het ontstaan van breuken in dna onder invloed

a/ ^
VRIJE U N I V E R S I T E I T
TE
AMSTERDAM
HET ONTSTAAN VAN BREUKEN
IN DNA ONDER INVLOED VAN
GAMMA STRALING
ACADEMISCH
PROEFSCHRIFT
ter verkrijging van de graad van Doctor in de Wiskunde en Natuurwetenschappen aaa de Vrije Universiteit te Amsterdam, op gezag van
de Rector Magnificus Mr. W. F. de Gaay Fortman, Hoogleraar in de
Faculteit der Rechtsgeleerdheid, in het openbaar te verdedigen op vrijdag
6 juni 1969 des namiddags om 13.30 uur in het Woestduincentrum,
Woestduinstraat 16 te Amsterdam
door
GOVERT PAULUS VAN DER SCHANS
geboren te Deurne
DRUKKERIJ JOKO SLOTERWEG 1247 AMSTERDAM
PROMOTOR: P R O F . DR. JOH. BLOK
STELUNGEN
De wijze waarop Dean uit experimentele gegevens concludeert dat b e s c h a diging van de purines en pyrimidines in DNA een belangrijke rol s p e e l t bij
de biologische werking van straling is aanvechtbaar.
Dean, C.J. (1968), Role of DNA damage and
its repair in the inactivation of cells by ionizing radiations. In: Effects of radiation on
Cellular Proliferation and Differentiation. Int.
Atomic Energy Agency, Wenen, pag. 23-38.
De snelle inactivering van glutamine s y n t h e t a s e in vivo verloopt door middel van een enzymatisch p r o c e s , waarbij adenylzuur aan het enzym wordt
gekoppeld. Er moet rekening mee worden gehouden dat r e a c t i e s van dit
type van belang kunnen zijn bij de regulering van de activiteit van andere
enzymen.
Shapiro, B.M., Stadtman, E.R. (1968), Biochem. Biophys. Res. Comm. 30, 32.
Wulff, K., Mecke, D., Hölzer, H. (1967),
Biochem, Biophys. Res. Comm. 28, 740.
Bij de sedimentatie van DNA in een a l k a l i s c h e sucrosegradiënt wordt dikwijls ten onrechte aangenomen dat het molecuulgewicht corresponderend
met de gemiddelde sedimentatiecoëfficiënt overeenkomt met het a a n t a l g e middelde dan wel met het gewichtsgemiddelde molecuulgewicht van het
preparaat.
McGrath, R.A., Williams, R.W. (1966), Nature
212. 534.
Lett, J.T., Caldwell, T., Pean, C.J., Alexander, P . (1967), Nature 214, 790.
Moroson, H., Anello, A. (1968), Biochem.
Biophys. Res. Comm. 31, 1.
De fractie a c t i e v e ribosomen, in vttro, kan volgens Matthaei en Milberg worden berekend uit de hoeveelheid tRNA die door het boodschapper RNA op
de ribosomen kan worden gebonden. Genoemde auteurs houden echter onvoldoende rekening met de complicaties, die bij deze bepaling kunnen optreden.
Matthaei, H., Milberg, M., (1967), Biochem.
Biophys. Res. Comm. 29, 593.
5
Bij de bepaling van de autoprotolyseconstante van dimethylformamide gaan
T e z é en Schaal van onjuiste veronderstellingen uit.
Tezé, H., Schaal, R. (1962), Bull. Soc. Chim.
France, 1372.
6
Chiou en Sastry verwaarlozen ten onrechte de invloed van andere eiwitten
bij fluorescentiemetingen aan commerciële cholinesterasepreparaten.
Chiou, C , Sastry, B.V.R. (1968), Biochem.
Pharmacol. 17, 805.
7
Tegen de wijze waarop Boersch en medewerkers met behulp van twee l a s e r s
lengteveranderingen in de orde van 10* A bepalen, zijn bezwaren aan te
voeren.
Boersch, H., Eichler, H., Herziger, G., Lindner, H., Makosch, H. (1967). In: Lasers et
Optique non Conventionelle, Paris, pag. 78.
8
Mallory Boush en Matsumura hebben bij hun onderzoek naar de afbraak van
dilsopropyl fosforofluoridaat en parathion door de bacterie Pseudomonas
melophthora geen rekening gehouden met de mogelijkheid, dat hun r e s u l t a ten zijn beïnvloed door de niet-enzymatische hydrolyse van genoemde insecticiden.
Mallory Boush, G., Matsumura, F. (1967),
J. Ec. Entom. 60, 918.
9
Het is onwaarschijnlijk dat het door Freifelder gevonden verschil in stralingsgevoeligheid t u s s e n het DNA in de bacteriofaag T7 en het P l a c DNA
in de h a c t e i i e Escherichia coli DF3 moet worden toegeschreven aan het gebruik van röntgenstraling van verschillende kwaliteit.
Freifelder, D. (1968), J. Mol. Biol. 35, 303.
G . P . van der Schans.
Aan mijn moeder
Aan mijn vrouw
Het in dit proefschrift beschreven onderzoek werd verricht in het Medisch Biologisch Laboratorium der Rijksverdedigingsorganisatie TNO.
Op deze p l a a t s wil ik mijn dank betuigen aan allen, die mij bij de bewerking van dit proefschrift behulpzaam zijn geweest. In het bijzonder ben
ik dank verschuldigd aan Prof.Dr. J . A . Cohen, directeur van het Medisch
Biologisch Laboratorium en aan Prof.Dr. J o h . Blok voor hun inspirerende
leiding en de prettige sfeer waarin het onderzoek kon worden uitgevoerd.
Dr, J . B . T . Aten, je belangstelling voor en aanmoediging bij mijn werk
heb ik zeer op prijs gesteld. J e adviezen zijn voor mij van veel nut g e w e e s t .
Ir. J . F . Bleichrodt, je hulp bij het samenstellen van het manuscript was
voor mij van grote waarde.
J.Meijer en Drs. C.M. Knijnenburg, ik dank jullie voor de bijdrage die
jullie geleverd hebben bij het voltooien van het onderzoek.
Mejuffrouw W.S.D.Verheij, voor de prettige samenwerking bij de bestralingsexperimenten ben ik je zeer erkentelijk.
Het bestuur van de Rijksverdedigingsorganisatie betuig ik mijn dank
voor de toestemming tot publikatie van dit onderzoek in de vorm van een
proefschrift.
Verder ben ik bijzonder dank verschuldigd
aan de heren Groot Bramel, Weber en hun medewerkers voor de verzorging
van de figuren,
aan Mejuffrouw G. Landwier, die het voorbereidende typewerk verzorgde en
aan de heren Engelen, Schriefer en hun medewerkers voor hun aandeel in
de totstandkoming en het onderhoud van de apparatuur.
INHOUD
Pag.
AFKORTINGEN
HOOFDSTUK I
INLEIDING
1. Probleemstelling
2. Uitvoering van het onderzoek
3. Indeling van dit proefschrift
HOOFDSTUK II
DE INVLOED VAN STRALING OP LEVENDE
CELLEN EN VIRUSSEN
1. Inleiding
2. De bijdrage van stralingsschade in het DNA
tot de inactivering van cellen en virussen
3. Modificatie van de stralingsschade door
zuurstof en sulfhydrylverbindingen
4. De inwerking van straling op vrij DNA
De directe werking
De indirecte werking
HOOFDSTUK Hl
DETAILGEGEVENS OVER DE TOEGEPASTE
METHODEN
1. Faag- en bacteriestammen
2. Materialen
3. Bacteriofaagpreparaten
4. Faagtitratie
5. DNA isolatie
6. Bepaling van de biologische activiteit van
DNA met sferoplasten
7. Denaturering van T4 DNA
8. Het breken van DNA moleculen door middel
van hydrodynamische schuifspanningen
9. Temperatuur-absorptie curven
10. Snelheidssedimentatie in de analytische ultracentrifuge
11. Evenwichtssedimentatie in een dichtheidsgradiënt
9
9
9
10
11
11
13
16
18
18
20
24
24
24
25
26
26
26
27
27
27
27
27
Pag.
12. Bestraling van DNA en bacteriofaag met
Co gamma straling
13. Bepaling van de SH-concentratie
14. Viscosimetrie
15. Sedimentatie in een sucrosegradiënt
16. De bepaling van het aantal dubbelstrengbreuken
17. De bepaling van het aantal enkelstrengbreuken
HOOFDSTUK IV
BEREKENING VAN MOLECUULGEWICHTSVERDELINGEN
1. Inleiding
2. De molecuulgewichtsverdeling van DNA en
de verdeling in een sucrosegradiënt na het
willekeurig aanbrengen van breuken
3. Het aantal dubbelstrengbreuken als functie
van het aantal enkelstrengbreuken
HOOFDSTUK V
HOOFDSTUK VI
BEPALING VAN DE MOLECUULGEWICHTSVERDELING VAN DNA DOOR MIDDEL VAN
SEDIMENTATIE IN EEN SUCROSEGRADIËNT
1, Inleiding
2, Berekening van S | Q " uit de door de sedimenterende deeltjes afgelegde weg in een
sucrosegradiënt
Resultaten en discussie
Sucrosegradiënt
Denaturering
Bepaling van s,M<elaties
De molecuulgewichtsverdeling
Vergelijking van de twee methoden om
het aantal breuken te berekenen
ONDERZOEK VAN DNA VAN BESTRAALDE
BACTERIOFAGEN
1. Inleiding
2. Experimenten met bacteriofaag T4
3. Experimenten met bacteriofaag T7
4. Controle-experimenten
5. Discussie
27
28
29
29
30
30
32
32
32
34
36
36
37
38
38
44
47
50
51
54
54
55
60
61
63
HOOFDSTUK VII
HOOFDSTUK VIII
BESTRALING VAN DNA IN OPLOSSING
1. Inleiding
2. Resultaten
Gevoeligheid voor hydrodynamische
schuifspanningen
Het aantal dubbelstrengbreuken als functie van het aantal enkelstrengbreuken
Stralingsgevoeligheid onder N», On en
N2O
"Crosslinks"
3. D iscussie
ALGEMENE DISCUSSIE
1. Breuken door directe werking
2. Breuken door indirecte werking
3. De produktie van breuken in het DNA van
levende cellen
Pag.
66
66
66
66
67
70
71
73
77
77
78
80
SUMMARY
82
LITERATUUR
84
AFKORTINGEN
DNA
E260
M of m
mn
P
rpm
s
°20,w
Qsucr
*20,w
S
t
desoxyribonucleïnezuur
extinctie bij een golflengte van 260 nm
molecuulgewicht
aantalgemiddeld molecuulgewicht
gewichtsgemiddeld molecuulgewicht
molecuulgewicht corresponderend met de p l a a t s van h e t maximum in de
verdeling van gebroken moleculen in een s u c r o s e g r a d i ë n t
gemiddeld aantal breuken per molecuul
omwentelingen per minuut
sedimentatiecoëfficiënt (Svedberg-eenheden)
sedimentatiecoëfficiënt bij 20 C in water, geëxtrapoleerd naar oneindige
verdunning
sedimentatiecoëfficiënt bij 20 ° C in water, gemeten in een s u c r o s e g r a diënt
-l'i
sec
Svedberg-eenhei d 10
tijd (in s e c )
partieel specifiek volume (cm / g )
dichtheid van d e s u c r o s e - o p l o s s i n g op een afstand x v a n de r o t a t i e - a s in
^x
de ultracentrifuge (g/cm )
v i s c o s i t e i t van de s u c r o s e - o p l o s s i n g op een afstand x van de r o t a t i e - a s
in de ultracentrifuge (centipoise)
^x
v i s c o s i t e i t (centipoise)
•n
CÜ
h o e k s n e l h e i d van de rotor in de ultracentrifuge (radialen per s e c )
s t r a l i n g s d o s i s waarbij 63% van de d e e l t j e s i s geïnactiveerd
D37
h e t a a n t a l moleculen, r a d i c a l e n , verbroken bindingen e n z . van een b e paalde soort dat per 100 eV in een o p l o s s i n g g e d i s s i p e e r d e s t r a l i n g s .energie o n t s t a a t of verdwijnt
h e t a a n t a l verbroken bindingen en andere beschadigingen van een b e paalde s o o r t d a t per 100 eV in DNA afgegeven s t r a l i n g s e n e r g i e o n t s t a a t
gehydrateerd elektron
%q
0,14 M NaCl + 0,02 M Natriumcitraat
0,14 M NaOH + 0,02 M Natriumcitraat
SCOH
0,01 M fosfaatbuffer: 0,0066 M NagHPO^ + 0,0034 M KHgPO^
HMP
N-ethyl-maleïnezuurimide
NEM
tellen per minuut
cpm
rad (afkorting rd)
eenheid van geabsorbeerde s t r a l i n g s d o s i s (= 100 erg/gram)
V
ssc
t
ds
es
b
D e volgende symbolen lüorden a l s index gebruikt:
temperatuur ( C)
dubbelstrengbreuk
enkelstren^reuk
biologische inactivering
HOOFDSTUK I
INLEIDING
1. Probleemstelling
In het kader van het onderzoek van de effecten van ioniserende straling
op het genetisch materiaal van de cel (DNA) bestond op het Medisch Biologisch Laboratorium der Rijksverdedigingsorganisatie TNO behoefte aan
een methode om zowel in preparaten van dubbelstrengig als van enkelstrengig DNA, op eenvoudige wijze de verdeling van de molecuulgewichten
te bepalen. Het in dit proefschrift beschreven onderzoek was erop gericht
zulk een methode te ontwikkelen en hiermee vervolgens een verband te
leggen t u s s e n het ontstaan van breuken in DNA en het verlies van biologische activiteit onder invloed van ioniserende straling. Bij dit onderzoek
werd niet alleen de directe werking van de straling op DNA onderzocht
maar tevens de indirecte werking, die een gevolg is van de door de straling
in de oplossing gevormde radicalen.
2. Uitvoering van het onderzoek
Voor de scheiding van de DNA moleculen naar grootte, die nodig is om
de molecuulgewichtsverdeling in een preparaat vast te stellen,werd gebruik
gemaakt van de in de literatuur beschreven methode van zonesedimentatie
in een sucrosegradiënt. Om molecuulgewichtsverdelingen te kunnen berekenen, dient de sucrosegradiënt goed reproduceerbaar, stabiel en van een
geschikte samenstelling te zijn. Voorts dient men over een betrouwbare
methode voor de fractionering van de gradiënt te beschikken. Om aan deze
eisen te voldoen werden apparaten geconstrueerd voor het teweegbrengen
en voor het fractioneren van sucrosegradiënten. Bij het beproeven van de
methode werd gebruik gemaakt van het DNA van de bacteriofaag T4, daar
dit DNA reeds uitvoerig door anderen was bestudeerd. Zo werden door Aten
(1965) het sedimentatiegedrag, de v i s c o s i t e i t e n d e gevoeligheid voor hydrodynamische schuifspanningen van dubbelstrengig T4 DNA in oplossing
onderzocht. Desondanks waren voor de toepassing van de sucrosegradiënt
methode op dubbelstrengig en in het bijzonder op enkelstrengig T4 DNA
nog enkele aanvullende onderzoekingen van dit DNA noodzakelijk.
Het onderzoek naar de invloed van straling op DNA omvatte enerzijds
experimenten waarbij complete bacteriofaagdeeltjes (T4 en T7) werden be-
straald en anderzijds proeven, waarbij het DNA van bacteriofagen, na i s o lering en zuivering, in oplossing werd bestraald. Bij de eerstgenoemde experimenten werd onder andere de invloed van zuurstof en van enkele SHverbindingen op de produktie van enkelstreng- en dubbelstrengbreuken in
het DNA onderzocht. Bij de bestraling van DNA in oplossing werd de produktie van dubbelstreng- en enkelstrengbreuken onder verschillende bestralingscondities bestudeerd om vast te stellen in welke mate de verschillende soorten radicalen tot dit effect bijdragen.
3 . Indeling van dit proefschrift
In hoofdstuk II wordt een algemene inleiding gegeven over het ontstaan
van breuken in DNA a l s gevolg van straling en de rol die zij spelen bij de
inactivering van virussen, bacteriën en zoogdiercellen. Na een beschrijving
in hoofdstuk III van de gebruikte bacterie- en bacteriofaagstammen, media
en methoden, worden in hoofdstuk IV enkele afleidingen van formules gegeven en wordt in hoofdstuk V vermeld welke experimenten werden uitgevoerd
om de sucrosegradiëntmethode voor het meten van dubbelstreng- en enkelstrengbreuken in DNA te beproeven. In hoofdstuk VI wordt beschreven hoe
d e , produktie van breuken in DNA wordt beïnvloed door zuurstof en enkele
SH-verbindingen- bij de bestraling van de bacteriofagen T 4 en T 7 . Het onderzoek van de invloed van ioniserende straling op DNA in oplossing wordt
in hoofdstuk VII samengevat en tot slot wordt in hoofdstuk VIII een a l g e mene d i s c u s s i e gegeven.
10
HOOFDSTUK II
DE INVLOED VAN STRALING O P LEVENDE CELLEN EN VIRUSSEN
1. Inleiding
Bij bestraling van cellen met y - s t r a l i n g ontstaan hierin of in het omringende medium snelle elektronen. Deze elektronen geven per botsing een
hoeveelheid energie af, die in het algemeen groot is vergeleken met de
bindingsenergieën der atomen. De afgegeven energie per botsing varieert
binnen zeer wijde grenzen, doch bedraagt gemiddeld 70 tot 100 eV (Hutchinson en Pollard, 1961). Zulk een energie-overdracht zal in het volgende een
treffer worden genoemd. Gezien de sterke verstrooiing der elektronen en de
vrij grote afstand t u s s e n achtereenvolgende primaire i o n i s a t i e s langs hun
baan kan men de treffers in het algemeen a l s ruimtelijk onafhankelijk van
elkaar beschouwen.
Veronderstel nu dat N identieke cellen met volume V homogeen worden
bestraald met een d o s i s van D treffers per eenheid van volume, dat wil
zeggen, gemiddeld VD treffers per c e l , dan is volgens de verdelingswet
van P o i s s o n de waarschijnlijkheid dat in een cel n treffers optreden
(VD)"
-VD
De waarschijnlijkheid dat een cel geen enkele treffer heeft geïncasseerd,
is dus e"
. Indien iedere eerste treffer dodelijk is,waarmee wordt bedoeld dat de cel het vermogen zich te vermenigvuldigen heeft verloren,
volgt hieruit dat na een dosis D het aantal overlevende cellen N wordt gegeven door
N = N„.e •VD
Als echter niet iedere treffer in een cel letaal i s , maar f de waarschijnlijkheid is dat een treffer tot de dood van de cel leidt, geldt voor het aantal
overlevende cellen na een dosis D
N = N .e-fVD _
O
11
Volgens deze formule wordt een rechte lijn verkregen a l s in een grafiek
log (N/N ) tegen D wordt uitgezet. Deze lijn noemt men de overlevingscurve en de helling ervan is een maat voor de stralingsgevoeligheid van de
cellen. Het is gebruikelijk de stralingsgevoeligheid aan te geven met behulpvan de s t r a l i n g s d o s i s waarbij het gemiddelde aantal letale treffers per
cel, fVD, gelijk is aan 1. Dit is dus de d o s i s waarbij de overleving N/No
gelijk is aan e"^ = 0,37. Deze s t r a l i n g s d o s i s wordt aangeduid met Dgy.
De waarde van f is meestal veel kleiner dan 1, met andere woorden fV
is veel kleiner dan het volume van de cel (Zimmer, 1961; Stent en F u e r s t ,
1965). Voor cellen die een kern bevatten, is fV dikwijls nog belangrijk
kleiner dan het volume van de kern (Ginoza, V e s s e y en Miller, 1966). Dit
resultaat suggereert dat s l e c h t s treffers in bepaalde gebieden in de cel met
een gezamenlijk volume fV tot de dood leiden. Deze fenomenologische beschouwing vormt de grondslag van de zogenaamde "target" theorie (Lea,
1947;Hutchinson en Pollard, 1961; Zimmer, 1961).
Er zijn duidelijke aanwij zingen dat het ' t a r g e t " gezocht moet worden
in het DNA van het organisme (Ginoza, 1963; McGrath en Williams, 1966;
Kaplan, 1966) indien althans a l s criterium voor de overleving het voortplantingsvermogen wordt genomen. Naar men thans algemeen aanneemt,
bepaalt de samenstelling van het DNA de erfelijke eigenschappen van een
cel. Elk DNA molecuul is opgebouwd uit twee strengen die in een schroeflijnstructuur (dubbele helix)om elkaar gewikkeld zijn. De strengen bestaan
uit desoxyribonucleotiden die door middel van fosfaatesterbindingen aan
elkaar zijn gebonden. De heterocyclische basen van de nucleotiden — a d e nine, guanine, cytosine en thymine — zijn naar de a s van de helix gericht
en de fosfaatgroepen liggen aan de buitenkant. De rangschikking van de
basen in beide strengen is zodanig dat zich s t e e d s tegenover een adenine
in de ene s t r e n g een thymine in de andere streng bevindt en tegenover een
cytosine in de ene een guanine in de andere.
Het voorgaande betekent niet dat inactivering van cellen altijd een gevolg moet zijn van een directe ionisatie in het DNA zelf (directe werking).
Stralingsprodukten, die ontstaan in de omgeving van het DNA, kunnen ook
bijdragen tot de inactivering (indirecte werking). In de bovengegeven beschouwing betekent dit dat het "target" een "diffuse" grens bezit.
Uit de bepaling van f kan men concluderen dat in zeer kleine virussen
bij benadering elke primaire ionisatie in h e t DNA letaal is (Ginoza, 1963).
In grotere virussen is ongeveer een tiende deel en in hogere organismen
een nog geringere fractie van de primaire i o n i s a t i e s in het DNA l e t a a l . Beschouwt men dus het DNA van een cel a l s "gevoelig volume", dan dient
men in de factor f ook de waarschijnlijkheid te verdisconteren, dat een primaire ionisatie in dit volume inderdaad tot letale veranderingen leidt.
Dikwijls worden voor virussen en eencellige organismen overlevings12
curven met een "schouder" gevonden. De helling van de overlevingscurve
neemt dan geleidelijk toe met de dosis en p a s bij hogere d o s e s nadert de
curve tot een rechte. Dit betekent dat er treffers voorkomen die op zichzelf
nog niet de dood van de cel of het virus veroorzaken maar die wel een verhoogde gevoeligheid voor volgende treffers teweegbrengen. Dit verschijnsel
treedt bijvoorbeeld op a l s een beperkt aantal beschadigingen ten gevolge
van treffers kan worden hersteld, mits verdere treffers dit herstel onmogelijk maken.
2 . De bijdrage van stralingsschade in het DNA tot de inactivering van cellen en virussen
In het bovenstaande werd vermeld dat de letale werking van ioniserende
straling voor een groot deel, zo niet geheel, wordt toegeschreven aan treffers in het DNA. Teneinde een verband te kunnen leggen tussen de dood
van een organisme en de door genoemde treffers veroorzaakte veranderingen
in het DNA dienen de methoden ter detectie van die veranderingen een zeer
grote gevoeligheid te bezitten. De s t r a l i n g s d o s i s die nodig is om met de
huidige analytische methoden veranderingen in het DNA te kunnen aantonen, is in het algemeen vele malen groter dan de letale dosis.-Een gunstige
uitzondering vormen de door straling teweeggebrachte breuken in het DNA.
Deze zijn met grote nauwkeurigheid te meten. Wanneer immers in ieder DNA
molecuul op een bepaalde plaats beide strengen worden gebroken (dubbelstrengbreuk), heeft dit een halvering van het gemiddelde molecuulgewicht
tot gevolg. Ontstaat een breuk in s l e c h t s één van de strengen (enkelstrengbreuk), dan kan men de strengen door denaturering scheiden en daarna het
gemiddelde molecuulgewicht van de strengen bepalen .
Gegevens over de produktie van breuken in DNA door straling zijn nog
s c h a a r s . Kaplan ,(1966) concludeerde uit experimenten met bacteriecellen
{E.coli Kl2) dat na bestraling de dubbelstrengbreuken de hoofdoorzaak van
de dood van de cel zijn. Voor het bepalen van het aantal dubbelstrengbreuken na bestraling werden de bacteriën gelyseerd met behulp van lysozyme
en vervolgens gesedimenteerd in een sucrosegradiënt. De verhouding van
de stralingsgevoeligheid van E.coli K l 2 en die van E.coli K l 2 waarin
BUdR in het DNA was geïncorporeerd, kwam overeen met de verhouding
waarmee dubbelstrengbreuken werden geïntroduceerd. Dit behoeft echter
nog niet te betekenen dat het aantal dubbelstrengbreuken overeenkomt met
het aantal letale treffers.
De produktie van enkelstrengbreuken in het DNA van bacteriën door
bestraling werd onderzocht door McGrath en Williams (1966). Zij brachten
de bacteriën op verschillende tijden na bestraling op een alkalische sucro•segradiënt. Hierdoor lyseerden de cellen en bij centrifugering werd het
DNA vervolgens in enkelstrengige vorm gesedimenteerd. T u s s e n bestraling
13
en lysering bleven de bacteriën in het voedingsmedium op 37 C. Direct na
bestraling bleek de sedimentatiesnelheid van het DNA aanzienlijk kleiner
te zijn dan voor onbestraalde bacteriën. Door incuberen bij 37 C verkreeg
het DNA van de bestraalde bacteriën echter na verloop van tijd weer nagenoeg de sedimentatie-eigenschappen van DNA uit onbestraalde bacteriën.
Dit is een sterke aanwijzing dat er gedurende incubatie herstel van enkelstrengbreuken optreedt. E.coli B -•, een stralingsgevoelige mutant, bleek
dit vermogen tot herstel van enkelstrengbreuken te ontberen (McGrath en
Williams, 1966) en daarom werd een verband aangenomen tussen de grote
stralingsgevoeligheid van E.coli B i en de afwezigheid van dit herstelproces.
In het algemeen worden dubbelstrengbreuken niet hersteld (Kaplan,
1966). Een uitzondering hierop vormt wellicht Micrococcus radiodurans,
een stralingsresistente bacterie die is ontdekt bij de sterilisering van vlees
door middel van straling (Anderson, Nordan, Cain, Parrish en Duggan, 1956).
Dit organisme i s volgens Dean, Feldschreiber en L e t t (1966) in s t a a t ook
dubbelstrengbreuken, of althans schade die bij de isolatie tot dubbelstrengbreuken kan leiden, te herstellen. Dean en medewerkers isoleerden op verschillende tijden na bestraling het DNA en bepaalden de v i s c o s i t e i t van de
verkregen DNA oplossing. T u s s e n bestraling en isolatie van het DNA bleven de bacteriën in het voedingsmedium op 30 C. De viscositeit van de
DNA oplossing, bij constante concentratie, bleek toe te nemen met de tijd
die was verstreken tussen bestraling e n ' i s o l e r i n g van het DNA. Dat wil
zeggen dat het gemiddelde molecuulgewicht toenam en dus het aantal dubbelstrengbreuken afnam met de tijd na bestraling.
Hoewel de methode voor de meting van het aantal dubbelstrengbreuken
in het DNA van bacteriën reeds zeer moeilijk is en in verschillende opzichten aan kritiek kan worden onderworpen, beweerden Alexander, L e t t en
Dean (1965) met dezelfde methode aangetoond te hebben, dat in zoogdiercellen het aantal dubbelstrengbreuken in DNA per eenheid van dosis en per
eenheid van molecuulgewicht van dezelfde orde van grootte is a l s in bacteriën. De DNA moleculen in zoogdiercellen zijn echter zo groot dat het aanbrengen van breuken bij de isolatie niet kan worden vermeden. Bovendien
kunnen storende invloeden van aan zoogdiercel DNA gebonden b a s i s c h e
eiwitten (bistenen) moeilijk worden uitgesloten.
Veel eenvoudiger zijn experimenten met bacteriële virussen (bacteriofagen) te interpreteren. Deze organismen bestaan uit een opgerolde DNA
keten omgeven door een eiwithuid. Daar het DNA betrekkelijk geringe afmetingen heeft, kan het worden geïsoleerd zonder dat ten gevolge van hydrodynamische schuifspanningen breuken worden aangebracht. Het eiwit
kan bovendien gemakkelijker van het DNA worden gescheiden dan in DNA
preparaten van hogere organismen.
14
Bij bestraling van bacteriofaagsuspensies dient er wel rekening mee te
worden gehouden dat DNA schade niet de enige oorzaak van de dood van
het organisme behoeft te zijn. Een gedeelte van de inactivering kan namelijk een gevolg zijn van beschadiging van het adsorptieeiwit van de bacteriofaag (Watson, 1950, 1952), waardoor de faag het vermogen verliest zijn
gastheer te infecteren. Zo vond Watson dat bij bestraling in buffer overwegend beschadiging van het faageiwit optreedt. Zelfs bij bestraling in "voedingsbouillon" (een medium dat veel wordt gebruikt om de reactie van in
het water gevormde vrije radicalen met de eiwitmantel s t e r k t e verminderen)
bleek eiwitschade nog een bijdrage van 30% tot de inactivering te geven.
Daar het DNA van een faag geheel door eiwit wordt omsloten, ligt het
voor de hand te veronderstellen dat het DNA weinig invloed ondervindt van
vrije radicalen die buiten de faag worden gevormd. Alleen stralingsprodukten van water die binnen de faag ontstaan, zullen dan tot beschadiging van
het DNA kunnen bijdragen.
Freifelder (1965, 1966a) concludeerde uit zijn experimenten dat voor de
bacteriofagen T7 en B3 het aantal letale treffers per deeltje overeenkwam
met het a a n t a l dubbelstrengbreuken per DNA molecuul.Enkelstrengbreuken,
waarvan het aantal een orde van grootte hoger was dan het aantal dubbelstrengbreuken, zouden ook hier voor het overgrote deel niet letaal zijn.
Volgens Freifelder (1966b) spelen enkelstrengbreuken wel een belangrijke
rol bij de inactivering van de zeer stralingsgevoelige bacteriofaag o.
Volgens Summers en Szybalski (1967) zou ook de bacteriofaag 0 2 9 bij
bestraling in buffer voornamelijk geïnactiveerd worden door het ontstaan
van dubbelstrengbreuken. Door Luthjens, Roos en Blok (1966) werd echter
door middel van viscositeitsmetingen gevonden, dat bij bestraling van de
bacteriofaag T 4 in fosfaat buffer de eiwithuid zo zwaar wordt beschadigd
door stralingsprodukten uit de buffer, dat het DNA uit de faag vrijkomt.
Dewey en Stein (1968) vonden hiervoor eveneens aanwijzingen bij de reactie van H-atomen met de bacteriofaag T 7 . Het grote aantal dubbelstrengbreuken per 100 eV in het DNA gedissipeerde energie (zie voor dit begrip
hoofdstuk VI), dat uit de resultaten van Summers en Szybalski kan worden
berekend, is daarom wellicht een gevolg van de reactie van vrije radicalen
met DNA, dat uit de eiwitmantal van reeds geïnactiveerde fagen naar buiten
is gekomen (zie tabel II.1).
In tabel II.1 is de produktie van enkel- en dubbelstrengbreuken weergegeven die werd berekend uit de resultaten van enkele, deels reeds genoemde onderzoekers. Hoewel niet in alle gevallen uit de experimentele gegevens een even nauwkeurige waarde kon worden berekend, bleken deze
waarden voor Jiet aantal enkelstrengbreuken per 100 eV in het DNA afgegeven stralingsenergie, op een uitzondering na, t u s s e n 0,7 en 2 te l i g g e n .
15
Tabel n . 1
De produktie van breuken door gamma- en röntgenstraling
Bestralingscondities
Organisme
Aantal
es-breuken
per 100 eV*
Aantal
ds-breuken
per 100 eV*
Faag
(1)
N2
1,9 - 2,9
0,19
Faag
(2)
lucht
2,0
0,21
E.coli
(3)
lucht
0,3
M.radiodurans
(4)
N2
-
Lymfoblasten
(5)
«2
1,4
-
N2
0,7
-
»
0,20
Faag
(6)
lucht
-
9,6
E.coli
(7)
«2
1,1
-
Menselijke
cellen
(8)
lucht
0,8
-
(1)
(2)
(3)
(4)
Freifelder, 1965
Freifelder, 1966a
McGrath en Williams, 1966
Dean, Feldschreiber en Lett, 1966
(5) Lett, Caldwell, Dean en
Alexander, 1967
(6) Summers en Szybalski, 1967
(7) Freifelder; 1968
(8) Lohman, 1968
* Aantal breuken per 100 eV in het DNA afgegeven stralingsenergie (zie voor dit
begrip hoofdstuk VI).
3 . Modificatie van de stralingsschade door zuurstof en sulfhydrylverbindingen
Reeds in 1933 toonden Crabtree en Cramer aan dat bij bestraling van
tumorcellen de gevoeligheid wordtverhoogd door de aanwezigheid van zuurstof tijdens bestraling.Nadien i s dit verschijnsel door andere onderzoekers
bevestigd (onder andere door Deschner en Gray, 1959) en is de verhoging
van de stralingsgevoeligheid ook bij andere cellen waargenomen (onder andere door Hollaender, Stapleton en Martin (1951) bij bestraling van E . c o l i ) .
16
• Ook op de produktie van breuken blijkt zuurstof van invloed te zijn. Zo
vermelden L e t t , Caldwell, Dean en Alexander (1967) dat het aantal enkelstrengbreuken in het DNA van lymfoblasten (zie tabel II.1) en in dat van
M.radiodurans ongeveer twee- tot driemaal zo groot was na bestraling onder
zuurstof a l s na bestraling onder stikstof. Volgens deze auteurs heeft zuurstof echter geen invloed op de produktie van dubbelstrengbreuken, althans
niet bij bestraling van zalmsperma DNA in droge toestand (bepaald met behulp van viscositeitsmetingen). Hieruit zou men moeten concluderen dat in
ieder geval in a a n w e z i ^ e i d van zuurstof naast dubbelstrengbreuken ook
andere soorten schade zoals bijvoorbeeld enkelstrengbreuken of b a s e s c h a de de dood van de cel tot gevolg kunnen hebben en dat deze schade door
de aanwezigheid van zuurstof wel wordt vergroot. Freifelder (1965) vond
bij bestraling van de bacteriofaag T7 evenmin verhoging van het aantal
dubbelstrengbreuken door zuurstof.
In tegenstelling tot cellen bleken bacteriofagen niet door zuurstof gesensibiliseerd te worden (Hewitt en Read, 1950; Ephrussi-Taylor en L a t a r jet, 1955). Onder bepaalde omstandigheden bleek zuurstof zelfs in geringe
mate te beschermen (Howard-Flanders, Levin en Theriot, 1963). HowardFlanders (1960) vond tevens dat de bacteriofaag T2 in afwezigheid van
zuurstof in grote mate wordt beschermd tegen straling door toevoeging van
thioglycol aan het medium. In aanwezigheid van zuurstof was deze bescherming veel geringer. Howard-Flanders en medewerkers stelden een hypothese op voor de beschermende werking van SH-verbindingen en de s e n sibiliserende werking van zuurstof in aanwezigheid van zulke verbindingen,
die in hoofdlijnen a l s volgt is weer te geven. Stelt men een DNA molecuul
voor door DH, waarbij in het midden wordt gelaten welk H-atoom in DNA
hierin wordt aangeduid, dan zou door bestraling onder andere een DNAradicaal D' ontstaan, dat de volgende secundaire r e a c t i e s kan ondergaan:
a) D • + XSH - DH + XS •
b) D • + Og
- DO^ - inactief produkt
c) D •
-• inactief produkt .
In afwezigheid van zowel zuurstof a l s SH-verbindingen zou dan inactivering
optreden (c). In afwezigheid van zuurstof, doch in aanwezigheid van XSH
treedt herstel van het DNA op door overdracht van een H-atoom (a). Zuurstof kan dit herstel geheel of gedeeltelijk voorkomen door competitie met
XSH (b).
Volgens Howard-Flanders en medewerkers zou ongeveer 50% van de aan
het DNA van de bacteriofaag T2 toegebrachte schade in afwezigheid van
zuurstof door XSH hersteld kunnen worden. Door de grote snelheid van de
reactie D " + Og is reeds een lage zuurstofconcentratie voldoende om het
h e r s t e l door XSH te voorkomen.
17
Het verschil in het effect van zuurstof op de stralingsgevoeligheid van
cellen enerzijds en die van bacteriofagen anderzijds, zou volgens HowardFlanders en medewerkers moeten worden toegeschreven aan het feit dat
SH-verbindingen in vrije toestand wel in de cel, maar niet in de faag voorkomen. Hiermee zou dan tevens verklaard zijn waarom faag DNA, na infectie van de gastheercel, wel een normaal zuurstofeffect vertoont (HowardF l a n d e r s , Levin en Theriot, 1963).
4. De inwerking van straling op vrij DNA
Zoals reeds in het voorgaande werd aangestipt, onderscheidt men de
directe en de indirecte werking van straling op een molecuul. Onder directe
werking verstaat men de vorming van primaire ionisaties in het molecuul en
onder indirecte werking de beschadiging van het molecuul door in het medium gevormde stralingsprodukten.
De directe werking
Een goede uiteenzetting over het principe van de directe werking is gegeven door Hutchinson en Pollard (1961). De meest waarschijnlijke waarde
voor de energie die per primaire ionisatie door een s n e l elektron wordt afgegeven, is ongeveer 20 k 30 eV. Ook kunnen hoge waarden voorkomen; de
waarschijnlijkheid dat deze voorkomen is echter omgekeerd evenredig met
het kwadraat van de afgegeven energie. De gemiddelde waarde voor de energie-overdracht per primaire ionisatie wordt in de literatuur geschat op 70 a
100 eV. Bij zulk een primaire ionisatie ontstaat een groepje van in het a l gemeen 1 à 3 ionenparen. De afmeting van zo'n groepje bedraagt s l e c h t s
enkele nm. De afstand tussen twee van zulke groepjes is (voor y-straling)
in het algemeen veel groter dan de afmetingen van het " t a r g e t " en van de
groepjes zelf. Over het mechanisme van de vorming van deze groepjes en
over de chemische reacties van de hierin ontstane produkten met biologisch
belangrijke moleculen, is weinig bekend.
De eenvoudigste manier om DNA uitsluitend aan de directe werking van
straling bloot te s t e l l e n , is het DNA te bestralen in droge toestand. Baker,
Ormerod,Dean en Alexander (1966) toonden zo met elektronspin resonantiemetingen aan dat zuurstof na bestraling van gevriesdroogde bacteriecellen
{E.coli B/r) een versnelde afname van het aantal primair gevormde radicalen tot gevolg had, door de omzetting van deze radicalen in peroxy-radicalen.Milvy en Pullman (1968) vonden dat in aanwezigheid van SH-verbindingen de primair in h e t DNA gevormde ongepaarde elektronen op de SH-verbinding kunnen worden overgedragen. Dit zou in overeenstemming zijn met
het door Howard-Flanders en medewerkers (1963) voorgestelde herstel door
SH-verbindingen.
Behalve elektronspin resonantiemetingen zijn ook sedimentatie-experi18
meuten uitgevoerd met opgelost DNA dat in droge toestand was bestraald
(Hagen en Wellstein, 1965). Uit het verloop van de grenslaag bij s n e l h e i d s sedimentatie in een analytische ultracentrifuge werd het aantalgemiddelde
en het gewichtsgemiddelde molecuulgewicht bepaald. Hieruit volgde dan
het aantal breuken dat door straling was aangebracht. Hagen en Wellstein
vonden dat in aanwezigheid van zuurstof vrij veel " c r o s s l i n k s " werden
gevormd en dat de produktie van enkelstrengbreuken onder zuurstof belangrijk hoger was dan in vacuüm. Het verschil in het aantal dubbelstrengbreuken na bestraling in zuurstof en dat na bestraling in vacuüm was veel
geringer. De uitkomsten van deze auteurs dienen echter met enige terughoudendheid te worden beschouwd, omdat de invloed van concentratieeffecten op het verloop van de grenslaag voor het bestraalde DNA en het
minder heterogene onbestraalde DNA verschillend i s . Bovendien zijn er
aanwijzingen dat bij de gebruikte methode het verloop van de grenslaag
wordt beïnvloed door geringe convecties (Aten en Cohen, 1965; Triebel,
1968).
Tot de experimenten waarmee de directe werking van straling op DNA
werd onderzocht, kan men ook die van Taylor en Ginoza (1967) rekenen.
Deze onderzoekers bestraalden de dubbelstrengige vorm van het DNA van
de bacteriofaag (^X174 (RF-DNA) in tris buffer, pH 8, bij - 1 9 6 " C . Bij deze lage temperatuur is de diffusie van vrije radicalen zo gering, dat zij
weinig bijdragen tot de aantasting van DNA. In tabel II.2 is de produktie
Tabel n.2
De produktie van breuken door gamma- en röntgenstraling
Preparaat
Kalfsthymus DNA
Bestralingscondities
(1)
„
2-strengig <^X174 DNA(2)
Aantal I e s breuken
pg^ jOO eV
Aantal d s breuken
per 100 eV
0^, droog
3,4
0,16
in vacuüm, droog
0,6
0,11
lucht, bij - 1 9 6 ° C ,
(bevroren oplossing)
1,1
0,02
(1) Hagen en Wellstein, 1965
(2) Taylor en Ginoza, 1967.
19
van breuken weergegeven, die is berekend uit de resultaten van deze onderzoekers, alsmede die van Hagen en Wellstein (1965).
<^X174 RF-DNA heeft de aantrekkelijke eigenschap dat het biologisch
actief is (dat wil zeggen, het heeft het vermogen om, na penetratie in sferoplasten van een geschikte gastheercel, een nageslacht van complete bacteriofagen te vormen). Taylor en Ginoza concludeerden uit hun experimenten dat de biologische inactivering van 0X174 RF-DNA door y - s t r a l i n g ,
hoofdzakelijk wordt veroorzaakt door enkelstrengbreuken, beschadiging
van basen of andere schade omdat de produktie van dubbelstrengbreuken
veel te gering is om de biologische inactivering te verklaren. Slechts 25%
van de enkelstrengbreuken en de beschadigde basen hebben een inactivering van het DNA tot gevolg.
De indirecte werking
Aangezien bij bestralingsexperimenten met waterige oplossingen of
s u s p e n s i e s water het belangrijkste bestanddeel i s , absorbeert dit het grootste gedeelte van de stralingsenergie. Hierbij ontstaan H en OH radicalen,
het gehydrateerd elektron, e ~ , en voorts de produkten H« en H g O , . Deze
stralingsprodukten ontstaan op die plaatsen in de oplossing, waar snelle
elektronen energie aan het water overdragen. Hun concentratieverdeling is
dus aanvankelijk zeer inhomogeen. Alleen die radicalen en moleculen,die
uit de gebiedjes van hoge concentratie ontsnappen voordat recombinatie i s
opgetreden, komen in de oplossing beschikbaar voor reactie met opgeloste
moleculen. Door middel van zulke r e a c t i e s kan men de opbrengst aan beschikbare stralingsprodukten meten. Deze opbrengst pleegt men uit te drukken a l s het aantal geproduceerde radicalen of moleculen per 100 eV in de
oplossing afgegeven stralingsenergie. De grootte ervan (G) is vrijwel onafhankelijk van de concentratie van opgeloste stoffen, mits deze niet te groot
is (kleiner dan 10" k 10 M). Een overzicht van de methoden, die voor de
opbrengstbepaling worden gebruikt, is gegeven door Allen (1961).
Voor y - s t r a l i n g heeft men de volgende opbrengsten gevonden. GQ|T en
G - zijn beide ongeveer 2,3 . G g i s 0,5 a 0,6(Dainton en Watt, 1963; Hayon
en Moreau, 1965). De opbrengst aan H , en H^O, is respectievelijk 0,45 en
0,8 moleculen per 100 eV (Allen, 1961). Indien zuurstof in de oplossing
aanwezig i s , reageert dit zeer snel met e~ en H volgens de vergelijkingen
^2 + ^Iq -* ^2
en
Og + H
-Og
(k = 2 X 10^° M-1 sec-1)
+ H ^ ( k = 2 x 1 0 ^ 0 M-1 sec-1)
(de reactieconstanten zijn ontleend aan een overzichtsartikel van Baxendale, 1965). Oö werkt zwak reducerend en reageert s l e c h t s zeer langzaam
20
met DNA en eiwitten. Ook H« en H g O , reageren vrijwel niet met DNA
(Blok, Luthjens en Roos, 1967). Deze stralingsprodukten zullen daarom in
het volgende buiten beschouwing blijven.
Voor wat betreft de reactie van in water gevormde radicalen met DNA
komen de volgende vragen naar voren:
1. Wat voor beschadigingen worden door de radicalen in het DNA aangebracht.
2. Welke radicalen zijn verantwoordelijk voor deze beschadigingen.
3 . Welke beschadigingen hebben biologische gevolgen.
Door Blok en medewerkers (1967,1968) werden onderzoekingen verricht
met het enkelstrengige DNA van de bacteriofaag <^X174. Dit DNA is ringvormig en biologisch actief. Met dit laatste wordt bedoeld dat het na penetratie in sferoplasten van een geschikte gastheercel aanleiding geeft tot
de vorming van een nageslacht van complete bacteriofagen. Het molecuulgewicht van dit DNA bedraagt 1,7 x 10 (Sinsheimer, 1959) en één breuk in
de ring is voldoende om het zijn biologische activiteit te ontnemen (Fiers
en Sinsheimer, 1962).
Met dit 0X174 DNA werd aangetoond dat behalve breuken ook andere
door straling teweeggebrachte beschadigingen tot de inactivering bijdragen
(Blok, 1967). Het aantal breuken per DNA molecuul bleek na bestraling (in
aanwezigheid van lucht) namelijk slechts 20 tot 50% van het aantal letale
treffers per molecuul te bedragen. Deze bijdrage van breuken werd berekend
uit het verloop van de grenslaag in snelheidssedimentatie-experimenten in
een analytische ultracentrifuge. De oorzaak van de grote variatie is niet
bekend. Over de bijdrage van breuk onder andere omstandigheden dan onder
lucht zijn in de literatuur geen gegevens beschikbaar.
Door Blok, Luthjens en Roos (1967) kon aannemelijk worden gemaakt
dat de bovenstaande "andere s c h a d e " hoofdzakelijk schade aan de basen
moest zijn. Zij bepaalden hiertoe enerzijds de biologische inactivering van
het DNA en anderzijds de afname van de UV-absorptie van dé DNA oplossing als functie van de dosis (de afname van de UV-absO|rptie is een ruwe
maat voor base-beschadiging).
Blok en medewerkers ( 1 % 7 , 1968) onderzochten eveneens de bijdrage
van de verschillende in water gevormde radicalen tot de biologische inactivering van 0X174 DNA. Zij deden dit door het DNA te bestralen onder
verschillende, zodanig gekozen omstandigheden dat één of meer soorten
radicalen werden afgevangen of in andere omgezet. Zij vonden dat de biologische inactivering bij bestraling onder lucht een gevolg is van de inwerking van OH radicalen. Ook bij bestraling van een geconcentreerde
0X174 DNA oplossing onder stikstof bleken OH radicalen de belangrijkste
oorzaak van inactivering te zijn. Er waren echter aanwijzingen dat in afwezigheid van zuurstof, vooral in verdunde oplossingen, de reducerende
21
radicalen ( e - en H) ook tot de inactivering bijdragen. De aanwezigheid
van zuurstof verminderde dan namelijk de gevoeligheid.
Aangezien in de meeste organismen het DNA in dubbelstrengige vorm
voorkomt, verdiende het aanbeveling op analoge wijze de werking van in
water gevormde vrije radicalen op dubbelstrengig DNA te bestuderen. Bij
bestraling van dubbelstrengig DNA kunnen niet alleen op bepaalde plaatsen
breuken in één van de strengen ontstaan maar tevens hier en daar in beide
strengen tegelijk. Deze dubbelstrengbreuken kunnen op twee manieren onts t a a n . Bij lage d o s e s kunnen ze worden gevormd door reactie van beide
strengen van het DNA met één of meer radicalen, ontstaan bij één primaire
ionisatie in de buurt van het DNA. Het aantal zo gevormde breuken is evenredig met de d o s i s . Bij hoge d o s e s kunnen er dubbelstrengbreuken optreden
doordat afzonderlijk gevormde enkelstrengbreuken in de verschillende
strengen s l e c h t s door enkele basenparen gescheiden zijn. Het aantal dubbelstrengbreuken dat op deze manier ontstaat, is evenredig met het kwadraat van de d o s i s . Het laatste mechanisme overheerst bij zeer hoge doses
(Cox, Overend, P e a c o c k e en Wilson, 1958; Hagen, 1967).
Volgens Hagen (1967) worden er bij bestraling van DNA in oplossing
" c r o s s l i n k s " gevormd, zowel tussen de beide strengen a l s intermoleculair.
Hagen maakte bij zijn experimenten echter gebruik van grenslaaganalyses
in snelheidssedimentatie-experimenten. Om reeds eerder genoemde redenen
is deze methode niet zo betrouwbaar. Freifelder (1965, 1966a), die deze
methode ook gebruikte, vermeldt niets over de vorming van " c r o s s l i n k s " .
Welke radicalen verantwoordelijk zijn voor de breuken in dubbelstrengig
DNA i s in de literatuur niet beschreven. Wel zijn er aanwijzingen dat naast
OH'radicalen ook reducerende radicalen een rol s p e l e n . Door Daniels, Schol e s . Weiss en Wheeler (1957) werd gevonden dat bij bestraling van een DNA
oplossing een geringe mate van dehydrogenering van de suikergroep optreedt (G = 0,4). De overgrote meerderheid van de reducerende radicalen
zou evenwel met dubbele bindingen van de basen reageren. In afwezigheid
van zuurstof is de hoeveelheid vrijgekomen anorganisch fosfaat iets hoger
dan in aanwezigheid van zuurstof (Scholes en Weiss, 1954). Dit wijst ook
op een invloed van reducerende radicalen.
De chemische veranderingen die onder invloed van ioniserende straling
in dubbelstrengig DNA optreden, zijn door verschillende onderzoekers beschreven (Scholes, Ward en Weiss, 1960; Hems, 1960; Latarjet, Ekert en
Demerseman, 1963; Weiss, 1964). De algemene conclusie is dat in aanwezigheid van zuurstof 1 tot 2 basen worden beschadigd per 100 eV g e d i s s i peerde energie (Scholes, Ward en Weiss, 1960; Hems, 1960). Het aantal beschadigingen in de desoxyribosefosfaatketen bedraagt volgens Scholes en
medewerkers (1960) 20 tot 30% van het totale aantal door radicalen teweeggebrachte beschadigingen. Dit percentage is gebaseerd op de enzymatische
22
a n a l y s e (met het enzym fosfomono-esterase) van vrije fosfaatuiteinden.
Hems (1960) vond dat het aantal beschadigde basen (chromatografisch bepaald na hydrolyseren van het bestraalde DNA) per 100 eV in afwezigheid
van zuurstof een factor 2,5 lager w a s dan in aanwezigheid van zuurstof.
Het aantal basen dat bij bestraling vrijkomt, volgens Hems een maat voor
het aantal beschadigde desoxyribosefosfaatgroepen, was onder stikstof en
zuurstof evenwel gelijk.Dit zou erop wijzen dat bij de door Hems gebruikte
hoge s t r a l i n g s d o s e s , de produktie van breuken niet wordt beïnvloed door
zuurstof. Al de bovengenoemde experimenten werden uitgevoerd met inhomogene preparaten van dubbelstrengig kalfthymus DNA. Meer betrouwbare
resultaten zijn te verwachten bij gebruik van het DNA van virussen dat kan
worden geïsoleerd zonder dat het door hydrodynamische schuifspanningen
wordt gebroken en dat beter gezuiverd kan worden van eiwitverontreinigingen.
23
HOOFDSTUK HI
DETAILGEGEVENS OVER DE TOEGEPASTE METHODEN
1. Faag- en bacteriestammen
Bij de experimenten werden dein tabel III.1 vermelde faag- en bacteriestammen gebruikt.
Tabel ni.1
Herkomst van de faag- en bacteriestammen
Organ
Herkomst
Bacteriofaag T4B
(aangeduid als T4)
Laboratory of Molecular Biology
(Medical Research Council) Cambridge, England (Dr. S. Brenner)
Bacteriofaag T7
Laboratorium voor Microbiologi e.
Rijksuniversiteit, Utrecht
(Dr. P.G. de Haan)
Bacteriofaag 0X174
California Institute of Technology,
U.S.A. (Dr. R.L. Sinsheimer)
Escherichia coli B
University of Washington, U.S.A.
(Dr. A.H. Doermann)
Escherichia coli C
California Institute óf Technology,
U.S.A. (Dr. R.L. Sinsheimer)
Escherichia coli K12S
Institute of Genetics, University of
Köln, Germany (Dr. W. Harm)
2. Materialen
De gebruikte chemicaliën waren voor zover mogelijk pro analysi. Van
24
de minder gangbare chemicaliën volgt hieronder de herkomst en, indien dit
bekend w a s , de graad van zuiverheid.
Thioureum, p . a . , Union Chimique Belge S.A.
Guanylaat (dinatriumzout van guanosine-3'(2 )-fosforzuur met 2 moleculen
kristalwater), Calbiochem. V.S.
Cysteamine (2-mercapto-ethylamine), zuiverheid volgens opgaaf van de fabriek groter dan 98%, Fluka A.G. Buchs, S.G., Zwitserland.
Thioglycol (2-mercapto-ethanol), L . Light en C o . , Ltd., Poyle Colnbrook,
Bucks, Engeland.
K a t a l a s e , Nutritional Biochemicals Corporation, V.S.
N-ethyl-maleïnezuurimide (NEM), Th. Schuchardt, München, Duitsland.
Fenol, Merck, Duitsland, werd gedestilleerd voor gebruik.
P O P O P (2,2'-p-fenyleen-bis-(4-methyl-5-fenyloxazooI)), Merck, Duitsland.
P P O (2,5-difenyloxazooI), Merck, Duitsland.
Triton XlOO, Wegman, N.V., Amsterdam.
H g ^ P O ^ , dragervrij, The Radiochemical Centre, Amersham, Engeland.
^H-thymine, specifieke activiteit 1 m C i / / i m o l , The Radiochemical Centre,
Amersham, Engeland.
"Stralingswater" werd verkregen door destillatie van water uit een oploss i n g van 15 g KMnO^en 6 g KOH/1 in gedestilleerd water en een tweede d e s t i l l a t i e van het opgevangen water in een geheel uit Pyrex glas
opgebouwd apparaat.
3 . Bacteriofaagpreparaten
De bacteriofagen T4 en T7 werden vermenigvuldigd in E.coli B en vervolgens gezuiverd door middel van differentiële centrifugering volgens de
door Veldhuisen (1966) beschreven methode * . D e gezuiverde faag werd bewaard in SSC (0,14 M NaCl + 0,02 M Natriumcitraat, verzadigd met chloroform). De SSC voor T7 faag bevatte geen chloroform, daar door toevoeging
van chloroform inactivering van de bacteriofaag bleek op te treden. De met
H-thymine gemerkte T4 faag werd bereid door infectie vaif E.coli B thy ~,
gekweekt in minimaal medium (M-9 medium, Adams, 1959) dat bovendien
5 fJ.g ^H-thymine/ml bevatte. De met ^^P gemerkte T 4 faag werd bereiddoor
infectie van E.coli B, gekweekt in het glycerollactaat medium volgens
Hershey en Rotman (1949) waaraan bovendien was toegevoegd N a 2 H P 0 ^ . 1 2
HgO (5 mg P / l ) en 10 mCi dragervrij Hg^^pQ^pgr liter (Veldhuisen, 1966).
Zowel voor gemerkte a l s voor niet gemerkte T4 faagsuspensies bedroeg de
fractie biologisch actieve partikels na zuivering ongeveer 60%. Dit werd
* Gaarne betuig ik mijn dank aan Dr. C. Veldhuisen voor het kweken en zuiveren
van de bacteriofaag T4 en aan Mej. W.S.D. Verhei] voor de bereiding van gezuiverde preparaten van de bacteriofaag T7.
25
bepaald door direct na het kweken en zuiveren de biologische activiteit en
de UV absorptie in de preparaten te vergelijken.
Gezuiverde preparaten van de bacteriofaag 0X174 werden verkregen
volgens de methode van Sinsheimer (1959) met de variatie van Eigner en
medewerkers (1963). Als gastheer werd E . c o l i C gebruikt. Na de l a a t s t e
stap in de zuiveringsprocedure, die b e s t a a t uit een evenwichtssedimentatie
in een RbCl gradiënt, werd de s u s p e n s i e gedialyseerd tegen HMP (pH ongeveer 7).
4. Faagtitratie
Het titreren van fagen geschiedde volgens de gebruikelijke agarlaagmethode (Adams, 1959). Voor T4 en T7 bevatte de bodemagar: 10 g Difco
bacto-agar, 10 g Difco bacto-trypton, 8 g NaCl, 2 g Natriumcitraat en 1 g
glucose per liter gedestilleerd water (pH 6,8 tot 7,0). De topagar had dezelfde samenstelling doch bevatte s l e c h t s de helft van de hoeveelheid
agar. Voor 0X174 faag bevatte de bodemagar 10 g Difco bacto-agar, 10 g
Difco bacto-trypton, 5 g Difco gistextract en 12 g glucose per liter g e d e s tilleerd water. De topagar bevatte 7 g Difco bacto-agar, 3 g Difco v l e e s extract en.5 g Difco bacto-pepton per liter.
E.coli B, de indicator-bacterie voor T 4 en T7,werd bij 37 C gekweekt
in 3XD medium volgens Brenner (persoonlijke mededeling aan Dr. J . H . van
de P o l zoals beschreven door Veldhuisen, 1966). E.coli C, de indicatorbacterie voor 0X174 werd bij 37 C gekweekt in 3XD medium volgens
Sinsheimer (1959). De zuurstoftoevoer werd gestimuleerd door schudden.
Na uitzaaien werden T4 en 0X174 gedurende 16 uur geïncubeerd bij
37 C, T7 gedurende 16 uur bij kamertemperatuur.
5. DNA isolatie
Bij de isolatie van DNA uit de bacteriofaag T4 werd gebruik gemaakt
van de door Aten (1965) gewijzigde fenolextractiemethode van Mandell en
Hershey (1960). Na de extractie werd de DNA oplossing gedialyseerd tegen
SSC (DNA concentratie ongeveer 250 / i g / m l ) .
Het DNA van de bacteriofaag 0X174 werd geïsoleerd volgens de fenolextractiemethode van Sinsheimer (1959).
6. Bepaling van de biologische activiteit van DNA met sferoplasten
De bepaling van de biologische activiteit van 0X174 DNA met sferoplasten van E.coli K12S, geschiedde geheel overeenkomstig de procedure
beschreven door Guthrie en Sinsheimer (1963) en Blok, Luthjens en Roos
(1967).
26
7. Denaturering van T4 DNA
De a l k a l i s c h e denaturering van T4 DNA werd a l s volgt uitgevoerd: aan
0,30 ml van een DNA oplossing in SSC (10 tot 50 /ig/ml) werd 0,50ml SCOH
(0,14 M NaOH + 0,02 M natriumcitraat) toegevoegd. De oplossingen werden
goed gemengd door voorzichtig te schudden. Na 10 minuten werd in stappen
geneutraliseerd door telkens 0,01 ml I N H C l in SSC toe te voegen. T u s s e n
de toevoegingen werd goed gemengd.
8. Het breken van DNA moleculen door middel van hydrodynamische schuifspanningen
Gebroken DNA moleculen werden verkregen door een DNA oplossing
met een bepaalde snelheid door een capillair te persen op de manier z o a l s
door Aten en Cohen (1965) is beschreven.
9. Temperatuur-absorptie curven
Voor het opnemen van temperatuur-absorptie curven werd gebruik gemaakt van een Zeiss-spectrofotometer. De temperatuur van de cuvettenhouder werd met tussenpozen van 15 minuten 5 verhoogd. De opwarmtijd bedroeg 1 minuut per C. Nauwkeurige smeltcurven waren-niet noodzakelijk
aangezien alleen het al of niet optreden van een smeltpunt en de grootte
van h e t totale hyperchrome effect van belang w a s .
10. Snelheidssedimentatie in de analytische ultracentrifuge
Snelheidssedimentaties volgens de methode van Svedberg (1940) werden
uitgevoerd in een Phywé of in een Spinco model E analytische ultracentrifuge.
1 1 . Evenwichtss'edimentatie i n een dichtheidsgradiënt
Evenwichtssedimentaties in een dichtheidsgradiënt van CsCl of C s n S O .
werden uitgevoerd in een Spinco model E ultracentrifuge volgens de methode van Meselson, Stahl en Vinograd (1957).
12. Bestraling van DNA en bacteriofaag met
Co gamma straling
Ongeveer 20 uur vóór de bestraling werd 0,20 ml van een T4 of T7 faags u s p e n s i e toegevoegd aan 1,80 ml SSC waarin de voor het experiment vere i s t e stoffen waren opgelost. De toevoeging van de faag had geen noemenswaardige invloed op de pH van de SSC oplossing die van tevoren met 1 N
NaOH of 1 N HCl op 8,0 was gebracht. De s u s p e n s i e s in SSC werden bestraald in glazen buisjes (100 x 10 mm). Het preparaat bevond zich hierbij
in het midden van de bestralingskamer van een Gamma cel 100 (Atomic
Energy of Canada Ltd.) die
Co a l s gammabron bevatte. De d o s e r i n g s snelheid werd bepaald met een ferrosulfaat dosimeter (zie Allen, 1961) en
27
bedroeg ongeveer 4,5 krd/minuut. Door het preparaat minder diep in de bestralingskamer te laten zakken kon ook worden bestraald met een doseringssnelheid van ongeveer 0,36 krd/minuut.
Vóór en onmiddellijk na bestraling werd 0,01 ml van een oplossing van
k a t a l a s e in water (1 mg/ml) toegevoegd ter vermijding van secundaire rea c t i e s van H g O , gedurende de bestraling en tijdens de DNA isolatie na bestraling.
Bestralingsbuisjes werden afgesloten met een rubberstop, voorzien van
glazen in- en uitlaat capillairen waardoor gas kon worden geleid. Het uiteinde van de inlaat capillair mondde uit in de oplossing. Het zuurstofgehalte in het gas werd, indien nodig, na p a s s e r e n van het bestralingsbuisje
door middel van een Hersch cel gemeten (Hersch, 1960). Gassen die zuurstofvrij moesten zijn, werden eerst door een met waterstof verzadigde katalysator (BTS, Bayerische Aniline und Soda Fabriken, Basel) geleid, waardoor Og in HnO werd omgezet. In.experimenten waarbij werd bestraald onder lucht, werd geen gas door de oplossing geleid.
Onmiddellijk na bestraling werd 0,10 ml van de faagsuspensie verdund
in tryptonbouillon en vervolgens uitgezaaid op indicatorbacteriën om de
overleving te bepalen. Breukmetingen werden eveneens zo spoedig mogelijk
na bestraling uitgevoerd teneinde eventuele na-effecten tot een minimum te
beperken.
Bij bestraling van T4 DNA, dat met H-thymine was gemerkt, werd uitgegaan van een T 4 faagsuspensie die tegen HMP was gedialyseerd. De geconcentreerde DNA oplossing in HMP, die na fenolextractie werd verkregen,
werd verdund met 0,01 M fosfaat in stralingswater (pH 7). Het glaswerk dat
bij en na de verdunning werd gebruikt, was gereinigd in een mengsel van
3 N HCl en alkohol (1:1) en daarna achtereenvolgens 2x uitgekookt met
glas-gedestilleerd water en l x met stralingswater. Tenslotte werd het op
150 C verhit. De te bestralen oplossing (0,5 ml) bevatte ongeveer 60 /i.gT4
DNA/ml.
Bij bestraling van oplossingen van T4 DNA werd alleen vóór de be-straling gas doorgeleid, aangezien het doorleiden van gas door een bestraalde
oplossing aanleiding bleek te geven tot breuken. Bij onbestraalde T 4 DNA
oplossingen was dit effect te verwaarlozen. In hoofdstuk VII wordt hier nader op ingegaan.
1 3 . Bepaling van de SH-concentratie
De concentratie van de vrije SH-groepen in oplossingen van SH-verbindingen werd bepaald volgens de methode van Alexander (1958). Hierbij
wordt de afname van de absorptie (bij 300 nm) van een NEM oplossing gemeten nadat een bepaalde hoeveelheid van de betreffende oplossing is toegevoegd.
28
14. Viscosimetrie
De v i s c o s i t e i t van bestraalde f a a g s u s p e n s i e s werd gemeten met een
kopie van de door Zimm en Crothers (1962) beschreven viscosimeter.
15. Sedimentatie in een sucrosegradiënt
Lineaire dichtheidsgradiënten in sucrose-oplossingen werden gemaakt
bij kamertemperatuur met een apparaat dat in het Medisch Biologisch Laboratorium i s geconstrueerd (Van der Schans, Aten, Knijnenburg en Meijer,
1968) en dat op hetzelfde principe berust a l s het apparaat van De Duve,
Berthet en Beaufay (1959). Hierbij worden twee injectiespuiten, gevuld met
respectievelijk SSC en een oplossing van sucrose (25 gewichtsprocenten)
in SSC, zodanig leeggedrukt in een kleine mengkamer, dat de toevoer van de
s u c r o s e - o p l o s s i n g lineair toeneemt met de tijd en die van de buffer lineair
afneemt met de tijd. Vanuit de mengkamer, wordt de oplossing onderin een
centrifugebuis geleid. In de op deze wijze verkregen sucrosegradiënten
blijkt de dichtheid in de buis vrijwel lineair af te nemen met de hoogte. Dit
is niet het geval met de concentratie. Meestal werden gradiënten van 5 tot
23 gewichtsprocenten sucrose in SSC gebruikt, in buizen behorende bij een
SW 25.1 rotor van een Spinco model L2 of L50 ultracentrifuge. De gradiënt
werd gecontroleerd door na fractionering met behulp van een Abbe refractometer de brekingsindex van de fracties te meten. Vóór centrifugering werden
de gradiënten tot 5 ° C gekoeld. Deze temperatuur werd gedurende de centrifugering gehandhaafd.
Van de te onderzoeken DNA preparaten werd 0,1 tot 1,0 ml op een gradiënt gebracht. Na centrifugering werd de gradiënt gefractioneerd. Hiertoe
werd door de bodem van de buis een injectienaald geprikt, waardoor vervolgens langzaam tetrachloorkoolstof onderin de buis werd geleid.Bovenop
de centrifugebuis' werd een met het nauwe uiteinde naar boven gekeerde conische glazen buis geplaatst. In tegenstelling tot het apparaat van Brakke
(1963) paste in onze opstellingde conische buis om de centrifugebuis h e e n .
Via deze conische buis werd de inhoud van de centrifugebuis door een doorstroomcuvet (Van der Schans, Aten, Knijnenburg en Meijer, 1968) geleid d i e ,
voor het meten van de extinctie (260 nm), in een Beekman DK2 spectrofotometer was geplaatst.
Bij proeven met radioactief DNA werden fracties van 15 druppels verzameld voor radioactiviteitsmetingen.
P-activiteit werd met een eindvenster G.M.-buis gemeten. Voor H-bepalingen werd aan fracties van 0,50 ml
12,5 ml toegevoegd van een mengsel van 5 volumedelen tolueen waarin per
liter 0,01 g P O P O P en 6 g P P O was opgelost en e'én deel Triton XlOO
(gemodificeerde methode van Patterson en Greene, 1965). Triton XlOO werd
voor het gebruik niet gezuiverd. De ^H activiteit werd gemeten in een Nuclear Chicago liquid scintillation counter. De telefficiëntie bij O ° C , d i e
29
uit de telverhouding van twee kanalen of door middel van een externe standaard werd bepaald, bedroeg voor alle fracties 27 + 2%.
16. De bepaling van het aantal dubbelstrengbreuken
De bepaling van het aantal dubbelstrengbreuken in het DNA in de faag
werd uitgevoerd met T 4 die met H-thymine w a s gemerkt. 0,20 ml van de
faagsuspensie (5 x 10
partikels/ml) werd gevoegd bij 0,40 ml met water
verzadigde fenol in een cultuurbuis. Dit werd goed met elkaar in contact
gebracht door de buis om zijn lengte-as te draaien. Heftig schudden veroorzaakt breuken door hydrodynamische schuifspanningen. Na 2 minuten
werd de waterfase verdund met 0,30 ml water en op een sucrosegradiënt
gebracht.
Voor de bepaling van het aantal dubbelstrengbreuken in T4 DNA dat in
oplossing was bestraald, werd de oplossing een factor 5 verdund. Hiervan
werd ongeveer 0,30 ml op een sucrosegradiënt gebracht onder vermijding
van hydrodynamische schuifspanningen.
Bacteriofaag T7 was niet radioactief gemerkt en werd door middel van
absorptiemetingen geanalyseerd. Na bestraling werden UV absorberende
stoffen verwijderd door dialyse (guanylaat en cysteamine) of door 2x met
fenol en 4x met ether te extraheren (thioglycol en zijn bestralingsprodukten).
Thioglycol absorbeert s l e c h t s weinig bij 260 nm, maar de stralingsprodukten ervan absorberen sterk. Het verdere verloop van de procedure is beschreven in paragraaf 15, "Sedimentatie in een sucrosegradiënt". De berekeningen en de calibrering van de sucrosegradiënt worden respectievelijk
in de hoofdstukken IV en V besproken.
17. De bepaling van het aantal enkelstrengbreuken
Voor de bepaling van het aantal enkelstrengbreuken in het DNA in de
faag werd 0,20 ml van een faagsuspensie (ongeveer 5 x 10
partikels/ml
indien de fracties van de sucrosegradiënt op hun radioactiviteit werden onderzocht en ongeveer 5 x 10
p a r t i k e l s / m l bij gebruik van de lichtabsorptiemethode) met 0,60 ml water verdund. Vervolgens werd 0,38 ml SCOH toegevoegd in stappen van ongeveer 0,10 ml. Na 10 minuten staan bij kamertemperatuur werd de oplossing geneutraliseerd met 1 N HCl in SSC in s t a p pen van 0,01 ml. T u s s e n de stappen door werd goed gemengd. 0,50 ml van
de geneutraliseerde oplossing werd op een sucrosegradiënt gebracht.
Voor de bepaling van de verdeling in de gradiënt werden zowel a b s o r p
tiemetingen bij 260 nm a l s radioactiviteitsmetingen toegepast. De DNA
concentratie, die voor betrouwbare absorbtiemetingen is v e r e i s t , gaf geen
verstoring van de vorm van de piek van T4- of T7 DNA a l s het DNA was
gedenatureerd (zoals in hoofdstuk V zal blijken, is dit bij dubbelstrengig
DNA wel het geval). Wanneer de lichtabsorptiemethode werd gebruikt in
30
experimenten waarin stoffen waren toegevoegd die bij 260 nm absorberen,
was dialyse van de preparaten noodzakelijk. In een aantal gevallen werd
aangetoond dat dialyse gevolgd door meting van de absorptie hetzelfde resultaat gaf als meting van de radioactiviteit.
Voor de verdere procedure zij weer verwezen naar paragraaf 15, "Sedimentatie in een sucrosegradiënt" en de hoofdstukken IV en V.
31
HOOFDSTUK IV
BEREKENING VAN MOLECUULGEWICHTSVERDELINGEN
1. Inleiding
In de volgende paragrafen worden formules afgeleid voor de molecuulgewichtsverdeling en de verdeling in een sucrosegradiënt van willekeurig
gebroken DNA. Verder wordt een formule afgeleid die het verband geeft
t u s s e n het aantal dubbelstrengbreuken en het aantal enkelstrengbreuken.
2 . De molecuulgewichtsverdeling van DNA en de verdeling in een s u c r o s e gradiënt na het willekeurig aanbrengen van breuken
Montroll en Simha (1940) hebben de molecuulgewichtsverdeling berekend van brokstukken die ontstaan a l s een monodisperse populatie van onvertakte polymeermoleculen op willekeurige wijze wordt afgebroken. F r e i felder en Davison (1962) pasten deze berekening toe op DNA dat door midd e l v a n ultrasonore trillingen was gebroken.De door laatstgenoemde auteurs
gebruikte formule geldt voor een integrale verdeling. Blok (1965) leidde op
analoge wijze een formule af die direct van t o e p a s s i n g is op de verdeling
van DNA brokstukken in een sucrosegradiënt. Deze afleiding is a l s volgt:
Veronderstel dat M het molecuulgewicht is van het homogene DNA
waarvan wordt uitgegaan en dat op willekeurige plaatsen gemiddeld p breuken per molecuul worden aangebracht. Een brokstuk met een bepaald molecuulgewicht kan op twee manieren worden gevormd. Ten e e r s t e kan een
stuk van één van beide einden van het molecuul worden afgebroken. De
waarschijnlijkheid dat een dergelijk stuk een molecuulgewicht heeft t u s s e n
m en m + dm, is
"1 Hm
2.e-PM.Pj^
(1)
m
De factor e'^ï^ vertegenwoordigt de kans dat een stuk van het molecuul met
molecuulgewicht m geen breuk gevat, p ^ is de kans dat er een breuk optreedt in een stuk dm. XivH^ vr twee uiteinden zijn, dient het produkt van
deze kansen met een factor 2 te worden vermenigvuldigd.
32
Een brokstuk met een bepaald molecuulgewicht kan echter ook ontstaan
t u s s e n twee breuken in het molecuul. De kans dat zo een brokstuk o n t s t a a t
door breuken in de stukjes dm en d/U. i s :
waarbij dm en d/U. de begrenzingen zijn van de uiteinden van het stuk met
molecuulgewicht m. De kans moet nu over jJ, worden geïntegreerd van /^ = O
totfJ, = M - m, waarbij /J. het stuk is dat wordt begrensd door ifJ. en één uiteinde van het molecuul. Dit geeft
P^.e-PÏ ƒ pla
(3)
O
De totale waarschijnlijkheid P(m)dm dat bij gemiddeld p breuken in het
oorspronkelijke molecuul een brokstuk met een molecuulgewicht t u s s e n m
en m + dm ontstaat,wordt gegeven door de som van bovengenoemde k a n s e n .
P(m)dm = P ^ { 2 + (1 -•|)p}e-PM
(4)
Hierin zijn de ongebroken moleculen niet begrepen. De extinctie van een
oplossing van DNA moleculen is evenredig met het aantal moleculen per
volume-eenheid en met het molecuulgewicht van de moleculen. Vindt men nu
in een sucrosegradiënt na sedimentatie een extinctie E(s) op de p l a a t s in
de buis, die overeenkomt met een sedimentatiecoëfficiënt s, dan i s , indien
het aantal moleculen met sedimentatiecoëfficiënt tussen s en s + ds geschreven wordt a l s P ( s ) d s , de gewichtshoeveelheid DNA tussen s en s + ds
gelijk aan mP(s)ds en tevens gelijk aan C . E ( s ) d s , waarin C een evenredigheidsfactor is en m het molecuulgewicht corresponderend met de sedimentatiecoëfficiënt s. Nu is P(s)ds =P(m)dm, dus C.E(s) = i s / i 2 - In<i>en wordt
aangenomen dat bij sedimentatie van DNA in een sucrosegradiënt het verband tussen sedimentatiecoëfficiënten molecuulgewicht wordt gegeven door
de relatie s = k m ° , waarin a en k constanten zijn, dan volgt hieruit dat
C.E(s) = ^ { 2 + (1 - ; ) p } e - P i . i n ^
(5)
33
Als p bekend i s , kan E(s) worden berekend a l s functie van s. Het maximum
van E(s) ligt bij een s-waarde die voldoet aan de relatie
(tM - ü - P + 5 - a
\SJ
- M-
2P
1_ i/~
~ 2B
f^
2s
+ (2a + 2)p + (9 - 2a + a^)
(6)
waarin S de sedimentatiecoëfficiënt van ongebroken DNA i s . De waarde
van p kan dus worden berekend indien -f bekend i s .
Als p zo klein is dat er nog een meetbare hoeveelheid ongebroken moleculen in het preparaat aanwezig i s , dan kan p ook uit de gewichtsfractie
ongebroken moleculen e"P worden berekend. In hoofdstuk V zal verder op
de bepaling van-i- en e"P worden ingegaan,
o
Kort geleden hebben Rupp en Howard-Flanders (1968) een formule gepubliceerd die eveneens gebruikt kan worden om de molecuulgewichtsverdeling te bepalen met behulp van sedimentatie in een s u c r o s e g r a d i ë n t .
Deze formule is echter niet exact en moet a l s een benadering worden beschouwd. De waarden voor het aantal breuken die ermee worden verkregen
zijn 15 tot 40% te hoog.
3 . Het aantal dubbelstrengbreuken a l s functie van het aantal enkelstrengbreuken
Zoals in hoofdstuk II werd uiteengezet, kan een dubbelstrengbreuk het
gevolg zijn van gelijktijdige breuk van beide DNA strengen op tegenover
elkaar liggende plaatsen, doch ook van twee successievelijk teweeggebrachte enkelstrengbreuken in beide strengen indien hun onderlinge afstand
klein genoeg i s . Indien deze kleinste afstand overeenkomt met een molecuulgewicht a, kan men a l s volgt een uitdrukking vinden voor het aantal
dubbelstrengbreuken ten gevolge van onafhankelijke enkelstrengbreuken.
De kans op een breuk in een van de strengen in een stuk corresponderend met één molecuulgewicht dm, is gelijk aan-Rdm. Hierin is p het gemiddelde aantal enkelstrengbreuken per molecuul, n e t aantal enkelstrengbreuken in de andere streng in een bepaald gedeelte overeenkomend met
een molecuulgewicht a, dat aan één kant wordt begrensd door het stuk dm,
is gemiddeld 7 - n . p . De kans dat het stuk a niet zulk een tweede e n k e l strengbreuk bevat, is dus e" 2M^ en de fractie van dejnoleculen waarin deze stukken wel een dergelijke breuk bevatten l - e " 2 ^ ' ^ . De kans o p e e n
dubbelstrengbreuk in een bepaald gedeelte van het molecuul is d u s :
£.(1
- e'iP)
M
34
(7)
en de kans p ^ ^ op een dubbelstrengbreuk op een willekeurige plaats in het
molecuul wordt verkregen door integratie over m van m = O tot m =M — a:
Pds = ƒ
(1 - e"âSiP)£dm = ^ . Pd - e"2JP)
(8)
Bij benadering is dit gelijk aan:
Pds = P{1 - (1 - IjP)} = |ip2
(9)
Z o a l s is te verwachten, volgt uit deze formule dat bij een klein aantal enkelstrengbreuken ( n is klein) vrijwel geen dubbelstrengbreuken aanwezig
zijn. Houdt men nu ook rekening met r e c h t s t r e e k s e dubbelstrengbreuken,
dan i s het aantal dubbelstrengbreuken per molecuulgewicht M te schrijven
als
^ds = Is -P^ + c-P
(10)
waarin c een constante i s .
35
HOOFDSTUK V
BEPALING VAN DE MOLECUULGEWICHTSVERDEUNG VAN DNA
DOOR MIDDEL VAN SEDIMENTATIE IN EEN SUCROSEGRADIËNT
1. Inleiding
Dé gemiddelde sedimentatiecoëfficiênt van een DNA preparaat kan betrekkelijk nauwkeurig worden bepaald met behulp van grenslaagsedimentatie of van bandsedimentatie (Vinograd, Bruner, Kent en Weigle, 1963) in
een analytische ultracentrifuge, vooropgesteld dat de molecuulgewichten
binnen redelijk nauwe grenzen liggen. De verdeling van sedimentatiecoëfficiënten van een polydispers preparaat kan in principe uit de vorm van de
grenslaag worden berekend. Tegen deze methode zijn echter verscheidene
bezwaren aan te voeren. Zo kan de vorm van de grenslaag worden beïnvloed
door de afhankelijkheid van de sedimentatiecoëfficiënt van de concentratie
(Eigner, Schildkraut en Doty, 1962) en door nog niet opgehelderde sedimentatie-anomalieën (Aten en Cohen, 1965; Triebel, 1968). Verder wordt de
nauwkeurigheid van de meting beperkt door het feit dat een differentiële
verdeling van een integrale verdeling moet worden afgeleid. Het l a a t s t g e noemde nadeel geldt niet voor de bandcentrifugeringsmethode, maar hierbij
kunnen de plaatselijk vrij hoge DNA concentraties aanleiding geven tot
vervorming van de band en de afwezigheid van dit verschijnsel is moeilijk
v a s t te s t e l l e n .
Sedimentatie door een sucrosegradiënt werd oorspronkelijk t o e g e p a s t
voor preparatieve doeleinden (Britten en Roberts, 1960). McGrath en Williams (1966) gebruikten deze methode voor een semi-kwantitatieve bepaling
van molecuulgewichtsverdelingen van DNA. De experimenten die in dit
hoofdstuk worden beschreven, hadden tot doel vast te stellen aan welke
e i s e n moet worden voldaan a l s kwantitatieve resultaten worden verlangd.
Aangetoond wordt dat een betrouwbare verdeling van sedimentatiecoëfficiënten kan worden verkregen, a l s bepaalde voorzorgen worden genomen.
Zulk een verdeling kan in een molecuulgewichtsverdeling worden getransformeerd a l s de relatie tussen s en M voor de gebruikte condities van de
sucrosegradiëntsedimentatie bekend i s . De relatie tussen s en M werd zowel voor dubbelstrengig a l s voor enkelstrengig DNA vastgesteld door de
sedimentatiecoëfficiënt van nagenoeg homogene DNA preparaten in de gradiënt te correleren met het molecuulgewicht. Het molecuulgewicht van het
36
DNA werd bepaald door grenslaagsedimentatie in de analytische ultracentrifuge.
Met de verkregen gegevens kan de sucrosegradiëntsedimentatie worden
gebruikt voor de bepaling van het gemiddelde aantal enkelstreng- en dubbelstrengbreuken, die bijvoorbeeld door straling in een DNA preparaat zijn
aangebracht. Aangetoond wordt dat het a a n t a l breuken, a l s deze willekeurig
zijn aangebracht, direct uit de verdeling der sedimentatie-afstanden kan
worden afgeleid.
2. Berekening van Snn^!^ uit de door de sedimenterende deeltjes afgelegde
weg in een sucrosegradiënt
Een sucrosegradiënt kan op een zodanige manier worden samengesteld,
dat de afstand waarover de DNA moleculen in een bepaalde tijd sedimenteren evenredig is met de sedimentatiecoëfficiënt (Burgi en Hershey, 1963).
Voor een constante sedimentatiesnelheid jf'knn S , « " worden g e s c h r e ven a l s :
osucr
-dx/dt
*20.w=f~2~
co
''7x,t
waarin
f = Y •
''ZO.W
•
^ '
''20,w^20,w
1 -
Vx.f^x.t
(1)
Hierin is x de afstand tot de r o t a t i e - a s , T^OQ W ^^ v i s c o s i t e i t van water bij
20 G, 17^ ^ de v i s c o s i t e i t van de sucrose-oplossing ter p l a a t s e x bij een
temperatuur t, Pgo w ^* dichtheid van water bij 20 ° G , p ^ ^ de dichtheid
van de s u c r o s e - o p l o s s i n g ter p l a a t s e x bij een temperatuur t en v het partieel specifiek volume van DNA. Voor v^ , en v , « ^ werd de waarde 0,55
m l / g genomen (Tennent en Vilbrandt, 1943; Hearst, l%2).i
De waarde 0,50 ml/g, die vrij recent door Cohen en Eisenberg (1968) is
voorgesteld, leidt s l e c h t s tot een verwaarloosbare verlaging van de met bovengenoemde 0,55 m l / g berekende waarde van S S Q " .
De v i s c o s i t e i t en de dichtheid van sucrose-oplossingen werden ontleend
aan het "Handbook of Chemistry and P h y s i c s * en de "International Critical T a b l e s " . Aangenomen werd dat de verhogingen van de v i s c o s i t e i t en van
de dichtheid door de buffer zonder meer bij de v i s c o s i t e i t en de dichtheid
van de sucrose-oplossing kunnen worden opgeteld.
Met behulp van deze gegevens werd voor verschillende waarden van x
de correctiefactor f berekend. Teneinde de berekeningen te vereenvoudigen
werd de waarde van f grafisch gemiddeld over de sedimentatie-afstand D.
37
De resultaten zijn in tabel V.1 weergegeven. In de tabel is te zien dat de
variatie van de gemiddelde waarde f veel geringer is dan die van f. Voor
de experimenten wordt de correctiefactor 7 gebruikt.
Tabel V.1
D
f
T
1,030
0,287
0,287
1,99
1,044
0,283
0,284
8,47
2,21
1,056
0,281
0,283
3,0
9,47
2,53
1,069
0,291
0,284
4,0
10,47
2,84
1,081
0,301
0,287
5,0
11,47
3,26
1,093
0,321
0,292
5,84
12,31
3,70
1,105
0,346
0,298
X
^,5
^x.5
0
6,47
1,78
1,0
7,47
2,0
D s afstand tot de meniscus.
De betekenis van de andere symbolen is in de tekst uiteengezet.
Bovenstaande methode verschilt van die van Nomura, Hall en Spiegelman (1960) die de experimentele waarden van s corrigeerden door aan te
nemen dat de v i s c o s i t e i t en de dichtheid een lineaire functie zijn van de
sucroseconcentratie. Dit i s echter vooral voor wat betreft de v i s c o s i t e i t
een vrij ruwe benadering.
3 . Resultaten en d i s c u s s i e
Sucrosegradiënt
De voornaamste reden voor de keuze van een fractioneringsmethode
waarbij de sucrosegradiënt bovenuit de centrifugebuis wordt gedrukt, is de
vervorming van het sedimentatiepatroon die optreedt bij de meer gebruikelijke methode waarbij de buisinhoud door een gat in de bodem wordt gefractioneerd. Dit wordt in figuur V.1 geïllustreerd. In dit experiment werd 25 fJ-g
T4 DNA door een sucrosegradiënt van 9 tot 28 gewichtsprocent gesedimenteerd. Bij fractionering via een naald door de bodem van de buis vertoonde
de DNA piek een scherp front en de gradiënt zelf was vervormd zoals bleek
uit metingen van de brekingsindex. Indien de gradiënt werd gefractioneerd
via een sterk conisch toelopende glazen buis, die bovenop de centrifugebuis werd geschoven, bleek de brekingsindex lineair toe te nemen met het
aantal fracties, maar de piek was wel vervormd.
38
In het l a a t s t e geval kon de vervorming van de piek niet worden toegeschreven aan de fractioneringsmethode. Dit kon worden aangetoond door
voorzichtig 0,5 ml van een oplossing van T4 DNA in 1 5 % sucrose op de
p l a a t s met de overeenkomstige dichtheid in een sucrosegradiënt te brengen.
20
^260
Q
8
meniscus
bodem
fractie nummer
Fig. V.1 — Sedimentatie van T4 DNA in een sucrosegradiënt
0,1 ml van een T4 DNA oplossing (250 /xg/ml) werd gesedimenteerd gedurende 6
uur bij 20.000 rpm in een sucrosegradiënt (9-28%) in SSC.
(a) Fractionering van de inhoud van de buis via een injectienaald door de bodem
van de buis.
(b) Fractionering via een conische glazen buis bovenop de centrifugebuis door
CCI. onder in de buis te leiden.
• ' • - • brekingsindex
O'O-o extinctie
39
Uit figuur V.2 blijkt duidelijk dat de vervorming ten gevolge van de fractioneringsprocedure bijzonder gering i s . Blijkbaar is de piek in figuur V . l b
asymmetrisch a l s gevolg van de sedimentatie. Bovendien heeft, zoals verderop in dit hoofdstuk zal blijken, de sedimentatiecoëfficiënt, afgeleid uit
de positie van het maximum van de piek, een te lage waarde.
Een niet-ideale sedimentatie werd s t e e d s gevonden voor DNA met een
groot molecuulgewicht, indien meer dan 4 /ig (zie figuur V . l b en V.11) op
de gradiënt werd gebracht. Voor een nauwkeurige bepaling van molecuulgewichtsverdelingen moest daarom zo weinig DNA op de gradiënt worden
gebracht, dat de hoeveelheid DNA in de fracties s l e c h t s was te meten a l s
het DNA radioactief was gemerkt.
^260
0.1-
mm
Fig. V.2
Extinctiepatroon, gemeten met een doorstroomcuvet, bij fractionering van een sucrosegradiënt (5-23%) in SSC waarin een laag van 0,5 ml met 5 Mg T4 DNA was
aangebracht. Er werd niet gecentrifugeerd; fractionering door uitdrukken met C C I . .
1
1
A
71
E
0.2•"260
V's-
-
—-^
^~^^^^"^^^™ÄB
50
1
40
— =
"
1
bod em
I
30
20
1
10
1
men SOIS
mm
Fig. V.3
Sedimentatiepatroon van enkelstrengig T4 DNA in een sucrosegradiënt (5—23%) in
SSC. Opgebracht: 0,5 ml van 40 Mg/ml enkelstrengig T4 DNA. Onderbroken lijn:
extinctie van de gradiënt als geen DNA aanwezig i s . Centrifugering: 3 uur 24.000
rpm.
40
Voor gedenatureerd DNA gelden niet zulke strenge beperkingen wat betreft de concentratie (zie figuur V.3). De waargenomen vervormingen moeten
daarom waarschijnlijk worden toegeschreven aan een te hoge v i s c o s i t e i t
van de DNA-laag in de gradiënt. Als de omstandigheden zodanig werden
gekozen dat geen vervorming van betekenis optrad, werd voor ongebroken
dubbelstrengig of enkelstrengig T4 DNA een halfwaarde breedte van de
piek gevonden die overeenkomt met ongeveer 3 fracties van 0,5 ml. De halfwaarde breedte was vrijwel even groot a l s 1,0 ml in plaats van 0,5 ml op
de gradiënt werd gebracht.
Indien het volume van de fracties wordt bepaald door telling van de
druppels, is het noodzakelijk de druppelsnelheid constant te houden daar
het druppelvolume afhankelijk is van deze snelheid. Figuur V.4 toont dat
een variatie van 5 - 10% in druppelvolume kan optreden als de druppelsnelheid niet onder controle wordt gehouden. Het druppelvolume is óók enigszins afhankelijk van de sucroseconcentratie maar in het algemeen kan dit
effect worden verwaarloosd.
O) 0.53
1
1
1
2
r
3
aantal druppels per seconde
Fig. V.4
Het gewicht van fracties van 15 druppels als functie van de druppelsnelheid (druppels per seconde) waarmee de oplossing in een centrifugebuis wordt gefractioneerd.
• - • - • centrifugebuis gevuld met 25% sucrose in SSC,
o-o-o centrifugebuis gevuld met SSC zonder sucrose.
In een sucrosegradiënt van 5 tot 23% is de sedimentatiesnelheid van
DNA vrijwel constant, zoals blijkt uit formule 1 en tabel V . 1 , Als experimentele controle hierop werden dubbelstrengig en enkelstrengig T4 DNA
gesedimenteerd bij 20.000 rpm en 5 C. De band behorend bij het dubbelstrengig DNA bleek na 5 uur 14 mm te hebben afgelegd, na 10 uur 26 mm en
na 15 uur 39 mm. Voor enkelstrengig DNA werd gevonden: 14 mm in 1,5,
18,5 in 2 en 33 mm in 3,5 uur.
41
Na centrifugering wordt er altijd materiaal op de bodem van de buis gevonden. Dit is waarschijnlijk een gevolg van het feit dat tijdens de centrifugering een gedeelte van het DNA tegen de wand van de cylindrische buis
sedimenteert en dan zeer snel naar de bodem verdwijnt. De afname van de
hoeveelheid DNA in de band die hiervan een gevolg i s , werd bepaald door
de hoeveelheid gedenatureerd DNA in de piek te vergelijken met de hoeveelheid die op de gradiënt was gebracht. In figuur V.5 is de fractie van
het opgebrachte DNA die in de band werd teruggevonden, uitgezet tegen de
afstand die door de sedimenterende moleculen was afgelegd. De resultaten
zijn in redelijke overeenstemming met de getekende curve, die werd berekend in de veronderstelling dat elk molecuul dat tegen de wand van de buis
sedimenteert, s n e l naar de bodem verdwijnt. Indien noodzakelijk kan dus
voor dergelijke verliezen op eenvoudige wijze worden gecorrigeerd.
100
4 cm
afstand tot de meniscus
Fig. V.5
De hoeveelheid enkelstrengig T4 DNA (bepaald door integratie van de extinctie) in
de sedimenterende piek als functie van de sedimentatie-afstand. In elk experiment
werd 15 ^6 DNA in 0,5 ml op een sucrosegradiënt gebracht en gedurende verschillende tijden gecentrifugeerd bij 24.000 rpm. De curve geeft de te verwachten hoeveelheid materiaal in de piek als wordt aangenomen dat materiaal, dat tegen de
wand van de buis sedimenteert, snel naar de bodem verdwijnt.
Een voorbeeld van het scheidend vermogen dat kan worden verkregen
met de sedimentatie in een sucrosegradiënt, is weergegeven in figuur V.6.
Een T4 DNA preparaat dat met
P was gemerkt en dat was gebroken door
42
middel van hydrodynamische schuifspanningen (gemiddelde sedimentatiecoëfficiënt ongeveer 26 S) werd gesedimenteerd. De oneven fracties werden
gebruikt voor het bepalen van de radioactiviteit. De fracties no. 20 en no.
28 werden na dialyse opnieuw tezamen gesedimenteerd. In het patroon van
de tweede sedimentatie werden twee goed gescheiden pieken waargenomen,
die bovendien op vrijwel de juiste p l a a t s lagen.
bodem
meniscus
fractie nummer
Fig. V.6
Oplossend vermogen van de sedimentatie in een sucrosegradiënt.
(a) Sedimentatiepatroon van 4 /ig met ^^P gemerkt T4 DNA dat is gebroken door
middel van hydrodynamische schuifspanningen. Centrifugering 15 uur 24.000 rpm.
De punten geven de radioactiviteit van de oneven fracties weer.
(b) Sedimentatie, onder gelijke omstandi^eden, van de bij elkaar gevoegde fracties 20 en 28.
De temperatuur onmiddellijk na centrifugering, bedroeg in beide experimenten 5 C.
43
Denaturering
Teneinde te onderzoeken of met de gebruikte methode van denaturering
het DNA volledig in de enkelstrengige vorm werd omgezet, werden de volgende proeven uitgevoerd. Van een preparaat, gedenatureerd volgens de
methode beschreven in III.7, werd de extinctie bepaald a l s functie van de
temperatuur. Dit DNA bleek niet coöperatief te smelten.
In een aantal experimenten werd een DNA preparaat gedurende 10 minuten op een bepaalde pH gehouden en daarna geneutraliseerd en gesedimenteerd. Figuur V.7 toont duidelijk dat bij pH 12 en hoger binnen 10 minuten
de s n e l sedimenterende enkelstrengige vorm ontstaat. In een overeenkoms t i g e ' s e r i e experimenten werden de pH-behandeling en de centrifugering uitgevoerd in aanwezigheid van 2% formaldehyde (figuur V.8). In dit geval
werd een geleidelijke verschuiving naar hogere sedimentatiecoëfficiënten
mm
Fig. V.7
Sedimentatiepatronen van T4 DNA (15 /xg) dat gedurende 10 minuten op verschillende pH's werd gehouden (20 C) en daarna geneutraliseerd. Centrifugering: 2,5
uur bij 24.(X)0 rpm in een sucrosegradiënt (5-23%) in SSC.
Onmiddellijk na centrifugering was de temperatuur 5 °C.
44
waargenomen. Dit is een gevolg van de reactie van formaldehyde met basen
in stukken van de DNA moleculen die bij de hoge pH gedenatureerd zijn,
waardoor deze stukken bij neutralisering niet kunnen renatureren. De s e d i -
meniscus
Fig. V.8
Sedimentatiepatronen van T4 DNA (15 /xg) dat gedurende 10 minuten op verschillende pH's werd gehouden in aanwezigheid van 2% formaldehyde en daarna geneutraliseerd. Centrifugering: 5 uur bij 21.000 rpm in een sucrosegradiënt (5—23%) in
SSC + 2% formaldehyde.
45
mentatiecoëfficiënt nadert bij toenemende pH tot de waarde die men verwacht voor in aanwezigheid van formaldehyde gedenatureerd DNA met hetzelfde molecuulgewicht a l s het natieve DNA. Voordat deze waarde echter
wordt bereikt, valt de sedimentatiecoëfficiênt terug op die van gedenatureerd DNA met de helft van het molecuulgewicht van natief DNA, ten gevolge van het uit elkaar gaan der strengen.
De sedimentatiecoëfficiënten in a a n - en in afwezigheid van formaldehyde a l s functie van de pH zijn in figuur V.9 weergegeven. De waarneming
van Studier (1965), dat de overgangs-pH enigszins wordt verlaagd bij hogere ionensterkte, werd bevestigd.
BU
-
s
a
60-
. sucr
'20 w
/
40-
—
1
V
-j
4
20-
1
160-
b
r-
"%
1
1
120-
1
-J
1
-1
1
80-
40-
—8» —•*
J
3
l'2
pH
Fig. V.9
S„„ van T4 DNA na alkalische behandeling gedurende 10 minuten bij verschillende pll's en neutralisering.
(a) Alkalische behandeling en centrifugering in aanwezigheid van formaldehyde.
(b) Idem, zonder formaldehyde.
De SgQ -waarden voor dubbelstrengig DNA die in dit experiment werden verkregen, zijn lager dan normaal omdat de relatief hoge concentratie van het DNA een
vertragende werking heeft op de sedimentatie.
46
Bepaling van s,M-relaties
De sedimentatiecoëfficiënt S | Q " , die kan worden berekend uit de door
de sedimenterende moleculen afgelegde weg (zie paragraaf 2), verschilt van
de sedimentatiecoëfficiênt die wordt verkregen bij centrifugering in afwezigheid van sucrose (Katz en Schachman, 1955; Burgi en Hershey, 1963).
Voor de transformatie van de SgQ^-verdeling van een DNA preparaat in de
molecuulgewichtsverdeling kan dus geen gebruik worden gemaakt van één
van de bekende s,M-relaties die gelden voor sedimentatie in afwezigheid
van s u c r o s e . De relatie t u s s e n het molecuulgewicht van het DNA en de s e dimentatiecoëfficiënt in de sucrosegradiënt werd a l s volgt bepaald.
Uit een groot aantal experimenten werd voor ongebroken dubbelstrengig
T 4 DNA een gemiddelde waarde voor S g g " van 57,5 S verkregen. DNA preparaten met een kleiner molecuulgewicht werden verkregen door degradatie
van T 4 DNA door middel van hydrodynamische schuifspanningen (Aten en
Cohen, 1965). Het molecuulgewicht van deze redelijk homogene preparaten
werd berekend uit de met een a n a l y t i s c h e ultracentrifuge gemeten sedimentatiecoëfficiënt in buffer, onder gebruikmaking van de relatie tussen M en
SSQ ^ van Eigner en Doty (1965). Dezelfde preparaten werden ook in een
sucrosegradiënt gesedimenteerd waarbij s t e e d s ongebroken T4 DNA a l s referentie werd meegesedimenteerd in dezelfde of één van de andere buizen
van de rotor. De resultaten zijn in tabel V.2 samengevat en in figuur V.10
uitgezet.
Als de relatie tussen de sedimentatiecoëfficiënt in de sucrosegradiënt (in
SSC) en het molecuulgewicht wordt geschreven a l s S | Q " = kM^, zijn de
beste waarden voor k en a respectievelijk 0,047 en 0,38. Ter vergelijking
werd in figuur V.10 ook de relatie van Burgi en Hershey (1963) weergegeven.
In een andere serie experimenten werden preparaten van door hydrodynamische schuifspanningen gebroken T4 DNA gedenatureerd en vervolgens
gesedimenteerd in een sucrosegradiënt. Gedenatureerd ongebroken T4 DNA
werd a l s referentie gebruikt. De S^Q^-waarden (in SSC) yoor deze preparaten zijn in tabel V.3 gegeven.
Voor het gemiddelde molecuulgewicht werd de helft van dat van het ongedenatureerde materiaal genomen, zoals dit werd verkregen uit analytische
sedimentatie-experimenten. De SgQ^-waarde voor ongebroken gedenatureerd
DNA bedroeg 160 S (gemiddelde van verscheidene experimenten). In figuur
V.10 is Slö*^ tegen het molecuulgewicht u i t g e z e t . Voor enkelstrengig DNA
werd gevonden dat in de bovengenoemde s,M-relatie k = 0 , 0 1 1 7 en a = 0 , 5 3 .
Als controle op de relatie voor enkelstrengig DNA werd het molecuulgewicht van enkelstrengig 0)C174 DNA bepaald door sucrosegradiëntsedimentatie. Het resultaat was 1,77 x 10 , hetgeen in goede overeenstemming
is met de waarde van 1,7 x 10 van F i e r s en Sinsheimer (1962). Voorts
47
Tabel V.2
Sedimentatiecoëfficiënten (SVifL en S20 ^ ) en molecuulgewichten
van ongebroken en gebroken dubbelstrengig T4 DNA
oo
w
^20,w
M ^10
.„-6
S20,w
cSucr
65,0
126
57,5
41,7
42,7
39,3
40.0
38,6
37,6
38,5
35,0
35,0
35.1
27,4
33,4
35,7
28,6
33,1
35,7
28,6
32,8
29,0
17,1
28,0
27,0
14,2
27,0
18,0
5,0
17,0
10,0
1,08
9,0
10.2
1,13
8,9
Tabel V.3
Sedimentatiecoëfficiënten en molecuulgewichten van ongebroken
en gebroken dubbelstrengig T4 DNA en de corresponderende
waarden voor Son*^/^ van de gedenatureerde preparaten
cO
''20,w
65
36
24,6
21,3
16,5
48
0,5 M X 10"^
63
15
5,6
4,0
2,0
cSucr
*20,w
160
72
47
41
25
werd van een aantal gedenatureerde preparaten het molecuulgewicht bepaald
zowel door middel van grenslaagsedimentatie in 1 M NaCl, onder gebruikmaking van de relatie van Studier (1965) voor deze omstandigheden (k =
0,0105 en a = 0,549), a l s door middel van sedimentatie in een sucrosegradiënt. De resultaten van beide methoden (zie tabel V.4) vertonen een goede
overeenstemming.
Tenslotte werd a l s controle een preparaat van dubbelstrengig materiaal gesedimenteerd in een sucrosegradiënt en uit de sedimentatiesnelheid werd
een molecuulgewicht van 3,9 x 10^ berekend. Dit materiaal werd vervolgens
I
10
-
10
-
I
1
1—
M
10
Fig. V.10
Molecuulgewicht als functie van S^«''' •
x-x-x dubbelstrengig DNA,
- - dubbelstrengig DNA volgens Burgi en Hershey (1963),
0-0-0 enkelstrengig DNA.
49
gedenatureerd en opnieuw gesedimenteerd in een sucrosegradiënt. Dit leidde tot een molecuulgewicht van 2,2 x 10 . Het verschil tussen de gemeten
en de verwachte waarde valt binnen de experimentele fouten.
Tabel V.4
Vergelijking van de molecuulgewichten van gedenatureerde DNA preparaten
verkregen met sucrosegradiënt- en grenslaagsedimentatie
Mj X 1 0 ' ^
65
Mg X 10"^
53 , 64 *
5.6
5,4
3.7
4,1
2,4
2,6
2,3
2,1
M. is verkregen met de sucrosegradiëntmethode
M„ is verkregen door middel van gr
grenslaagsedimentatie in 1 M NaCl, waarbij gebruik werd gemaakt van de relatie van Studier (1965).
Twee verschillende experimenten
De molecuulgewichtsverdeling
Nu de relatie tussen s en het molecuulgewicht bekend i s , kan de molecuulgewichtsverdeling op eenvoudige wijze uit een verdeling van s-waarden
worden berekend. Zij P(m)dm de waarschijnlijkheid dat een brokstuk met
een molecuulgewicht tussen m en m-f dm ontstaat en dat ds het met dm corresponderende interval van sedimentatiecoëfficiënten voorstelt, dan is
P(s)ds = P(m)dm. Experimenteel wordt de extinctie E(s) als functie van de
sedimentatiecoëfficiënt gemeten. E(s) is evenredig met P(s) en met het molecuulgewicht, dus P(s) = ^ E ( s ) , waarin C een constante i s . Hieruit volgt
dat
P(ni) = P ( s ) a | = Cka.E(s)m*-2
(2)
waarin k en a de constanten in de relatie s = km^ zijn.
Voor een smalle verdeling van sedimentatie coëfficiënten geeft de verdelingsfunctie P(m) niet de werkelijke verdeling weer, omdat de spreiding
in sedimentatie-afstand voor moleculen met eenzelfde molecuulgewicht is
verwaarloosd. Voor bredere verdelingen is dit effect echter klein.
50
Vergelijking van de twee methoden om het aantal breuken te berekenen
In hoofdstuk IV is uiteengezet dat het gemiddelde aantal breuken per
molecuul p na bestraling zowel kan worden berekend uit de fractie (e'P)
van het DNA in de sedimentatiepiek corresponderend met de ongebroken
moleculen, a l s uit de sedimentatiecoëfficiënt corresponderend methet maximum van de gebroken moleculen. De eerste methode is onnauwkeurig a l s de
piek van het ongebroken materiaal klein i s .
6000 S" 5000 4000
300020001000-
4000 2000 -
P
O
8
meniscus
56
bodem
f r a c t i e nummer
Fig, V.11
Sedimentatiepatronen van dubbelstrengig DNA uit onbestraalde en bestraalde T4
faag. Het DNA werd geëxtraheerd volgens de methode in hoofdstak III. Sucrosegradiënt: 5-23% in SSC. Het DNA was gemerkt met %-thymine.
Centrifugering: 15 uur 20.000 rpm bij 5 °C.
(a) Onbestraald. Het berekende gemiddelde aantal dubbelstrengbreuken bedroeg
0,12 per molecuul.
(b) Bestraald met 200 krd gamma straling onder On in SSC + 0,1 M cysteamine, pH
8,0. Zie voor het aantal breuken per molecuul tabel V.5.
De onderbroken lijn geeft de berekende verdeling weer als in ongebroken moleculen
willekeurig gemiddeld 1,6 breuken per molecuul worden aangebracht.
51
Onderzocht werd of de twee methoden voor een preparaat waarop beide
kunnen worden toegepast, tot hetzelfde resultaat leiden. In figuur V.11 zijn
de sedimentatiepatronen weergegeven van dubbelstrengig DNA dat werd
verkregen uit onbestraalde en uit bestraalde bacteriofaag T4. Het aantal
breuken per molecuul in het bestraalde preparaat werd gebruikt voor de berekening van P(m) (zie hoofdstuk IV). Van P(m) werd de functie E(s) afgeleid. Deze functie werd zodanig genormaliseerd dat het maximum met dat
van de experimentele curve samenviel. Uit de figuur blijkt dat dan de berekende en experimentele curven redelijk met elkaar overeenstemmen. Figuur
V.12 toont een overeenkomstig experiment waarin het DNA vóór sedimenta-
T
1
1
r
3000
E
o.
"
200010001000500
—r-
56
48 bodem
fractie nummer
Fig. V.12
Sedimentatiepatronen van enkelstrengig DNA uit onbestraalde en bestraalde T4
faag. Het DNA werd geëxtraheerd en gedenatureerd volgens de methode in hoofdstuk n i .
Sucrosegradiënt: 5—23% in SSC. Het DNA was gemerkt met H-thymine.
Centrifugering: 2,5 uur 24.000 rpm bij 5 °C.
(a) Onbestraald, 1,1 enkelstrengbreuken per DNA molecuul (dubbelstrengig).
(b) Bestraald met 56 krd gamma straling, onder Og in SSC •*• 0,1 M cysteamine pH
8,0. Uit de fractie ongebroken moleculen e**^ (bepaald uit de oppervlakken van de
pieken zoals aangegeven in de figuur) werd berekend dat het gemiddelde aantal
enkelstrengbreuken per DNA molecuul (dubbelstrengig) 6,1 was. Uit de plaats van
het maximum volgde een waarde van 6,2. De onderbroken lijn geeft de berekende
verdeling weer als in ongebroken moleculen willekeurig gemiddeld 6,2 breuken per
molecuul worden aangebracht.
52
tie werd gedenatureerd. In tabel V.5 is voor de experimenten van figuur
V . l l b en figuur V.12b het gemiddelde aantal breuken per molecuul vermeld,
dat met bovengenoemde methoden werd berekend.
Tabel V.5
Gemiddeld a a n t a l breuken berekend uit de sedimentatiepatronen
die zijn weergegeven in de figuren V . l l b en V.12b
-P
*
„
**
l^
P
^max
dubbelstrengig
0,22
1,5
50,4
1,6
enkelstrengig "^
0,045
3,1
99
3,1
P
* Berekend uit de fractie ongebroken moleculen (e"P).
** Berekend uit de plaats van het maximum van de sebroken moleculen in de gradient ( S „ „ ) .
a) Het gemiddelde aantal breuken per enkele streng T4 DNA.
Voor de bepaling van het oppervlak onder de curven voor ongebroken en
gebroken DNA moleculen werd in het overgangsgebied de theoretische grens
(stippellijn in de figuren V . l l b en V.12b) a l s grens t u s s e n beide oppervlakken genomen.
53
HOOFDSTUK VI
ONDERZOEK VAN DNA VAN BESTRAALDE BACTERIOFAGEN
1. Inleiding
In dit hoofdstuk worden experimenten beschreven waarmee werd vastgesteld in welke mate de door straling in het DNA geïnduceerde breuken
bijdragen tot de inactivering van de bacteriofaag T4. Hiertoe dienden de
overleving van de faag, het aantal enkelstreng- en het aantal dubbelstrengbreuken in het DNA te- worden bepaald als functie van de stralingsdosis.
Ol
c
>
o
>
o»
10
-
T
100
50
dosis (krd)
F i g . VI.1
Overlevingscurven
0 0 0 bestraling
XXX bestraling
• • • bestraling
54
van de bacteriofaag T4, bestraald in 0,1 M thioureum.
onder Op
onder lucht
onder Nn
Voorts werd de invloed van zuurstof en van SH-verbindingen op de produktie van breuken en op de overleving van de faag onderzocht. Alle resultaten
hebben betrekking op experimenten waarbij de faag werd bestraald, waarna
het DNA werd geïsoleerd voor de bepaling van het gemiddelde aantal breuken per molecuul. Teneinde te onderzoeken of de resultaten verkregen met
T4 algemeen geldig zijn, werden analoge proeven verricht met de bacteriofaag T7.
2. Experimenten met bacteriofaag T4
Zoals in hoofdstuk II is beschreven, werd door Luthjens, Roos en Blok
(1%6) met behulp van viscositeitsmetingen gevonden, dat bij bestraling
van een suspensie van de bacteriofaag T4 in buffer de eiwithuid van de
faag zo zwaar wordt beschadigd door de in het water gevormde radicalen,
dat er DNA vrijkomt. Indien de radicalen worden afgevangen door toevoegingvan "voedingsbouillon", thioureum of guanylaat, wordt de beschadiging
van de eiwitmantel grotendeels voorkomen en blijft het DNA in de faag.
In figuur VI.1 en VI.2 zijn als voorbeeld enige overlevingscurven van
T4 weergegeven. In het eerste geval was het medium 0,1 M thioureum, in
het tweede 0,1 M cysteamine. Zoals uit de figuren blijkt verhoogt zuurstof
ISO
200
dosis (rd )
F i g . VI.2
Overlevingscurven van de bacteriofaag T4, bestraald in 0,1 M cysteamine pH 8,0.
0 0 0 b e s t r a l i n g onder On
• • • b e s t r a l i n g onder W„
55
T
1
1
1
4000
r
ü
o. 3000
o krd
2000
P=0.2
1
1000
'Saaa.
- «•»»»"-—
6000
01
n
4000
55 krd
p=.0.4
2000
eooe^«
"T
I
2000
r
o
1000 •
100 krd
P=0.8
/ \
'i^^—I—-V3000 •
e
il
2000 •
200krd
P=1.3
1000 •
O
T'*'"-T
16
24
1
32
1
40
1
48
1
56
fractie nummer
Fig. VI.3
^
*
q
Sedimentatiepatronen van met H-thymine gemerkt dubbelstrengig T4 DNA in een
sucrosegradiënt (5—23%) in SSC. Na bestraling van T4 met verschillende doses
werd het DNA geïsoleerd door fenolextractie (zie hoofdstuk IH). Centrifugering:
15 uur 20.000 rpm bij 5 C. p is het gemiddelde aantal breuken per molecuul. De
hoeveelheid DNA in de verschillende preparaten is niet precies gelijk.
56
de stralingsgevoeligheid a l s er SH-verbindingen in het medium aanwezig
zijn; in afwezigheid van deze stoffen beschermt zuurstof daarentegen enigsz i n s . Het doorleiden van gas door de faagsuspensie had op zichzelf geen
invloed op de biologische activiteit van de s u s p e n s i e .
Afhankelijk van de omstandigheden werden vrijwel exponentiële overlevingscurven (figuur VI.1) of curven met een schouder waargenomen (figuur
VI.2). De oorzaak van deze verschillen werd niet nader onderzocht, omdat
het enige doel van deze experimenten was een maat voor de inactiveringssnelheid bij lage s t r a l i n g s d o s e s te verkrijgen. In de gevallen waarin de
overlevingscurven niet exponentieel waren, werd de D , - (de d o s i s waarbij
37% van de fagen nog biologisch actief is) berekend uit de beginhelling.
In figuur VI.3 en VI.4 zijn een aantal sedimentatiepatronen weergege1
1
1
1
1
2000 -
Okrd
/
E
o.
u 1000-
p=3.0
l
1
1
1
1
—y—,'\ -
1000 -
1
1
r
1
25 krd
p=4.8
1
50 krd
p = 6.8
1000 -
1
1
'
1
1
T
2000 -
100 krd
1000 -
0 -
P=9.?
r
}
1
8
1'
16
1
24
I
32
I
40
fractie nummer
Fig. VI.4
Sedimentatiepatronen van met "'H-thymine gemerkt enkelstrengig T4 DNA in een
sucrosegradiënt (5—23%) in SSC. Na bestraling van T4 met verschillende doses
werd het DNA geïsoleerd en gedenatureerd door toevoeging van SCOH (ziehoofdstuk III). p is het gemiddelde aantal enkelstrengbreuken perDNA molecuul (dubbelstrengig). De onderbroken vertikale lijnen geven de plaats aan van het maximum
in de verdelingscurven. Centrifugering: 2,5 uur 24.000 rpm bij 5 C.
57
ven van respectievelijk dubbelstrengig en enkelstrengig T 4 DNA, geïsoleerd
na bestraling van de faag met verschillende d o s e s . Zoals in de hoofdstukken IV ea V is beschreven, kan het gemiddelde aantal breuken per molecuul
zowel uit de oppervlakte onder de piek van de ongebroken moleculen, a l s
uit de plaats van het maximum van het brede sedimentatiepatroon van de
brokstukken worden berekend. Het gemiddelde aantal enkelstreng-en dubbelstrengbreuken per molecuul a l s functie van de dosis is weergegeven in
figuur VI.5. Beide curven zijn lineair. Tevens blijkt dat het aantal breuken
1
r
100
200
dosis (krd)
Fig. VI.5
Het gemiddelde aantal breuken per molecuul T4 DNA als functie van de dosis.
a) enkelstrengbreuken,
b) dubbelstrengbreuken.
De curven zijn gebaseerd op de experimenten die in de figuren VI.3 en VI.4 zijn
weergegeven.
58
Tabel VI.1
Inactivering van bacteriofaag T4 en T7 en de produktie van breuken in het DNA
Faag
T4
Medium
Yds/YbC^«)
Yb-Yds
D37
Yb
Yds
Yes
62
65
46
0,12
0,11
0,16
0,08
0,08
0,04
1,6
1,6
0,8
67
73
25
0,04
0,03
0,12
60
50
70
90
80
100
70
90
80
0,13
0,15
0,10
0,08
0,09
0,08
0,11
0,08
0,09
1,2
0,8
1,0
0.9
62
27
80
50
89
50
64
50
67
0,05
0,11
0,02
0,04
0,01
0,04
0,04
0,04
0.03
-
-
0,7
0,4
63
75
0,03
0,01
thioureum
100 mM, lucht
100 mM, O j
100 mM, Nj
cysteamine
0 mM,
0 mM,
1 mM,
1 mM,
27 mM,
27 mM,
27 mM,
27 mM,
67 mM,
67 mM,
110 mM,
110 mM,
g.Oj
g,N2
g.Og
g.Nj
g.Og
g.N2
Og
Ng
Oj
Ng
Og
Nj
-
-
80
190
0,08
0,04
0,08
0,04
0,08
0,04
0,08
0,04
0,07
0,04
0,06
0,04
0,05
0,03
80
100
0,10
0,07
0,08
0,04
1,0
0,6
80
57
0,02
0,03
110
90
300
390
0,32
0,39
0,11
0,09
0,10
0,04
0,05
0,04
1,5
1.2
0,7
0,4
33
10
45
47
0,22
0,35
0,06
0,05
160
340
0,22
0,10
0,07
0,04
1,0
0.7
32
40
0,15
0.06
-
thioglycol
150 mM,
150 mM,
77
Oj
Ng
cysteamine
0
0
100
100
mM, g,02
mM, g,N2
mM, O j
mM, Ng
thioglycol
100 mM,
100 mM,
O2
Nj
: guanylaat, 20 mM
aantal letale treffers
per 100 eV energie geabsorbeerd in het DNA
'ds^ : aantal dubbelstrengbreuken
: aantal enkelstrengbreuken
D „ , = 37% overlevingsdosis in fcrd, bepaald uit de beginhelling van de overlevingscurven
De onzekerheid in de Yj^-waarden bedraagt in sommige gevallen ongeveer 25%. De
geschatte maximale fout in Y^^ en Y^^ is 10 tot 15%. •
59
in DNA, geïsoleerd uit onbestraalde faag, zeer laag i s . In het algemeen lag
het aantal dubbelstrengbreuken in het DNA van onbestraalde faag t u s s e n
0,1 en 0,5 per molecuul. Het aantal enkelstrengbreuken bedroeg voor het
radioactief gemerkte DNA van de onbestraalde faag doorgaans 1 tot 3 en
voor het ongemerkte DNA ongeveer 0,2 per molecuul (het aantal enkelstrengbreuken werd in geen enkel geval gecorrigeerdvoor het aantal dubbelstrengbreuken). Het doorleiden van gas door de faagsuspensie had geen invloed
op het aantal breuken per molecuul.
De resultaten van een groot aantal experimenten zijn samengevat in tabel V l . l . I n deze tabel zijn Y, , Y , en Y^^ respectievelijk het aantal letale treffers, het aantal dubbelstrengbreuken en h et aantal enkelstrengbreuken
per 100 eVin het DNA van de faag gedissipeerde stralingsenergie. De energie gedissipeerd in het DNA kan worden berekend uit de geabsorbeerde dos i s , die is uitgedrukt in krd (1 krd = 10 erg/gram). Voor het molecuulgewicht van T4 DNA werd 130 x 10^, voor dat van T7 DNA 28 x 10^ a a n g e nomen. Een opbrengst van Y = 1 komt overeen met 0,136 treffers of breuken
per krd per molecuul met een molecuulgewicht van 130 x 10 of met 0,029
treffers of breuken per krd per molecuul met een molecuulgewicht van 28 x
10^.
Bij een primaire ionisatie wordt gemiddeld ongeveer 70—100 eV afgegeven. Y is dus ongeveer gelijk aan het aantal letale treffers of breuken
per primaire ionisatie in het DNA.
Alle bestralingen werden uitgevoerd in aanwezigheid van voldoende
hoeveelheden beschermende stoffen, zodat beschadiging van de eiwithuid
tot een minimum werd beperkt.
Een complicatie doet zich voor a l s gevolg van het feit dat sommige
SH-verbindingen gemakkelijk worden geoxydeerd, vooral in aanwezigheid
van metaalionen. De in tabel VI.1 vermelde concentraties van de gebruikte
SH-verbindingen zijn nominale waarden die werden verkregen door inwegen.
Bij bepaling van het SH-gehalte met NEM werd gevonden dat de oplossingen
van cysteamine en thioglycol respectievelijk 70 en 80% bevatten van de
berekende hoeveelheid SH-groepen. Doorleiding van stikstof gaf zowel met
a l s zonder bestraling geen meetbare verlaging van het SH-gehalte van faags u s p e n s i e s waaraan cysteamine was toegevoegd. Na 40 minuten zuurstof
doorleiden, waarbij al of niet werd bestraald tot een d o s i s van 180 krd, was
de SH-concentratie in een oplossing van 100 mM cysteamine afgenomen van
70 tot 30 mM. Voor thioglycol werd onder dezelfde omstandigheden geen
significante verlaging van de SH-concentratie waargenomen. De resultaten
van deze metingen zijn samengevat in tabel VI.2.
3. Experimenten met bacteriofaag T7
De experimenten met bacteriofaag T7 werden op dezelfde wijze uitge60
voerd a l s die met T 4 . De resultaten zijn eveneens in tabel VI.1 gegeven.
Opgemerkt dient te worden dat de waarden voor de 37% overlevingsdosis
minder betrouwbaar zijn dan die voor T 4 . Dit is een gevolg van het feit dat
de overlevingscurven een brede schouder vertoonden, waardoor het moeilijk
was de beginhelling nauwkeurig te bepalen. De niet-exponentiële vorm van
de overlevingscurven moet waarschijnlijk worden toegeschreven aan de a c cumulatie van stralingsprodukten in het medium. Bij de experimenten met
T7 wordt een hogere concentratie van dergelijke produkten verwacht dan
bij die met T 4 omdat hogere d o s e s nodig zijn om T7 te inactiveren.
Tabel VI.2
SH-concentratie van cysteamine- en thioglycoloplossingen na
verschillende behandelingen
Oplossing
Gas
Tijdsduur van
gasdoorleiding
(min)
Dosis in
krd
SH-concentratie
0
0
7,0 X 10^2 M
M
40
0
3,0 X 10"2 M
0,1 M
40
180
3,1 X 10-2 ^
40
180
7,1 X 10-2 ^
0
0
12,0 X 10-2 M
0,15 M
40
0
12,1 X 10*2 M
0,15 M
40
180
0,1
M cysteamine
0,1
0,1 M
0,15 M thioglycol
N,
11,5x10-2 M
4. Controle-experimenten
De bepaling van het aantal enkelstrengbreuken zou kunnen worden verstoord indien bij bestraling " c r o s s l i n k s " tussen de strengen van het DNA
worden gevormd. Als deze " c r o s s l i n k s " stabiel zijn in alkalisch milieu
treedt bij neutralisering weer renaturering op van de strengen die door
" c r o s s l i n k s " zijn verbonden. Teneinde te onderzoeken of onder de gebruikte omstandigheden zulke covalente bindingen tussen de strengen van T4
DNA worden gevormd, werd een evenwichtssedimentatie in CsCl uitgevoerd
met een DNA preparaat waarin door straling 7 enkelstrengbreuken en 0,4
dubbelstrengbreuken per molecuul waren geïnduceerd en dat na alkalische
denaturering weer was geneutraliseerd. De verdeling van het DNA in de
61
CsCl gradiënt is in figuur VI.6 weergegeven. Dubbelstrengig en e n k e l strengig DNA concentreren zich in de gradiënt op verschillende plaatsen
(figuur Vl.öa). Uit de figuur volgt dat de hoeveelheid dubbelstrengig materiaal die eventueel in het gedenatureerde, bestraalde DNA aanwezig i s ,
bijzonder klein i s . Uit dit experiment (figuur VI.6b) kan worden geconcludeerd dat ten hoogste 6% van het materiaal werd gerenatureerd. Zo er dus
" c r o s s l i n k s " worden gevormd, dan is hun aantal zo gering dat het sedimentatiepatroon in de sucrosegradiënt niet merkbaar zal worden beïnvloed.
1'
u
cM
Ol
\jr^
u
1
meniscus
*-
1 ^
u
dichtheid
Fig. VI.6
Evenwichtssedimentatie in CsCl van DNA uit bestraalde bacteriofaag na alkalische denaturering en neutralisering. Bestraling met 50 krd in 3,5 x 1 0 ^ M cysteamine onder stikstof. Sedimentatie van ongeveer 0,5 fjg DNA gedurende 16 uur bij
44.770 rpm bij kamertemperatuur.
a) Mengsel van dubbelstrengig onbestraald DNA (dichtheid 1,700) en gedenatureerd
bestraald DNA (dichtheid 1,719). Het referentiegedeelte van de dubbelsector cel
bevatte CsCl.
b) Gedenatureerd bestraald DNA, gecentrifugeerd in een enkelsector cel, waardoor
geen correctie voor de extinctie van de CsCl oplossing kon worden aangebracht.
c) Gedenatureerd onbestraald DNA. Het referentiegedeelte van de dubbelsector cel
bevatte CsCl.
62
Als er " c r o s s l i n k s " t u s s e n DNA en eiwit worden gevormd, zou een gedeelte van het DNA verloren kunnen gaan bij de verwijdering van het eiwit
door fenolextractie. Voor het ontstaan van dit type " c r o s s l i n k s " werden
echter geen aanwijzingen gevonden. Zo werd bijvoorbeeld, uitgaande van
een constante hoeveelheid radioactiviteit in de faag, gevonden dat de totale H-activiteit van gemerkt DNA in de sucrosegradiënt onafhankelijk was
van de d o s i s waaraan de faag had blootgestaan. De activiteit bedroeg 17.700
tellen per minuut voor onbestraald materiaal, 18.200 tellen per minuut na
bestraling van de faag met 50 krd en 17.300 tellen per minuut na 200 krd.
Een probleem van geheel andere aard is het volgende. Bij de bepaling
van de biologische activiteit van de faag wordt deze blootgesteld aan temperaturen rond 37 ° C . De faag die werd gebruikt voor de bepaling van het
aantal breuken in het DNA kwam echter niet op temperaturen boven 22 C.
De mogelijkheid b e s t a a t dat bepaalde beschadigingen in het DNA niet tot
uitdrukking komen a l s dubbelstrengbreuken bij 22 ° C maar wel bij hogere
temperatuur. Dit werd op de volgende manier onderzocht:
Bacteriofaag T7 in 0,1 M thioglycol werd bestraald onder stikstof met
een dosis van 920 krd. Na bestraling werd het DNA geïsoleerd door middel
van fenol- en etherextractie. De helft van de DNA oplossing werd gedurende 10 minuten op 45 ° C verwarmd en de andere helft bij kamertemperatuur
bewaard. Daarna werd van beide preparaten door middel van sedimentatie
in een sucrosegradiënt het aantal dubbelstrengbreuken bepaald. Er was
t u s s e n de DNA preparaten geen verschil in het aantal dubbelstrengbreuken
waarneembaar. In beide bedroeg het aantal 0,9 per molecuul.
5. D i s c u s s i e
Zoals in hoofdstuk II is uiteengezet wordt door sommigen de verlaging
van de stralingsgevoeligheid van cellen en van intracellulair faag DNA
door anoxie toegeschreven aan h e r s t e l van s t r a l i n g s s c h a d e door in de cel
aanwezige SH-verbindingen. De sensibiliserende werking van zuurstof zou
berusten op een voorkoming van dit h e r s t e l . Dit herstel ^ou bij fagen niet
optreden, omdat deze geen vrije SH-verbindingen bevatten ( H o w a r d - F l a n ders, Levin en Theriot, 1963).
De resultaten in tabel VI.1 tonen echter aan dat zuurstof ook zonder
dat SH-verbindingen aanwezig zijn, de inductie van dubbelstrengbreuken
stimuleert. De opbrengst van dubbelstrengbreuken was onder zuurstof in
het algemeen 0,08 en onder stikstof 0,04. Bij de hogere cysteamineconcentraties bleek G j onder zuurstof lager te zijn. Mogelijk is dit een gevolg
van een verlaging van de zuurstof concentratie in de faag. Men zou zich kunnen voorstellen dat bij hoge cysteamineconcentratie de r e a c t i e met zuurstof
snel genoeg verloopt om een gedeelte van de zuurstof af te vangen voordat
deze in de faag is gediffundeerd. Deze hypothese wordt gesteund door het
63
feit dat bij bestraling in aanwezigheid van een hoge cysteamineconcentratie in een gesloten buisje, dat vóór de bestraling met lucht was verzadigd,
een D n - werd gevonden die ongeveer gelijk was aan de waarde onder stikstof. G j bedroeg voor deze proef 0,04. Dit wijst erop dat de zuurstof i n d e
buis vrijwel volledig met cysteamine heeft gereageerd. Het zeer langzaam
met zuurstof reagerende thioglycol had geen invloed op G j ^ onder zuurstof.
De opbrengst van enkelstrengbreuken werd ook verhoogd door de aanwezigheid van zuurstof, zij het in mindere mate. De afwezigheid van een
zuurstofeffect bij de inactivering van bacteriofagen in thioureum, guanylaat
(figuur VI.1, tabel VI.1) en "voedingsbouillon" ( H o w a r d - F l a n d e r s , Levin
en TTieriot, 1963) moet waarschijnlijk worden toegeschreven aan een bescherming van andere faagcomponenten door zuurstof, waardoor de s e n s i b i lisering van het DNA wordt gemaskeerd. Deze beschermende werking van
zuurstof is vermoedelijk een gevolg van het wegvangen van de reducerende
radicalen e" en H, waardoor de eiwitmantel nog beter wordt beschermd.
Dat bacteriofagen gevoelig zijn voor reducerende radicalen werd aangetoond door Alper (1954). Afhankelijk van de mate waarin reducerende radicalen worden afgevangen zal zuurstof dus beschermend of s e n s i b i l i s e r e n d
werken. In enkele experimenten bleek zuurstof inderdaad de bacteriofaag
a l s geheel te beschermen (zie bijvoorbeeld figuur VI.1).
Als in het DNA van een faagdeeltje een dubbelstrengbreuk aanwezig i s ,
kan men verwachten dat s l e c h t s een deel van het DNA molecuul de bacterie
binnenkomt of dat het molecuul in twee gescheiden stukken in de gastheer
dringt. Het is niet waarschijnlijk dat een dergelijke infectie tot de produktie van bacteriofagen leidt. Het lijkt dus gewettigd aan te nemen dat elke
dubbelstrengbreuk l e t a a l i s .
Er zijn twee argumenten voor de veronderstelling dat een dubbelstrengbreuk veroorzaakt wordt door één primaire i o n i s a t i e . Ten eerste neemt het
aantal dubbelstrengbreuken lineair toe met de d o s i s (figuur VI.5). Ten
tweede is de waarschijnlijkheid dat twee onafhankelijk gevormde enkelstrengbreuken in tegenovergestelde strengen zo dicht bij elkaar liggen dat
een dubbelstrengbreuk o n t s t a a t , veel te klein om het waargenomen aantal
dubbelstrengbreuken te kunnen verklaren.
Uit tabel VI.1 volgt dat enkelstrengbreuken in het algemeen niet letaal
zijn, daar hun aantal (Y ) s t e e d s een orde van grootte hoger is dan het
aantal letale treffers ( Y . ) . H e t is echter niet uitgesloten dat een klein deel
van de enkelstrengbreuken, bijvoorbeeld die in een bepaald gedeelte van
een DNA molecuul, wel letaal i s . Deze mogelijkheid werd kort geleden ook
door Freifelder (1968) gesuggereerd.
In de l a a t s t e kolom van tabel VI.1 is het verschil Yj^-Yj^ (dit is het totale aantal letale beschadigingen per 100 eV verminderd met dat ten gevolge van dubbelstrengbreuken) weergegeven. Deze andere beschadigingen
64
kunnen letale enkelstrengbreuken of beschadigingen van de basen van het
DNA zijn. In afwezigheid van SH-verbindingen is Yj^-Yj^ hoog, vooral a l s
tijdens bestraling geen zuurstof aanwezig i s . Waarschijnlijk is dit een gevolg van de werking van de reducerende radicalen op het faageiwit. In de
kolom in tabel V I . 1 , waarin Y . / Y , is weergegeven, kan men zien dat,
wanneer voldoende tegen de indirecte werking wordt beschermd, de dubbelstrengbreuken de hoofdoorzaak van de letaliteit zijn.
Hoewel om de al eerder genoemde redenen de experimenten met de b a c teriofaag T7 minder nauwkeurige resultaten opleverden, kon hieruit toch
worden geconcludeerd dat dubbelstrengbreuken niet de voornaamste oorzaak
van de letaliteit vormen. Verder zijn de resultaten met T7 faag dezelfde
a l s die met de bacteriofaag T 4 .
De gevonden waarden voor de produktie van enkelstrengbreuken stemmen redelijk overeen met die van andere auteurs (zie tabel II.1 en II.2).
Voor de produktie van dubbelstrengbreuken vonden Summers en Szybalski
(1967) 9,6 en andere auteurs in het algemeen waarden t u s s e n 0,11 en 0 , 2 1 .
Deze waarden werden verkregen uit viscositeitsmetingen (Dean, F e l d schreiber en L e t t , 1966) of uit grenslaaganalyses na sedimentatie in een
analytische ultracentrifuge. Z o a l s in de voorgaande hoofdstukken is uiteengezet, zijn deze methoden minder betrouwbaar dan sedimentatie in een zone
of band, waarbij een scheiding van DNA moleculen naar molecuulgewicht
wordt verkregen.
65
HOOFDSTUK VII
BESTRALING VAN DNA IN OPLOSSING
1. Inleiding
In dit hoofdstuk worden experimenten beschreven waarbij DNA in oplossing werd bestraald. Onder deze omstandigheden is de bijdrage van de directe werking, zoals later zal blijken, te verwaarlozen en kan dus de werkingvan in water gevormde vrije radicalen op DNA worden bestudeerd. Voor
de experimenten werd het DNA van de bacteriofaag T4 gekozen, omdat hiervan gemakkelijk gezuiverde preparaten zijn te bereiden en omdat dit DNA
door andere onderzoekers uitvoerig is bestudeerd. Getracht werd de bijdrage van de verschillende soorten radicalen tot de produktie van dubbelstrengen enkelstrengbreuken vast te stellen.
Mede in verband met het werk van Hagen (1967) wordt in het volgende
voorts aandacht geschonken aan de eventuele vorming van "crosslinks".
2. Resultaten
Gevoeligheid voor hydrodynamische schuifspanningen
Uit enkele oriënterende experimenten bleek dat bestraald DNA veel gevoeliger is voor hydrodynamische schuifspanningen dan onbestraald DNA.
Wanneer stikstof of zuurstof door een onbestraalde oplossing van T4 DNA
werd geleid, had dit vrijwel geen invloed op het aantal breuken in het DNA.
Indien echter gedurende 3 minuten stikstof werd geleid door een oplossing
van DNA waarin door bestraling 300 enkelstrengbreuken per DNA molecuul
waren aangebracht, was het gemiddelde aantal dubbelstrengbreuken toegenomen van 5,5 tot 9,8 per molecuul. Het aantal enkelstrengbreuken veranderde niet als na bestraling stikstof werd doorgeleid.
De stijging van het aantal dubbelstrengbreuken werd niet veroorzaakt
door na-effecten van stabiele stralingsprodukten ontstaan in de buffer, want
het aantal breuken in DNA nam niet toe als DNA werd toegevoegd aan SSC
of HMP buffer die tevoren onder stikstof of zuurstof was bestraald. De toename moet worden toegeschreven aan een verhoogde gevoeligheid voor
schuifspanningen door de aanwezigheid van enkelstrengbreuken in het DNA;
Bij de proeven met dubbelstrengig T4 DNA in oplossing werd daarom kort
vóór de bestraling de doorleiding van het gebruikte gas stopgezet.
66
De verhoging van de gevoeligheid voor hydrodynamische schuifspannin^eu lif) be&itra.iing was niet van heiang :'>ij C-e experimenten beschreven in
hoofdstuk VI, omdat daar de verhouding van het aantal enkelstrengbreuken
en het aantal dubbelstrengbreuken veel kleiner w a s . Bovendien was bij de
bestraling van complete faagdeeltjes het maximale aantal enkelstrengbreuken per DNA molecuul veel kleiner dan bij de hier beschreven experimenten.
Het aantal dubbelstrengbreuken a l s functie van het a a n t a l enkelstrengbreuken
In de figuren VII.1 en VII.2 zijn zowel voor bestraling onder stikstof
a l s onder zuurstof dosis-effect curven weergegeven voor respectievelijk
enkelstreng- en dubbelstrengbreuken .Alle experimenten werden uitgevoerd
met monsters van eenzelfde preparaat T4 DNA. De curven zijn, althans in
het beginstuk, recht. Dit wijst erop dat dubbelstrengbreuken niet alleen
^ss
1
'
56 -
1
1 -
/
If '2
48 -
-
•
1
-
40 -
/
-
32-
/
-
24 -
/
16 -
02
/
•-—
8 -/
i
._
e
/^^_,-^
n —
u ~
2^
4Â0
1
600
800
dosis (rd)
Fig. VII.l
Het gemiddelde aantal enkelstrengbreuken per T4 DNA molecuul (dubbelstrengig)
als functie vaii de stralingsdosis. 0,5 mivan een oplossing van T4 DNA (60 /ig/ml),
gemerkt met H-thymine, werd bestraald met verschillende doses, daarna gedenatureerd met SCOH en geanalyseerd door middel van sedimentatie in een sucrosegradiënt (5—23%) in SSC. Centrifugering: 2,5 uur 24.000 rpm bij 5 °C.
0 0 0 bestraling onder Oo
• • • bestraling onder No
67
een gevolg zijn van twee toevallig dicht bij elkaar liggende enkelstrengbreuken, zoals door sommige auteurs werd verondersteld (Peacocke en
P r e s t o n , 1960a; Hagen, 1967).
1
1
1
I
5 -
^
'ds
O
4 -
e
02
~
3 -
,N2
•
l
2 -
•
1 -
1
n 1
0 T
^ ^
^
1
2000
1
4000
1
6000
1
8000
dosis (rd)
Fig. VII.2
Het gemiddelde aantal dubbelstrengbreuken per T4 DNA molecuul als functie van
de stralingsdosis. 0,5 ml van een oplossing van T4 DNA (60 ;ig/ml), gemerkt met
''H-thymine, werd bestraald met verschillende doses en geanalyseerd door middel
van sedimentatie in een sucrosegradiënt (5—23%) in SSC. Centrifugering: 15 uur
20.000 rpm bij 5 ° C .
o o o bestraling onder O2
• • •. bestraling onder Nn
In figuur VII.3 is voor een bepaald T4 DNA preparaat dat in HMP onder
zuurstof met verschillende d o s e s werd bestraald, het aantal dubbelstrengbreuken uitgezet tegen het a a n t a l enkelstrengbreuken. Het a a n t a l enkelstrengbreuken werd alleen bij lagere d o s e s gemeten, omdat bij hogere dos e s de enkelstreng brokstukken zo klein zijn dat het niet zeker is dat de
voor enkelstrengig DNA bepaalde s,M-relatie nog kan worden t o e g e p a s t .
Voor de hogere d o s e s werd daarom het aantal enkelstrengbreuken bepaald
door lineaire extrapolatie.
68
Met behulp van de methode der kleinste kwadraten werd voor de meetpunten (waarvoor een constante relatieve fout in p j werd aangenomen),
weergegeven in figuur VII.3, berekend dat de waarden van -^f en c uit de in
hoofdstuk IV afgeleide formule
(IV,10)
Pds - M - P ^ + «^-P
respectievelijk bedragen 0,26 x 10- en 0,016. De waarde van h komt overeen met 5 nucleotidenparen. De nauwkeurigheid van ^ , die hoofdzakelijk
afhankelijk is van de systematische fout (ongeveer 10%) in p , bedraagt ongeveer 20%.
De factor c kan ook uit de beginhelling van de curve van p^ tegen p
worden berekend, omdat bij lage d o s e s de bijdrage van de enkelstrengbreuken tot de dubbelstrengbreuken te verwaarlozen i s . c bleek van preparaat
tot preparaat sterk te verschillen en varieerde t u s s e n 0,008 en 0,025. .
T
Fig. VII.3
Het aantal dubbelstrengbreuken in T4 DNA als functie van het aantal enkelstrengbreuken. Experimentele details als bij de experimenten van figuur VII.l en VII.2.
Alle metingen werden verricht met hetzelfde DNA preparaat. Bestralingen werden
onder On uitgevoerd. Het aantal enkelstrengbreuken werd gemeten tot doses van
400 rd. Bij 400 rd bedroeg het aantal enkelstrengbreuken per T4 DNA molecuul
(dubbelstrengig) 25 ± 1 (standaardfout) en 10 ± 0,5 in het onbestraalde preparaat.
De in de figuur gegeven waarden voor het aantal enkelstrengbreuken bij hogere doses werden bepaald door lineaire extrapolatie.
69
In beginsel is de bovengenoemde lineaire extrapolatie ter bepaling van
het aantal enkelstrengbreuken bij hogere d o s e s niet j u i s t . Zoals i s uiteengezet door Blok en medewerkers (1967, 1968) wordt de verdeling van DNA
in de oplossing meer homogeen naarmate er meer dubbelstrengbreuken in
het DNA worden aangebracht. Dit heeft tot gevolg dat de fractie van de radicalen die met verontreinigingen reageert, geringer wordt. Het DNA wordt
stralingsgevoeliger. -Door dit effect zou de waarde van ^ nog wat kleiner
worden dan de bovengenoemde.
Stralingsgevoeligheid onder Ny, O2 en N2O
De opbrengst aan dubbel- en enkelstrengbreuken per 100 eV geabsorbeerde stralingsenergie bij bestraling van DNA in buffer in aanwezigheid
van verschillende g a s s e n , is samengevat in tabel V I I . l . De getallen voor
Tabel Vn.1
Inactivering van epXl74 DNA en de produktie van breuken in T4 DNA
bij bestraling van mengsels van beide soorten DNA
preparaat
gas
D37 ^° '•*
^ds
Ges
1
O2
580 ( 50)
0,00018
0,022
1
N2
87 ( 4)
0,0035
0,17
2
O2
1250 (250)
0,00028
0,014
2
N2
NgO
2
78 ( 5)
-
0,11
60 ( 3)
0,0042
0,12
Preparaat 1 bevatte 62 Mg T4 DNA en 5,7 fig </>X174 DNA per ml
Preparaat 2 bevatte 57 /xg T4 DNA en 4,0 /Jg ^X174 DNA per ml
1 en 2 bevatten verschillende T4 DNA preparaten.
Dgy = de straliagsdosis waarbij 37% van de i^X174 DNA moleculen nog biologisch
actief is.
Gj = het aantal dubbelstrengbreuken •)
G^^ = het aantal enkelstrengbreuken } ^ ' 10°«^ gedissipeerd in de oplossing.
De onzekerheid in de waarden voor Gj en G bedraagt ongeveer 15%.
Qs
es
De getallen tussen haakjes geven de maximale fout in de D^^.
De D„_ werd bepaald uit overlevingscurven.
70
G , en G werden verkregen door na bestraling met één of meer d o s e s het
aantal breuken te bepalen. In die gevallen waarbij G J en G bij verschillende d o s e s werden bepaald, zijn in de tabel gemiddelde waarden voor dez e grootheden opgegeven.
Het aantal breuken per rd in T 4 DNA in oplossing bleek, afhankelijk
van het preparaat, ongeveer 10 tot 10 maal zo groot te zijn a l s bij de
proeven in hoofdstuk VI, wEiarbij de faag werd bestraald in een beschermend
medium. Bij bestraling van DNA in oplossing kan dus de directe werking
van straling worden verwaarloosd.
T 4 DNA in HMP bleek onder stikstof veel gevoeliger te zijn dan onder
zuurstof, zowel wat betreft de .produktie van enkelstrengbreuken a l s die van
dubbelstrengbreuken. Bovendien bleek er een grote variatie te bestaan
(groter nog dan blijkt uit de in tabel VII.l samengevatte proeven) in de protectiefactor van zuurstof. Deze variatie moet vermoedelijk worden toegeschreven aan verschillen in zuiverheid van de DNA preparaten. Om een indruk te krijgen van de zuiverheid werd een kleine hoeveelheid van het biologisch a c t i e v e , enkelstrengige 0 X 1 7 4 DNA a l s een biologisch a c t i e v e indicator toegevoegd. Na de bestraling werd de biologische activiteit gemeten op bacterie-sferoplasten. Inderdaad bleek, dat de gevonden Dg^ vijftot tienmaal zo groot was a l s de waarde van 110 rd, die werd verwacht op
grond van proeven van Blok en Verheij (1968). Dit geldt voor bestraling onder zuurstof. Bij bestraling onder stikstof was de D,y ongeveer 80 rd, dat
is niet veel hoger dan de waarde van 60 rd, die door Blok en Verheij (1967)
werd gevonden voor preparaten van <^174 DNA gemengd met gedenatureerd
kalfthymus DNA (totale DNA concentratie 50 / i g / m l ) .
Deze resultaten betekenen vermoedelijk dat het gebruikte T 4 preparaat
onzuiverheden bevatte met een grote affiniteit voor OH radicalen, doch niet
voor reducerende radicalen. Worden deze l a a t s t e door zuurstof geëlimineerd,
dan geeft dit een sterke verlaging, zowel voor de biologische gevoeligheid
van ( ^ 1 7 4 DNA a l s van de opbrengst aan breuken.
Onder N - O werd ongeveer dezelfde stralingsgevoeligheid gevonden a l s
onder N«. De betekenis hiervan wordt later besproken.
"Crosslinks"
In principe kunnen covalente bindingen ("crosslinks") ontstaan van de
volgende typen:
1. " C r o s s l i n k s " tussen twee gedeelten van eenzelfde streng van een molecuul.
2 . " C r o s s l i n k s " t u s s e n de twee strengen van eenzelfde molecuul.
3 . " C r o s s l i n k s " tussen twee verschillende moleculen.
De tweede soort en misschien ook de eerste soort kan leiden tot stukken
DNA die renatureren a l s de oplossing na behandeling met loog wordt ge71
neutraliseerd. Deze gerenatureerde stukken nemen in een C s C l gradiënt
een plaats in, die verschillend is van die van gedenatureerd DNA. Bij
" c r o s s l i n k s " tussen twee verschillende moleculen ontstaat een complex
met een groter molecuulgewicht en een grotere sedimentatiecoëfficiënt.
Volgens Hagen (1967) ontstaan bij bestraling deze drie soorten " c r o s s l i n k s " . In het' hier te beschrijven onderzoek werden alleen de soorten onderzocht die aanleiding geven tot renaturering.
Voor het onderzoek naar de vorming van covalente bindingen t u s s e n de
twee strengen van eenzelfde molecuul werd T4 DNA bestraald onder stikstof in concentraties van 60 en 150 /xg/ml. Als buffer werd zowel HMP a l s
SSC gebruikt. De dosis bedroeg 8 krd en het aantal enkelstrengbreuken in
de bestraalde preparaten varieerde van 1000 tot 4000 per DNA molecuul.
Na bestraling werd het DNA met loog behandeld, geneutraliseerd en gecentrifugeerd in C s C l (zie hoofdstuk III). Uit de extinctiepatronen die na het
bereiken van evenwicht in de gradiënt werden verkregen (zie hoofdstuk VI,
paragraaf 4), bleek dat per 40 enkelstrengbreuken minder dan één " c r o s s link" werd gevormd.
l fl,'
a
u
c
S
JU^
,
meniscus
Ä'
dichtheid
Fig. VII.4
Evenwichtscentrifugering in CsnSOx van bestraald DNA na alkalische denaturering
en neutraliserin^. Bestraling met 8 krd in HMP onder stikstof. Centrifugering van
ongeveer 2 fJLg DNA gedurende 16 uur bij 44.770 rpm en kamertemperatuur. De dichtheid van gedenatureerd DNA in CSJSOA hangt af van de verhouding van de hoeveelheid Hg^ en de hoeveelheid enkelstrengig, DNA. Deze verhouding was niet
voor alle experimenten dezelfde.
a) Mengsel van dubbelstrengig onbestraald DNA (dichtheid 1,431) en gedenatureerd
onbestraald DNA (dichtheid 1,554), gecentrifugeerd in een enkelsector cel.
b) Mengsel van gedenatureerd bestraald en gedenatureerd onbestraald DNA (dichtheid mengsel 1,58). Het referentiegedeelte van de dubbelsector cel bevatte CsnSO«.
72
Aangezien in een C s n S O . gradiënt in aanwezigheid van Hg
een betere scheiding tussen dubbelstrengig en enkelstrengig DNA kan worden verkregen, werden eveneens enkele evenwichtssedimentaties in CsnSO^ uitgevoerd volgens het voorschrift van Nandi, Wang en Davidson (1965). Deze
experimenten werden verricht met dubbelstrengig kalfthymus DNA. Een
oplossing van 2000 /i.g/mlwerd bestraald onder stikstof met een dosis van
8 krd. Direct na bestraling werd de oplossing verdund tot 50 / i g / m l ; vervolgens werd het DNA gedenatureerd met SCOH en daarna werd de oplossing
geneutraliseerd en gedialyseerd tegen 0,1 M NagSO^. Bij evenwichtscentrifugering in CsgSO^- en 10"^ M HgClg, pH 9,0 (5 x 10"^ M Na^BgO^) konden in het aldus behandelde DNA geen " c r o s s l i n k s " worden aangetoond
(zie figuur VII.4).
3 . Discussie
Bij lage doses neemt het aantal dubbelstrengbreuken lineair toe met de
d o s i s . Hieruit kan worden geconcludeerd dat bij lage d o s e s dubbelstrengbreuken een gevolg zijn van één enkel proces waarbij breuk .van beide DNA
strengen op tegenover elkaar liggende plaatsen optreedt. Bij hogere d o s e s
ontstaan ook dubbelstrengbreuken a l s gevolg van twee afzonderlijk gevormde enkelstrengbreuken, die op korte afstand van elkaar (overeenkomend met
molecuulgewicht a) in de verschillende strengen liggen. Door andere onderzoekers werden alleen dubbelstrengbreuken van het laatstgenoemde type
waargenomen. Dit moet waarschijnlijk worden toegeschreven aan het feit
dat zij a l s uitgangsmateriaal heterogeen DNA gebruikten en zich bedienden
van minder nauwkeurige analysemethoden. Bovendien werd DNA gebruikt
met een molecunlgewicht dat veel kleiner was dan dat van T 4 . Uit formule
IV.10 volgt dat de relatieve bijdrage van enkelstrengbreuken tot het ontstaan van dubbelstrengbreuken toeneemt naarmate M kleiner wordt. Hierdoor
zijn met laag-moleculair DNA beide processen moeilijker gescheiden waar
te nemen.
Voor %f worden in de literatuur sterk uiteenlopende waarden vermeld.
Door Thomas (1956) werd bij de enzymatische afbraak van DNA (200 ftg/ml,
in 0,2 M NaCl) een waarde gemeten die overeenkomt met s l e c h t s twee nucleotidenparen. Hagen (1967) vond bij bestraling van kalfthymus DNA (200
fJ.g/ml, in 0,01 M NaCl) een waarde die overeenkomt met drie nucleotidenparen. Scholes, Ward en Weiss (1960) vonden met behulp van extinctiemetingen en door middel van een enzymatische bepaling van fosfaateindgroepen dat de dubbele helix zich per enkelstrengbreuk over een afstand van
16 nucleotidenparen ontwindt (DNA concentratie 1000 / i g / m l , in water). Dit
zou betekenen, dat bij twee enkelstrengbreuken met een onderlinge afstand
van minder dan 16 nucleotidenparen een dubbelstrengbreuk optreedt.
P e a c o c k e en Preston (1960a) komen op grond van hun resultaten ver-
73
kregen uit viscositeitsmetingen aan bestraalde DNA oplossingen (4300 /.tg/
ml, waarschijnlijk in water), tot de formule
G^^ = 4,6 (2s + 1)-^«
(1)
die een verband geeft tussen het aantal enkelstrengbreuken dat ontstaat
per 100 eV stralingsenergie, gedissipeerd in de oplossing, en het aantal
nucleotidenparen (s) dat t u s s e n twee enkelstrengbreuken mag liggen om
nog een dubbelstrengbreuk tot gevolg te kunnen hebben. H e l a a s hebben
P e a c o c k e en Preston niet het aantal enkelstrengbreuken bepaald. Uit de
resultaten van Collins, Okada, Scholes, Weiss en Wheeler (1965) die voor
bestraling van 4300 jJ-g DNA/ml, in water, onder lucht een waarde voor G^g
van 0,8 vonden, volgt voor s een waarde van 16 nucleotidenparen.
P e a c o c k e en Preston gaan niet, zoals Scholes, Ward en Weiss, van de
thans toch wel zeer waarschijnlijk lijkende veronderstelling uit, dat de gevonden partiële denaturering van DNA door bestraling een gevolg is van
enkelstrengbreuken. Voor de afzonderlijk gemeten denaturering vinden zij
38 ontkoppelde basenparen per 100 eV (1960b) en in een latere publikatie
vermeldt deze groep zelfs 60 basenparen per 100 eV (Lloyd en P e a c o c k e ,
1963).
De bovengenoemde auteurs houden bij de bespreking van hun resultaten
geen rekening met de invloed van de ionensterkte op de waarde van j j . Deze invloed zal ongetwijfeld bestaan daar bij een ionensterkte van 10- tot
1 0 ' en een DNA concentratie kleiner dan 10/U.g/ml zelfs een spontane denaturering van de dubbel-helixstructuur optreedt (Inman en Jordan, 1960).
Uiteraard zullen ook de temperatuur en de pH van invloed zijn op de waarde van ^ .
Uit de experimentele gegevens van Freifelder (1966a) betreffende bestraling van DNA in oplossing, kan een waarde voor w worden berekend
overeenkomende met 120 nucleotidenparen. T e v e n s vond Freifelder voor
bestraling van bacteriofagen onder bestralingscondities die overeenkomen
met die van de experimenten beschreven in hoofdstuk VI, veel hogere opbrengsten aan dubbelstrengbreuken dan die welke in tabel VI.1 zijn vermeld.
Het is niet uitgesloten dat hij het DNA heeft blootgesteld aan hydrodynamische schuifspanningen, bijvoorbeeld bij het inbrengen van het DNA in de
centrifugecel. Zoals uit de resultaten in paragraaf 2 blijkt, wordt door het
aanleggen van hydrodynamische schuifspanningen (doorleiden van een gas)
het aantal dubbelstrengbreuken in een bestraald T4 DNA preparaat verhoogd. Gebruikt men het aantal dubbelstrengbreuken na gasdoorleiding a l s
uitgangspunt, dan vindt men voor n een waarde, die ongeveer overeenkomt
met een afstand van 20 nucleotidenparen t u s s e n twee in tegenovergestelde
strengen liggende enkelstrengbreuken. De door ons gevonden afstand van
74
5 nucleotidenparen werd verkregen met zorgvuldige vermijding van schuifspanningen en in aanwezigheid van zout. Er i s voorshands geen reden om
de gevonden afstand in twijfel te trekken.
Bij de bestraling van DNA in oplossing is het aantal dubbelstrengbreuken per enkelstrengbreuk in het gebied van lage d o s e s , waar beide lineair
toenemen, 0,008 à 0,04. Dit is lager dan de verhouding 0,05 à 0,08, die bij
bestraling van de complete bacteriofaag werd gevonden. De grote variatie
in deze verhouding onder condities van indirecte werking is vermoedelijk
te wijten aan verschillen in aard en concentratie van onzuiverheden die de
r a d i c a a l r e a c t i e s beïnvloeden.
De waarden voor G
in tabel VII.l zijn opvallend laag vergeleken met
de hoeveelheid prïmair gevormde radicalen in water. Dit is waarschijnlijk
een gevolg van de lage DNA concentratie, waarbij de invloed van onzuiverheden relatief groot is (Blok en Verheij, 1968). De laagste DNA concentratie
waarbij Collins, Okada, Scholes, Weiss en Wheeler (1965) G^^ bepaalden,
bedroeg 1000 fJ-g/ml (in water). Zij vonden bij bestraling onder lucht de
waarde 0,4. Bij een DNA concentratie van 60 /^g/ml hebben zij echter wel
het aantal beschadigde basen per 100 eV bepaald. Dit was een factor 2,4
lager dan bij 1000 fJ,g/ml. Indien ook G met een dergelijke factor wordt
verlaagd, i s , althans voor bestraling onder stikstof, de in tabel VII.l vermelde opbrengst aan enkelstrengbreuken, in overeenstemming met het werk
van genoemde a u t e u r s .
De grote bescherming door zuurstof, die blijkt uit tabel VII.l, wijst erop
dat de aantasting van het DNA onder stikstof voornamelijk geschiedde door
reactie met reducerende radicalen, dat wil zeggen met H of e" . De OH radicalen werden in deze preparaten kennelijk geëlimineerd door reactie met
onzuiverheden.
Onder NnO werd dezelfde stralingsgevoeligheid gevonden a l s onder
stikstof. Daar NnO leidt tot de omzetting van e" in OH, waarbij het laats t e radicaal door de onzuiverheden weinig kans kreeg om met DNA te reageren, kan men de conclusie trekken dat er geen effectievç reactie van e"
met DNA optreedt of d a t e ' eveneens door onzuiverheden wordt geëlimir
neerd. Bij de bestralingsexperimenten met T4 DNA in oplossing, in afwezigheid van zuurstof, zouden dus H radicalen de voornaamste oorzaak zijn
van breuken en ook van de biologische inactivering van het toegevoegde
<^X174 DNA.
In het onderzoek naar de vorming van " c r o s s l i n k s " door middel van
evenwichtssedimentatie konden geen " c r o s s l i n k s " worden aangetoond. Gezien de gevoeligheid van deze experimenten kan hieruit de conclusie worden getrokken dat per 40 enkelstrengbreuken hoogstens één " c r o s s l i n k "
wordt gevormd. H e l a a s zijn geen vergelijkbare literatuurwaarden voor handen. Door Hagen (1967) worden alleen kwalitatieve gegevens vermeld. Door
75
middel van grenslaaganalyses van sedimentatie-experimenten in een analytische ultracentrifuge vond Hagen dat de verhouding van m.^^ en m^^ voor
DNA na bestraling in oplossing toeneemt met de s t r a l i n g s d o s i s . Hieruit
concludeert hij dat bij bestraling een aanzienlijk aantal " c r o s s l i n k s " wordt
gevormd. Het is niet duidelijk op grond van welke theoretische overwegingen Hagen uit de verhoging van de verhouding van m ^ en m concludeert
tot de vorming van " c r o s s l i n k s " . De verhoging van de verhouding moet vermoedelijk aan andere oorzaken worden toegeschreven, zoals verstoring van
de grenslaag door sedimentatie anomalieën (Aten en Cohen, 1965; Triebel,
1968).
76
HOOFDSTUK VIII
ALGEMENE DISCUSSIE
1. Breuken door directe werking
Het feit dat men bij bestraling van DNA, terwijl dit zich in de bacteriofaag bevindt, veel minder dubbelstrengbreuken dan enkelstrengbreuken
vindt, zou men kunnen verklaren met twee verschillende mechanismen.
a) De beide enkelstrengbreuken in het DNA, die gezamenlijk tot een
dubbelstrengbreuk leiden, worden teweeggebracht door twee verschillende
i o n i s a t i e s afkomstig van dezelfde primaire wisselwerking.
b) Indien in een streng van een DNA molecuul een breuk wordt a a n g e bracht, is er een bepaalde kleine k a n s , dat door secundaire r e a c t i e s t e v e n s
een breuk in de complementaire streng ontstaat.
Stelt men in geval a) de kans op een enkelstrengbreuk in het DNA per
ionisatie in het inwendige van de bacteriofaag gelijk aan f, dan i s , indien
per primaire ionisatie in totaal x i o n i s a t i e s plaatsvinden, de kans op een
enkelstrengbreuk per ionisatie te schrijven a l s xf. De kans op een tweede
enkelstrengbreuk ten gevolge van dezelfde primaire ionisatie is dan (x-l)f
en %{x-l){ a l s men a l s voorwaarde s t e l t , dat deze tweede breuk in de complementaire streng.wordt aangebracht. De kans op een d u b b e l s t r e n ^ r e u k
per primaire ionisatie wordt dan }4(x-l).x.f en de verhouding Y j ^ / Y ^ g is
dan gelijk aan /^(x-l)f.' De waarde van x is niet nauwkeurig bekend, doch
bedraagt vermoedelijk ongeveer 2 (zie bijvoorbeeld Hutchinson en Pollard,
1961). Aangezien in dit model Y . evenredig is met f en Y met f, moet
men, indien zuurstof een vergroting van f ten gevolge heqft, een groter effect van zuurstof op Y j dan op Y
verwachten.
In geval b) is de verhouding Y , /Y
onafhankelijk van f. Het effect
van zuurstof is moeilijk te voorspellen.
We kunnen de resultaten in tabel VI.1 indelen in de bestralingsexperimenten in aanwezigheid van SH-verbindingen (in een hoge concentratie) en
die in afwezigheid van SH-verbindingen'. In afwezigheid van SH-verbindingen blijken er meer enkelstrengbreuken te ontstaan dan in aanwezigheid
van deze stoffen. Dit zou kunnen wijzen op een herstel van enkelstrengbreuken door SH-verbindingen. Het is echter ook mogelijk dat in afwezigheid van SH-verbindingen enkelstrengbreuken ontstaan a l s gevolg van reactie van het DNA met radicalen die in de onmiddellijke omgeving van h e t
77
DNA molecuul in de faag worden gevormd. Het is immers bekend dat de faag
behalve DNA ook nog andere stoffen, voornamelijk water, bevat en dat in
de faag gebiedjes voorkomen waar zich geen DNA bevindt (Klimenko, Tikchonenko en Andreev, 1%7). Uit de resultaten in tabel VI.1 kan voor geval
a) worden berekend dat bij een hoge SH-concentratie onder stikstof f gemiddeld 0,15 en onder zuurstof gemiddeld 0,14 bedraagt. Daar ongeveer 16%
van de bindingselektronen in het DNA direct betrokken is bij het in stand
houden van de suikerfosfaatketen, heeft f een redelijke grootte. Anderzijds
blijkt echter de berekende waarde van f onafhankelijk te zijn van de aanwezigheid van zuurstof, hetgeen in strijd is met het experimentele r e s u l t a a t
dat zuurstof het aantal breuken verhoogt.
In afwezigheid van SH-verbindingen is f onder stikstof gelijk aan 0,08
en onder zuurstof gelijk aan 0,13. Dit zou in overeenstemming zijn met model a ) . Men mag echter ook de mogelijkheid niet uitsluiten, dat model b)
van toepassing is en dat zuurstof de opbrengst aan enkel- en dubbelstrengbreuken in gelijke mate verhoogt, doch dat deze verhoging bij de enkelstrengbreuken gedeeltelijk ongedaan wordt gemaakt omdat zuurstof tevens
reducerende radicalen, gevormd in het water in de bacteriofaag, elimineert.
Men zou dan moeten aannemen, dat zulke radicalen voornamelijk enkelstrengbreuken veroorzaken zonder secundaire r e a c t i e s , die tot dubbelstrengbreuken leiden.
De experimenten laten dus niet een conclusie toe omtrent de geldigheid
van mechanisme a) of b) of wellicht een combinatie van beide.
Over de werking van zuurstof is weinig bekend. Deze zou kunnen berusten op een voorkoming van recombinatie van ladingen, bijvoorbeeld doordat zuurstof met een elektron op het DNA reageert. Dit is geen onredelijke
veronderstelling, omdat de kans op recombinatie in een DNA molecuul of de
directe omgeving ervan, veel groter zou kunnen zijn dan in water, omdat de
polariseerbaarheid en dus ook de dielektrische constante in of vlakbij een
DNA molecuul vergeleken met die van water, laag mag worden verondersteld.
Een tweede mogelijkheid zou kunnen zijn dat een primaire beschadiging
van de desoxyribose of de base onder invloed van 0 „ tot een secundaire
breuk leidt.
2 . Breuken door indirecte w'erking
Met de in hoofdstuk VII beschreven experimenten werd aangetoond dat
bij bestraling van DNA in oplossing met lage doses het aantal dubbelstrengbreuken lineair toeneemt met de d o s i s . Het in de voorgaande paragraaf gegeven model a) is hierop echter zeker niet van t o e p a s s i n g . Dit
blijkt uit de volgende berekening. Zoals beschreven in hoofdstuk VII zijn
bij lage d o s e s de dubbelstrengbreuken een gevolg van reactie van één of
78
meer radicalen uit hetzelfde groepje ionen met beide DNA strengen. Bij bestraling onder stikstof worden per 100 eV stralingsenergie gedissipeerd in
het DNA molecuul (hoofdstuk VI) slechts 0,04 dubbelstrengbreuken geproduceerd. Voor de stralingsenergie die in de oplossing, vlak naast het DNA
molecuul wordt gedissipeerd zal de opbrengst vermoedelijk nog lager zijn.
Per 100 eV stralingsenergie, gedissipeerd in 1 ml oplossing, komt bij een
DNA concentratie van 67 Mg/ml 67 x 10-^x100 eV in het DNA terecht. Dit
geeft 67 x lO"* x 100 x ^ » ^ = 2,68 x lO** dubbelstrengbreuken als gevolg
van de directe werking. Gjg bedraagt echter 0,0035 (tabel VII.l). Dus vrijwel alle dubbelstrengbreuken worden veroorzaakt door ionisaties in het
water. Als wordt aangenomen dat per 100 eV gedissipeerd in een cylinder
met straal R om de DNA keten 0,04 dubbelstrengbreuken ontstaan, hetgeen
aan de hoge kant is, dan is voor een stuk in een DNA molecuul ter lengte
van bijvoorbeeld 34 Ä (dit is de lengte van een stuk van 10 nucleotidenparen met een molecuulgewicht van 6000) een cylindrische watermantel nodig met een gewicht van 2 68 x 10-^ * ^ ^ ^ gram, waarin N het getal van
Avogadro voorstelt. Als we het gewicht van de watermantel gelijkstellen
aan het volume van de cylinder met een lengte van 34 Â en een straal R,
dan leert deze berekening dât R ongeveer 300 A moet bedragen om het aantal dubbelstrengbreuken te kunnen verklaren. De afstand van 5 nucleotidenparen, waarbinnen zoals in hoofdstuk VII is uiteengezet twee enkelstrengbreuken moeten liggen om een dubbelstrengbreuk te kunnen geven, bedraagt
echter veel minder dan 300 Ä, namelijk slechts 17 Ä. Het is erg onwaarschijnlijk, mede gezien het geringe aantal radicalen dat uit een groepje
ionen ontsnapt, dat twee radicalen afkomstig van één primaire ionisatie op
een afstand van het DNA molecuul die vele malen groter is dan 17 Ä een
dubbelstrengbreuk veroorzaken. Het is daarom veel aannemelijker dat een
primair gevormde' enkelstrengbreuk in de ene streng via secundaire reacties
leidt tot een tweede enkelstrengbreuk in de andere streng. Dit zou betekenen (tabel VII.l) dat 1 tot 3% van de enkelstrengbreuken gepaard gaat met
een tweede enkelstrengbreuk in de complementaire streng.|
Er zij op gewezen dat de gevonden dubbelstrengbreuken niet een gevolg
kunnen zijn van een grotere gevoeligheid van het DNA voor hydrodynamische schuifspanningen na het aanbrengen van enkelstrengbreuken. Dit blijkt
uit het feit dat' het aantal dubbelstrengbreuken als functie van de dosis
goed reproduceerbaar te meten i s . Bovendien vindt men bij breuk door
schuifspanningen, zoals in hoofdstuk VII werd betoogd, een te grote waarde voor het maximale aantal nucleotidenparen tussen twee enkelstrengbreuken, die samen een dubbelstrengbreuk veroorzaken. De gevonden waarde van 5 nucleotidenparen is echter zo laag, dat hydrodynamische schuifspanningen als oorzaak van dubbelstrengbreuken uitgesloten kunnen worden.
79
De produktie van breuken bij indirecte werking leidt dus ondubbelzinnig
tot mechanisme b (dubbelstrengbreuk door secundaire r e a c t i e s ) . Er is dan
geen reden om te veronderstellen, dat dit mechanisme bij directe werking
geen rol zou s p e l e n .
3 . De produktie van breuken in het DNA van levende cellen
De opbrengst aan enkelstrengbreuken per 100 eV in het DNA g e d i s s i peerde stralingsenergie is bij bestraling van de bacteriofagen T4 of T7 ongeveer even groot a l s men uit de literatuurgegevens kan berekenen voor het
DNA van bacterie- en zoogdiercellen. Het ligt dus voor de hand te veronderstellen dat de bestralingscondities van DNA in cellen vergelijkbaar zijn
met die in bacteriofagen en dat de directe werking de voornaamste rol
speelt.
Deze veronderstelling wordt ook gesteund door de volgende overwegingen. Over de produktie van dubbelstrengbreuken in het DNA in cellen zijn
weliswaar geen nauwkeurige literatuurwaarden bekend, maar a l s voor Y ,
in de bacterie E.coli B / r evenals voor DNA in bacteriofagen een waarde
van 0,04 wordt aangenomen, komt dit overeen met een 37% overlevingsdosis
van 12 krd, zoals te berekenen is met behulp van het bekende molecuulgewicht van het DNA in deze bacterie (2 x 10 dalton. Cairns, 1963). Indien
ook voor cellen de opbrengst aan dubbelstrengbreuken door zuurstof wordt
verdubbeld, verwacht men onder zuurstof een waarde van 6 krd. Deze berekende waarden van de Dn- blijken vrij dicht bij de in de literatuur vermelde
experimentele waarden te liggen. Voor E . c o l i B/r, waarvoor geen h e r s t e l
van dubbelstrengbreuken maar wel van enkelstrengbreuken is aangetoond,
is de gevoeligheid enigszins afhankelijk van de experimentele omstandigheden, maar de gemiddelde waarde voor de 37% overlevingsdosis bedraagt
in zuurstof ongeveer 5 krd en in stikstof 10 tot 13 krd (Howard-Flanders
en Alper, 1957; Munson, Neary, Bridges en Preston, 1968). Dit wijst erop
dat de indirecte werking van de straling via radicalen, in de omgeving van
het DNA van de cel gevormd, van weinig betekenis is voor de vorming van
dubbelstrengbreuken. Samenvattend lijken de volgende conclusies daarom
gere chtvaardigd :
a) In E . c o l i B / r worden de dubbelstrengbreuken voornamelijk veroorzaakt door de directe werking van ioniserende straling.
b) Daar, z o a l s reeds in hoofdstuk II werd gesuggereerd en door de hier
gegeven berekening wordt bevestigd, dubbelstrengbreuken de voornaamste
oorzaak van inactivering van E.coli B / r zijn, kan het effect van zuurstof
op de overleving grotendeels worden verklaard uit het effect van zuurstof
op de produktie van dubbelstrengbreuken.
Tenslotte volgt uit de r e s u l t a t e n , vermeld in dit proefschrift, duidelijk
(hoofdstuk VI) dat zuurstof een s e n s i b i l i s e r e n d e werking heeft, ook zonder
80
dat SH-verbindingen aanwezig zijn, al wordt deze werking voor wat betreft
de biologische activiteit van bacteriofagen grotendeels opgeheven door een
bescherming van de eiwitmantel door zuurstof.
81
SUMMARY
The principal aim of the work described in this t h e s i s was to obtain
quantitative data on the production of breaks in DNA by y-rays and on their
role in the inactivation of micro-organisms. The average number of breaks
per molecule for a population of DNA molecules was measured using the
technique of sedimentation through a sucrose gradient in a preparative ultracentrifuge.
Literature data on the problem are d i s c u s s e d in chapter II. Details of
methods and materials are described in chapter III. In chapter IV some formulae are derived for the molecular weight distribution obtained after introducing random breaks in an initially monodisperse population of chain molecules.
When a polydisperse sample of DNA is sedimented through a sucrose
gradient and the concentration of DNA is measured a s a function of s e d i mentation d i s t a n c e , the profile obtained can in principle be used to calculate the distribution of molecular weights in the sample provided that the
relation between sedimentation coefficient and molecular weight is known.
In order to avoid errors due to viscosity of the sample, distortion of the
gradient during fractionation, loss of material on the wall of the centrifuge
tube e t c . , a number of precautions is n e c e s s a r y . T h e s e have been systematically examined and a complete calibration of the method is reported both
for single and double stranded DNA in chapter V.
It is shown that if random breaks are introduced into DNA molecules by
means of gamma irradiation, the average number of breaks per molecule can
be calculated from the sedimentation distance corresponding to the maximum of the distribution of broken DNA in the gradient.
Most of the experimental work was concerned with an investigation of
the effect of gamma rays on the DNA of bacteriophages T4 and T 7 . After
irradiation of the phage the DNA was isolated and analysed by s u c r o s e
gradient sedimentation. Irradiation w a s carried out in the presence of organic compounds in order to protect the protein coat of the phage a g a i n s t
free radicals produced in water (chapter VI).
In the a b s e n c e of oxygen the number of double strand breaks per krd
per T4 DNA molecule amounts to 0.0054, whereas it is 0.011 in oxygen
saturated phage s u s p e n s i o n s . The yield of single strand breaks is 10 to 20
times higher than that of double strand breaks and in oxygen the yield of
single strand breaks is on the average 1.5 times larger than in nitrogen.
82
It is shown that for bacteriophage the increased lethality due to break
production in the presence of oxygen is masked by a protective action of
oxygen against other types of damage. If sulphydryl compounds are added
the yield of breaks is not much affected but the amount of other damage is
considerably reduced. Under such conditions DNA breakage becomes the
main cause of lethality and the radiosensitivity of the phage is about twice
a s large in oxygen a s in nitrogen.
Single strand s c i s s i o n occurs much more frequently than particle inactivation and therefore only a small fraction of such lesions can be lethal.
A large part of the inactivation can be accounted for by double strand
breaks, but it is shown that a third type of damage either in the protein or
in the DNA must play a role. In T7 this type of damage is more importa'nt
than in T4.
In addition to irradiation of DNA in complete bacteriophage particles
irradiation experiments were also carried out with DNA in solution (chapter
VII).
Irradiated double stranded T4 DNA appeared to be much more shear
s e n s i t i v e than unirradiated T4 DNA. The rate of production of single strand
breaks was 40 to 120 times higher than that of double strand breaks. The
yield of both single and double strand breaks increased linearly with d o s e .
Only at higher doses double strand breaks did occur due to single strand
breaks lying close together in opposite s t r a n d s . It could be shown that
such a double strand break is introduced if two single strand breaks have
occurred at a distance of 5 nucleotide pairs or l e s s .
T4 DNA in solution appeared to be much more radiosensitive under nitrogen than under oxygen. Evidence is presented that the large and variable
protection by oxygen is due to scavenging of OH radicals by impurities in
t h e s e experiments. Under N „ 0 the radiosensitivity was the same a s under
nitrogen. This indicates that either e" is not capable of producing breaks
or is a l s o scavenged by impurities. It is therefore concluded that in the
absence of oxygen H radicals were the main cause of breajcs.
A general discussion is given in the last chapter. It is demonstrated
that in the case of indirect action double strand breaks arise from secundary reactions following radical attack on one strand. In this way a single
strand break leads to a break in the complementary strand with an efficiency of about 2%. The same mechanism cannot be excluded for direct action.
Furthermore evidence is presented that in E.coli B/r lethality is due
to double strand breaks which are produced by direct action of ionizing radiation.
83
LITERATUUR
Adams, M.H. (1959), The b a c t e r i o p h a g e s . Interscience, New York.
Alexander, N.M. (1958), Anal.Chem., 30, 1292.
Alexander, P . , L e t t , J . T . , Dean, C . J . (1965), Prog.Biochem.Pharmacol., 1,
22.
Allen, A . 0 . (1961), The radiation chemistry of water and aqueous s o l u t i o n s .
Van Nostrand C o m p . I n c , London.
Alper, T. (1954), J.Gen.Microbiol., 1 1 , 3 1 3 .
Anderson, A.W., N o r d a n , H . C . , C a i n , R . F . , Parrish, G., Duggan,G.E.(1956),
Food T e c h n o l . , 10, 575.
Aten, J . B . T . (1965), Dissertatie L e i d e n .
Aten, J . B . T . , Cohen, J.A. (1965), J.Mol.Biol., 12, 537.
Baker, A., Ormerod, H.G., Dean, C . J . , Alexander, P . (1966), Biochim. Biophys.Acta, 114, 169.
Baxendale, J . H . (1965), In " P u l s e R a d i o l y s i s " , pag. 15, uitgegeven onder
redactie van Ebert et a l . . Academie P r e s s , London en New York.
Blok, J o h . (1965), Persoonlijke mededeling.
Blok, J o h . (1967), Proceedings of the 3rd International Conference of Radiation R e s e a r c h , pag. 423, uitgegeven onder redactie van S i l i n i , North
Holland Publishing Company, Amsterdam.
Blok, Joh., Luthjens, L.H., Roos, A.L.M. (1967), Radiation R e s . , 3 0 . 4 6 8 .
Blok, J o h . , Verheij, W.S.D. (1967), Persoonlijke mededeling.
Blok, J o h . , Verheij, W.S.D. (1968), Radiation R e s . , 34. 689.
Brakke, M.K. (1963), Anal.Biochem., 5, 2 7 1 .
Britten, R . J . , Roberts, R . B . (1960), Science, 131, 3 2 .
Burgi, E . , Hershey, A.D. (1963), Biophysical J . , 3 , 309.
C a i m s , J. (1963), J.Mol.Biol., è . 208.
Cohen, G., Eisenberg, H. (1968), Biopolymers, 6, 1077.
Collins, B . , Okada, S., Scholes, G., Weiss, J . J . , Wheeler, C M . (1965), Radiation R e s . , 2 5 , 526.
Cox, R.A., Overend, W.G.,- P e a c o c k e , A.R., Wilson, S. (1958), Proc.Roy.
Soc.London, B149. 5 1 1 .
Crabtree, H.G., Cramer, W. (1933), Proc.Roy.Soc.London, B113. 226, 238.
Dainton, F . S . , Watt, W.S. (1963), Proc.Roy.Soc.London, A275. 447.
D a n i e l s , M., Scholes, G., Weiss, J . J . , Wheeler, C M . (1957), J . C h e m . S o c ,
pag. 226.
Dean, C.J., Feldschreiber, P . , L e t t , J . T . (1966), Nature, 209, 49.
84
Deschner, E . E . , Gray, L.H. (1959), Radiation R e s . , 1]_, 115.
Dewey, D.L., Stein, G. (1968), Nature, 217. 3 5 1 .
Duve, C. de, Berthet, J., Beaufay, H. (1959), Progress in Biophysics and
Biophysical Chemistry, pag. 325, Pergamon P r e s s .
Eigner, J., Doty, P . (1965), J.Mol.Biol., 12, 549.
Eigner, J., Schildkraut, C , Doty, P . (1962), Biochim.Biophys.Acta, 5 5 , 1 3 .
Eigner, J., Stouthamer,-A.H., Sluys, I. van der, Cohen, J.A. (1963), J.Mol.
Biol., 6, 6 1 .
Ephrussi-Taylor, H., Latarjet, R. (1955), Biochim.Biophys.Acta, 16, 183.
F i e r s , W., Sinsheimer, R.L. (1962), J.Mol.Biol., 5, 408,
Freifelder, D. (1965), Proc.Natl.Acad.Sci., 54, 128.
Freifelder, D. (1966a), Radiation R e s . , 29, 329.
Freifelder, D. (1966b), Virology, 30, 328.
Freifelder, D. (1968), J.Mol.Biol., 35, 303.
Freifelder, D., Davison, P . F . (1962), Biophysical J., 2, 235.
Ginoza, W. (1963), Nature, 1J9, 453.
Ginoza, W., Vessey, K., Miller, B.C. (1966), Abstracts Biophysical Cong r e s s , Wenen, pag. 585.
Guthrie, G.D., Sinsheimer, R . L . (1963), Biochim.Biophys.Acta, 72, 290.
Hagen, U. (1967), Biochim.Biophys.Acta, 134, 45.
Hagen, U., Wellstein, H. (1965), Strahlentherapie, 128, 565.
Hayon, E . , Moreau, M. (1965), J . C h i m . P h y s . , 62, 3 9 1 .
Hearst, J . E . (1962), J.Mol.Biol., 4, 415.
Hems, G. (1960), Nature, 186, 710.
Hersch, P.A. (1960), Anal.Chem., 32, 1030.
Hershey, A.D., Rotman, R. (1949), Genetics, 34, 44.
Hewitt, H . B . , Read, J. (1950), Brit.J.RadioL, 2 3 , 416.
Hollaender, A., Stapleton, G.E., Martin, F . L . (1951), Nature, 167, 103.
Howard-Flanders, P . (1960), Nature, 186, 485.
Howard-Flanders, P . , Alper, T. (1957), Radiation R e s . , ]_, 518.
Howard-Flanders, P . , Levin, J., Theriot, L. (1963), Ra.^iation R e s . , 18,
593.
Hutchinson, F . , Pollard, E. (1961), in "Mechanisms in Radiobiology", pag.
1, uitgegeven onder redactie van Errera en Forsberg, Academic P r e s s ,
New York en London.
Inman, R . B . , Jordan, D.O. (1960), Biochim.Biophys.Acta, 4 3 , 206.
Kaplan, H. (1966), Proc.Natl.Acad.Sci., 55, 1442.
Katz, S., Schachman, H.K. (1955), Biochim.Biophys.Acta, 18., 2 8 .
Klimenko, S.M., Tikchonenko, T.1. en Andreev, V.M. (1967), J.Mol.Biol.,
23, 523.
Latarjet, R., Ekert, B., Demerseman, P . , (1963), Radiation R e s . , Suppl.3,
. 247.
85
L e a , D.E. (1947), Actions of Radiations on Living C e l l s , Univ.Press.Cambridge.
Lett, J . T . , Caldwell, 1., Dean, C.J., Alexander, P . (1967), Nature. 214. 790.
Lloyd, P.M., P e a c o c k e , A.R. (1963), Proc.Roy.Soc.London, B158, 7 1 .
Lohman, P.H.M. (1968), Mutation R e s . , 6, 449.
Luthjens, L.H., Roos, A.L.M., Blok, Joh. (1966), MBL rapport 1966-13.
Mandell, J.D., Hershey, A.D. (1960), A n a l . B i o c h e m . , ! , 66.
McGrath, R.A., Williams, R.W. (1966), Nature, 212, 534.
Meselson, M., Stahl, F.W., Vinograd, J. (1957), Proc.Natl.Acad.Sci., 43,
581.
Milvy, P . , Pullman, 1. (1968), Radiation R e s . , 34, 265.
Montroll, E.W., Simha, R. (1940), J . C h e m . P h y s . , 8, 7 2 1 .
Munson, R.J., Neary, G.J., Bridges, B.A., Preston, R.J. (1968), Int.J.Rad.
Biol., 13, 205.
Nandi, U.S., Wang, J . C , Davidson, N. (1965), Biochem., 4, 1687.
Nomura, M., Hall, B.D., Spiegelman, S. (1960), J.Mol.Biol., 2, 306.
P a t t e r s o n , M.S., Greene, R.C. (1965), Anal.Chem., 37, 854.
P e a c o c k e , A.R., Preston, B.N. (1960a), Proc.Roy.Soc.London, B153, 90.
P e a c o c k e , A.R., Preston, B.N. (1960b), Proc.Roy.Soc.London, B153, 103.
Rupp, W.D., Howard-Flanders, P . (1968), J.Mol.Biol., 3 1 , 303.
Schans, G.P. van der. Aten, J . B . T . , Knijnenburg, C M . , Meijer, J. (1968),
MBL rapport 1968-2.
Scholes, G., Ward, J . F . , Weiss, J . J . (1960), J.Mol.Biol., 2, 379.
Scholes, G., Weiss, J . J . (1954), Biochem.J., 56, 6 5 .
Sinsheimer, R.L. (1959), J . M o l . B i o l . , ! , 37.
Stent, G.S., Fuerst, C R . (1965), J . G e n . P h y s i o l . , 38, 441.
Studier, F.W. (1965), J.Mol.Biol., U , 373.
Summers, W . C , Szybalski, W. (1967), J.Mol.Biol., 26, 227.
Svedberg, T., P e d e r s e n , K.O. (1940), Die Ultrazentrifuge, Handbuch der
Kolloidwissenschaft Band VII, Steinkopff, Dresden.
Taylor, W.D., Ginoza, W. (1967), Proc.Natl.Acad.Sci., 58, 1753.
Tennent, H.G., Vilbrandt, C F . (1943), J.Am.Chem.Soc, 65, 424.
Thomas, C A . (1956), J . A m . C h e m . S o c , 78, 1861.
Triebel, H. (1968), Biopolymers, 6, 449.
Veldhuisen, G. (1966), Dissertatie Leiden.
Vinograd, J., Bruner, R., Kent, R., Weigle, J. (1963), Proc.Natl.Acad.Sci.,
49, 902.
Watson, J . D . (1950), J.Bacteriol., 60, 697.
Watson, J . D . (1952), J.Bacteriol., 6 3 , 473.
Weiss, J.J . (1964), In " P r o g r e s s in Nucleic Acid Research and Molecular
Biology", 3 , 103, uitgegeven onder redactie van Davidson en Cohn,
Academie P r e s s , London en New York.
86
Zimm, B.H., Crothers, D.M. (1962), Proc.Natl.Acad.Sci., 48, 905.
Zimmer, K.G. (1961), Studies on quantitative radiation biology, Oliver en
Boyd, Edinburgh en London.
87