzen als verdere okselklierverwijdering nodig is. Uitzaaiing in één of meerdere lymfeklieren is geassocieerd met een slechtere prognose en een belangrijke factor voor het bepalen van de verdere behandeling (6). Chirurgie wordt als curatieve, genezende behandeling vaak gecombineerd met adjuvante of neoadjuvante therapie. Beide behandelingen zijn gericht op een beter eindresultaat. Neoadjuvante therapie wordt vóór een operatie gegeven met als doel de tumor te verkleinen, zodat deze gemakkelijker te verwijderen is. Tevens kan de gevoeligheid van kanker voor een therapie gemakkelijker worden gecontroleerd. Adjuvante therapie wordt gebruikt om micrometastasen te controleren en dus het risico op locoregionaal herval en sterfte te reduceren (4). 4 2.2. Radiotherapie Radiotherapie is een behandelingsmethode die gebaseerd is op de inductie van DNA schade door middel van ioniserende straling (IR). Bij 50-60% van alle kankerpatiënten is het, als monotherapie of als (neo)adjuvante therapie, een onderdeel van de behandeling (11). De bestraling kan afkomstig zijn van externe bestralingsbundels (externe radiotherapie) of van ingekapseld radioactief materiaal dat in de tumor wordt gebracht (interne radiotherapie of brachytherapie). De bestraling bij borstkanker is hoofdzakelijk uitwendig (4). Het succes van radiotherapie hangt af van de totale bestralingsdosis die aan de tumor wordt gegeven (12). De aanwezigheid van omgevend, gezond weefsel in het bestralingsveld zorgt echter voor een belangrijke limitatie van deze dosis (13). Een belangrijke doelstelling van radiotherapie is het toedienen van een maximale dosis aan de kankercellen, terwijl weefseltoxiciteit geminimaliseerd wordt (12). Met conforme en intensiteitsgemoduleerde radiotherapie (Intensity-Modulated Radiotherapy of IMRT) is er reeds een enorme vooruitgang in de optimalisatie van de dosistoediening. In tegenstelling tot de conventionele radiotherapie, die geen rekening houdt met de anatomie van de patiënt, gebruiken de planningsystemen van deze technieken driedimensionale informatie over de tumor en de normale structuren. De vorm van de bundels wordt zodanig gemoduleerd, zodat de kritische organen gespaard blijven en de tumor een hogere dosis krijgt. IMRT is een speciale vorm van conforme radiotherapie, waarbij de bundels tevens een niet-uniforme fluentie hebben. Dit is vooral nuttig wanneer in het doelvolume een holte aanwezig is en/of wanneer de tumor net naast kritische organen gelegen is (14, 15). Bewijs voor het gebruik van IMRT voor borstkanker komt van verschillende gerandomiseerde studies die een reductie in stralingsgeïnduceerde complicaties aantonen. De resultaten betreffende overleving, tumorcontrole en secundaire maligniteiten zijn echter inconsistent. Bovendien zijn de kost en complexe technische implementatie belangrijke limitaties van IMRT (16-19). 2.3. Systemische therapieën Systemische behandelingen kunnen kankercellen overal via de bloedstroom bereiken en hebben dus betrekking op het volledige lichaam. Dit in tegenstelling tot de lokale behandelingen, chirurgie en radiotherapie, die enkel tot doel hebben de tumor of het tumorbed te behandelen (4). 5 2.3.1. Chemotherapie Chemotherapie maakt gebruik van medicijnen (cytostatica) om kankercellen te verwijderen of hun groei af te remmen. Het wordt vaak gegeven in combinatie met chirurgie om de tumor te verkleinen (neoadjuvante chemotherapie) of om het risico op herval en sterfte te reduceren (adjuvante chemotherapie). Vaak bestaat een behandeling uit een combinatie van verschillende cytostatica, omdat niet alle kankercellen even gevoelig zijn voor eenzelfde medicijn (4). 2.3.2. Hormoontherapie Hormoontherapie wordt meestal gebruikt als adjuvante behandeling voor hormoonreceptorpositieve borstkanker. De groei van borstkankercellen wordt in dit geval bevorderd door oestrogeen en/of progesteron. De toegediende medicatie kan enerzijds de hormoonspiegels verlagen (vb. aromatase inhibitoren) en anderzijds het effect ervan blokkeren (vb. tamoxifen) (4, 6). 2.3.3. Immunotherapie Immunotherapie is een behandeling met medicatie die gericht is op het versterken van de immuunreactie tegen kankercellen. Dit is mogelijk door toediening van cytokines of vaccins die de aanmaak van natuurlijke antilichamen stimuleren. Het is voornamelijk gekend voor de behandeling van melanoomkanker en de toepassing bij borstkanker wordt momenteel onderzocht (20, 21). 2.3.4. Doelgerichte therapie In deze vorm van therapie, ook wel ‘targeted’ therapie genoemd, worden small molecules of monoklonale antilichamen toegediend die specifiek gericht zijn tegen essentiële pathways of eiwitten van kankercellen. Doelgerichte therapie maakt gepersonaliseerde geneeskunde mogelijk met behulp van specifieke biomerkers. In de behandeling van borstkanker wordt Trastuzumab toegediend bij vrouwen met een HER2 overexpressie (6). 6 3. STRALINGSGEÏNDUCEERDE COMPLICATIES Verschillende biologische en technische factoren, zoals het spreidingspatroon van de tumor of onzekerheden in positionering van de patiënt, hebben tot gevolg dat gezonde, omgevende weefsels ook in het bestralingsveld gelegen zijn. Aangezien de kans op tumorgenezing stijgt met de toegediende dosis, wordt de totale bestralingsdosis bepaald door de tolerantie van deze gezonde weefsels voor ioniserende straling (22). Figuur 2. Dosis - respons curve voor radiotherapie. Naarmate de bestralingsdosis stijgt, stijgt de kans op tumorgenezing, maar ook de kans op ernstige late neveneffecten. De stippellijn geeft de theoretische dosis weer geassocieerd met ong. 5% ernstige late toxiciteit. Bron: Barnett GC et al. (12). De maximaal toegestane dosis wordt vastgelegd als die dosis waarbij 5% van de patiënten ernstige neveneffecten vertoond (figuur 2). Dit betekent dat bij vele patiënten een dosis wordt toegediend die sub-maximaal is. Er zijn reeds enorme vooruitgangen in het verhogen van deze maximale bestralingsdosis, terwijl de toxiciteit van het omgevend weefsel wordt geminimaliseerd (23). Enkele voorbeelden hiervan zijn het gebruik van IMRT, gewijzigde fractioneringsschema’s en moleculair targeted radiosensitizers (12, 23). Desondanks blijft weefseltoxiciteit een onvermijdelijk en ongewenst neveneffect van RT, die de functie van organen en de levenskwaliteit van de patiënt sterk beïnvloedt. Bovendien wordt, met stijgende kans op overleving, de reductie van deze late complicaties steeds belangrijker. 7 3.1. Pathogenese van normale weefseltoxiciteit Vanuit klinisch en biologisch oogpunt worden stralingsgeïnduceerde complicaties onderverdeeld in acute en late neveneffecten. Vroege of acute neveneffecten manifesteren zich gedurende of kort na het beëindigen van de behandeling. Ze zijn meestal reversibel en treden op in snel prolifererende weefsels zoals de huid, het gastro-intestinaal stelsel of het hematopoëtisch stelsel. De symptomen zijn het gevolg van schade aan de stamcellen, waardoor er tijdelijk een verminderde productie is van functionele cellen en het verlies (door normale weefsel turnover) niet wordt vervangen. Naast celdood zijn er mogelijk nog andere mechanismen betrokken bij bepaalde acute weefselreacties. Ioniserende straling activeert verschillende signaalpathways die leiden tot de expressie en activatie van fibrotische en inflammatoire cytokines, vasculaire schade en de activatie van de stollingscascade. Deze veranderingen zijn mogelijk betrokken bij de ontwikkeling van oedeem, inflammatie en de initiatie van wondheling (22). De belangrijkste acute neveneffecten bij borstkanker zijn huidverdikking met oedeem, erytheem, vochtige desquamatie en vermoeidheid. De introductie van meer agressieve therapieën, zoals de combinatie van radio- en chemotherapie, hebben aanleiding gegeven tot een stijging in de ernst en duur van acute neveneffecten. De resulterende chronische effecten worden consequentiële late neveneffecten (consequential late effects of CLE) genoemd. Ze komen meestal voor in orgaansystemen waar acute schade een verminderde functie van de weefselbarrière tegen mechanische en chemische stress tot gevolg heeft en zo toxiciteit veroorzaakt in de onderliggende weefsels. CLE zijn dus late neveneffecten die in ernst en frequentie beïnvloed worden door de ernst en duur van acute effecten in hetzelfde weefsel (22, 24, 25). Late effecten treden op zes maanden tot jaren na de behandeling in trager prolifererende weefsels zoals het bindweefsel, de nieren, het hart of het centraal zenuwstelsel. Aangezien ze irreversibel kunnen zijn, zorgen vnl. deze effecten voor een limitatie van de dosis. De processen betrokken bij late weefseltoxiciteit zijn veel complexer dan bij acute toxiciteit en kunnen in het algemeen met het proces van wondheling worden vergeleken (22). De symptomen ontstaan door cellulaire schade aan een complex netwerk van celtypes, waaronder weefselspecifieke functionele cellen, alsook endotheelcellen en fibroblasten. De pathologie is bijgevolg zeer divers en omvat fibrosis, atrofie en vasculaire schade (12, 22, 24). Fibrosis is een inflammatoirgemedieerde proliferatie van fibrocyten als antwoord op groeifactoren, cytokines en 8 chemokines. Samen met atrofie is het verantwoordelijk voor het verharden en inkrimpen van de bestraalde borst. Vasculaire schade kan aanleiding geven tot dilatatie van de kleine bloedvaten in de huid, wat zich manifesteert als telangiectasieën. Hiernaast zijn secundaire maligniteiten en hormoon deficiënties andere belangrijke late neveneffecten bij borstkanker (26). In tegenstelling tot acute neveneffecten, waar de duur van de behandeling een belangrijke rol speelt, blijken late neveneffecten gevoeliger aan de dosis per fractie (12). 3.2. Analyse van stralingsgeïnduceerde complicaties Onderzoek naar weefseltoxiciteit heeft nood aan een gestandaardiseerde rapportering, opdat verschillende onderzoeken kunnen worden vergeleken en de doeltreffendheid van nieuwe behandelingstherapieën kan worden geschat. De LENT SOMA (Late Effects Normal Tissues: Subjective, Objective, Management and Analytic) schaal werd opgesteld voor het scoren van late neveneffecten en werd later opgenomen in de CTCAE v3.0 (Common Terminology Criteria for Adverse Effects version 3.0) van het National Cancer Institute (NCI). Dit scoringsysteem is toepasbaar voor het evalueren van vroege en late neveneffecten van chemotherapie, radiotherapie, chirurgie en andere behandelingstherapieën (12, 22). 3.3. Interindividuele radiosensitiviteit Naast het probleem van radiotoxiciteit wordt ook een enorme interindividuele variabiliteit vastgesteld in de incidentie en de ernst van de complicaties. Dit is het gevolg van verschillende factoren die enerzijds aan de behandeling en anderzijds aan de patiënt kunnen gerelateerd zijn. Tot de behandelingsgerelateerde fractioneringsschema, boost), factoren additionele behoren dosimetrie behandelingen (o.a. (hormoon-, totale dosis, chemo- en immuuntherapie) en het bestraald volume gezond weefsel. De patiëntgerelateerde factoren omvatten leeftijd, borstgrootte en co-morbiditeit. Desondanks suggereren klinische data dat 7080% van de variabiliteit niet het gevolg is van deze gekende factoren, maar waarschijnlijk van een (epi)genetische achtergrond. Het bewijs dat specifieke genen radiosensitiviteit kunnen beïnvloeden, wordt geleverd door zeldzame genetische syndromen zoals ataxia-telangiectasia (AT) of Nijmegen Breakage syndroom. Deze patiënten ontwikkelen ernstige stralingsgeïnduceerde complicaties, omwille van mutaties in genen betrokken bij de detectie van DNA schade en DNA herstel. Hoewel deze syndromen zeldzaam zijn, is het duidelijk dat 9 genetische variaties belangrijk zijn voor de individuele klinische radiosensitiviteit, waarbij de complexiteit varieert van één enkele zeldzame mutatie tot een combinatie van meerdere mutaties in verschillende genen (12, 22). 4. DNA DAMAGE RESPONSE DNA wordt continu blootgesteld aan endogene en exogene factoren die de structurele integriteit van het DNA schaden. Exogene factoren omvatten UV licht, ioniserende straling en genotoxische stoffen. Endogene DNA schade is meestal het gevolg van reactieve zuurstofradicalen (reactive oxygen species of ROS) die tijdens het oxidatieve metabolisme van de cel worden gevormd. Aangezien de integriteit van DNA essentieel is voor het goed functioneren van de cel en de correcte overdracht van genetische informatie, heeft de cel mechanismen ontwikkeld die instaan voor de controle van DNA herstel, celcyclus checkpoints, genexpressie en apoptose. Dit complexe signaalnetwerk wordt de DNA damage response (DDR) genoemd en zal de cellulaire uitkomst, nl. celoverleving, DNA mutaties of celdood, bepalen (27, 28). 4.1. Effecten van ioniserende straling De interactie van ioniserende straling met weefsels resulteert enerzijds in rechtstreekse DNA schade, zoals enkelstrengbreuken (SSB), dubbelstrengbreuken (DSB) en base modificaties, en anderzijds in onrechtstreekse schade door productie van reactieve zuurstof- en stikstofradicalen. Dit geeft aanleiding tot een veranderde micro-omgeving door vrijstelling van chemokines, cytokines en groeifactoren, veranderde cel-cel interacties, influx van inflammatoire cellen en de inductie van de DDR (figuur 3). Variaties in genen betrokken bij deze processen spelen dus mogelijk een rol in de ontwikkeling van individuele radiosensitiviteit (12, 26). DNA DSB worden gezien als de meest schadelijke vorm van stralingsgeïnduceerde DNA schade. In dit geval gaat de integriteit van beide strengen verloren, waardoor het herstel moeilijker is. Foutief herstel van DNA DSB geeft aanleiding tot mutaties, chromosoomaberraties en celdood, en is dus de belangrijkste oorzaak van biologisch waarneembare effecten. Het gebruik van ioniserende straling in radiotherapie heeft als doel deze cellulaire effecten in kankercellen te veroorzaken en tumorcontrole als biologisch eindpunt 10 te verkrijgen. Hoewel DNA repair efficiënter is in gezonde weefsels, gebeurt dit tevens in normale cellen, wat neveneffecten tot gevolg heeft (27). Figuur 3. Samenvatting van de mechanismen betrokken bij de biologische respons tegen IR. De interactie van IR met weefsel leidt tot meerdere types DNA schade, waarvan DNA DSB het meest schadelijk zijn. IR produceert ook reactieve zuurstof- (ROS) en stikstofradicalen (RNOS) die cytokines, groeifactoren en chemokines induceren. Verschillende signaalcascades kunnen aanleiding geven tot celdood, cel senescentie, genoominstabiliteit, mutaties en inflammatoire processen. Enkele belangrijke genen betrokken bij deze processen worden getoond. Bron: West CM and Barnett GC (26). 4.2. Het cellulair antwoord op ioniserende straling DNA DSB worden initieel herkend door sensor proteïnen die ter hoogte van het beschadigde DNA worden gerekruteerd. Deze eiwitten initiëren de signaaltransductie cascade door accumulatie en activatie van transductie eiwitten. Het Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN) complex heeft hierin een belangrijke rol en functioneert in de detectie van schade en de controle van celcyclus signaalpathways. Binding ter hoogte van een DSB leidt tot fosforylatie van het ATM (Ataxia-telangiectasia mutated) transductie eiwit, dat behoort tot de PI3K-like kinase familie. Defecten in het ATM gen leiden tot het neurodegeneratieve syndroom AT: deze patiënten worden gekenmerkt door een verhoogd kankerrisico, overgevoeligheid voor IR en neurodegeneratie. ATM zal vervolgens histon 2AX eiwitten fosforyleren, waardoor het signaal wordt geamplificeerd en verschillende herstel- en checkpoint eiwitten worden aangetrokken naar de plaats van DNA schade. Enkele voorbeelden hiervan zijn MDC1 (Mediator of DNA damage checkpoint 1), 53BP1 (p53-binding protein), BRCA1 (Breast cancer susceptibility 11 protein 1), p53 en Chk2 (Checkpoint kinase 2). De cellulaire uitkomst wordt mede bepaald door de specifiek aangetrokken effector eiwitten die kunnen instaan voor de inductie van DNA herstel, celcyclusstop, transcriptie of apoptose (26-28). Er zijn twee belangrijke pathways betrokken bij het herstel van DNA DSB: homologe recombinatie (HR) en niet-homologe endjoining (NHEJ). Beide herstelsystemen zijn complementair en worden gebruikt in verschillende situaties. HR vereist een homologe template, werkt “error free” en treedt op tijdens de S- en G2-fase (in prolifererende cellen). NHEJ vereist daarentegen geen of weinig homologie en kan optreden in alle fasen van de celcyclus, met de belangrijkste bijdrage in de G0-, G1- en M-fase. De herstelwijze is vaak “error prone”, wat resulteert in foutief herstel van de DNA DSB (26-28). 5. BIOMERKERS VOOR HET BEPALEN VAN DE INDIVIDUELE STRALINGSGEVOELIGHEID De problematiek rond individuele stralingsgevoeligheid stimuleert onderzoek naar biomerkers die het risico op de ontwikkeling van ernstige late neveneffecten kunnen voorspellen. Een sensitieve en specifieke voorspellende test zou van grote waarde zijn als basis voor gepersonaliseerde radiotherapie, waarbij het therapieplan voor elke patiënt kan worden geoptimaliseerd. De huidige dosislimieten leiden er namelijk toe dat ong. 95% van de patiënten geen ernstige neveneffecten ontwikkelt en dus voordeel zou hebben bij een hogere tumordosis. Anderzijds vertonen patiënten met ernstige complicaties een hypersensitiviteit voor ioniserende straling, waardoor tumorcontrole reeds mogelijk zou zijn bij lagere dosissen (12, 29, 30). Onderzoek wordt o.m. verricht naar de associatie tussen in vivo stralingsgeïnduceerde toxiciteit en in vitro cellulaire radiosensitiviteit. Er werden reeds verschillende cellulaire testen voorgesteld om de stralingsgevoeligheid van een patiënt te kunnen bepalen. Deze baseren zich op verschillende biologische eindpunten zoals kolonievormende capaciteit (klonogene overlevingstesten), chromosomale schade (dicentrische test, micronucleus test), chromatide breuken (G2 test) en DNA schade (γH2AX foci test). De klinische toepasbaarheid is echter nog steeds beperkt, omwille van de tegenstrijdige resultaten (vb. micronucleus test) en/of specifieke nadelen van de test (vb. vereiste huidbiopsie bij klonogene overlevingstesten) (29, 30). Naast de cellulaire radiosensitiviteitstesten focussen studies zich ook op de genetische basis van weefseltoxiciteit. Individuele stralingsgevoeligheid kan immers als een erfelijk, polygenetisch 12 en complex kenmerk worden beschouwd. Moleculair biologische technieken onderzoeken het genetisch profiel geassocieerd met de ontwikkeling van ernstige neveneffecten. De nadruk ligt hierbij vooral op vinden van genetische variaties, vnl. SNPs (single nucleotide polymorfismen), in genen betrokken bij de DDR, oxidatieve stress en fibrogenese. De huidige resultaten van deze kandidaat-gen studies zijn echter moeilijk te interpreteren door methodologische tekortkomingen. Bovendien is het onderzoek beperkt tot genen waarvan de functie goed gekend is (31). De selectie van kandidaat-genen wordt echter bemoeilijkt door de complexe en niet volledig gekende moleculaire pathogenese van stralingsgeïnduceerde complicaties. Dit nadeel wordt vermeden door onderzoek naar SNPs in genome-wide associatie studies (GWAS). Hierdoor wordt het mogelijk om nieuwe ziekte loci te identificeren die verspreid voorkomen in het volledige genoom (ook in niet-coderende regio’s) en waarvan de functie vooraf niet gekend is (12, 29, 32). Ten slotte kan aan de hand van microarrays ook het expressiepatroon van genen in associatie tot radiosensitiviteit worden onderzocht. Een differentiële expressie werd vastgesteld in genen geassocieerd met processen zoals apoptose, cel adhesie, proliferatie en radicale detoxificatie. Het aantal studies is echter beperkt en de resultaten vertonen een grote variatie als gevolg van verschillen in methodologie (30). 5.1. Gamma-H2AX foci test Een meer recente techniek is de detectie van DNA DSB aan de hand van de gamma-H2AX foci test. Het H2AX eiwit is een isovorm van de H2A histon familie en heeft o.a. een belangrijke rol in DNA condensatie. Het DNA windt zich hiervoor rond een geheel van acht histoneiwitten (het nucleosoom), bestaande uit telkens twee van de H2A, H2B, H3 en H4 families (33). Het H2AX eiwit verschilt van de andere H2A eiwitten door de aanwezigheid van een sterk geconserveerd motief (Ser-Gln) in zijn C-terminale uiteinde. Eén van de vroegste cellulaire antwoorden tegen IR is de fosforylatie van dit Ser139 residu door kinasen van de PI3K-like familie (33, 34). Het eiwit wordt dan γH2AX genoemd en heeft een rol in de DDR door accumulatie van effector eiwitten en het moduleren van de chromatine organisatie (35, 36). γH2AX eiwitten kunnen immunologisch gedetecteerd worden als kleine spots (foci) door gebruik te maken van een antilichaam specifiek tegen het C-terminaal uiteinde, inclusief het gefosforyleerd Ser (33). Elke focus bestaat uit honderden tot duizenden gefosforyleerde H2AX eiwitten en correleert met één DSB (figuur 4). Dit leidt tot de vorming van een heldere spot en maakt kwantificatie van biologische effecten reeds mogelijk bij lage dosissen. Hierdoor is de γH2AX foci test de meest sensitieve methode voor de detectie van stralingsgeïnduceerde DNA 13 schade (36). Aangezien stralingsgevoeligheid geassocieerd is met een langer behoud van de γH2AX foci, kunnen residuele DNA DSB, 24u na bestraling, significante determinanten zijn van vroege en late neveneffecten (34, 37). Figuur 4. Amplificatie van het γH2AX signaal rond de DNA DSB. Binding van het MRN complex leidt tot fosforylatie van het ATM eiwit, dat op zijn beurt H2AX fosforyleert. MDC1 zal zowel γH2AX als Nbs1 binden en zo MRN en ATM naar de DSB rekruteren. Deze positieve feedbackloop leidt tot amplificatie van het γH2AX over de chromatine regio rond de DNA DSB. 5.2. Apoptose assay Stralingsgeïnduceerde apoptose (radiation induced apoptosis of RIA) in perifere bloed lymfocyten lijkt een belovende test, gebaseerd op de resultaten van enkele studies. Een omgekeerde correlatie werd aangetoond tussen de hoeveelheid stralingsgeïnduceerde apoptose en toxiciteit. Met andere woorden, hoe lager de levels van RIA, hoe meer risico op het ontwikkelen van neveneffecten (38, 39). In een prospectieve klinische studie werd RIA bepaald in CD4 en CD8 T-lymfocyten subpopulaties voor 399 kankerpatiënten. Een significant lager percentage RIA werd aangetoond bij patiënten met ernstige late toxiciteit (graad 3). Er werd geen correlatie gevonden voor acute toxiciteit (40). De associatie tussen RIA en toxiciteit werd ook gevonden in 94 patiënten met cervicale kanker (41) en 79 patiënten met hoofd- en halskanker (42). 14 6. PROBLEEM- EN DOELSTELLING Ondanks optimalisatie van de behandeling, blijft weefseltoxiciteit een onvermijdelijk en ongewenst neveneffect als gevolg van radiotherapie. Bovendien wordt een grote variabiliteit vastgesteld in incidentie en ernst van de complicaties. Dit is o.a. het gevolg van factoren die gerelateerd zijn met de dosimetrie, additionele behandelingen en patiënt-karakteristieken. Klinische data suggereren echter dat 70-80% van de variabiliteit mogelijk het gevolg is van (epi)genetische variaties die een effect hebben op het cellulair antwoord tegen ioniserende straling. Omwille van deze grote variabiliteit wordt onderzoek verricht naar biologische merkers, die de stralingsgevoeligheid van een patiënt kunnen bepalen. Hierdoor wordt het mogelijk om de klinische effecten van de behandeling op het omgevend weefsel te voorspellen. Volgens de literatuur wordt bij borstkankerpatiënten met ernstige late toxiciteit een verlaagde apoptose in CD8 lymfocyten en een verhoogd aantal residuele DNA dubbelstrengbreuken gevonden na in vitro bestraling. Het doel van deze studie is om deze associatie, tussen late stralingsgeïnduceerde huidtoxiciteit en cellulaire in vitro radiosensitiviteit, te valideren. De studie kadert met deze doelstelling binnen de onderzoeksactiviteiten van de onderzoekseenheid ‘straling en DNA repair’ van de vakgroep Medische basiswetenschappen. 15 Materialen en methoden 1. INLEIDING In deze studie wordt nagegaan of ernstige late neveneffecten geassocieerd zijn met een verlaagde RIA en een verhoogd aantal residuele DNA dubbelstrengbreuken. Hiervoor worden bloedstalen verzameld van borstkankerpatiënten behandeld in het Universitair Ziekenhuis Gent. Uit deze stalen worden enerzijds lymfocyten geïsoleerd voor de microscopische kwantificatie van gamma-H2AX foci. Anderzijds wordt een deel van het bloed verdund voor flowcytometrische bepaling van stralingsgeïnduceerde apoptose. 2. STUDIEPOPULATIE De studiepopulatie omvat borstkankerpatiënten behandeld met IMRT na borstsparende chirurgie tussen 2009 en 2012. In het UZ Gent worden alle vrouwen in rug- of buiklig behandeld met hypofractionaire radiotherapie volgens het START B schema (15 x 2,67 Gy) (43). Bij een groot aantal patiënten wordt dit door een additionele boost (4 x 2,5 Gy) gevolgd. Uit deze groep worden retrospectief vrouwen met ernstige huidtoxiciteit (cases) en een gematchte groep zonder neveneffecten (controles) geselecteerd na een minimale follow-up van anderhalf jaar. De bepaling van ernstige complicaties gebeurt tijdens de follow-up onderzoeken op basis van gestandaardiseerde borstfoto’s vergeleken voor en na de radiotherapie. De kenmerken die worden beoordeeld zijn asymmetrie, atrofie, telangiectasieën, hyper- en hypopigmentatie en subcutane fibrose. Hiernaast wordt toxiciteit ook met het Breast Cancer Conservation Treatment. cosmetic results (BCCT.core) software programma gescoord. BCCT.core werd ontwikkeld om de scoring te standaardiseren en subjectiviteit te reduceren. Er wordt echter ook een algemene esthetische schatting (uitstekend, goed, gewoon, slecht) gegeven, rekening houdend met de eerder vermelde kenmerken, waardoor eenzelfde resultaat als de klassieke methode wordt verwacht (44). Matching van cases met controles gebeurt op basis van patiëntkarakteristieken (leeftijd, borstgrootte en BMI) en behandeling-gerelateerde factoren (systemische therapieën, rug- of buiklig, boost en nodale bestraling). Na informed consent worden bloedstalen afgenomen in een heparine buis voor de bepaling van individuele in vitro stralingsgevoeligheid. 16 3. IN VITRO BESTRALING De in vitro stralingsgevoeligheid wordt bepaald na bestraling van geïsoleerde T-lymfocyten en verdund bloed met een dosis van respectievelijk 4 Gy en 8 Gy. De bestraling wordt toegediend met een X-stralenbuis (MCN420 buis, 3mm Al filtratie) in een warmwaterbad op 37°C. De Xstralen worden gevormd aan de hand van een Philips MG420 X-stralengenerator, waarbij de stralingskwaliteit en het dosistempo op respectievelijk 160 kVp en 1 Gy/min. constant worden gehouden. De dosimetrie wordt met een NE2571 Farmer ionisatiekamer (Thermo Electron) uitgevoerd. 4. GAMMA-H2AX FOCI TEST Onderzoek naar het aantal residuele DNA DSB gebeurt door vergelijking van het aantal foci tussen cases en controles, 24 uur na in vitro bestraling van lymfocyten. De kern van lymfocyten bevat dezelfde genetische informatie als de cellen van het bestraalde, gezond weefsel. Hierdoor zou het aantal residuele foci in lymfocyten representatief moeten zijn voor DNA herstel in andere weefsels. Deze hypothese werd reeds bevestigd aan de hand van muisexperimenten (45). 4.1. Isolatie van T-lymfocyten Er werd reeds aangetoond dat T- en B-lymfocyten een verschillende gevoeligheid voor IR hebben (46). Om confounding te vermijden worden T-lymfocyten geïsoleerd uit vol bloed gebruik makend van de RosetteSepTM Human T Cell Enrichment Cocktail (50 µl/ml vol bloed) (Stemcell Technologies). De hierin aanwezige tetramere antilichaamcomplexen zorgen voor crosslinking van ongewenste cellen aan rode bloedcellen, met vorming van immunorosettes. Als gevolg van de densiteitsstijging zullen ongewenste cellen na centrifugatie een pellet vormen. Na 20 minuten incubatie bij kamertemperatuur (15-20°C) wordt het bloed verdund met 2% foetal calf serum (FCS) (Life Technologies) in Dulbecco’s phosphate-buffered saline (D-PBS) (Life Technologies) en vervolgens wordt dit zacht, zonder mengen, op het RosetteSep DM-L densiteitsmedium gevoegd. De geschikte hoeveelheden worden weergegeven in tabel 1. 17 Tabel 1. Aanbevolen volumes. Whole Blood (ml) 1 2 3 4 5 PBS + 2% FCS (ml) 1 2 3 4 5 Density Medium (ml) 1,5 3 3 4 15 Na 20 minuten centrifugatie bij 1200g (brake en acceleratie 0) worden de T-lymfocyten teruggevonden als een dun laagje tussen het plasma en het medium (figuur 5). Figuur 5. RosetteSepTM protocol. De geïsoleerde cellen worden tweemaal gewassen met 10 ml D-PBS + 2% FCS en geresuspendeerd in cRPMI1 + 15% FCS tot de geschikte concentratie. Het aantal T-lymfocyten wordt geteld onder een lichtmicroscoop met behulp van een Bürker telkamer (Marienfeld). Een kleine hoeveelheid van de celsuspensie (30 µl) wordt hiervoor samengevoegd met een gelijke hoeveelheid trypaanblauw (Sigma-Aldrich) en geladen op de Bürker kamer. Het totaal aantal lymfocyten per ml wordt vervolgens berekend door het gemiddeld aantal lymfocyten van 2 x 16 vakjes te vermenigvuldigen met de verdunning (x 2) en de conversiefactor (x 10 000). De geschikte concentratie is afhankelijk van de gebruikte cytospin. Er wordt verder gewerkt met 1 Compleet RPMI (Life Technologies): 500ml RPMI (1640) + 1,98 ml L-glutamine + 2,5ml peniciline/streptomycine 18 een concentratie van 400.000-600.000 T-lymfocyten per ml. Bestraalde en niet-bestraalde lymfocyten worden vervolgens voor 24u in een incubator (Thermo Scientific) op 37°C in 5% CO2 geplaatst. 4.2. Fixatie en immunofluorescentiekleuring Na een hersteltijd van 24u worden de proefbuizen in ijswater geplaatst om de DNA herstelprocessen te stoppen. Hierna wordt 250μl van de celsuspensie met een cytospin (Tharmac Cellspin) op poly-L-lysine gecoate slides gecentrifugeerd (5min, 500 RPM). De cellen worden 20 minuten gefixeerd in een bad van 3% paraformaldehyde (PFA) (SigmaAldrich) in D-PBS en hierna eventueel overnacht in 0,5% PFA in D-PBS (4°C). De preparaten worden vervolgens 5 minuten gereinigd in D-PBS en gepermeabiliseerd met ijskoude 0,2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich). Na driemaal wassen in D-PBS met 1% bovine serum albumin (BSA) (Roche) wordt het primaire anti-γH2AX antilichaam (Biolegend) in een verdunning van 1:500 (D-PBS + 1% BSA) toegevoegd. Dit monoklonaal antilichaam, verkregen uit een muis, is gericht tegen het C-terminaal uiteinde van het γH2AX eiwit. Visualisatie is mogelijk, na driemaal wassen, door toevoegen van een secundair geit anti-muis (GAM) antilichaam (SigmaAldrich), geconjugeerd met tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC) (1:1000 in D-PBS+ 1% BSA). De cellen worden voor een laatste keer in D-PBS gewassen en 2% 4’,6-diamino-2 phenylindole (DAPI) in fluoromount wordt toegevoegd alvorens de slides met een dekglaasje worden bedekt. Het principe van de immunofluorescentiekleuring wordt in figuur 6 geïllustreerd. De γH2AX foci worden zichtbaar als rode spots in een blauw gekleurde kern. Figuur 6. Principe van immunofluorescentiekleuring. 19 Ter optimalisatie van de γH2AX foci assay wordt tevens een dubbele immunofluorescentiekleuring uitgewerkt. Bij deze kleuring wordt, naast de rode γH2AX foci, het 53BP1 eiwit als groene spots gevisualiseerd. Hiervoor wordt een tweede polyklonaal antilichaam, anti-53BP1 opgewekt in konijn, in een concentratie van 1:500 toegevoegd. Visualisatie gebeurt met een zwijn anti-konijn (SAR) antilichaam, geconjugeerd met fluorescein isothiocyanate (FITC) (Sigma-Aldrich) of Alexa Fluor 488 (Invitrogen), in verschillende concentraties (1:500 of 1:1000). De concentratie van het GAM-TRITC antilichaam wordt eveneens gevarieerd (1:500 of 1:1000). Hiernaast wordt ook een immunofluorescentiekleuring voor apoptose en γH2AX gecombineerd. Voor deze kleuring wordt hetzelfde principe als voor de γH2AX en 53BP1 dubbele immuunkleuring toegepast. Visualisatie van apoptose is mogelijk door middel van het anti-cleaved caspase-3 antilichaam (Cell Signaling). Dit monoklonaal antilichaam wordt verkregen uit konijn en is gericht tegen het actieve gedeelte van effector caspase-3. Het wordt samen met het anti-γH2AX antilichaam (1:500) in een concentratie van 1:200 toegevoegd. De secundaire antilichamen, eveneens met TRITC en Alexa Fluor 488 geconjugeerd, worden respectievelijk 1:1000 en 1:800 verdund. 4.3. Foci analyse Het inscannen van de slides en weergeven van de beelden is mogelijk met behulp van de Chromoscan en de Metafer. Bij gebruik van de Chromoscan worden slides manueel opgenomen aan de hand van verschillende filters (DAPI, TRITC en FITC) met een 100x olielens van een Olympus BX60 fluorescentiemicroscoop. De beelden worden, na opname door een digitale camera (Applied Imaging), met behulp van Cytovision v.2.8 software weergegeven. De rode (TRITC) en groene (FITC of Alexa Fluor 488) signalen worden opgenomen in 10 optische secties langs de z-as (Zstack) en geprojecteerd in één vlak. Het finale beeld wordt gevormd door combinatie van deze signalen met DAPI kleuring. Het scoren van foci met behulp van de Chromoscan is echter een zeer arbeidsintensieve methode, waardoor op het automatische systeem van de Metafer wordt overgeschakeld. Het preparaat wordt met behulp van een automatische fluorescente Zeiss-Axio-Imager Z.2 microscoop (Carl Zeiss) ingescand en weergegeven met Metacyte Software v.3.8.6 20 (Metasystems). Net als bij de Chromoscan wordt een Z-stack van 10 toegepast voor het rode en groene signaal. De beelden worden opgenomen met een 63x olielens en met een geschikte classifier voor visualisatie van foci in lymfocyten. De foci worden manueel gescoord in 400 cellen per twee preparaten. 5. APOPTOSE ASSAY Bij vrouwen met een verhoogde stralingsgevoeligheid wordt in lymfocyten een verlaagde hoeveelheid stralingsgeïnduceerde apoptose vastgesteld. De bepaling van RIA gebeurt 48 uur na in vitro bestraling van het verdunde bloed en enkel voor CD8 T-lymfocyten. De keuze hiervoor is gebaseerd op de literatuur, die aangeeft dat CD8 meer sensitief en specifiek is dan CD4 T-lymfocyt apoptose (40). Het proces van apoptose wordt door verschillende morfologische veranderingen gekenmerkt. Enkele voorbeelden hiervan zijn condensatie van het cytoplasma en de nucleus, DNA fragmentatie en de vorming van apoptotic bodies. Eén van de vroegste gebeurtenissen is het verlies van asymmetrie in de dubbele fosfolipidelaag met translocatie van fosfatidylserine naar de buitenste laag van de celmembraan. Annexine V is een Ca2+-afhankelijk fosfolipide-bindend eiwit dat meer specifiek een hoge affiniteit voor fosfatidylserine heeft. Dit vroege fenomeen van apoptose kan dus gemakkelijk door binding van fluorescent annexine V worden gedetecteerd. Het percentage RIA wordt in deze studie door flowcytometrische analyse van een FITC-annexine V kleuring bepaald. Verder wordt een onderscheid met late apoptose gemaakt door 7-AAD kleuring: laat apoptotische cellen zullen 7-AAD doorheen de permeabele membraan opnemen en positief kleuren voor zowel annexine als 7-AAD. 5.1. Voorbereiding voor flowcytometrie Voor de bepaling van stralingsgeïnduceerde apoptose wordt een bestraling van 0 en 8 Gy toegediend aan verdund bloed (1:10 in cRPMI + 20% FCS). Na 48u incubatie worden de proefbuizen op ijs geplaatst en wordt 5 µl van de anti-CD45 en anti-CD8 antilichamen (BD Biosciences), respectievelijk met HV500 en APC geconjugeerd, aan 100 µl van het verdunde bloed toegevoegd. Deze oppervlaktemerkers maken selectie van respectievelijk leukocyten en CD8 T-lymfocyten mogelijk. Na 20 min. incubatie in het donker, worden de rode bloedcellen met 2 ml verdunde lyse buffer (1:10 in bidest water) (BD Biosciences) gelyseerd en worden de 21 buisjes voor 10 min. in het donker geplaatst. De suspensie wordt dan gecentrifugeerd (5 min, 1500 RPM) en het supernatans verwijderd. Deze stap wordt tweemaal herhaald na toevoeging van 2 ml D-PBS om te wassen. Als laatste stap gebeurt een annexine V kleuring, waarmee de apoptotische cellen kunnen worden gevisualiseerd. Hiervoor wordt de pellet eerst in 100 µl annexine buffer (BD Biosciences) geresuspendeerd en wordt 5 µl van het FITC-geconjugeerde annexine V (BD Biosciences) samen met 5 µl van 7-aminoactinomycin D (7-AAD) (BD Biosciences) toegevoegd. Deze laatste stof maakt onderscheid mogelijk met dode cellen. Na 15 min. incubatie in het donker wordt finaal nog 400 µl annexine buffer bijgevoegd en is de suspensie klaar voor uitlezing met de flowcytometer (BD FACSCanto II, BD Biosciences). 5.2. Flowcytometrische analyse Verschillende grafieken maken achtereenvolgens selectie van leukocyten, CD8 T-lymfocyten en apoptotische CD8 T-lymfocyten mogelijk (figuur 7). Figuur 7. Werkblad flowcytometer. 22 Op basis van forward (FWS) t.o.v. side scatter (SSC) kunnen verschillende subpopulaties van leukocyten samen met het celdebris worden onderscheiden. De leukocyten en CD8 Tlymfocyten kunnen vervolgens in grafieken, waarin respectievelijk het anti-CD45 en anti-CD8 antilichaam uitgezet staan, worden geselecteerd. Per conditie (0 Gy of 8 Gy) wordt data verzameld van drie keer 5000 CD8-positieve cellen. In een laatste grafiek wordt het 7-AAD t.o.v. het annexine V signaal weergegeven. Vroeg apoptotische cellen worden door een hoge annexine V intensiteit gekarakteriseerd. Laat apoptotische cellen kleuren negatief en viabele CD8 cellen positief voor beide merkers. 6. STATISTISCHE ANALYSE De resultaten worden met standaardfout (SF) weergegeven en statistisch verwerkt met behulp van Microsoft Office Excel 2010 en het Statistical Package for Social Sciences (SPSS) v22 software pakket. De Wilcoxon signed-rank test voor gepaarde waarden wordt gebruikt om te onderzoeken of er een significant verschil tussen cases en controles is. P-waarden kleiner dan 0,05 worden als statistisch significant beschouwd. 23 Resultaten 1. GAMMA-H2AX FOCI TEST 1.1. Vergelijking van Chromoscan en Metafer Het gebruik van de Metafer heeft een groot voordeel t.o.v. de Chromoscan door het automatisch inscannen van slides. Hiernaast is de Metacyte software ook in staat om foci in lymfocyten te scoren. Deze automatische scoring is echter nog niet geoptimaliseerd en daarom werd gekozen om de foci manueel te tellen op beelden (training files) opgenomen met de Metafer. Om deze telling te valideren werd een experiment uitgevoerd, waarbij het aantal stralingsgeïnduceerde foci vergeleken werd tussen de Chromoscan en de Metafer. Voor dit experiment werd een dosis van 0 en 4 Gy toegediend en werden de cellen na 24u incubatie gefixeerd. Na de immuunkleuring werden de preparaten manueel met de Chromoscan en automatisch met de Metafer ingescand. Het gemiddeld aantal stralingsgeïnduceerde foci (figuur 8), bekomen na telling met de Chromoscan en de Metafer, was niet statistisch significant verschillend (p = 0,317). Geïnduceerd aantal foci/cel 7 6 5 4 Chromoscan 3 5,52 5,92 Metafer 2 1 0 4 Gy Figuur 8. Vergelijking Chromoscan en Metafer. Vergelijking van het aantal residuele stralingsgeïnduceerde foci na 24u bij 4 Gy tussen de Chromoscan en de Metafer. Foutenbalken zijn de SF berekend volgens de Poissondistributie. 24 1.2. Optimalisatie dubbele immunofluorescentiekleuring De γH2AX foci test is een zeer gevoelige en vroege indicator van DNA DSB en het eiwit heeft een rol in DNA herstel door accumulatie van hersteleiwitten. In dit onderzoek wordt het gebruik van de test als biomerker voor radiosensitiviteit nagegaan door kwantificatie van het aantal residuele foci. Om een foci beter te kunnen karakteriseren, werd een dubbele immunofluorescentiekleuring uitgewerkt. Naast het γH2AX eiwit wordt hiervoor een tweede hersteleiwit, 53BP1 dat tevens ter hoogte van de DNA DSB accumuleert, fluorescent gemerkt. Een foci kan nu worden gedefinieerd als co-lokaliserende γH2AX en 53BP1 spots. 1.2.1. Concentraties Een eerste stap in de optimalisatie van de dubbele immunofluorescentiekleuring is het bepalen van de geschikte concentraties. De gebruikte primaire antilichamen werden telkens in een concentratie van 1:500 toegediend. De concentraties van de GAM-TRITC en SAR-FITC antilichamen werden gevarieerd (1:500 of 1:1000). Een overzicht van de verschillende kleuringen wordt in tabel 2 weergegeven. Tabel 2. Overzicht van de verschillende concentraties voor optimalisatie van de dubbele immunofluorescentiekleuring. Immuunkleuring 1 2 3 Primaire antilichamen Anti- γH2AX Anti-53BP1 1:500 1:500 1:500 1:500 1:500 1:500 Secundaire antilichamen GAM-TRITC SAR-FITC 1:500 1:500 1:1000 1:500 1:1000 1:1000 Op basis van de beelden bekomen met de Metafer kon de juiste concentratie worden geselecteerd. Het gebruik van minder verdunde secundaire antilichamen (1:500) gaf een aspecifieke binding rond de kern (immuunkleuring 1 en 2). Dit werd niet teruggevonden wanneer een verdunning van 1:1000 werd gebruikt (immuunkleuring 3). De keuze voor deze laatste concentraties werd vervolgens met een tweede experiment gevalideerd. De resultaten worden in figuur 9 geïllustreerd. 25 Figuur 9. Resultaten dubbele immunofluorescentiekleuring. (A) Voorbeeld van aspecifieke binding bij hogere concentraties aan secundaire antilichamen. (B) Immuunkleuring van lymfocyten met beelden van de kern (DAPI signaal), γH2AX foci (TRITC signaal) en 53BP1 foci (FITC signaal). Op het merge beeld is een combinatie van de signalen te zien. Een groot nadeel van dit protocol was de vermindering van het FITC-signaal naarmate er meer beelden waren ingescand. Hierdoor was het, na enkele beelden, niet meer mogelijk om de groene foci te onderscheiden (figuur 10). Ook stelde de vraag zich in welke mate deze fading een bijdrage had in de eerste ‘goede’ beelden. Hoewel een daling van de intensiteit hier nog niet opvallend was, kon fading reeds een invloed hebben op de zichtbaarheid van kleinere spots. Om dit probleem te vermijden, werd gekozen om met een Alexa Fluor 488-geconjugeerd secundair antilichaam verder te werken. Deze fluorescerende stof heeft bijna identieke spectrale eigenschappen als FITC, maar is meer stabiel en produceert een feller emissielicht. Een voorbeeld van deze kleuring wordt weergegeven in figuur 11. Aangezien het probleem van fading zich niet meer voordeed, werd beslist om tijdens de volgende immunofluorescentiekleuringen steeds gebruik te maken van het Alexa Fluor 488 antilichaam. Figuur 10. Fading van het FITC-signaal. Het TRITC-beeld toont de aanwezigheid van γH2AX foci. Op het FITC-beeld is echter geen enkele 53BP1 spot te zien. Kwantificatie van co-lokaliserende spots is niet meer mogelijk. 26 Figuur 11. Dubbele immunofluorescentiekleuring met Alexa Fluor 488 secundair antilichaam. 1.2.2. Vergelijking γH2AX en γH2AX/53BP1 scoring Ter controle van de γH2AX/53BP1 scoring werd het gemiddeld aantal stralingsgeïnduceerde foci per cel voor eenzelfde bloedstaal vergeleken tussen de enkele, γH2AX, en dubbele immunofluorescentiekleuring. De resultaten, weergegeven in onderstaande grafiek (figuur 12), zijn voor beide kleuringstechnieken gelijkaardig (p = 0,655). 9 Geïnduceerd aantal foci/cel 8 7 6 5 4 3 7,94 7,92 6,71 6,58 γH2AX γH2AX/53BP1 2 1 0 1 2 Experiment Figuur 12. Vergelijking van enkele en dubbele immunofluorescentiekleuring. Vergelijking van het aantal stralingsgeïnduceerde γH2AX foci en co-lokaliserende γH2AX/53BP1 foci. Foutenbalken stellen de SF voor, berekend volgens de Poissondistributie. 1.2.3. Aspecifieke binding van secundaire antilichamen Als laatste stap in de optimalisatie werd ook gekeken naar aspecifieke binding van de secundaire antilichamen. Om dit te bepalen werd tijdens de immuunkleuring geen primair, maar enkel secundair antilichaam toegevoegd en dit voor 0 en 4 Gy preparaten. Voor beide preparaten werd een aspecifieke binding van 0,08 foci/cel (SF: 0,001) gevonden. 27 1.3. Intra-individuele variabiliteit Het gebruik van een test als biomerker vereist een hoge mate van reproduceerbaarheid. Om een associatie te vinden tussen individuele stralingsgevoeligheid en residuele γH2AX/53BP1 foci, moet de variatie binnen een individu, de intra-individuele variatie, eerst worden onderzocht. Hiervoor werden lymfocyten geïsoleerd uit bloed afkomstig van eenzelfde vrijwilliger en gedoneerd op verschillende data. Na de immuunkleuring werd het aantal residuele foci voor 0 Gy en 4 Gy bepaald en het gemiddeld aantal stralingsgeïnduceerde foci per cel berekend. Een grafische voorstelling van de resultaten kan in figuur 13 worden teruggevonden. 10 9 Aantal foci/cel 8 7 CD_20131112 6 5 CD_20140310 9,51 9,42 8,88 4 7,20 8,43 7,96 7,92 6,71 3 CD_20140324 CD_20140411 2 1 0 0,49 1,08 1,46 0,96 0 Gy 4 Gy Geïnduceerd Figuur 13. Intravariabiliteit. Aantal foci/cel (0 Gy, 4 Gy en geïnduceerd) van eenzelfde donor, geanalyseerd op verschillende tijdstippen. Foutenbalken zijn de SF berekend volgens de Poissondistributie. Een gemiddelde van 8,10 geïnduceerde foci per cel en een variatiecoëfficiënt (CV) van 3,47% wordt bekomen. Wegens gebruik van het FITC antilichaam, werden de waarden van de eerste analyse (CD_20131112) niet geïncludeerd in de variatiecoëfficiënt om de mogelijke invloed van fading uit te sluiten. 28 1.4. Apoptose bepaling met immunofluorescentie kleuring Tijdens het scoren van preparaten werden, naast kernen met foci, ook kernen met een volledige γH2AX kleuring vastgesteld. Gezien de hoge dosissen, werd verondersteld dat deze cellen zich in een vroeg stadium van apoptose bevonden. Om deze hypothese te bevestigen werd een experiment uitgevoerd, waarbij een immunofluorescentiekleuring voor apoptose en γH2AX werd gecombineerd. Als controle werd ook een dubbele immunofluorescentiekleuring voor γH2AX en 53BP1 uitgevoerd. Figuur 14 toont een representatief voorbeeld van een volledig opgelichte γH2AX kern. Uit de co-lokalisatie met cleaved caspase-3 is af te leiden dat het wel degelijk om apoptotische cellen gaat. Op de DAPI kleuring zijn kleinere, meer compacte kernen zichtbaar. Ze vertonen eveneens een minder scherpe begrenzing en meer homogene inhoud. Figuur 14. Apoptose bepaling via immunofluorescentiekleuring. Immuunkleuring van lymfocyten met beelden van de kern (DAPI signaal), γH2AX (TRITC signaal) en cleaved caspase-3 (Alexa Fluor 488 signaal). Op het merge beeld is overlap van beide signalen duidelijk zichtbaar. De resultaten van dit experiment zijn een primaire bevestiging van de duale rol van γH2AX in zowel DNA herstel als in de apoptose pathway. Dit kan echter de relevantie van residuele γH2AX foci in vraag stellen, omdat het onderscheid misschien niet met zekerheid zichtbaar is. Dit probleem zou echter, door visualisatie van een hersteleiwit, met de dubbele immuunkleuring kunnen worden vermeden. Bijgevolg werd in de controlepreparaten colokalisatie van het 53BP1 hersteleiwit en volledig opgelichte γH2AX kernen nagegaan. Een voorbeeld hiervan wordt in figuur 15 weergegeven. Uit de beelden kan worden besloten dat co29 lokalisatie van γH2AX met 53BP1 foci een correcte weergave is van het aantal residuele DNA DSB. Figuur 15. Apoptose bepaling via immunofluorescentiekleuring. Immuunkleuring van lymfocyten met beelden van de kern (DAPI signaal), γH2AX (TRITC signaal) en 53BP1 (Alexa Fluor 488 signaal). Het merge beeld toont geen co-lokalisatie van 53BP1 met γH2AX opgelichte kernen. Bijkomend werd in dit experiment het aantal volledige gekleurde γH2AX kernen geteld en uitgedrukt ten opzichte van het totaal aantal lymfocyten. Voor de 4 Gy preparaten werd een hoeveelheid van 4,33 en 6,50% apoptotische cellen vastgesteld. In de 0 Gy preparaten was dit aantal met 0,50 en 0,00% zeer laag. 2. APOPTOSE ASSAY 2.1. Bestralingstemperatuur De stralingsgevoeligheid van lymfocyten kan worden bepaald na in vitro bestraling van de proefbuizen in een warmwaterbad. De bestralingstemperatuur wordt naar biologische relevantie op 37°C ingesteld. In de studie van Azria et al. (47), waarop dit onderzoek is gebaseerd, gebeurt de bepaling van RIA echter na een bestraling op kamertemperatuur. Om een vergelijking tussen de resultaten mogelijk te maken, moet een mogelijke invloed van de bestralingstemperatuur eerst worden nagegaan. 30 Tijdens deze experimenten werd het bloed van vrijwilligers opgesplitst en na verdunning op een temperatuur van 20° of 37°C bestraald. Op deze manier worden na flowcytometrische analyse telkens resultaten van beide bestralingstemperaturen bekomen en kunnen verschillen in resultaten niet het gevolg zijn van experimentele en intra-individuele variaties (figuur 16). 50 45 40 RIA(%) 35 30 25 8 Gy_KT 20 8 Gy_37° 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Analyse Figuur 16. Vergelijking bestralingstemperatuur. Vergelijking van het percentage late stralingsgeïnduceerde apoptose na bestraling op kamertemperatuur (KT, 20°C) of 37°C. Foutenbalken worden als één standaarddeviatie op het gemiddelde (SDM) berekend. Zoals weergegeven in figuur 17 zijn de gemiddelden voor kamertemperatuur en 37°C respectievelijk 28,74 en 28,78%. Er wordt geen statistisch significant verschil gevonden tussen deze waarden (p = 0,722). Bovendien is de spreiding op gemiddelde (SDM) in beide groepen gelijkaardig (resp. 3,68 en 3,01). 31 35 30 Ria (%) 25 20 8 Gy_KT 15 28,74 28,78 8 Gy_37° 10 5 0 Gemiddelde Figuur 17. Vergelijking bestralingstemperatuur. Gemiddelde en SDM van het percentage RIA na bestraling op kamertemperatuur (KT, 20°C) of 37°C. Foutenbalken stellen 1 SDM voor. 2.2. Intra-individuele en interindividuele variabiliteit Voor het gebruik als biomerker moet, net als bij de γH2AX foci test, de intra-individuele variabiliteit van de apoptose assay worden bepaald. Dit gebeurt eveneens door analyse van bloed afkomstig van eenzelfde vrijwilliger en gedoneerd op verschillende data. De resultaten staan in grafiek 18 uitgezet. 50 45 RIA (%) 40 35 CD_20140206 30 CD_20140212 25 CD_20140226 43,63 20 15 31,85 40,27 30,37 CD_20140305 36,30 CD_20140319 28,00 CD_20140326 10 5 0 8 Gy_37° Figuur 18. Intra-individuele variabiliteit. Percentage stralingsgeïnduceerde apoptose bepaald voor eenzelfde donor, op verschillende tijdstippen. Foutenbalken stellen 1 SDM voor. 32 Met een CV van 17,44% wordt een groot verschil in de resultaten van eenzelfde donor vastgesteld. Er moet hierbij worden opgemerkt dat de derde analyse (CD_20140226) niet werd meegerekend in de verwerking van de resultaten. Dit wegens een afwijking in de grafieken van de celpopulaties bij de flowcytometrische analyse. Om een verschil in radiosensitiviteit tussen verschillende individuen vast te kunnen stellen, moet de interindividuele variabiliteit significant groter zijn dan de intra-individuele variatie. Het percentage RIA werd aldus bepaald voor vijf verschillende donoren, waarvan de resultaten in onderstaande grafiek (figuur 19) worden voorgesteld. 80 70 60 Donor 1 RIA (%) 50 Donor 2 40 Donor 3 73,93 Donor 4 30 Donor 5 20 40,43 35,70 10 15,03 21,57 0 8 Gy_37° Figuur 19. Interindividuele variabiliteit. Percentage stralingsgeïnduceerde apoptose bepaald bij verschillende donoren. Foutenbalken stellen 1 SDM voor. Een interindividuele CV-waarde van 61,34% wordt bekomen, wat hoger is dan de intraindividuele variatiecoëfficiënt. 3. PATIËNTEN RESULTATEN 3.1. Geselecteerde cases en controles Het doel van deze studie is om een associatie te vinden tussen het klinisch eindpunt, late huidtoxiciteit, en cellulaire in vitro radiosensitiviteit. Binnen deze masterproef konden drie 33 case-controle paren worden geselecteerd met een follow-up van twee jaar. Een overzicht van de patiënten samen met de relevante klinische gegevens worden in tabel 3 samengevat. De gemiddelde leeftijd is voor zowel cases als controles 62 jaar en de gemiddelde BMI is respectievelijk 29 en 33 kg/m2. Aangezien al deze factoren een invloed op late borsttoxiciteit hebben, is het van groot belang dat ze in beide groepen gelijkmatig zijn verdeeld. Tabel 3. Klinische gegevens van cases en controles. BC1.0 48 Cases BC2.0 75 BC3.0 62 B95 E100 C95 B100 D100 E100 27 34 26 29 35 34 Chemotherapie (J/N) J N N J N N Hormoontherapie (J/N) N J J N J J Targeted therapie (J/N) N N N N N N Rug-/Buiklig R R R R R R Boost (J/N) J J J J J J Nodale therapie (J/N) N N J N N J Patiënt Leeftijd (jaar) Cup maat BMI (kg/m2) 3.2. Controles BC1.1 BC2.1 BC3.1 54 70 62 GammaH2AX foci assay Het gemiddeld aantal stralingsgeïnduceerde foci per cel wordt voor gematchte cases en controles in figuur 20 weergegeven. Er wordt geen significant verschil geobserveerd in het aantal residuele foci tussen cases (6,524) en controles (6,878) (p = 1,000). De variatiecoëfficiënt voor de volledige patiëntenpopulatie is 24,76%. 34 10 Geïnduceerd aantal foci/cel 9 8 7 6 5 9,55 4 3 Controle 7,65 5,57 Case 6,06 6,35 5,02 2 1 0 Case-controle 1 Case-controle 2 Case-controle 3 Figuur 20. Resultaten van de γH2AX foci assay voor cases en controles. Vergelijking van het gemiddeld aantal stralingsgeïnduceerde foci/cel tussen de (gematchte) cases en controles. Foutenbalken geven de SF weer berekend volgens de Poissondistributie. 3.3. Apoptose assay In figuur 21 worden het percentage RIA uitgezet voor gematchte cases en controles. De apoptose levels in CD8 T-lymfocyten zijn met een percentage van 24,85% voor cases en 16,62% voor controles niet statistisch significant verschillend (p = 0,593). Voor alle patiënten samen wordt een interindividuele CV van 50,31% vastgesteld. 45 40 35 RIA (%) 30 25 Case 20 39,45 Controle 15 27,40 10 5 22,97 19,30 7,70 7,60 0 Case-controle 1 Case-controle 2 Case-controle 3 Figuur 21. Resultaten van de apoptose assay voor cases en controles. Vergelijking van het percentage RIA tussen de (gematchte) cases en controles. Foutenbalken zijn als 1 SDM uitgezet. 35 Bespreking De ontwikkeling van stralingsgeïnduceerde complicaties is nog steeds een belangrijke limitatie in de radiotherapie. Naast optimalisatie van de bestralingstechnieken, wordt veel onderzoek verricht naar biologische merkers om de radiosensitiviteit van een individu te bepalen. Hierdoor zou optimalisatie van de behandeling en dus minimalisatie van weefseltoxiciteit mogelijk worden. Verschillende cellulaire en genetische testen werden hiervoor reeds ontwikkeld, maar de klinische toepasbaarheid is nog steeds beperkt door een lage sensitiviteit en/of arbeidsintensieve methodologie. Aan het gebruik van biologische merkers voor predictie van individuele stralingsgevoeligheid zijn enkele belangrijke voorwaarden verbonden. Ten eerste moet de test toelaten om snel resultaten te verkrijgen. Het gebruik van lymfocyten in deze studie heeft hierbij een voordeel ten opzichte van fibroblasten, aangezien er geen celculturen moeten worden opgestart. Andere voordelen van lymfocyten zijn dat ze een synchrone populatie vormen (G0), zeer stralingsgevoelig zijn en door eenvoudige bloedafname worden verkregen. Hier kan echter worden opgemerkt dat in vitro radiosensitiviteit ten gevolge van defecten in HR mogelijk niet wordt vastgesteld en dat een test met prolifererende cellen dit probleem zou kunnen oplossen. Een tweede voorwaarde is de vereiste van een hoge reproduceerbaarheid, waarbij onder meer de resultaten van verschillende onderzoekers gelijkaardig moeten zijn. De scoring van γH2AX foci wordt echter bemoeilijkt door de aanwezigheid van kleine spots die niet met zekerheid een DNA DSB voorstellen. Om de betrouwbaarheid van deze merker te verhogen werd aldus een dubbele immunofluorescentiekleuring geoptimaliseerd. Verder werd de reproduceerbaarheid in deze masterproef nagegaan door het bepalen van de intra-individuele variabiliteit. Als laatste moeten biomerkers een hoge sensitiviteit en specificiteit hebben. De aanwezigheid van outliers binnen de radiosensitieve en –resistente groepen maakt de keuze van een geschikte cut-off waarde voor predictie van klinische complicaties echter zeer moeilijk. Ook hier kan de combinatie van verschillende biologische testen mogelijk een oplossing bieden. De ontwikkeling van biomerkers die directe evaluatie van DNA schade mogelijk maken is dus een belangrijke toepassing in de behandeling van kanker. Een recente techniek is de γH2AX foci test, die kwantificatie van individuele DNA DSB mogelijk maakt en dus de meest gevoelige methode is voor detectie van stralingsgeïnduceerde DNA schade. Een verhoogd aantal residuele DNA DSB zou geassocieerd zijn met een verhoogde radiosensitiviteit. 36 Hiernaast wordt de bruikbaarheid van apoptose bepaling in lymfocyten als biomerker getest. Voorgaande studies konden een omgekeerde correlatie tussen stralingsgeïnduceerde apoptose en late toxiciteit terugvinden (38-42). De doelstelling van deze studie is om de toepasbaarheid van beide biologische testen te onderzoeken met betrekking tot late huidtoxiciteit bij borstkankerpatiënten. Een belangrijk onderdeel was hierbij de optimalisatie van de technieken. De inductie van de DDR is een belangrijk onderdeel van de biologische respons op ioniserende straling. Ter hoogte van DNA dubbelstrengbreuken accumuleren eiwitten die de cellulaire uitkomst zullen bepalen. Een belangrijke component is het histon 2AX eiwit dat nabij de DSB wordt gefosforyleerd en zo spreiding van het DDR signaal en rekrutering van andere eiwitten mogelijk maakt. Aangezien het γH2AX signaal zich over honderden tot duizenden eiwitten verspreidt, kunnen nucleaire foci met behulp van immunofluorescentie microscopie worden gedetecteerd. Hiernaast kunnen foci van andere hersteleiwitten, zoals 53BP1, Mre11 en Nbs1, ook als merker van DNA DSB worden gebruikt. De relatie tussen foci en DNA schade is echter minder evident dan voor γH2AX foci. De fosforylatie van het H2AX eiwit is één van de vroegste cellulaire antwoorden op IR. In tegenstelling tot de meeste andere hersteleiwitten is γH2AX dus niet in de kern aanwezig vóór de accumulatie in een focus. De detectie van γH2AX is gebaseerd op immunologische kleuring van het eiwit met behulp van specifieke antilichamen. In deze studie werd geopteerd om foci te kwantificeren met behulp van immunofluorescentie microscopie. Hoewel er met flowcytometrische analyse een sneller alternatief beschikbaar is, biedt microscopie meer sensitieve en kwalitatieve informatie, gezien detectie van individuele DSB mogelijk is. Een nadeel van deze methode is de arbeidsintensieve telling die bovendien onderhevig is aan menselijke subjectiviteit. Systemen zoals de Metafer worden aldus ontwikkeld voor automatische microscopie, beeldverwerking en foci scoring. Hiervoor is echter een nauwkeurige aanpassing van de classifier vereist, wat buiten het bereik van deze masterproef ligt. Bovendien moet worden opgemerkt dat de gegenereerde scores zeer afhankelijk zijn van de toegepaste classifier en de kwaliteit van de preparaten. Er werd dan ook gekozen om foci manueel te kwantificeren op automatisch ingescande beelden. Vergelijking van de telling met de klassieke scoringsmethode (Chromoscan) toont geen significant verschil tussen het gemiddeld aantal stralingsgeïnduceerde foci per cel. Op basis van deze resultaten werd besloten om deze scoringstechniek verder toe te passen. Een belangrijke limitatie geassocieerd met de γH2AX foci test is de variabele hoeveelheid focale achtergrond. In de literatuur wordt dit voornamelijk toegeschreven aan ATR (Ataxia 37 telangiectasia and Rad3-related) activiteit ten gevolge van DNA enkelstrengbreuken. SSB worden onder meer geïnduceerd door ultraviolette (UV) straling, maar komen ook voor in Sfase cellen ter hoogte van replicatievorken (48, 49). Ondanks het gebruik van G0-lymfocyten in dit onderzoek, werd in een groot aantal cellen toch een onscherp patroon van foci teruggevonden. Dit maakt de kwantificatie van foci niet gemakkelijk en heeft mogelijk een invloed op de reproduceerbaarheid van de test. Het zou dan ook een mogelijke verklaring kunnen zijn voor de tegenstrijdige resultaten die in de literatuur worden teruggevonden. Om een meer betrouwbare kwantificatie van foci te kunnen uitvoeren, werd een dubbele immunofluorescentiekleuring uitgewerkt. Fosforylatie van H2AX leidt tot accumulatie van DDR eiwitten ter hoogte van de DNA DSB. Deze eiwitten kunnen eveneens als discrete nucleaire spots worden gevisualiseerd en zullen co-lokaliseren met γH2AX in de aanwezigheid van een dubbelstrengbreuk. De keuze voor het 53BP1 eiwit is op andere onderzoeken gebaseerd (50-52). Uiteraard werd een verklaring voor het gebruik van dit eiwit ook in literatuurgegevens opgezocht. Ten eerste worden 53BP1 foci, in tegenstelling tot Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN) en BRCA1 foci, zeer snel gevormd als antwoord op IR (53). Een tweede gegeven is het belang van 53BP1 in checkpoint activatie en vooral in DNA herstel (54). Na optimalisatie van de concentraties werd de scoring vergeleken met de klassieke γH2AX kleuring in twee experimenten. Voor beide kleuringstechnieken worden gelijkaardige resultaten bekomen. Hoewel de γH2AX kleuring dus correcte informatie biedt, wordt toch geopteerd voor de dubbele immunofluorescentiekleuring. Dit wegens een gemakkelijke en meer consequente telling en hiermee geassocieerd een hogere reproduceerbaarheid van de resultaten. Zodoende werd de reproduceerbaarheid van de foci test onderzocht door het bepalen van de intra-individuele variabiliteit. Er werd een variatie van 3,47% ten opzichte van het gemiddelde (CV) geobserveerd. Dit ligt in dezelfde grootteorde als de variatiecoëfficiënt van 4 en 5% uit twee andere studies (55, 56). In vergelijking met flowcytometrische analyse, waar een intraindividuele CV van 20% wordt vastgesteld (46), kan worden geconcludeerd dat individuele foci scoring het meest betrouwbaar is. De reproduceerbaarheid van de test zou in de toekomst door bepaling van de interobserver variabiliteit nog verder kunnen worden uitgewerkt. Naast de visualisatie van individuele dubbelstrengbreuken wordt DNA schade ook vaak geëvalueerd aan de hand van apoptose detectie in lymfocyten. Geprogrammeerde celdood na blootstelling aan IR is een biologisch proces dat cellen elimineert wanneer de DNA schade te complex is om hersteld te worden. Apoptotische cellen worden door een verminderde DNA inhoud en morfologische veranderingen gekarakteriseerd, die eenvoudige detectie van apoptose 38 mogelijk maken. Flowcytometrische bepaling van RIA wordt in de literatuur voorgesteld als een eenvoudige, snelle en betrouwbare methode voor predictie van stralingsgeïnduceerde complicaties. De reproduceerbaarheid van deze merker werd bijgevolg nagegaan door, net als bij de γH2AX foci assay, de variatie binnen eenzelfde individu te bepalen. Een intra-individuele CV van 17,44% wordt in deze masterproef vastgesteld. Deze waarde is vergelijkbaar met wat in de literatuur wordt teruggevonden. In de studies van Ozsahin et al. (38) en Crompton and Ozsahin (57) werd een variatiecoëfficiënt van respectievelijk 15,1% en 24,1% binnen een individu genoteerd. Wegens het grote verschil in de resultaten afkomstig van eenzelfde donor, werd eveneens de variatie tussen verschillende individuen bepaald. Dit is noodzakelijk om uit te sluiten dat enkel experimentele variaties de oorzaak zijn van de waargenomen interindividuele variabiliteit. Om hierbij leeftijdsafhankelijke variaties te vermijden, hadden alle donoren een leeftijd tussen 20 en 25 jaar. Het effect van leeftijd op stralingsgeïnduceerde apoptose werd reeds bevestigd in een vorige studie (58). De bekomen interindividuele CV van 61,34% is hoger dan de intraindividuele waarde. Dit resultaat wordt eveneens door andere onderzoeken bevestigd (38, 42, 57). In het onderzoek van Ozsahin et al. (38) en Crompton and Ozsahin (57) wordt echter een kleinere variatie (50,6% en 41,1%) tussen de individuen gevonden. De hogere waarde binnen dit onderzoek kan mogelijk door de aanwezigheid van een outlier (RIA van 73,93%) worden verklaard. De hoge interindividuele variatie en de uitschieters zijn echter belangrijke limitaties van de apoptose assay in de toepasbaarheid als biomerker voor radiosensitiviteit. Binnen dit kader van apoptose is de observatie van volledig opgelichte γH2AX kernen bijzonder interessant. Preliminaire resultaten over de co-lokalisatie van deze kleuring met cleaved caspase-3 geeft een indicatie over de duale rol van het eiwit in DNA herstel en apoptose. In de literatuur worden verschillende fasen in de fosforylatie van H2AX na inductie van DNA schade gerapporteerd. Initieel leidt de aanwezigheid van DNA DSB tot de vorming van DDR foci. Vervolgens kunnen ook apoptotische γH2AX nuclei in drie opeenvolgende kleuringspatronen worden vastgesteld: eerst de γH2AX ring, in kernen zonder duidelijke morfologische veranderingen, dan volledige opgelichte nuclei en finaal een blijvende aanwezigheid in apoptotische lichaampjes (59, 60). Het tijdspunt en de morfologie van individuele cellen moet met andere woorden in rekening worden gebracht voor een correcte foci scoring (figuur 22). Het belang van microscopische kwantificatie kan hierbij nogmaals worden benadrukt, gezien de kwalitatieve informatie die hiermee wordt verkregen. 39 Figuur 22. Twee verschillende fasen in het γH2AX signaal tijdens apoptose. Theoretische weergave van het γH2AX signaal na hoge dosissen. (Links) DNA DSB vormen DDR foci. (Rechts) Cellen ondergaan apoptose en apoptotische ringen worden gevormd. Bron: Solier and Pommier (59). In dit onderzoek werden preparaten 24u na 4 Gy bestraling geëvalueerd. Op dit tijdspunt werden voornamelijk volledige γH2AX-gekleurde kernen waargenomen. Apoptotische ringen, die eerder verschijnen in een vroeg stadium van apoptose, waren veel minder opvallend aanwezig. Bijkomend onderzoek naar de verschillende tijdspunten is bijgevolg noodzakelijk voor detectie van de andere, bovengenoemde kleuringspatronen. Het morfologisch onderscheid tussen DNA repair en apoptose zou met behulp van bijkomende biomerkers kunnen worden verduidelijkt. In deze studie werd reeds een primaire bevestiging gevonden voor het gebruik van de γH2AX en 53BP1 dubbele immunofluorescentiekleuring. In de toekomst zou echter nog dieper op het effect van verschillende tijdspunten op deze kleuring moeten worden ingegaan. Een mogelijke verklaring voor de afwezigheid van 53BP1 in volledig γH2AX-opgelichte cellen wordt gegeven door Solier and Pommier (61). In deze studie werd vastgesteld dat een volledige DDR activatie tijdens apoptose wordt verhinderd door een caspase-3 gemedieerde verknipping van MDC1. De integriteit van dit eiwit is immers van groot belang tijdens normaal DNA herstel en checkpoint activatie, gezien het BRCT (breast cancer C-terminal) en FHA (forkheadassociated) domein respectievelijk door γH2AX en ATM worden gebonden. Tijdens apoptose wordt deze essentiële interactie, en bijgevolg accumulatie van andere DDR eiwitten, verstoord door de verknipping van MDC1 tussen het BRCT en FHA domein (figuur 23). Solier and Pommier maken in hun onderzoek echter gebruik van apoptose-inducerende stoffen, waardoor 40 voorzichtigheid in de algemene interpretatie van deze resultaten is geboden. Verder onderzoek naar de potentiële rol van deze interacties tijdens stralingsgeïnduceerde apoptose is vereist. Figuur 23. Schematische voorstelling van MCD1 interacties tijdens DDR en apoptose. Verknipping van MDC1 tijdens apoptose door caspase-3 verhindert de volledige DDR activatie. Bron: Solier and Pommier (59). Een andere mogelijke uitleg voor de afwezigheid van 53BP1 bij apoptotische γH2AX signalen komt uit twee aparte studies van Cook et al. (62) en Xiao et al. (63). Deze onderzoekers omschrijven een nieuwe histon 2AX modificatie die mogelijk een rol heeft in de apoptose pathway. Constitutieve fosforylatie van het C-terminale Tyr142 residu wordt door WSTF, een sub-unit van het WICH (WSTF-ISWI ATP-dependent chromatin-remodelling) complex, gekatalyseerd. In tegenstelling tot een stijging van het γH2AX signaal, wordt na inductie van DNA schade een defosforylatie van Tyr142 door het fosfatase EYA (eyes absent) waargenomen. Een interessante bevinding is hierbij dat een blijvend PY142-H2AX signaal een stabiele associatie van MDC1 met γH2AX lijkt te verhinderen. Dit zou de afwezigheid van hersteleiwitten, zoals 53BP1, in apoptotische γH2AX kernen kunnen verklaren. Bovendien tonen preliminaire experimenten dat de aanwezigheid van gefosforyleerd Tyr142 en Ser139 aanleiding geeft tot accumulatie van pro-apoptotische factoren zoals JNK1 (c-Jun N-terminal protein kinase 1). Samenvattend zou Tyr142 fosforylatie dus als een moleculaire switch tussen DNA herstel en apoptose kunnen worden gezien (figuur 24). 41 Figuur 24. Moleculaire switch tussen DNA herstel en apoptose. In de afwezigheid van DNA schade wordt Tyr142 constitutief door WSTF gefosforyleerd. De aanwezigheid van DNA DSB breuken leidt tot fosforylatie van ATM en bijgevolg het Ser139 residu van H2AX. Tijdens DNA herstel wordt Tyr142 gedefosforyleerd door EYA1/3, waardoor MDC1 en andere DDR eiwitten wordt aangetrokken. Als de schade te groot is, leidt de dubbele fosforylatie van Ser139 en Tyr142 tot de initiatie van apoptose. Bron: Stucki (64). Ter besluit kan worden gesteld dat verder onderzoek naar het ontstaan van stralingsgeïnduceerde apoptotische γH2AX noodzakelijk is. Inzicht in deze biologische pathways zou interessante perspectieven voor de detectie van DNA schade kunnen bieden. Microscopische evaluatie zou scoring van zowel DNA herstel als apoptose mogelijk maken en zou zo meer informatie kunnen geven omtrent de relatie tussen beide merkers. Deze studie naar de evaluatie van DNA schade na in vitro bestraling van T-lymfocyten toont geen correlatie tussen het aantal residuele foci en late stralingsgeïnduceerde complicaties bij borstkankerpatiënten. Evenmin werd een verschil in apoptose levels tussen cases en controles gevonden. In de literatuur rapporteren drie studies een positieve correlatie tussen ernstige late neveneffecten en residuele γH2AX foci bij borstkanker- (50, 51) en prostaatkankerpatiënten (65). Dit verband werd eveneens in een studie naar acute effecten bij borstkanker gevonden (56). Andere onderzoeken vonden geen associatie met late toxiciteit bij prostaat- (66) en gynaecologische kanker (13) en met acute complicaties (35) of orale mucositis (67) bij hoofden halskanker patiënten. Hoewel het gebrek aan correlatie binnen deze masterproef eventueel aan de kleine patiëntenpopulatie kan worden toegeschreven, worden tevens in de literatuur geen 42 eenduidige resultaten teruggevonden. Gezien in deze studie een hoge reproduceerbaarheid werd aangetoond, moet de oorzaak van de inconsistentie waarschijnlijk ergens anders worden gezocht. Een mogelijke verklaring is dat de γH2AX foci test niet alle aspecten betrokken bij de ontwikkeling van late neveneffecten omvat. Naast DNA herstel hebben fibrotische en inflammatoire processen immers ook een belangrijke rol in het ontstaan van late stralingsgeïnduceerde complicaties. De resultaten omtrent de bepaling van stralingsgeïnduceerde apoptose in lymfocyten zijn daarentegen, wat de klinische toepasbaarheid van deze merker betreft, veelbelovend. Een omgekeerde correlatie tussen het percentage RIA en toxiciteit werd in verschillende studies aangetoond (38-42, 68). Ook voor de apoptose assay is een eventuele associatie in deze studie moeilijk aan te tonen wegens het gebrek aan voldoende case-controle paren. Desondanks worden in de literatuur studies teruggevonden die eveneens geen correlatie rapporteren (51, 69). Een mogelijke oorzaak van deze uiteenlopende resultaten is het gebrek aan uniformiteit in de methodologie. Hiermee worden o.a. verschillen in het gebruikte celtype, analyse van apoptose en het bestralingsprotocol bedoeld. Het is dan ook uitermate belangrijk om in de toekomst de invloed van experimentele variaties te onderzoeken. Het effect van verschillende bestralingstemperaturen werd in deze studie nader onderzocht. Zoals enigszins verwacht, wordt geen verschil tussen een bestraling op kamertemperatuur of 37°C aangetoond. De in vitro bestraling van dit onderzoek gebeurt immers aan een hoog dosistempo, waardoor een mogelijk effect slechts enkele minuten van belang kan zijn. In een volgende stap zou dit experiment bij bestralingen aan laag dosistempo kunnen worden herhaald, aangezien een mogelijk invloed hier nog niet uit te sluiten is. 43 Algemeen besluit Samenvattend kan worden gesteld dat de ontwikkeling van biologische testen ter predictie van individuele stralingsgevoeligheid van essentieel belang is voor het succes van radiotherapie. In dit onderzoek werd geen associatie teruggevonden tussen twee verschillende merkers, namelijk residuele DNA dubbelstrengbreuken en stralingsgeïnduceerde apoptose, en late huidtoxiciteit bij borstkankerpatiënten. Een grotere patiëntenpopulatie is echter noodzakelijk om hier meer uitsluitsel over te kunnen geven. Verder werd in deze studie het gebruik van de dubbele immunofluorescentiekleuring voor een meer betrouwbare foci scoring onderzocht. Met een uiterst kleine intra-individuele variatiecoëfficiënt van 3,47% werd een hoge reproduceerbaarheid van de foci test aangetoond. Preliminaire resultaten duiden bovendien op het belang van deze scoringsmethode in het onderscheid tussen DNA herstel en apoptose. Er werd vastgesteld dat γH2AX in beide pathways betrokken is en 53BP1 enkel in DNA herstel. Het vinden van een extra merker, die samen met γH2AX bij apoptose betrokken is, zou eventueel een visuele scoring via immunofluorescentie microscopie mogelijk maken. Deze interessante bevindingen dienen in de toekomst nog verder te worden uitgewerkt om zo verdere toepassingen mogelijk te maken. In tegenstelling tot de γH2AX foci test werd wel een grote variatie van apoptose levels binnen eenzelfde individu gevonden. Toch werd er tussen verschillende donoren een nog grotere variabiliteit vastgesteld. Dit, samen met de vaststelling van outliers, vormt mogelijk een belangrijke limitatie voor de klinische toepasbaarheid van deze test. Als laatste werd in deze studie het effect van de bestralingstemperatuur nagegaan. Andere mogelijke experimentele invloeden, zoals dosis en tijdspunt, zouden in de toekomst nog moeten worden bepaald. Er kan hierbij worden benadrukt dat uniformiteit in methodologie noodzakelijk is voor het vinden van eenduidige en vergelijkbare resultaten. 44 Referenties 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. Parkin DM, Pisani P, Ferlay J. Estimates of the worldwide incidence of 25 major cancers in 1990. Int J Cancer. 1999;80(6):827-841. Stichting Kankerregister 2014. Available from: http://www.kankerregister.org/. Breast Cancer Home Page - National Cancer Institute 2014. Available from: http://www.cancer.gov/ cancertopics/types/breast. Breast Cancer | Learn About Cancer | American Cancer Society 2014. Available from: http://www.cancer.org/cancer/breastcancer/index. Borstkanker | Stichting tegen Kanker 2014. Available from: http://www.kanker.be/borstkanker. Bracke M, Brochez L, Depypere H, De Wever O, Kas K, Peeters M. Cursus Kanker: Universiteit Gent; Postgraduaatsopleiding Deskundige in de medische stralingsfysica. Claus EB, Schildkraut JM, Thompson WD, Risch NJ. The genetic attributable risk of breast and ovarian cancer. Cancer. 1996;77(11):2318-2324. Fisher B, Anderson S, Redmond CK, Wolmark N, Wickerham DL, Cronin WM. Reanalysis and results after 12 years of follow-up in a randomized clinical trial comparing total mastectomy with lumpectomy with or without irradiation in the treatment of breast cancer. N Engl J Med. 1995;333(22):1456-1461. Effect of radiotherapy after breast-conserving surgery on 10-year recurrence and 15-year breast cancer death: meta-analysis of individual patient data for 10 801 women in 17 randomised trials. Lancet. 2011;378(9804):1707-1716. Stellamans K, Van Limbergen E, Christiaens MR, Vandevoort M. Borstreconstructie en radiotherapie: een probleem? . TvG 2000;56(6):399-409. Bourton EC, Plowman PN, Smith D, Arlett CF, Parris CN. Prolonged expression of the gamma-H2AX DNA repair biomarker correlates with excess acute and chronic toxicity from radiotherapy treatment. Int J Cancer. 2011;129(12):2928-2934. Barnett GC, West CM, Dunning AM, Elliott RM, Coles CE, Pharoah PD, et al. Normal tissue reactions to radiotherapy: towards tailoring treatment dose by genotype. Nat Rev Cancer. 2009;9(2):134-142. Werbrouck J, De Ruyck K, Beels L, Vral A, Van Eijkeren M, De Neve W, et al. Prediction of late normal tissue complications in RT treated gynaecological cancer patients: potential of the gamma-H2AX foci assay and association with chromosomal radiosensitivity. Oncol Rep. 2010;23(2):571-578. Webb S. The physical basis of IMRT and inverse planning. Br J Radiol. 2003;76(910):678-689. Mareel M. 40 jaar oncologie, radiotherapie, nucleaire geneeskunde in het Universitair Ziekenhuis Gent. TvG 2005;61(4):245-253. Veldeman L, Madani I, Hulstaert F, De Meerleer G, Mareel M, De Neve W. Evidence behind use of intensity-modulated radiotherapy: a systematic review of comparative clinical studies. Lancet Oncol. 2008;9(4):367-375. Mukesh MB, Barnett GC, Wilkinson JS, Moody AM, Wilson C, Dorling L, et al. Randomized controlled trial of intensity-modulated radiotherapy for early breast cancer: 5-year results confirm superior overall cosmesis. J Clin Oncol. 2013;31(36):4488-4495. De Neve W, De Gersem W, Madani I. Rational use of intensity-modulated radiation therapy: the importance of clinical outcome. Semin Radiat Oncol. 2012;22(1):40-49. Dayes I, Rumble RB, Bowen J, Dixon P, Warde P. Intensity-modulated radiotherapy in the treatment of breast cancer. Clin Oncol (R Coll Radiol). 2012;24(7):488-498. Breast Cancer 2014. Available from: http://cancerresearch.org/cancer-immunotherapy/impacting-allcancers/breast-cancer. Soliman H. Immunotherapy strategies in the treatment of breast cancer. Cancer Control. 2013;20(1):1721. Stone HB, Coleman CN, Anscher MS, McBride WH. Effects of radiation on normal tissue: consequences and mechanisms. Lancet Oncol. 2003;4(9):529-536. Bakhshandeh M, Hashemi B, Mahdavi SR, Nikoofar A, Vasheghani M, Kazemnejad A. Normal tissue complication probability modeling of radiation-induced hypothyroidism after head-and-neck radiation therapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2013;85(2):514-521. Hendry JH, Jeremić B, Zubizarreta EH. Normal tissue complications after radiation therapy. Rev Panam Salud Publica 2006;20(2-3):151-160. Dorr W, Hendry JH. Consequential late effects in normal tissues. Radiother Oncol. 2001;61(3):223-231. West CM, Barnett GC. Genetics and genomics of radiotherapy toxicity: towards prediction. Genome Med. 2011;3(8):52. 45 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. Vral A, Van Eijkeren M, De Neve W, Vakaet L. Cursus Radiobiologie en radiopathologie: Universiteit Gent; 1e master Biomedische Wetenschappen. Kavanagh JN, Redmond KM, Schettino G, Prise KM. DNA double strand break repair: a radiation perspective. Antioxid Redox Signal. 2013;18(18):2458-2472. Chua ML, Rothkamm K. Biomarkers of radiation exposure: can they predict normal tissue radiosensitivity? Clin Oncol (R Coll Radiol). 2013;25(10):610-616. Henríquez-Hernández LA, Bordón E, Pinar B, Lloret M, Rodríquez-Gallego C, Lara PC. Prediction of normal tissue toxicity as part of the individualized treatment with radiotherapy in oncology patients. Surg Oncol. 2012;21(3):201–206. Andreassen CN, Alsner J. Genetic variants and normal tissue toxicity after radiotherapy: a systematic review. Radiother Oncol. 2009;92(3):299-309. Rosenstein BS. Identification of SNPs associated with susceptibility for development of adverse reactions to radiotherapy. Pharmacogenomics. 2011;12(2):267-275. Bonner WM, Redon CE, Dickey JS, Nakamura AJ, Sedelnikova OA, Solier S, et al. γH2AX and cancer. Nat Rev Cancer. 2008;8(12):957-967. Werbrouck J, De Ruyck K, Beels L, Vral A, Van Eijkeren M, De Neve W, et al. Prediction of late normal tissue complications in RT treated gynaecological cancer patients: potential of the gamma-H2AX foci assay and association with chromosomal radiosensitivity. Oncol Rep. 2010;23(2):571-578. Werbrouck J. Lack of a correlation between γH2AX foci kinetics in lymphocytes and the severity of acute normal tissue reactions during IMRT treatment for head and neck cancer. Int J Radiat Biol. 2011;87(1):4656. Ivashkevich A, Redon CE, Nakamura AJ, Martin RF, Martin OA. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Lett. 2012;327(1-2):123-133. Finnon P, Kabacik S, MacKay A, Raffy C, A'Hern R, Owen R, et al. Correlation of in vitro lymphocyte radiosensitivity and gene expression with late normal tissue reactions following curative radiotherapy for breast cancer. Radiother Oncol. 2012;105(3):329-336. Ozsahin M, Ozsahin H, Shi Y, Larsson B, Wurgler FE, Crompton NE. Rapid assay of intrinsic radiosensitivity based on apoptosis in human CD4 and CD8 T-lymphocytes. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 1997;38(2):429-440. Crompton NE, Miralbell R, Rutz HP, Ersoy F, Sanal O, Wellmann D, et al. Altered apoptotic profiles in irradiated patients with increased toxicity. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 1999;45(3):707-714. Ozsahin M, Crompton NE, Gourgou S, Kramar A, Li L, Shi Y, et al. CD4 and CD8 T-lymphocyte apoptosis can predict radiation-induced late toxicity: a prospective study in 399 patients. Clin Cancer Res. 2005;11(20):7426-7433. Bordón E, Henríquez Hernández LA, Lara PC, Pinar B, Fontes F, Rodríguez Gallego C, et al. Prediction of clinical toxicity in localized cervical carcinoma by radio-induced apoptosis study in peripheral blood lymphocytes (PBLs). Radiat Oncol. 2009;4(1):58. Bordón E, Henriquez-Hernandez LA, Lara PC, Ruiz A, Pinar B, Rodriguez-Gallego C, et al. Prediction of clinical toxicity in locally advanced head and neck cancer patients by radio-induced apoptosis in peripheral blood lymphocytes (PBLs). Radiat Oncol. 2010;5:4. Bentzen SM, Agrawal RK, Aird EG, Barrett JM, Barrett-Lee PJ, Bliss JM, et al. The UK Standardisation of Breast Radiotherapy (START) Trial B of radiotherapy hypofractionation for treatment of early breast cancer: a randomised trial. Lancet. 2008;371(9618):1098-1107. BCCT.core - Breast Research Group 2014. Available from: http://medicalresearch.inescporto.pt/ breastresearch/index.php/BCCT.core. Rube CE, Grudzenski S, Kuhne M, Dong X, Rief N, Lobrich M, et al. DNA double-strand break repair of blood lymphocytes and normal tissues analysed in a preclinical mouse model: implications for radiosensitivity testing. Clin Cancer Res. 2008;14(20):6546-6555. Andrievski A, Wilkins RC. The response of gamma-H2AX in human lymphocytes and lymphocytes subsets measured in whole blood cultures. Int J Radiat Biol. 2009;85(4):369-376. Azria D, Gourgou S, Sozzi WJ, Zouhair A, Mirimanoff RO, Kramar A, et al. Concomitant use of tamoxifen with radiotherapy enhances subcutaneous breast fibrosis in hypersensitive patients. Br J Cancer. 2004;91(7):1251-1260. Bonner WM, Redon CE, Dickey JS, Nakamura AJ, Sedelnikova OA, Solier S, et al. γH2AX and cancer. Nat Rev Cancer. 2008;8(12):957-967. Kinner A, Wu W, Staudt C, Iliakis G. ?-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 2008;36(17):5678-5694. Chua ML, Somaiah N, A'Hern R, Davies S, Gothard L, Yarnold J, et al. Residual DNA and chromosomal damage in ex vivo irradiated blood lymphocytes correlated with late normal tissue response to breast radiotherapy. Radiother Oncol. 2011;99(3):362-366. 46 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. Chua ML, Horn S, Somaiah N, Davies S, Gothard L, A'Hern R, et al. DNA double-strand break repair and induction of apoptosis in ex vivo irradiated blood lymphocytes in relation to late normal tissue reactions following breast radiotherapy. Radiat Environ Biophys. 2014;53(2):355-364. Djuzenova CS, Elsner I, Katzer A, Worschech E, Distel LV, Flentje M, et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone ?-H2AX and 53BP1 foci. Radiat Oncol. 2013;8:98. Celeste A, Fernandez-Capetillo O, Kruhlak MJ, Pilch DR, Staudt DW, Lee A, et al. Histone H2AX phosphorylation is dispensable for the initial recognition of DNA breaks. Nat Cell Biol. 2003;5(7):675679. FitzGerald JE, Grenon M, Lowndes NF. 53BP1: function and mechanisms of focal recruitment. Biochem Soc Trans. 2009;37(Pt 4):897-904. Goutham HV, Mumbrekar KD, Vadhiraja BM, Fernandes DJ, Sharan K, Kanive Parashiva G, et al. DNA double-strand break analysis by gamma-H2AX foci: a useful method for determining the overreactors to radiation-induced acute reactions among head-and-neck cancer patients. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2012;84(5):e607-612. Mumbrekar KD, Fernandes DJ, Goutham HV, Sharan K, Vadhiraja BM, Satyamoorthy K, et al. Influence of double-strand break repair on radiation therapy-induced acute skin reactions in breast cancer patients. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2014;88(3):671-676. Crompton NE, Ozsahin M. A versatile and rapid assay of radiosensitivity of peripheral blood leukocytes based on DNA and surface-marker assessment of cytotoxicity. Radiat Res. 1997;147(1):55-60. Crompton NE, Shi YQ, Emery GC, Wisser L, Blattmann H, Maier A, et al. Sources of variation in patient response to radiation treatment. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2001;49(2):547-554. Solier S, Pommier Y. The nuclear gamma-H2AX apoptotic ring: implications for cancers and autoimmune diseases. Cell Mol Life Sci. 2014. Solier S, Pommier Y. The apoptotic ring: a novel entity with phosphorylated histones H2AX and H2B and activated DNA damage response kinases. Cell Cycle. 2009;8(12):1853-1859. Solier S, Pommier Y. MDC1 cleavage by caspase-3: a novel mechanism for inactivating the DNA damage response during apoptosis. Cancer Res. 2011;71(3):906-913. Cook PJ, Ju BG, Telese F, Wang X, Glass CK, Rosenfeld MG. Tyrosine Dephosphorylation of H2AX Modulates Apoptosis and Survival Decisions. Nature. 2009;458(7238):591-596. Xiao A, Li H, Shechter D, Ahn SH, Fabrizio LA, Erdjument-Bromage H, et al. WSTF regulates the H2A.X DNA damage response via a novel tyrosine kinase activity. Nature. 2009;457(7225):57-62. Stucki M. Histone H2A.X Tyr142 phosphorylation: a novel sWItCH for apoptosis? DNA Repair (Amst). 2009;8(7):873-876. van Oorschot B, Hovingh SE, Moerland PD, Medema JP, Stalpers LJ, Vrieling H, et al. Reduced activity of double-strand break repair genes in prostate cancer patients with late normal tissue radiation toxicity. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2014;88(3):664-670. Olive PL, Banath JP, Keyes M. Residual gammaH2AX after irradiation of human lymphocytes and monocytes in vitro and its relation to late effects after prostate brachytherapy. Radiother Oncol. 2008;86(3):336-346. Fleckenstein J, Kuhne M, Seegmuller K, Derschang S, Melchior P, Graber S, et al. The impact of individual in vivo repair of DNA double-strand breaks on oral mucositis in adjuvant radiotherapy of headand-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2011;81(5):1465-1472. Henriquez-Hernandez LA, Carmona-Vigo R, Pinar B, Bordon E, Lloret M, Nunez MI, et al. Combined low initial DNA damage and high radiation-induced apoptosis confers clinical resistance to long-term toxicity in breast cancer patients treated with high-dose radiotherapy. Radiat Oncol. 2011;6:60. Finnon P, Kabacik S, MacKay A, Raffy C, A'Hern R, Owen R, et al. Correlation of in vitro lymphocyte radiosensitivity and gene expression with late normal tissue reactions following curative radiotherapy for breast cancer. Radiother Oncol. 2012;105(3):329-336. 47
