STUDIE VAN KANKERGENEN IN EMBRYONALE TUMOREN

Academiejaar 2011-2012
STUDIE VAN KANKERGENEN IN
EMBRYONALE TUMOREN
Jolien BERWOUTS
Promotor: dr. ir. K. De Preter
Begeleider: drs. C. Kumps
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader
van de opleiding tot MASTER IN DE GENEESKUNDE
“De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen
en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van
het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden
bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”
Datum
(handtekening student(en))
(handtekening promotor)
(Naam student)
(Naam promotor)
Dankwoord
Oncologie en pediatrie waren steeds mijn grote interesses. Toen ik de titel van dit onderwerp in de lijst
voor de masterproef las, was ik direct enthousiast. Bovendien bood dit onderwerp me de kans om eens
niet naar het stellen van een diagnose toe te werken, maar om vanuit de diagnose te vertrekken en op
basis daarvan moleculair onderzoek uit te voeren. Er werd mij op deze manier ook de kans geboden
om in een labo te werken, wat in onze opleiding nauwelijks aan bod komt, en heb ik kunnen
exploreren wat wetenschappelijk onderzoek inhoudt.
De oorspronkelijke titel van deze thesis was “Neuroblastoom en de mogelijkheden tot het ontwikkelen
van nieuwe moleculaire therapieën”. Daar er tijdens mijn eerste werkjaar aan deze thesis ook
experimenten in het kader van Ewing tumoren uitgevoerd werden, leek het onderwerp “Studie van
kankergenen in embryonale tumoren” een betere omschrijving voor het onderwerp van deze thesis.
Ten slotte zou ik alle mensen willen bedanken die deze kans voor me mogelijk gemaakt hebben.
Hierbij denk ik vooral aan mijn promotor, Dr. K. De Preter, en mijn begeleidster, drs. Candy Kumps.
Mijn begeleidster zou ik extra willen bedanken voor haar vele geduld en tijd, haar kennis en alle
informatie die ze mij heeft bijgebracht. Ook de medestudenten in het cursuskot wil ik niet vergeten en
mijn broer voor hulp bij de lay-out van dit werk.
INHOUDSTAFEL
ABSTRACT ....................................................................................................................................... 1!
1 INLEIDING .................................................................................................................................... 3!
a) Neuroblastoom
1.1 Algemeen .............................................................................................................................. 3!
1.2. Neuroblastoom en ALK .................................................................................................................... 12!
b) Ewing tumoren ......................................................................................................................... 16!
1.1 Oorsprong en pathogenese ................................................................................................................. 16!
1.2. Diagnose en klinische presentatie ..................................................................................................... 17!
1.3. Stadiëring........................................................................................................................................... 18!
1.4. Genomische analyse van Ewing tumoren ......................................................................................... 18!
1.5. Prognostische factoren ...................................................................................................................... 19!
1.6. Therapie ............................................................................................................................................. 19!
2 METHODOLOGIE ..................................................................................................................... 21!
2.1. Cellijnen en primaire tumoren .............................................................................................. 21!
a) Neuroblastoom ..................................................................................................................................... 21!
b) Ewing tumoren ..................................................................................................................................... 21!
2.2. Weefselkweek: opgroeien, verversen en splitsen van cellen ................................................. 21!
2.2.1 Opgroeien van cellen ....................................................................................................................... 21!
2.2.2 Verversen van adherente cellen ....................................................................................................... 22!
2.2.3 Splitsen van adherente cellen .......................................................................................................... 22!
2.3. TAE-684 inhibitor behandeling ............................................................................................. 22!
2.4. Eiwitten oogsten..................................................................................................................... 23!
Algemeen.................................................................................................................................................. 23!
Materiaal ................................................................................................................................................... 23!
Methode .................................................................................................................................................... 23!
2.5. Meten van concentraties door gebruik te maken van de ‘Nanodrop’ .................................... 23!
Algemeen.................................................................................................................................................. 23!
Materiaal ................................................................................................................................................... 24!
Methode .................................................................................................................................................... 24!
2.6. Kwantitatieve PCR methode .................................................................................................. 24!
Algemeen.................................................................................................................................................. 24!
Materiaal ................................................................................................................................................... 25!
Methode .................................................................................................................................................... 25!
2.7. Polymerase-kettingreactie ...................................................................................................... 26!
Algemeen.................................................................................................................................................. 26!
Materiaal ................................................................................................................................................... 27!
Methode .................................................................................................................................................... 27!
3 RESULTATEN ............................................................................................................................. 29!
a) Neuroblastoom .......................................................................................................................... 29!
3.1 Inhibitor behandeling ......................................................................................................................... 29!
3.2 Analyse van het NF-1 gen .................................................................................................................. 36!
b) Ewing tumoren ......................................................................................................................... 41!
4 DISCUSSIE ................................................................................................................................... 49!
a) Neuroblastoom .......................................................................................................................... 49!
4.1 Algemeen............................................................................................................................................ 49!
4.2 ALK inhibitorbehandeling ................................................................................................................. 49!
4.3 Analyse van het NF1 gen ................................................................................................................... 52!
b) Ewing tumoren ......................................................................................................................... 53!
4.1 Algemeen............................................................................................................................................ 53!
4.2 Sequentie-analyse in het PRDM2 gen ................................................................................................ 53!
5 BIJLAGEN ................................................................................................................................... 55!
6 REFERENTIES ............................................................................................................................ 57!
AFKORTINGSLIJST
ALCL: Anaplastic Large Cell Lymfoma
ALK: Anaplastic Lymphoma Kinase
Array CGH: Array Comparative Genomic Hybridisation
Az: aminozuren
BDNF: Brain Derived Neurotrophic Factor
CADM1: Cell ADhesion Molecule 1
CESS: Cooperative Ewing’s Sarcoma Studies
CMGG: Centrum Medische Genetica Gent
DMSO: Dimethyl sulfoxide
DPBS: Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
ES: Ewing Sarcomen
ESFT: familie van de Ewing sarcomen
FDA: Food and Drug Administration
FISH: Fluorescentie In Situ Hybridization
FLI1: Friend of Leukemia virus Integration site 1
FRMD3: Ferm Domain Containing Protein 3
IDRF: Image-Defined Risk Factor
INRG: International Neuroblastoma Risk Group
INSS: International Neuroblastoma Staging System
MYCN: v-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived
NB: Neuroblastoom
NSCLC: Non-Small Cell Lung Cancer
NSE: Neuron-Specifiek Enolase
PCR: Polymerase Chain Reaction
PHOX2B: Paired- like Homeobox 2B
pNT: perifere neuroblastische tumoren
PRDM2: PR Domain Containing 2
QV: Quality Values
RIZ: Retinoblastoma proteïne-Interagerend Zinc finger
RT-qPCR: Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction
RTK: Receptor Tyrosine Kinase
SBRT: Small Blue Round Cell Tumours
Trk: Tyrsoine receptor kinase
UKCCSG: UK Childrens’s Cancer Study Group
ABSTRACT
Inleiding: Embryonale tumoren zijn neoplasmen die ontstaan door één of meerdere fouten in de cellen
tijdens de embryonale ontwikkeling en komen meestal klinisch tot uiting in de kinderjaren of de
vroege adolescentie (1, 2). Array Comparative Genomic Hybridisation (array CGH) is een
veelgebruikte techniek met hoge resolutie voor het detecteren van kopie-aantalveranderingen in
tumorcellen op genoomwijde schaal. Meer bepaald kunnen deze genomische afwijkingen leiden tot de
ontdekking van genen met een belangrijke rol in kanker. De techniek werd toegepast op twee
embryonale tumoren, het neuroblastoom en het Ewing sarcoom. Op basis van de resultaten werden
drie genen (ALK, NF1 en PRDM2), waarvoor afwijkingen gevonden werden, geslecteerd en verder
onderzocht. (a) Neuroblastoom (NB) is de meest voorkomende extra-craniale tumor bij kinderen (3, 4).
Deze tumor ontstaat uit progenitorcellen van het sympathisch zenuwstelsel (neuroblasten) (5). Recent
werden bij NBen activerende puntmutaties en amplificaties ontdekt in het ALK (Anaplastic Lymphoma
Kinase) gen, een gen coderend voor een tyrosine kinase dat reeds als oncogen werd beschreven in
andere tumoren (6, 7). Het NF1 gen (17q11.2), waarvoor deleties gevonden werden met array CGH, is
verantwoordelijk voor de aanmaak van het neurofibromin 1 (8). Reeds werd een rol van NF1 als
tumorsuppressorgen bij NB beschreven (8, 9). (b) Ewing Sarcomen (ES) zijn zeer agressieve tumoren
die voornamelijk voorkomen bij kinderen en adolescenten, met een piekincidentie op 15 jaar.
Kenmerkend voor deze groep van tumoren is een translocatie waardoor een fusieproteïne (in 85% is
dit (t(11;22)(q24;q12)) ontstaat (10).
Doel: (a) Het begrijpen van het werkingsmechanisme en de verschillende pathways die door ALK
geactiveerd worden, kan bijdragen tot de ontwikkeling van een nieuw therapeutisch agens. Het NF1
gen wordt in NB cellijnen onderzocht op mutaties en deleties, gezien de beschreven rol als
tumorsuppressorgen. (b) Bij een kopie-aantal bepaling van het volledige genoom werd, via array CGH
van tien Ewing tumor-stalen en twee cellijnen, een deletie gevonden in twee stalen op chromosoom 1p.
De overlap van deze deleties was heel klein (2,5 Mb) en bevatte slechts enkele genen, waaronder
PRDM2 (PR Domain Containing 2). Specifiek werden in exon 5, 6, 7 en 8 van het PRDM2 gen reeds
mutaties beschreven in andere tumoren zoals het diffuse large B-cell lymfoom, retinoblastoom,
colorectaal carcinoom, hepatocellulair carcinoom, prostaat-, borst- en longcarcinoom (11). Met dit
experiment wordt nagegaan of er ook bij de Ewing tumoren mutaties terug te vinden zijn in de reeds
genoemde exonen.
Methodologie: (a) In dit onderzoek wordt de werking van ALK inhibitoren TAE-684 en PF-2341066
nagegaan zowel functioneel als op genexpressie- en proteïne-niveau door gebruik te maken van
volgende technieken: viabiliteitsonderzoek, qPCR en Western Blot. Voor het NF1 gen wordt aan de
hand van een Sanger sequentie analyse van 18 cellijnen gezocht naar deleties en wordt een qPCR
experiment op de SKNF1 cellijn uitgevoerd om het aantal kopieën te bepalen. (b) In het tweede deel
1
van deze thesis worden de exonen 5a, 6a, 7a, 8a, 8b en 8 onderzocht door PCR-experimenten. Om het
experiment te optimaliseren worden verschillende protocols toegepast (touch down en ‘GRAD’) en
wordt gebruik gemaakt van de optimalisatiestof DMSO (Dimethyl sulfoxide). Vervolgens wordt een
sequentie-analyse uitgevoerd voor het opsporen van mutaties.
Resultaten: (a) De inhibitoren TAE-684 en PF-2341066 oefenen beiden een effect uit op de ALK
geamplificeerde cellijn en de hotspotmutante cellijnen, weliswaar met een verschillende sensitiviteit.
Op de wild type cellijn oefenen de ALK inhibitoren, zoals verwacht, bij lage concentraties geen effect
uit. Als validatie, voor de neerregulatie van het FRMD3 gen na TAE-684 behandeling in voorafgaande
experimenten, wordt in dit onderzoek FRMD3 mRNA getest via qPCR en op eiwitniveau via Western
Blot. Door de Sanger sequentie analyse van het NF1 gen worden vijf deleties aangetoond op cDNA
niveau en door het uitvoeren van een qPCR experiment (kopie-aantal bepaling) wordt een homozygote
deletie in de SKNF1 cellijn bevestigd. Inactivatie van dit tumorsuppressorgen zou een rol kunnen
spelen bij de NB pathogenese, verder onderzoek moet worden uitgevoerd. (b) In Ewingstaal 323 exon
5a wordt een “waarschijnlijk schadelijke mutatie” aangetoond. Deze resultaten moeten echter
bevestigd worden door het herhalen van het experiment. Voor exon 6a, 7a en 8b is verdere
optimalisatie vereist.
Conclusie: Array CGH analyse in tumoren laat toe om potentieel belangrijke kankergenen te
identificeren. Door detectie van kankergenen en door nieuwe inzichten in signalisatie-cascades kunnen
mogelijks doelwitten geselecteerd worden, welke als nieuwe therapie-opties kunnen fungeren.
2
1 INLEIDING
Embryonale tumoren zijn neoplasmen die ontstaan door één of meerdere fouten in de cellen tijdens de
embryonale ontwikkeling. Tijdens de embryonale periode moeten de cellen een groot aantal keren
vermenigvuldigen om uit te kunnen groeien tot een volwassen orgaan. Eens de cellen de groei van het
orgaan voltooid hebben, stoppen deze cellen met delen. Wanneer dit niet of niet tijdig gebeurt, kan een
tumor ontstaan. Deze zeldzame tumoren komen meestal klinisch tot uiting in de kinderjaren of in de
vroege adolescentie (1, 2). In deze heterogene groep van embryonale tumoren bevinden zich onder
andere de nefroblastomen, die zich uit embryonale niercellen ontwikkelen, de hepatoblastomen, die
ontstaan uit embryonale levercellen, de retinoblastomen, ontstaan uit embryonale netvliescellen, de
neuroblastomen, ontstaan uit zenuwweefsel, met name het sympatisch zenuwstelsel alsook de familie
van de sarcomen, waaronder de Ewing tumoren (2). De Ewing tumoren en de neuroblastomen zullen
in deze thesis verder besproken worden.
a) Neuroblastoom
1.1 Algemeen
1.1.1 Oorsprong en pathogenese
Het neuroblastoom (NB) is de meest voorkomende extra-craniale tumor bij kinderen (4, 12, 13) en
maakt 7,6% van alle embryonale tumoren uit (1, 2). De incidentie bedraagt 1-5 per 100.000/jaar en in
90% van de patiënten wordt de diagnose gesteld bij kinderen jonger dan één jaar (3). Deze tumoren
zijn verantwoordelijk voor 15% van alle kanker-gerelateerde sterftes bij kinderen (5, 12, 14). Het NB
ontstaat uit progenitorcellen (neuroblasten) van het sympatisch zenuwstelsel. Na migratie vanuit de
crista neuralis vormen de pluripotente cellen de sympatische ganglia, de chromafiene cellen, de
adrenale medulla en de paraganglia. Dit zijn bijgevolg de voorkeurslocaties voor het ontwikkelen van
NB. Het mechanisme dat proliferatie-arrest verhindert, waardoor een tumor zich kan ontwikkelen, is
nog niet opgehelderd. Wel wordt aangenomen dat de genen die instaan voor de ontwikkeling van de
crista neuralis bij het embryo verantwoordelijk kunnen zijn voor de verstoorde proliferatie,
differentiatie of apoptose (5, 12).
Neuroblastomen (NBen) behoren tot de “Small Blue Round Cell Tumours” (SBRT). SBRT is een
verzameling
van
agressieve
ongedifferentieerde
embryonale
tumoren
met
moleculair
en
histopathologisch gemeenschappelijke kenmerken, waardoor het stellen van een differentiaal diagnose
binnenin deze groep zeer moeilijk is. Tot deze verzameling behoren eveneens de Ewing sarcomen
maar onder andere ook de rhabdomyosarcomen, de retinoblastomen, de non-Hodgkin lymfomen (3, 12,
15). De neuroblastomen, de ganglioneuroblastomen en de ganglioneuromen vormen samen de groep
van de perifere Neuroblastische Tumoren (pNT). Dit zijn tumoren waarvan de neuroblasten een
verschillende differentiatiegraad bezitten en omringd worden door Schwann cellen. Als morfologische
indicatoren voor differentiatie bij deze tumoren wordt gebruik gemaakt van de hoeveelheid aanwezig
3
cytoplasma en kernmateriaal. De neuroblastomen worden onderverdeeld in sterk- (>5%), zwak- (<5%)
of niet gedifferentieerd, waarbij een sterke differentiatie correleert met een gunstige histologie. De
ganglioneuromen en ganglioneuroblastomen intermixed zijn goedaardige tumoren. De nodulaire
ganglioneuroblastomen kunnen goed- of kwaadaardig zijn. Goedaardige tumoren groeien in de regel
enkel lokaal in tegenstelling tot kwaadaardige tumoren die kunnen metastaseren (8, 12).
NB kan zich presenteren in associatie met andere ziekten die hun oorsprong vinden in het autonoom
zenuwstelsel (neurocristopathieën) zoals de ziekte van Hirschsprung, het congenitale centrale
hypoventilatie syndroom, feochromocytoom en neurofibromatose type 1, allen neurocristopathieën.
Voor sommigen is er reeds een link bekend tussen deze verschillende aandoeningen. PHOX2B
(Paired- like Homeobox 2B) mutaties zijn beschreven bij de ziekte van Hirschsprung en zijn de
grootste oorzaak voor het ontwikkelen van het hypoventilatie syndroom (5, 12, 16, 17).
Constitutionele PHOX2B mutaties zijn reeds beschreven bij familiale vormen (6.4%) van NB en in
een zeldzaam aantal sporadische NBen (2,3%) (3, 5, 6, 12). PHOX2B gen is een belangrijke regulator
in de ontwikkeling van het autonome zenuwstelsel (2). NF1 is een causaal gen voor neurofibromatose
1, mutaties/deleties worden frequent gezien bij glioblastomen en recent werd voor NF1 een rol als
tumorsuppressorgen aangetoond in NB. Het NF1 gen (17q11.2) is verantwoordelijk voor de aanmaak
van het neurofibromin 1 (8), wat op zijn beurt aangemaakt wordt in zenuwcellen (oligodendrocyten)
en Schwann cellen. Het NF1 gen fungeert als een tumorsuppressorgen door de inactivatie van het RAS
proteïne, waardoor celgroei gestimuleerd wordt (8, 18). Aangezien lage expressie van NF1 gepaard
gaat met een slechte overleving, worden mutaties voornamelijk bij de hoog-risico groep verwacht;
verder onderzoek hieromtrent is nodig (8).
1.1.2 Diagnose en klinische presentatie
Verschillende
diagnostische
middelen
zoals
een
biopt,
urine-onderzoek
(catecholamines),
bloedonderzoek of beeldvorming zoals RX, CT of MRI scan, kunnen gebruikt worden. Mogelijke
uitzaaiingen kunnen opgespoord worden met behulp van een MIBG scan of een beenmerg onderzoek
(5, 12, 19).
Typisch voor NBen is de klinische heterogeniteit zowel in het voorkomen van de tumor als in het
geassocieerde klachtenpatroon. Bij het stellen van de diagnose kan de tumor nog lokaal of reeds
gemetastaseerd zijn. Bij lokale ziekte bevindt de tumor zich bij 65% van de patiënten in het abdomen
(50% in de bijnier), bij 16% in de thorax, bij 3% in het kleine bekken en bij 3% ter hoogte van de nek
(5, 12, 19). Het klachtenpatroon van een primaire tumor varieert van asymptomatisch tot hevige pijn.
Een abdominale tumor kan abdominale distensie, prikkelbare darmen, massagevoel, gewichtsverlies of
anorexie veroorzaken. Een tumor in de thorax kan gepaard gaan met hoesten en ter hoogte van de nek
kan een massa gevoel aanwezig zijn. Een Horner syndroom (verlies van sympathische innervatie in
4
het oog) kan ontstaan wanneer de primaire tumor in het mediastinum gelokaliseerd is. Bij 5% tot 15%
worden neurologische klachten waargenomen door epidurale of intradurale extensie (12).
Metastasen, ontstaan via lymfogene of hematogene weg, worden bij de helft van de gediagnosticeerde
patiënten waargenomen (12, 19). Deze worden het meest frequent gezien in het beenmerg en het bot
(hematogene verspreiding) en zeldzaam in de longen en het centraal zenuwstelsel (minder dan 5%).
Een gemetastaseerde tumor kan zich presenteren als een algemeen ziektebeeld met koorts. Proptose,
ecchymose en periorbitale zwelling (raccoon eyes/brilhematoom) kunnen gezien worden bij
metastasen in de orbita.
Een zeldzame keer kan de patiënt zich aanmelden met paraneoplastische fenomenen, welke de
prognose beïnvloeden. Paraneoplatische syndromen worden veroorzaakt door de tumor, maar komen
klinisch tot uiting op afstand van de tumor. De symptomen kunnen veroorzaakt worden door humorale
afscheiding van de tumor of een immunologische reactie van het lichaam op de tumor (zie bijlage 1)
(12).
Afbeelding 1: Klinische presentatie van NB; van boven naar onder links: paraspinale tumor, leverinfiltratie en beenmerg
metastase; van boven naar onder rechts: Horner syndroom, celiac-axis tumor en adrenale tumor (17).
1.1.3 Stadiëring
Om de outcome van NBen te voorspellen werden verschillende classificatiesystemen opgericht. Zo
werd in 1988 het "International Neuroblastoma Staging System" (INSS) opgericht, waar in 1993
wijzigingen werden aangebracht (19, 20). In 2004 kwamen de belangrijkste pediatrische oncologen
samen om gegevens te bekijken van 8800 NB patiënten die behandeld waren in Europa, Japan, USA,
Canada en Australië tussen 1990 en 2002. Dit heeft geleid tot het vormen van de “International
Neuroblastoma Risk Group (INRG)”. Deze ontwikkelden voor NB twee systemen; Het “INRG
Staging System” (INRGSS) en het “INRG Classification System” (3, 5, 12, 19, 21). Het INRGSS
kwam uit in 2009 en werd ontworpen om de risicostratificatie te bepalen vóór behandeling (incl.
chirurgie), gebaseerd op prognostische factoren. De focus wordt hier gelegd op de bevindingen
5
verkregen door beeldmateriaal, in tegenstelling tot chirurgische bevindingen waarop het INSS
gebaseerd is. Het nieuwe “INRG Staging System” creëerde voor de gelokaliseerde tumoren twee
subtypes (L1 en L2) op basis van de aanwezigheid van “Image-Defined Risk Factors (IDRFs)”. Dit
zijn afwijkingen die op beeldmateriaal worden gezien op het moment van de diagnose. Beeldmateriaal
heeft als voordeel dat het retrospectief kan bekeken worden, zelfs door expert radiologen. Dit maakt
het INRGSS meer robuust, reproduceerbaar en uniform dan wanneer gewerkt wordt met chirurgische
bevindingen (INSS). Dit systeem wordt idealiter parallel met het INSS gebruikt en niet als substitutie
(zie tabel 1) (19, 21).
INSS
INRGSS
Stadium
Kenmerken
Stadium
Kenmerken
1
Gelokaliseerde tumor met complete resectie met of
zonder tumorvrije randen. Ipsilaterale lymfeklieren
zijn negatief, geëxciseerde lymfeklieren kunnen
positief zijn.
L1
Gelokaliseerde ziekte zonder
beeld-gedefinieerde
risicofactoren.
2A
Eenzijdige tumor met onvolledige bruto resectie,
herkenbare ipsilaterale en contralaterale lymfeklieren
negatief voor tumor.
L2
Gelokaliseerde ziekte
beeld-gedefinieerde
risicofactoren.
2B
Eenzijdige tumor met volledige of onvolledige bruto
resectie; ipsilaterale lymfeklier positief voor tumor,
herkenbare contralaterale lymfeklieren negatief voor
tumor.
M
Gemetastaseerde ziekte.
3
Tumor infiltreert middellijn, met of zonder regionale
betrokkenheid van de lymfeklieren, of eenzijdige
tumor met contralaterale betrokkenheid van de
lymfeklieren, of middellijn tumor met een bilaterale
betrokkenheid van de lymfeklieren.
MS
Gemetastaseerde
ziekte
“speciale” waar MS is gelijk
aan het stadium 4S.
4
Verspreiding van de tumor naar distante lymfeklieren,
beenmerg, bot, lever of andere organen, behalve zoals
gedefinieerd door stage 4S.
4S
Gelokaliseerde primaire tumor, zoals gedefinieerd in
fase 1 of 2, met uitzaaiingen beperkt tot de lever, de
huid of beenmerg. Enkel voor kinderen jonger dan één
jaar, <10% van de kern beenmergcellen aangetast en
MIBG
scan
resultaten
negatief
voor
beenmergonderzoek.
met
Tabel 1: Stadia en kenmerken van het INSS en het INRGGS classificatiesysteem (19, 21).
1.1.4 Genomische analyse van neuroblastoom
Typisch voor NB is de heterogeniteit, dit zowel klinisch, biologisch als genetisch (3, 5). Het aantonen
van de genetische heterogeniteit (amplificaties, gain en verlies van genoom regio’s) werd mogelijk
door genoomwijde analyse (3). Enkele genetische afwijkingen worden hieronder besproken.
6
Ploïdie
Op basis van DNA-index, wordt NB onderverdeeld in “near”diploïd kern-DNA en “near”triploïd
(voorkomen van 3n chromosomen in de cel) kern-DNA, met respectievelijk voorkomen 45% en 55%.
De “near”triploïde vorm zou een fout veroorzaken in de mitotische deling waardoor verlies of winst
van een heel chromosoom mogelijk is. Dit zijn numerieke chromosomale aberraties en geen
structurele defecten. Bij de “near”diploïde vorm in locoregionale of gemetastaseerde tumoren wordt
gedacht dat mogelijk een fout in de stabiliteit van het genoom verantwoordelijk zou kunnen zijn voor
genetische aberraties zoals de winst van 17q, chromosomale deleties, MYCN-amplificaties of
translocaties. Deze vorm heeft een hogere recidief kans in tegenstelling tot de “near”triploïde tumoren,
welke met een goede prognose gepaard gaan. De DNA-index kan specifiek als prognostische factor
gebruikt worden bij kinderen onder de twee jaar met uitgezaaide ziekte (3, 12).
MYCN-amplificatie
MYCN (2p24) is een proto-oncogen dat behoort tot de MYC-familie van transcriptiefactoren. Het gen
bevordert proliferatie en vermijdt differentiatie van neurale progenitorcellen tijdens de embryonale
ontwikkeling. Amplificatie van dit gen wordt teruggevonden in 20% tot 35% van de NBen en gaat
meestal gepaard met een slechte prognose (3, 5, 12, 13) .
Chromosoom 1p verlies
Deletie van de korte arm van chromosoom één (1p) wordt aangetroffen bij 25% tot 35% van de
primaire NB, vooral bij oudere kinderen met een stadium 3 of 4 en gaat over het algemeen gepaard
met MYCN-amplificatie. Door het veelvuldig voorkomen van deze deletie wordt gesuggereerd dat één
of meerdere tumorsuppressorgenen aanwezig zouden zijn in deze regio (vb. CHD5) (3). Een tweede
regio waarin deleties werden beschreven op chromosoom 1p36, bevatte het KIF1B gen. Dit gen
behoort tot de kinesin-3 familie en werd als een haplo-insufficiënt kandidaat tumorsuppresorgen
aangeduid (3, 5).
Chromosoom 3p verlies
Dit verlies presenteert zich typisch in tumoren met 11q verlies maar zonder MYCN-amplificatie of 1p
deletie. Dit genetische defect wordt vaker gezien bij oudere patiënten, waaruit hypothetisch kan
besloten worden dat dit een laattijdige gebeurtenis is in de oncogenese van NB. Op de korte arm van
chromosoom 3 zijn eveneens verschillende kandidaat tumorsuppressorgenen naar voor geschoven
zoals het RASSF1A gen (3).
Chromosoom 11q verlies
Chromosoom 11q verlies wordt gezien bij 15% tot 22% van de primaire NBen. Het is omgekeerd
evenredig met MYCN maar associatie met andere ongunstige biologische factoren wordt wel gezien.
7
Er is een associatie tussen chromosoom 11q verlies en een verminderd ziektevrij-interval. Recent
werden de twee meest frequent gedeleteerde regio’s op de lange arm van chromosoom 11
geïdentificeerd en Cell Adhesion Molecule 1 (CADM1) werd als kandidaat tumorsuppressor van
chromosoom 11q aangeduid (3, 5, 12) .
Chromosoom 17q winst
Chromosoom 17q winst is de meest frequente afwijking, die voorkomt in 80% van de NBen. Deze
afwijking is het resultaat van een ongebalanceerde translocatie van 17q21-25 met chromosoom 1 of 11.
Het diploïde subtype waar een onstabiele 17q winst werd teruggevonden is de meest onafhankelijke
parameter die met een slechte prognose gepaard gaat. Dit in tegenstelling tot de “near”trïploidtumoren waar vaak een volledig extra chromosoom 17 teruggevonden kan worden, wat correleert met
een gunstige prognose (3, 12).
1.1.5 Additionele prognostische factoren
De overleving en het verloop van NBen zijn zeer variabel. Sommige tumoren kunnen spontaan
regresseren terwijl andere tumoren mits maximale therapeutische behandelingen toch fataal aflopen (3,
6, 8, 21). In totaal zijn reeds 31 prognostische factoren bekend (12). Over de meest relevante klinische
factor zijn verschillende meningen terug te vinden. Uit meerdere studies blijkt dat het stadium het
meest statistisch significant en klinisch relevant is (19), terwijl andere studies aangeven dat MYCNamplificatie of DNA ploïdie als meest significant kunnen beschouwd worden (12). Andere
voorbeelden van gebruikte parameters om de prognose in te schatten zijn de leeftijd van de patiënt (in
het voordeel van kinderen jonger dan 18 maand), differentiatiegraad van de tumor, chromosomale
afwijkingen,... (12, 19, 21).
Recent werd onderzocht welke genen kunnen bijdragen tot het bepalen van de prognose en
behandeling van de patiënt. Heden ten dage wordt de behandeling bepaald op basis van het
risicoprofiel (zie verder ‘Therapie’) (5, 12). In de praktijk wordt gesuggereerd dat patiënten binnen één
groep toch een verschillende outcome kunnen hebben en bijgevolg ook nood hebben aan een ander
behandelingsplan. Hieruit vloeit de noodzaak voort om meer tumorspecifieke prognostische merkers
te identificeren en subtypes, binnen de huidige therapiestratificatie, te onderscheiden (22). Dit geldt
zeker voor hoog-gradige NBen, waar de outcome nog steeds zeer slecht is (23). Zo werd een studie
uitgevoerd in het Centrum Medische Genetica Gent (CMGG) waarin een multigensignatuur gemaakt
werd op basis van 59 prognostische genen. Een signatuur is een specifiek expressiepatroon van een
groep genen, bekomen door het uitvoeren van genexpressie profilering op een grote reeks van tumoren.
De signatuur is een onafhankelijke risicofactor in vergelijking met de huidige, toegepaste
risicofactoren (22). Het doel van deze signatuur is patiënten met een hoog en laag moleculair risico te
onderscheiden. Bij een ongunstig moleculair profiel kan intensief behandeld worden. Zo zouden
patiënten met een ongunstig moleculair profiel en momenteel behandeld volgens het hoog-risico
8
protocol, in aanmerking kunnen komen voor een behandeling met moleculaire therapieën. Op deze
manier kan een individueler behandelingsplan opgesteld worden met een betere outcome voor de
patiënt tot gevolg (22). Onderzoek naar mRNA, microRNA en gen copy number profilering is
aangewezen om inzicht te verkrijgen in de pathways die leiden tot verschillende subtypes van NB (3).
Een rol van miRNA in NB is reeds opgehelderd. Er werd vastgesteld dat de verschillende subtypes
van NB gekarakteriseerd worden door specifieke miRNA expressie profilering, met als belangrijke
drijfkracht onder andere MYCN-amplificatie (3).
Moleculair prognostische kandidaat merkers
Naast genexpressiesignaturen kunnen, op basis van moleculair onderzoek, eveneens individueel
prognostische merkers worden opgespoord (22). In deze context werden al een aantal kandidaten naar
voor geschoven. Reeds is geweten dat neurotrofine centraal staat bij de normale neuronale
ontwikkeling. Dit impliceert dat deze signalisatie gestoord kan verlopen bij differentiatie en regressie
van NB. In deze signalisatie-cascade zijn verschillende tyrosine kinase receptoren zoals NTRK1
(=TrkA), NTRK2 (=TrkB) en NTRK3 (=TrkC) aanwezig (5, 12). Trk is een receptor voor
zenuwcelgroei en bijgevolg cruciaal voor de groei, differentiatie en apoptose van zenuwcellen in het
centrale en perifere zenuwstelsel (13). Trk (Tyrsoine receptor kinase) kan als prognostische factor
beschouwd worden. Hoge expressie van TrkA wordt gezien bij NBen met biologisch gunstige factoren
en een goede prognose, hoge expressie van TrkB wordt vastgesteld bij agressieve tumoren met
biologische ongunstige factoren zoals MYCN-amplificatie. Wanneer TrkB geactiveerd wordt door zijn
ligand BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor) ontstaan proliferatie, migratie, angiogenese en
chemotherapie resistente neuroblastoomcellen (5, 12). Andere kandidaat prognostische merkers die
reeds beschreven werden in de literatuur zijn NME-1, CD44, BIRC5, ABC1 en ABCC1. NME-1 en
BIRC5 overexpressie en lage expressie van CD44, gaan gepaard met een slechte prognose (24-27).
Spontane regressie
Spontane regressie zou kunnen verklaard worden door laattijdige activatie of verstoring van normale
apoptose-pathways. Een afwijkende signalisatie-cascade die leidt tot apoptose (met BLC2 familie,
survivine en caspase-8) kan ontstaan door inactivatie, gegenereerd door hypermethylatie van CpGeilanden van promotor genen. Bij NBen is deze inactivatie reeds aangetoond voor verschillende
elementen (caspase-8, de caspase-8 inhibitor FLIP, de RASSF1A tumorsuppressor, CD44, p73, DAPK,
p14ARF, p16INK4a, en de vier TRAIL apoptose receptoren) (12, 21).
1.1.6 Therapie
De therapiekeuze wordt gebaseerd op het risicoprofiel van de patiënt. De ontwikkeling van dit risicoprofiel is ontstaan door verbeterde kennis van biologische overlevingsfactoren en de impact hiervan op
de prognose. De volgende parameters worden gebruikt: INSS-classificatie, leeftijd van de patiënt,
MYCN status, histologische kenmerken en DNA-index. De risicostratificatie gebruikt 12 maanden als
9
cut off-waarde voor de leeftijd. Op deze manier wordt de patiënt ingedeeld in een laag-risico, een
intermediair-risico of een hoog-risico profiel. De mogelijke behandelingen zijn observatie, chirurgie,
chemotherapie, radiotherapie en het uitvoeren van stamceltransplantatie (5, 12).
Laag-risico patiënten
Tot de laag-risico groep behoren de patiënten met een INSS stadium 1, 2 of 4S én gunstige
biologische status. Deze patiënten kunnen meestal behandeld worden door chirurgie, wat omschreven
wordt als “minimale therapie” (3, 5). Dit geldt niet wanneer de tumor klachten veroorzaakt worden
door compressie van het ruggenmerg, door respiratoire insufficiëntie, door leverinfiltratie en
uitgesproken hepatomegalie of door een tumor gelegen in het intraventriculair systeem.
Chemotherapie wordt gegeven aan kinderen met stadium 1 indien een recidief aanwezig is of aan
stadium 2 patiënten indien chirurgische resectie niet volledig kon worden uitgevoerd (12). Noch
radiotherapie, noch chemotherapie verhogen de overlevingskansen bij deze patiënten en worden hier
niet toegepast. Een uitzondering hierop vormen de patiënten ouder dan één jaar, met een stadium 2
tumor en MYCN-amplificatie. Reeds werd aangetoond dat deze tumoren snel progressief zijn met een
hoog risico op metastasering zonder agressieve therapie; daarom worden deze patiënten behandeld
zoals hoog-risico patiënten (zie verder ‘Hoog-risico patiënten’). Bij kinderen met een 4S NB tumor
zonder MYCN-amplificatie, regresseert de tumor meestal spontaan (5, 12). In de helft van de gevallen
wordt toch een korte chemotherapie kuur met cyclophosphamide toegediend of wordt de lever
bestraald. De zeldzame gevallen in deze groep (stadium 4S) met MYCN-amplificatie worden
behandeld zoals hoog-risico patiënten (19, 20).
Intermediair-risico patiënten
Een patiënt behoort tot de intermediair-risico groep wanneer de ziekte overeenkomt met een stadium 3
of stadium 4 zonder MYCN-amplificatie. De vijfjaars-overleving voor de intermediare groep bedraagt
75%. De behandeling begint met negen maanden chemotherapie, waarna chirurgie en eventueel lokale
bestraling van de residuele tumor volgen (12, 13). Indien er ongunstige classifiatie factoren aanwezig
zijn of indien er diploïdie aanwezig is, zal het aantal cycli chemotherapie verdubbeld worden en zal
bijgevolg de duur van de behandeling toenemen (als standaard geldt vier cycli chemotherapie
gedurende 12 weken) (12).
Hoog-risico patiënten
Patiënten behoren tot de hoog-risico groep wanneer uitzaaiingen van de ziekte naar andere organen
(meestal beenmerg en/of bot) kunnen aangetoond worden of wanneer de patiënten een actief MYCN
gen bezitten (MYCN-amplificatie). Een uitzondering vormen kinderen jonger dan één jaar met
uitzaaiingen. Voor hen gelden de richtlijnen van het intermediair-risico protocol. De hoeksteen van de
therapie bestaat uit intensieve chemotherapie (3, 5). De meeste hoog-risico tumoren zijn hiervoor
gevoelig maar de relaps kans is groot en bedraagt 50% tot 60% (17). Het therapieschema gebruikt bij
10
deze kinderen bestaat uit vier fasen: inductie fase, locale controle, consolidatie fase en behandeling
met biologische therapeutica om residuele ziekte aan te pakken (12, 13, 17). De slechte prognose bij
de hoog-risico groep kan mede verklaard worden door de frequent voorkomende chemo- en
radiotherapie resistentie (12). De vijfjaars-overleving bedraagt slechts 40% (3, 28).
Bijwerkingen
Belangrijk bij het gebruik van deze therapieën zijn de zware bijwerkingen. Bovendien zijn de
behandelde patiënten meestal jonge kinderen met kans op lange en zeer lange termijn complicaties.
Bijwerkingen van chemotherapeutica zijn haarverlies, misselijkheid, braken, verhoogd infectiegevaar
en neutropene koorts. Deze drugs tasten ook het immuunsysteem aan waardoor het kind zeer gevoelig
wordt voor infecties en gevaar loopt op het ontwikkelen van neutropene koorts. Monitoring van hart,
lever en nieren is aangewezen (12, 19, 29).
11
1.2. Neuroblastoom en ALK
1.2.1 Beschrijving en werking van het ALK tyrosine kinase in normaal weefsel
ALK (Anaplastic lymphoma kinase) maakt deel uit van de Insuline Receptor (IR) superfamilie van
Receptor Tyrosine Kinasen (RTKs) (13, 30). Het humane ALK gen is gelegen op de korte arm van
chromosoom 2 (2p23). ALK expressie wordt enkel waargenomen in zenuwstelsel, voornamelijk in de
hersenen van neonaten, met een snelle daling van de expressie na de geboorte. Op basis hiervan wordt
vermoed dat ALK een rol speelt in de ontwikkeling en werking van het zenuwstelsel (30, 31). ALK is
een transmembraanproteïne dat gevormd wordt door 1620 aminozuren (az). Het extracellulair domein
bestaat uit 1030 az, het transmembraandomein uit 28 az en het intracellulair tyrosine kinase domein
wordt opgebouwd door 276 az en twee juxtamembraan domeinen van 64 az (zie afbeelding 2) en
vormt een polypeptide van 177 kDA. Alvorens de mature proteïnen van 220 kDa en 190 kDa kunnen
gevormd worden, ondergaat het proteïne post-translationele modificiaties zoals N-glycosilatie. Naast
dit doublet wordt ALK eveneens gedetecteerd als 140 kDA proteïne, dat ontstaat na extracellulaire
klieving (30, 32).
Afbeelding 2: De domein structuur van ALK wordt weergegeven. Het extracellulaire domein is opgebouwd uit een signaal
peptide (az 1-26), twee MAM domeinen (az 264–427 en 480–626), één LDL domein (az 453–471) en één glycine rijk
domein (az 816–940). Het paarse transmembraan domein (TM) (az 1030–1058) vormt de verbinding tussen het extra- en het
intracellulaire domein. Het intracellulaire domein bevat het juxtamembranair domein (az 1058–1122) en het tyrosine kinase
katalytische domein (az 1122–1376) (30).
Het katalytisch domein van het tyrosine kinase (az 1122–1376) bevat de drie majeure tyrosine sites
Tyr1278, Tyr1282 en Tyr1283, allen gelegen binnen een specifieke regio van het kinase domein, de
A-lus genaamd. Deze worden weergegeven door het motief YXXXYY. Deze sites werken zoals de
kinasen in de insuline receptor familie waar fosforylatie leidt tot activatie van het kinase. De kinaseactiviteit wordt geregeld door sequentiële fosforylatie van de drie majeure autofosforylatie sites,
waarvan Tyr1278 de belangrijkste is. Wanneer ALK in de inactieve configuratie verkeert, verhindert
de hierboven genoemde A–lus de toegang tot de ATP binding pocket. Indien ligandbinding plaatsvindt,
verandert de conformatie van de receptor waardoor de A-lus naar buiten klapt en de ATP binding
pocket toegankelijk wordt en leidt tot de activatie van het tyrosine kinase (30).
12
1.2.2 Beschrijving en werking van ALK als oncogen
Het ALK gen werd als oncogen ontdekt in 1994, meer bepaald werd het als fusiegen (NPM–ALK;
t(2;5)(p23;q35)) aangetroffen in een subtype van non Hodgkin lymfomen, het anaplastic large cell
lymfoma (ALCL) (28). ALK fusiegenen zijn onder andere nog beschreven bij longcarcinomen, typisch
het non-small cell lung cancer (NSCLC) (EML4–ALK) en inflammatoire myofibroblast tumoren
(TMP3/4-ALK en RANBP2-ALK) (7, 31, 33).
In 2008 werden in het ALK gen activerende puntmutaties ontdekt in familiale en sporadische vormen
van NB (6, 30, 32, 34). Deze mutaties werden vooral aangetroffen in het kinase domein, waardoor
autofosforylatie optrad met een verhoogde kinase activiteit, fosforylatie (van ALK en de downstream
signalisatie-cascades (zoals AKT en MAPK)) en proliferatie tot gevolg. Twee hotspot mutaties op
positie R1275 en F1174, werden reeds geïdentificeerd (3, 6, 12, 14, 32, 35). Deze missense mutaties
komen voor in 8% van de NB patiënten waarbij de hotspot mutaties verantwoordelijk zijn voor
respectievelijk 49% en bijna 35% van de ALK mutaties (4). R1275Q wordt gezien bij familiale en
sporadische NBen terwijl F1174 enkel bij de sporadische NBen aangetroffen wordt (30). Op basis van
een oncogeneciteits assay van IL-3 afhankelijke Ba/F3 cellen kon sterkere autofosforylatie en
celproliferatie waargenomen worden voor de F1174L mutatie dan voor de R1275Q mutatie (4, 30). De
mutatie op positie F1174 wordt vaak aangetroffen bij patiënten met MYCN-amplificatie, wat
samengaat met een uiterst slechte prognose (4, 7, 32). Een synergistisch effect van ALK en MYCN
werd recent beschreven door experimenten met een transgeen zebravismodel (36). Tot op heden
werden nog geen mutaties in het ALK gen geïdentificeerd bij de andere embryonale tumoren, verder
onderzoek is hier aangewezen (35). Recent werden wel, naast puntmutaties in NBen, mutaties
beschreven bij thyroïd carcinomen (het anaplastic thyroid carcinoom) (33).
Amplificatie van het ALK gen werd ook beschreven in 1,2%-4,4% van de NB patiënten en komt
voornamelijk voor bij cellen met MYCN-amplificatie (3, 32). NB cellen die de overexpressie
vertoonden van de wild type receptor (zonder amplificatie), bleken net zoals gemuteerde en
geamplificeerde cellijnen gevoelig te zijn voor ALK neerregulatie (37). Passoni et al. publiceerde dat
een bepaalde drempelwaarde voor de wilde type ALK expressie dient overschreden te worden,
vooraleer oncogene activatie optreedt (4). De oncogene activiteit veroorzaakt door overexpressie van
het gemuteerde of het wild type ALK, gaat gepaard met een slechte prognose, wat bevestigd werd
door de Brouwer et al. (4, 32, 28).
1.2.3 Familiaal NB
Familiale vormen van NB maken slechts 1% tot 2% uit van alle NBen (3, 12, 28). Het
overervingspatroon is autosomaal dominant met een lage penetratiegraad. In vergelijking met de
sporadische vorm wordt de tumor hier gemiddeld vroeger ontdekt (9 maanden in plaats van 2 jaar) en
worden vaak verschillende tumorhaarden aangetroffen (6, 17). Het belangrijkste oncogen bij deze
13
familiale vorm is het recent ontdekte ALK gen. In ongeveer de helft van de familiale gevallen worden
activerende puntmutaties gevonden in het tyrosine kinase domein van ALK (6, 38) (ten opzichte van
8% bij sporadische tumoren) (3, 6, 32). Eveneens worden PHOX2B mutaties teruggevonden in 6,4%
van de familiale vorm en in 2,3% van de sporadische NBen (12, 32, 17).
1.2.4 Inhibitie van ALK signalisatie
De ontdekking van het ALK gen bij NBen lijkt veelbelovend aangezien small molecule ALK
inhibitoren kunnen gehanteerd worden. Dit geldt zeker voor de hoog-risico patiënten waarvoor de
prognose nog steeds zeer slecht is (4, 32). Er werd reeds aangetoond dat ALK inhibitorbehandeling
een verminderde proliferatie en verminderd proteïne level van pALK en downstream signalisatiecascades (zoals pAKT, pERK) veroorzaakt in ALK gemuteerde NB cellijnen (32). Analoog werd door
gebruik van shRNA silencing van hoge ALK expressie bekomen in F1174L mutante NBcellijnen met
een verminderde celproliferatie en inductie van apoptose tot gevolg. Bij NB cellijnen met hoge
expressie van het wild type zonder mutaties kon in twee studies ook een effect van ALK inhibitor
worden aangetoond (4). “Dit betekent dat inhibitie van ALK-activiteit potentieel bij veel meer
neuroblastoompatiënten een tumorremmend effect zou kunnen hebben” (onderzoeksleider Max van
Noesel, Erasmus ziekenhuis Amsterdam).
1.2.5 Huidige ALK inhibitoren
Algemeen
Op dit moment worden clinical trials uitgevoerd met ALK inhibitoren, waaronder Crizotinib (PF02341066). Crizotinib is een 2,4-pyrimidinediamine derivaat en een c-Met/ALK-specifieke inhibitor
(30). Recent werd een volledige Fase II clinical trial voor Crizotinib bij patiënten met NSCLC (EML4ALK) uitgevoerd en een fase III is reeds in uitvoering (39). Uit de fase I trial bleek reeds dat Crizotinib
veilig is en goed verdragen wordt. Uit de gerapporteerde bijwerkingen bleken gastro-intestinale
klachten (nausea, braken en diarree) het meest frequent op te treden gevolgd door visuele stoornissen
(graad I), perifeer oedeem (20%) en hepatotoxiciteit (dosis afhankelijk) (31). Op basis van de
algemeen gunstige resultaten werd het gebruik van de inhibitor bij NSCLC door de FDA (Food and
Drug Administration) goedgekeurd (36). Een fase I/II clinical trial wordt uitgevoerd voor
neuroblastoom en andere pediatrische tumoren zoals het Anaplastic Large-Cell Lymphoma (ALCL) en
de inflammatoir myofibroblast tumor (40). Naast Crizotinib bestaan nog andere ALK inhibitoren zoals
CH5424802, ASP3026 en CEP-28122 (30), waarvoor nog verder in vitro / in vivo evaluatie dient te
gebeuren.
Gevoeligheid van de inhibitoren
De respons van de ALK inhibitor correleert sterk met de ALK mutatie- en differentiatie-status, ALK
mRNA en proteïne levels (32). Voor de twee hotspot mutaties F1174L en R1275Q is reeds gebleken
14
dat F1174L een grotere transformatiecapaciteit bevat en dat F1174L resistentie tegen Crizotinib
veroorzaakt (18). De resistentiemechanismen zijn niet volledig bekend. Verdere kennis van de
bindingsplaats en structurele eigenschappen van de inhibitoren is vereist wanneer de resistentie van
TAE-684 versus Crizotinib met de F1174L mutante cellijn wil verklaard worden (41). In een andere
studie werden Crizotinib en TAE-684 getest, waar een effect gezien werd bij alle cellijnen, maar de
sensitiviteit van de verschillende mutante cellijnen varieerde. Dit bewijst opnieuw dat een
verschillende ALK mutatie-status met een verschillende gevoeligheid samengaat (23).
In 2001 werd de sequentie van het eerste menselijke genoom ontdekt. Uit deze bevinding is het
concept ‘Pharmacogenomics’ ontstaan. Dit betekent dat op basis van genetische variaties (genen,
SNPs, copy number alteraties en mutaties) de werking en het toxiciteitsprofiel van een geneesmiddel
zou kunnen voorspeld worden (37). Voor Crizotinib is reeds aangetoond dat genetische kenmerken
correleren met de respons op therapie (vb. F1174L) (14, 30, 38). Bovendien blijft deze de mutatiestatus behouden na chemotherapie, waardoor bij NB ‘Pharmacogenomics’ zou kunnen toegepast
worden (35).
Kandidaat therapie mechanismen
Naast ALK inhibitoren werden reeds andere therapeutische middelen zoals antilichaam therapie, RNA
interferentie en HSP90/70 naar voor geschoven. Aangezien ALK expressie voorkomt op het
celoppervlak van bijna alle NBen, is ALK ook een ideaal target voor antilichaam therapie. Het
voordeel van RNA interferentie is de efficiënte werking tegen zowel wild type als gemuteerde
transcripten en de hoge sequence-specificiteit. Gebruik van deze technologie bij de mens is nog
gelimiteerd tot targets in de lever waardoor nog een lange weg te gaan is voor deze alternatieve
behandeling. Het Heat Shock Proteïne 90 (HSP90) en het Heat Shock Proteïne 70 (HSP70) oefenen
een cruciale rol uit bij de folding, stabilisatie en degradatie van oncogene kinasen (zoals ALK) en
worden bijgevolg als kandidaten voorgesteld om op een alternatieve manier ALK te targetten. IPI-504,
een nieuwe HSP90 inhibitor, bevindt zich in een fase II clinical trial met veelbelovende resultaten voor
het gebruik bij EML4-ALK (longkanker) (30).
15
b) Ewing tumoren
1.1 Oorsprong en pathogenese
Primaire bottumoren vormen samen 5% van alle carcinomen bij kinderen en adolescenten (42). Ewing
Sarcomen (ES) zijn de tweede meest frequent voorkomende bottumoren na de osteosarcomen (42-44).
ES zijn zeldzame tumoren met een incidentie van 1-3 per miljoen/jaar in het Westen (42, 45). Deze
tumoren komen het meest frequent voor bij kinderen en adolescenten, met een voorkeur voor het
mannelijk geslacht (zie afbeelding 3) (43, 46). De familie van de Ewing sarcomen (ESFT) bestaat uit
drie types: de klassieke Ewing sarcomen (bot en weke weefsels), de Askin tumoren
(thoracopulmonair) en de Perifere Primitieve Neuroectodermale Tumoren (PPNET) (42, 43, 45).
Ewing tumoren behoren, net zoals de NBen, tot de groep van de “Small Round Blue Cell Tumours”,
ontstaan uit het neuroectoderm (zie inleiding ALK: ‘Oorsprong en pathogenese’) (15, 42). Een
differentiaal diagnose binnen deze groep van tumoren bekomen is zeer moeilijk en vereist een
combinatie van immunohistochemische technieken, Fluorescentie In Situ Hybridization (FISH),
karyotypering en/of elektronenmicroscopie. De Ramanspectroscopie zou een potentiële techniek zijn
om in slechts 30 minuten tijd de diagnose te verkrijgen (15).
Afbeelding 3: De leeftijd op het moment van de diagnose (X-as) versus het aantal patiënten (Y-as). 90% van de tumoren
worden gediagnosticeerd in de eerste en tweede levensdecade (46).
Bijna de helft van de tumoren ontstaat ter hoogte van de diafyse van de lange beenderen (49%). Het
tweede meest frequent wordt het kleine bekken getroffen (29%), gevolgd door de ribben en de wervels
(12%) (zie afbeelding 4) (47). Bij één op vier patiënten ontstaat de tumor eerder in de zachte weefsels
(spieren en bindweefsel) dan in het bot (45, 47). De Extraskeletale Ewing Sarcoma (EES) (waar
invasie van het bot niet kan worden aangetoond) worden minder frequent gezien bij mannen en in de
blanke populatie en worden gemiddeld op latere leeftijd gediagnosticeerd (45, 48). De meest
voorkomende EES zijn de Askin tumoren (thoracopulmonair gelokaliseerde tumoren) (49).
Neurologische symptomen komen voor bij 10% tot 33% van de patiënten en kunnen veroorzaakt
worden door invasie van botstructuren zoals het calvarium of van het ruggenmerg. Zeldzamer kan het
gaan om extra-osseuze vormen van ES die hun oorsprong in het centraal zenuwstelsel vinden en nog
16
minder frequent tumoren waarvan de oorsprong in de hersenen gelegen is (1%); deze vorm heeft
weinig kans tot metastasering (42, 47).
Afbeelding 4: Weergave van de verschillende lokalisaties van primaire ES (46).
1.2. Diagnose en klinische presentatie
Beeldmateriaal
Bij vermoeden van een ES worden in eerste instantie RX opnames (minimum 2) gemaakt. Indien deze
verdacht of suggestief zijn, wordt vervolgens een FDG-PET, CT of MRI (dit laatste geniet de
voorkeur) uitgevoerd. Op RX presenteert een ES zich als een osteolytisch fenomeen in combinatie met
een periostale reactie zichtbaar als een “uienschil aspect”. Op MRI kan de tumor worden gezien als
een isointense tot hyperintense zone, ten opzichte van het spierweefsel, op T1 opnames en hyperintens
op T2 gewogen beelden (45, 49).
Biopt
De diagnose kan bevestigd worden door afname van een biopt voor histologisch en moleculair
onderzoek. Het biopt dient steeds na beeldmateriaal te worden afgenomen, aangezien door mogelijke
bloeding of oedemen, het beeldmateriaal minder betrouwbaar zou kunnen worden (45). In de
differentieel diagnose kan bij ES gebruikt gemaakt worden van MIC2 (CD99), aanwezig bij 90% van
de ES, en Neuron-Specifiek Enolase (NSE) aangezien ES hierop meestal positief reageren (10, 44, 47).
Het aantonen van een fusieproteïne (85%), typerend voor ES, is het meest betrouwbare diagnostische
criterium (zie verder ‘Genomische analyse’). Dit wordt routinematig uitgevoerd bij het stellen van de
diagnose door cytogenetische karyotypering, door Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction
(RT-PCR) (transcript van het fusieproteïne aantonen) of door FISH (100% specificiteit) (10, 42, 43,
45).
De klinische presentatie is afhankelijk van de lokalisatie van de tumor. Wanneer de tumor zich in het
bot bevindt, is de eerste en meest frequente aanmeldingsklacht van deze tumor lokale botpijn (weken
tot maanden) en/of zwelling. Ter hoogte van de borstkas, het abdomen en het kleine bekken kan de
tumor een zeer insidieus verloop kennen en een zeer grote massa vormen. Tumoren met een afmeting
17
van 20cm reeds zijn beschreven. Algemene symptomen zoals vermagering, verminderde eetlust,
koorts en vermoeidheid kunnen optreden. Hoe groter de primaire tumor, hoe groter de mortaliteit (45,
49).
Bij één op vier patiënten zijn bij het stellen van de diagnose reeds metastasen aanwezig. De
voorkeurslocaties hiervoor zijn de longen (50%, afhankelijk van de bron tot 80%), het bot (25%) en
het beenmerg (20%) (43, 47, 49).
1.3. Stadiëring
Er bestaat nog geen internationaal erkend risico-classificatiesysteem voor ES, wel zijn er verschillende
classificatiesystemen in omloop. De classificatie van de Children’s Oncology Group studies in NoordAmerika verdeelt de patiënten in drie risicogroepen: als eerste de patiënten met gelokaliseerde
tumoren, een tweede groep met longmetastasen en een derde wanneer er één of meerdere metastasen
aanwezig zijn. Een andere benadering is deze van de UK Childrens’s Cancer Study Group (UKCCSG)
en de German-Dutch-Swiss Cooperative Ewing’s Sarcoma Studies (CESS). De CESS classificeert
patiënten in standaard-risico en hoog-risico. Standaard-risico betekent aanwezigheid van
gelokaliseerde tumor met een detecteerbaar volume van 100mL tot 200mL. Wanneer grotere tumoren
of metastasen aanwezig, worden de patiënten in de groep van hoog-risico ingedeeld. Een andere
classificatie van de EuroEWING-99 study hanteert een complexer systeem gebaseerd op de
aanwezigheid van metastasen, (onderverdeeld in geen, long- of andere metastasen), de grootte van de
initiële tumor (referentiewaarde 200 mL) én de respons op chemotherapie (45).
Alvorens het risicoprofiel van de patiënt kan opgemaakt worden, aan de
hand van een classificatiesysteem, moet de patiënt een volledig staging
onderzoek ondergaan. Dit onderzoek bestaat uit een CT thorax om
mogelijke pulmonaire metastasen op te sporen, een botscintigrafie om
botmetastasen uit te sluiten en een biopt of aspiraat van het beenmerg (45).
Afbeelding 5: 22 jarige man met pijn aan de linker knie en de rug.
FDG-PET scan geeft een maximale capaciteit ter hoogte van de linker femur weer, metastasen zijn
zichtbaar in het bot, de longen en het anterieure mediastinum (49).
1.4. Genomische analyse van Ewing tumoren
De ES worden gekenmerkt door een translocatie waardoor een fusieproteïne ontstaat. Translocaties
zijn mogelijk tussen het EWS gen, gelegen op chromosoom 22, en FLI1, ETV1 of ERG (ETS protooncogenen), respectievelijk gelegen op chromosoom 11, 7 en 21. De meest voorkomende translocatie
(85%) vindt plaats tussen het EWS gen en Friend of Leukemia virus Integration site 1 (FLI1) dat
codeert voor een transcriptiefactor (meestal exon 1-7 van het EWS gen en exon 6-10 van het FLI1 gen)
18
en waarbij het DNA bindend domein van dit FLI1 fuseert met het transactiverend domein van EWS
(t(11;22)(q24;q12)) (zie afbeelding 6) (10, 42, 43, 45, 50). Het fusieproteïne fungeert als een
constitutief geactiveerde transcriptiefactor die genen beïnvloedt betrokken in de celcyclus,
metabolisme, angiogenese, intracellulaire signalisatie en transcriptiemodulatie. Op deze manier wordt
de groei van de tumor gestimuleerd (43, 47).
Afbeelding 6: Schematische representatie van het EWS-FLI-1 fusiegen gevormd door de translocatie t(22;11). Het TET
familie geassocieerde RRM domein, het ETS DNA bindend domein (ETS-DBD) en het amino terminale transactivatie
domein (ATA) zijn op de figuur aangeduid. Het fusiegen kan variëren afhankelijk of de exonen 5-9 of 6-9 van FLI-1
geïncludeerd zijn (50).
1.5. Prognostische factoren
Als belangrijkste prognostische factoren worden het stadium bij diagnose en de respons op de
ingestelde therapie vermeld. Andere prognotische factoren zijn de plaats en het volume van de tumor,
de leeftijd van de patiënt, de respons op de chemotherapie en de aanwezigheid van metastasen (12).
Wanneer p53 wordt aangetast, gaat dit samen met een slechte prognose. Dit wordt echter niet vaak
aangetroffen in ES (51). De chemotherapie geïnduceerde tumornecrose wordt beschreven als de
belangrijkste indicator voor het ziektevrij-interval bij ES patiënten na chirurgie en inductiechemotherapie (50). Het overlevingspercentage voor patiënten met een gelokaliseerde tumor bedraagt
nu 75%, dit in tegenstelling tot 10% vóór een behandeling met chemotherapie werd toegepast.
Wanneer er metastasen aanwezig zijn, is de prognose nog steeds slecht. Amper 10% tot 30% van deze
patiënten overleven vijf jaar (42-44). Na tien jaar is nog maar 30% van de patiënten in leven (42).
Wanneer een recidief optreedt bedraagt de vijfjaars-overleving slechts 13%. De belangrijkste
prognostische factor hierbij is het tijdsinterval tot het optreden van het eerste recidief (44). De
vijfjaars-overleving voor EES is beter dan voor de skeletale tumoren. De ratio van het aantal fatale
casussen van skeletale tumoren vergeleken met gelokaliseerde EES was 2.36 (95% confidence interval,
1.61-3.44) over een periode van 24 maanden, gerekend vanaf het begin van de diagnose (48).
1.6. Therapie
Over het algemeen kan gesteld worden dat de primaire tumorhaard behandeld kan worden door
chemotherapie of een combinatie van chemotherapie en chirurgische resectie (eventueel aangevuld
met radiotherapie) (42). Er dient opgemerkt te worden dat slechts 55% van de patiënten de juiste
19
therapie krijgt (44). Dit terwijl de gebruikte therapieën ernstige korte en lange termijn toxiciteit
kunnen veroorzaken. Nieuwe inzichten in de pathogenese kunnen leiden tot het ontwikkelen van
nieuwe, doelgerichte therapieën (45).
Chemotherapie
Chemotherapie wordt al toegepast voor ES sinds 1960, sindsdien zijn verschillende studies gebeurd
met optimalisatie van de behandeling en verbeterde overleving tot gevolg (van 10% naar 70%-80%
voor locale tumoren). Vroeger werd gewerkt met één chemotherapeutisch middel, waar nu gebruik
gemaakt wordt van verschillende cocktails, afhankelijk van de grootte van de tumor en de
aanwezigheid van metastasen (45). De outcome bij patiënten met metastasen is zeer slecht (10% tot
30% vijfjaars-overleving). Zelfs door het toepassen van megatherapie wordt geen langere overleving
vastgesteld. Megatherapie betekent een myeloablatieve therapie waar gebruik gemaakt wordt van hoge
dosissen chemotherapie (vb. busulfan-melphalan megatherapie), eventueel in combinatie met whole
body radiotherapie, gevolgd door een stamceltransplantatie. De langetermijn resultaten van de stamcel
transplantatie zullen pas binnen enkele jaren bekend geraken (45). Na chirurgische resectie is een
behandeling met systemische chemotherapie steeds noodzakelijk, aangezien de meerderheid van de
patiënten micrometastasen bezit. Indien geen systemische behandeling wordt gegeven, zouden
micrometastasen in 90% van de gevallen relaps van de ziekte veroorzaken (43).
20
2 METHODOLOGIE
2.1. Cellijnen en primaire tumoren
a) Neuroblastoom
In de experimenten wordt gebruikt gemaakt van verschillende cellijnen namelijk SKNAS, CLB-GA,
SKNSH, SHSY5Y, NB1 en SKNF1. Afhankelijk van het experiment dat uitgevoerd wordt, zijn andere
reagentia nodig; deze worden per techniek aangehaald.
b) Ewing tumoren
Hier wordt het DNA materiaal van twee Ewing tumor cellijnen, tc71 en a673 en van tien Ewing
tumoren, ew277t, ew147t, ew279t, ew197t, ew283t, ew286t, ew296t, ew318t, ew213t en ew323t
gebruikt.
2.2. Weefselkweek: opgroeien, verversen en splitsen van cellen
De cellen waar onze interesse naar uitgaat, worden gekweekt en behandeld in het weefselkweeklabo
met veiligheidniveau L2. Specifiek voor dit onderzoek worden neuroblastoom kankercellijnen
gebruikt, afgeleid van neuroblastoomtumoren.
2.2.1 Opgroeien van cellen
Algemeen
De cellen kunnen gebruikt worden voor perturbatie van welbepaalde pathways bijvoorbeeld door
middel van inhibitorbehandelingen. Vervolgens kunnen functionele assays uitgevoerd worden of kan
het celmateriaal (DNA, RNA of eiwitten) verder onderzocht worden.
De cellen die gekweekt worden, hebben voor hun groei verschillende voedingstoffen nodig (zoals
water, proteïnen, elektrolyten,…). Deze stoffen moeten voortdurend aangevuld worden door ze te
voorzien van medium met foetaal kalfsserum. Er wordt gebruikt gemaakt van adherente
(vastgroeiende) neuroblastoomcellen. De handelingen worden steeds uitgevoerd in een LAF-kast
(laminaire airflow) omdat de handelingen steriel moeten worden uitgevoerd.
Materiaal
-Plastic flask van 75 cm! (T75)
-Pipetten (1ml, 5ml en 10ml) (Fisherbrand)
-Verseen (Gibco)
-0,05% Trypsine/EDTA (Gibco)
21
-Dimethyl sulfoxide (DMSO)
-Microscoop (Leitz)
-CO2 incubator 150i (Heracell)
-Centrifuge 5430 (Eppendorf)
-Cultuurmedium:
* RPMI 1640
* 10% FCS (Fetal calf serum)
* 1% L-Glutamine
* 1% Penicilline
* 1% Streptomycine
* 1% Kanamycine
Methode
2.2.2 Verversen van adherente cellen
De cellen groeien in aanwezigheid van 12ml cultuurmedium in een verwarmde incubator (37°C) in
aanwezigheid van 5% CO2 en hoge luchtvochtigheid in de plastic flasks (T75, 75 cm!). Cellen worden
ververst met nieuw medium tot een confluente monolaag gevormd wordt.
2.2.3 Splitsen van adherente cellen
Wanneer een confluente monolaag gevormd is in een T75, wordt het medium geaspireerd en worden
de cellen gewassen met 2ml verseen. Na verwijderen van het verseen wordt 2ml trypsine toegevoegd
en worden de cellen gedurende 3 minuten geïncubeerd bij 37°C. Trypsine verbreekt de celadhesie
moleculen waardoor de cellen loskomen van het flask-oppervlak en van elkaar. Dit wordt
gecontroleerd onder de lichtmicroscoop. Indien nodig wordt dit proces verbeterd door uitvoerig tikken
tegen de flask. Hierna kunnen de cellen opnieuw uitverdeeld worden aan de gewenste densiteit
(gesplitst). Als laatste wordt medium toegevoegd tot een totaal volume van 12ml (voor een T75). Het
medium is in staat om het trypsine te inactiveren.
2.3. TAE-684 inhibitor behandeling
Als eerste stap wordt de mastermix (0,3"M) gemaakt door 7,2"L van 5mM TAE-684 en 200"l
medium samen te voegen voor elke T75 (op een totaal van 12ml). Vervolgens wordt de mix kort
gevortexed en afgespind. Voor de controlemix met DMSO wordt een gelijke hoeveelheid DMSO aan
het medium toegevoegd (aangezien TAE-684 opgelost werd in DMSO). Vervolgens wordt
22
respectievelijk 200"L van de TAE-684 mix en 200"L DMSO mix toegevoegd aan 2 T75 flasks. De
flasks worden vervolgens gekanteld om het geheel te mengen en gedurende 6h in de incubator
gehouden. Hierna worden de cellen in de flasks beoordeeld onder de lichtmicroscoop en geoogst voor
verdere toepassingen.
2.4. Eiwitten oogsten
Algemeen
Naast functionele assays (zoals viabiliteitsanalyses) kan ook het celmateriaal zelf gebruikt worden
voor verdere analyse. Een voorbeeld hiervan is de detectie van eiwitten van interesse uit de cellen (zie
‘resultaten Western Blot’). Daarvoor dienen de cellen geoogst te worden om vervolgens eiwitten te
kunnen isoleren.
Materiaal
!
Plastic flask van 75 cm! (T75)
!
Falcon 15 ml (BD Biosciences)
!
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) (ml) (Gibco)
!
Schraper (Costar)
Methode
Eerst wordt het medium uit de T75 flasks geaspireerd. 5ml (ijskoude) Dulbecco's Phosphate Buffered
Saline (DPBS) wordt toegevoegd in elke T75 flask om de cellen te wassen. Vervolgens worden de
cellen losgemaakt met een schraper en verzameld in een 15ml falcon. Hier wordt geen trypsine
gebruikt aangezien dit drastische veranderingen in de signalisatie van verschillende pathways in de
cellen kan teweegbrengen. De falcon wordt gecentrifugeerd gedurende drie minuten op 1500rpm. Na
het centrifgeren, wordt opnieuw geaspireerd. De overgebleven celpellet wordt in vloeibaar stikstof
geplaatst en vervolgens gestockeerd bij -80°C. Tijdens de handelingen worden de flasks steeds op ijs
gehouden.
2.5. Meten van concentraties door gebruik te maken van de ‘Nanodrop’
Algemeen
Naast het gebruik van celmateriaal voor eiwitanalyse, wordt ook met DNA en RNA materiaal gewerkt.
Voor isolatie en meting van DNA en RNA moeten de cellen eerst geoogst worden. De nanodrop
spectrofotometer is een instrument dat gebruikt wordt om concentratie van onder andere eiwitten en
nucleïnezuren te meten. De meting gebeurt door het staal tussen twee optische kabels te pipetteren, dit
wordt op zijn plaats gehouden door de aanwezige oppervlakte spanning. De druppel wordt omgezet in
een kolom waarvan, door gebruik te maken van een Xenon lamp, de concentratie van het staal kan
23
worden berekend. Dit wordt vervolgens weergegeven in een UV-vis spectrum. Wanneer de nanodrop
gebruikt wordt, staat rechts steeds een ratio vermeld. Deze ratio geeft informatie over de kwaliteit van
het staal. Deze 260/280 ratio, is een ratio die bij meting met een golflengte van 260nm en 280nm de
verhouding van de absorptie weergeeft. Een ratio van 2 komt overeen met een zuiver RNA staal, een
ratio van 1,8 komt overeen met een zuiver DNA staal. Wanneer de ratio lager is, wijst dit op de
aanwezigheid van proteïnen die sterker absorberen bij hogere golflengte. De nanodrop meting wordt
minder gevoelig indien een lagere concentratie materiaal aanwezig is (52).
In dit onderzoek werd de nanodrop gebruikt om zowel DNA als RNA concentratie te meten.
Materiaal
- Computerprogramma ND-1000 UV-Vis
- NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific)
- Droog doekje
- Pipet en pipettips van 10"l (Gilson)
- Nucleasevrij water (Sigma) ("l)
Methode
Eerst wordt het computerprogramma ‘ND-1000’ geopend. Hierin wordt ‘Nucleid acid samples’
geselecteerd om de concentratie van DNA of RNA te meten. Als ‘Sample type’ wordt aansluitend
‘DNA-50’/’RNA-50’ aangeklikt. Na het reinigen met een droog doekje van het optische meetpunt van
de nanodrop, wordt 1,5"l vloeistof op de nanodrop gepipetteerd met een 10"l tip. De bovenste
meetarm, die de bovenste optische vezel bevat, wordt naar beneden gebracht. In het programma wordt
op ‘OK’ geklikt en zo wordt het toestel geijkt. Hierna wordt de meetarm naar boven gebracht en wordt
het meetpunt gereinigd. Vervolgens wordt één druppel sigma water gepipetteerd zonder luchtbellen te
maken. De meetarm wordt gesloten en opnieuw wordt op ‘OK’ geklikt, nu is het toestel geïnitialiseerd.
Dit laatste wordt herhaald waarna op ‘Blanc’ geklikt wordt, zo wordt het toestel gekalibreerd.
Vervolgens wordt 1,5"l staal gepipetteerd op het meetpunt, steeds na reiniging en wordt op ‘Measure’
geklikt. Dit laatste wordt voor alle stalen herhaald.
2.6. Kwantitatieve PCR methode
Algemeen
Een Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction experiment (RT-qPCR) kan target-DNA of
cDNA exponentieel amplificeren (zie verder ‘PCR’) én kwantificeren, wat respectievelijk resulteert in
het bepalen van kopie-aantal of genexpressie. Dit is mogelijk omdat het geamplificeerde product
gedetecteerd kan worden via fluorescentie door gebruik te maken van een intercalerende dye (vb.
SYBR green I) (53, 54). Wanneer deze zich inbouwt in dubbelstrengige moleculen, kan deze licht
24
uitzenden op een bepaalde golflengte. De intensiteit van de fluorescentie komt overeen met de
hoeveelheid geamplificeerd target-DNA/cDNA. De Cq waarde of de ‘quantification cycle’ komt
overeen met het aantal cycli waarbij de fluorescentie boven een bepaalde grenswaarde komt, voor de
start van het experiment ingesteld (55). Hoe groter de hoeveelheid target-DNA/cDNA, hoe sneller
deze grens bereikt wordt en hoe kleiner de Cq waarde.
Materiaal
Er bestaan verschillende kits (Eurogentec Buffer (SYBR Green), Roche) om een master mix te
prepareren voor het uitvoeren van een qPCR.
- Mastermix Eurogentec Buffer
* Eurogentec buffer (2x)
* RNA-se vrij water
* Forward primer (5"M) ("l)
* Reverse primer (5"M) ("l)
- cDNA staal (5ng/"l)
- Verschillende pipetten en pipettips (Gilson)
- Epjes
- Vortex L46 (Labincol)
- Centrifuge & Vortex (Elmi-Tech skyline)
- Multichannel (Gilson)
- Lightcycler 480 multiwell plate 384 scaling foil (Roche)
- Centrifuge 5430 (Eppendorf)
Methode
a) qPCR
De mastermix wordt samengesteld door 2,50"l Eurogentec Buffer (SYBR green I), 0,25"l forward en
reverse primer en 1,00"l sigma water samen te voegen per well. De vereiste hoeveelheid mastermix
per primerpaar wordt berekend door de hoeveelheden van de componenten te vermenigvuldigen met
het aantal stalen (in duplo). De complete mastermix wordt vervolgens gevortexed en afgespind. Hierna
25
wordt 3"l van de mix gepipetteeerd in elke well (volgens de plaatlayout). Na het vortexen en
afspinnen van het cDNA wordt 2"l cDNA in elke well gepipetteerd. De plaat wordt zorgvuldig
afgesloten met adhesieve folie en in de centrifuge geplaatst gedurende dertig seconden op 1500rpm.
Hierna wordt de plaat in de Lightcycler 480 gebracht en de qPCR reactie wordt gestart (protocol zie
tabel 2). De resultaten van het qPCR experiment worden in een bijhorend Lightcycler softwareprogramma weergeven.
FASE
# CYCLI
TARGET (°C) TIJD
ROMP RATE °C/sec
1) Pre incubatie
1
95 10 min
4,8
2) Amplificatie
50
95 10 sec
4,8
60 45 sec
2,5
72 1 sec
4,8
95 5 sec
4,8
60 1 min
2,5
3) Smeltcurve
1
95 continue
4) Afkoeling
1
40 30 sec
0,11
1
Tabel 2: Weergave protocol ‘Lightcycler 480’ Eurogentec Buffer.
b) Primerparen
De primerparen gebruikt in de mastermix van het qPCR experiment, worden eerst getest op een een
standaardverdunningsreeks (DNA of cDNA) (32ng/"l, 8ng/"l, 2ng/"l, 0,5ng/"l, 0,125ng/"l,
0,03125ng/"l) om efficiëntie en specificiteit na te gaan. Nieuw bestelde primerparen komen aan als
gelyofiliseerd product met een gekende hoeveelheid mol en moeten eerst verdund worden alvorens
deze bruikbaar zijn in een qPCR experiment.
2.7. Polymerase-kettingreactie
Algemeen
De ‘Polymerase Chain Reaction’ (PCR) wordt gebruikt om een bepaalde sequentie van DNA te
amplificeren. Die sequentie kan verkregen worden met behulp van een kwalitatief primerpaar voor een
regio van interesse. De lengte van deze primers is van belang aangezien bij gebruik van een te kort
primerpaar de specificiteit kan dalen en wanneer een te lang primerpaar gebruikt wordt, bestaat het
gevaar dat secundaire bindingen gevormd worden.
Drie verschillende fasen kunnen onderscheiden worden:
1) Denaturatie fase: Tijdens deze fase stijgt de temperatuur tot 94°C. Hierdoor worden de
verbindingen tussen de H-bruggen verbroken en denatureert het DNA.
26
2) Annealing fase: In het begin daalt de temperatuur tot 54°C en bewegen, via het principe van de
Brownse beweging, alle primers. Hierdoor worden eerst kortstondige verbindingen gevormd en later
stevigere verbindingen indien een match gevormd wordt tussen primer en template. Wanneer het DNA
polymerase op deze verbinding inwerkt, kunnen de verbindingen blijven bestaan.
3) Elongatie fase: In deze fase stijgt de temperatuur tot 72°C. Dit is een ideale temperatuur voor het
DNA polymerase. De sterke verbindingen blijven bestaan en de zwakke verbindingen worden
verbroken. De basen worden op de 3’ streng gekoppeld aan de primer, de dNTP’s worden aangebracht
door het DNA polymerase in de 5’ richting. Bijgevolg wordt de template streng afgelezen in de 3’ !
5’ richting (56).
Materiaal
- Mastermix
* 10x PCR buffer ("l)
* dNTP’s: G, C, A ,T (10mM) ("l)
* Reverse Primer (5"M) ("l)
* Forward Primer (5"M) ("l)
* Kapa Taqhotstar (5U/"l) ("l)
* MgCl2 (25"M) ("l)
- DNA (10ng/"l)
- Verschillende pipetten en pipettips (Gilson)
- Epjes
- Centrifuge 5430 (Eppendorf)
- Adhesive PCR foil seals (Thermo Scientific)
- C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad)
- Caliper plaat en capillaire gelelektroforese
Methode
De mastermix per well wordt gemaakt door samenvoegen van 10,8"l sigma water, 5,0"l 10xPCR
buffer, 2,5"l MgCl2, 0,5"l dNTP’s, 2,5"l Reverse en Forward primer en 0,2"l Kapa Taqhotstar. De
totale hoeveelheid mastermix die moet gemaakt worden, wordt berekend aan de hand van het aantal
stalen per primerpaar. Het DNA (10ng/"l) wordt gevortexed en afgespind. Vervolgens wordt in elke
well 2,0"l van dit DNA gepipetteerd. De PCR plaat wordt afgedekt met de adhesieve PCR folie en
27
wordt dertig seconden op 1500rpm in de centrifuge geplaatst. Vervolgens wordt de plaat in het PCR
toestel bevestigd. In het CMGG wordt standaard gebruik gemaakt van een ‘touch down’ PCR
programma. Hierbij verandert de annealingstemperatuur per cyclus waardoor de specificiteit van de
reactie stijgt en de vorming van secundaire producten onderdrukt wordt (protocol zie tabel 3). Hierna
wordt het geamplificeerde PCR product op het capillaire gelelektroforese toestel geplaatst om de
grootte van het amplificatieproduct na te gaan en de werking van primers te evalueren. Dit gebeurt
door 3"l van het PCR product met 17"l water te pipetteren op de caliperplaat. Deze plaat wordt tot het
uitvoeren van de gelelektroforese bij een temperatuur van 4°C bewaard.
Tijd
Temperatuur
1
Initiële
denaturatie
2 min
94°C
2
Denaturatie
20 sec
94°C
3
Annealing
15 sec
4
Extensie
1 min
5
Stap 2 – 4
11 X
6
Denaturatie
40 sec
94°C
7
Annealing
40 sec
50°C
8
Extensie
30 sec
72°C
9
Stap 6 – 8
23 X
10 Finale extensie
4 min
62°C
72°C
72°C
Tabel 3: Weergave van het touch down protocol.
28
3 RESULTATEN
a) Neuroblastoom
In het kader van het neuroblastoom onderzoek worden twee onderwerpen behandeld. Als eerste
worden experimenten uitgevoerd omtrent het ALK oncogen. Op het labo cytogenetica focust een groot
onderdeel van het ALK onderzoek zich op het ontrafelen van de ALK signalisatie pathway. Een
voornaam doel hierbij is het identificeren van belangrijke knooppunten in de signalisatie pathway die
mogelijk opties kunnen bieden voor nieuwe therapeutische doelwitten en deze nieuwe therapieën
kunnen dan deel uitmaken van een combinatietherapie. In de besproken experimenten, wordt gebruik
gemaakt van neuroblastoomcellijnen met verschillende ALK mutatie-status. ALK inhibitoren worden
toegediend aan deze cellijnen voor onderzoek op verschillende niveaus. Eerst wordt na
inhibitorbehandeling een viabiliteitsanalyse uitgevoerd, waardoor de inhibitor op functioneel niveau
nagegaan wordt. Anderzijds wordt een ALK inhibitorbehandeling toegepast voor het valideren van
nieuwe kandidaat ALK targetgenen, door expressie van deze genen na te gaan, zowel op mRNA als op
eiwit niveau. Resultaten hieruit kunnen een verklaring bieden voor de resultaten verkregen bij de
functionele analyse. Met betrekking tot het tweede onderwerp worden experimenten uitgevoerd in
verband met het NF1 gen.
3.1 Inhibitor behandeling
a) Viabiliteitsanalyse
In deze thesis zal gebruik gemaakt worden van tyrosine kinase inhibitoren die in vitro een remmende
werking op het oncogene ALK proteïne uitoefenen. Bij een eerste experiment wordt gebruik gemaakt
van twee ALK inhibitoren, TAE-684 en PF-2341066 (Crizotinib) om het effect op de viabiliteit van
verschillende cellijnen met een verschillende ALK mutatie-status na te gaan. In het tweede experiment
wordt getest hoeveel inhibtor exact nodig is om celdood te veroorzaken (zie verder
‘viabiliteitsanalyse’). Aangezien inhibitoren in vivo vaak toxisch zijn voor alle cellen, zowel de
gezonde als de zieke, moet er bij de ontwikkeling van nieuw farmacon, gezocht worden naar die
bepaalde concentratie waarbij een minimaal toxisch effect op de gezonde cellen en een maximaal
toxisch effect op de zieke cellen uitgeoefend wordt.
Inleiding
Door het uitvoeren van een viabiliteitsanalyse wordt informatie omtrent viabiliteit verkregen (zonder
een concreet onderscheid te maken tussen proliferatie, differentiatie en apoptose), door gebruik te
maken van een ‘CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay’. Metabool actieve cellen worden
gedetecteerd op basis van ATP. Indien er minder (prolifererende) cellen zijn, zal er ook minder ATPverbruik zijn. De hoeveelheid aanwezige cellen wordt weergegeven door een luminescent signaal dat
29
uitgezonden wordt. Dit signaal wordt verkregen door een luciferase reactie, waarin luciferase als
katalysator fungeert voor de omzetting van luciferine naar oxyluciferine.
Verder worden de IC50 (half maximal Inhibitory Concentration 50%) waarden berekend voor
verschillende NB cellijnen en wordt onderzocht op welke cellijn de twee gebruikte inhibitoren een
vermindering in viabiliteit veroorzaken. De IC50 waarde komt overeen met de vereiste hoeveelheid
inhibitor om celviabiliteitsreductie in 50% van de cellen te bekomen. Indien een ALK inhibitor de
hoeveelheid levende cellen doet afnemen bij bepaalde lage concentraties, betekent dit dat ze ALKafhankelijk zijn.
Doel
Dit experiment heeft als doel het werkingsprofiel van twee verschillende inhibitoren te analyseren. De
werking van de inhibitoren wordt nagegaan op neuroblastoomcellijnen met verschillende ALK
mutatie-status, gebruikmakend van verschillende concentraties op verschillende tijdstippen (de
geselecteerde neuroblastoom cellijnen zijn representatief voor de verschillende ALK mutatie-statussen).!
Experiment
Er wordt een vergelijking gemaakt tussen de respons van twee ALK inhibitoren in drie NB cellijnen
met verschillende ALK mutatie-status op drie verschillende tijdstippen: 24h (hours), 48h en 72h.
Concreet worden hier de cellijnen SKNAS (ALKWT), CLBGA (ALKR1275Q) en SHSY5Y (ALKF1174L)
en de inhibitoren TAE-684 en PF-2341066 gebruikt. De drie cellijnen worden behandeld met 0,00"M,
0,16"M, 0,32"M, 0,64"M en 1,28"M TAE-684. SKNAS (ALKWT) wordt behandeld met 0,0"M,
0,5"M, 1,0"M en 2,0"M PF-2341066 en CLBGA (ALKR1275Q) en SHSY5Y (ALKF1174L) met 0,00"M,
0,16"M, 0,32"M, 0,64"M, 1,28"M en 2,56"M PF-2341066 inhibitor. Vervolgens worden de IC50
waarden berekend door gebruik te maken van het programma “Graphpad Prism”.
Als referentiewaarde wordt steeds gewerkt met de waarde verkregen zonder toevoeging van inhibitor
(0,0"M TAE-684), wat enkel de aanwezigheid van DMSO betekent.
Wanneer de SKNAS cellijn (ALKWT) wordt behandeld met de laagste 3 inhibitorconcentraties
(0,16"M, 0,32"M en 0,64"M TAE-684) wordt amper celviabiliteisreductie gezien. Wanneer
behandeld met de hoogste dosis, 1,28"M, wordt een duidelijk effect gezien wat het meest
uitgesproken is na 72h behandeling (85% celviabiliteisreductie). Wanneer de wild type cellijn
behandeld wordt met PF-2341066, worden gelijkaardige effecten gezien zoals na de behandeling met
TAE-684; hier wordt echter een effect gezien vanaf een dosis van 1"M.
Voor de CLBGA cellijn (ALKR1275Q) wordt na behandeling met TAE-684 een uitgesproken effect
gezien bij lage concentraties, dit in tegenstelling met de wild type cellijn. De tijdsduur van de
behandeling heeft een grotere impact dan de concentratie. De celviabiliteisreductie wordt meer
30
uitgesproken wanneer langer wordt behandeld maar is minder afhankelijk van de gebruikte dosis.
Algemeen wordt er celviabiliteisreductie gezien van ongeveer 25% na 24h, van ongeveer 40% na 48h
en van ongeveer 55% na 72h. Wanneer behandeld met lage concentraties PF-2341066 inhibitor wordt
een minder uitgesproken effect gezien dan wanneer behandeld met TAE-684. Wanneer gedurende
48h/72h behandeld met een lage dosis (0,16"M) PF-2341066 wordt een celviabiliteisreductie van
ongeveer 15% (versus 40% voor TAE-684) waargenomen. Hier is wel een impact van de duur én de
dosis van de behandeling aanwezig.
Voor de SHSY5Y cellijn (ALKF1174L) wordt een zeer uitgesproken effect gezien wanneer behandeld
met lage concentraties TAE-684 inhibitor, in tegenstelling met de wild type cellijn. Wanneer slechts
24h behandeld wordt met 0,16"M (laagste dosis) wordt al een celviabiliteisreductie van 29,5% gezien
en op 48h/72h van bijna 60%. Met de PF-2341066 inhibitor wordt een beperkter effect vastgesteld dan
wanneer behandeld met TAE-684. Wanneer behandeld met de lagere dosissen (0,16"M, 0,32"M en
zelfs 0,64"M) wordt de sterkste celviabiliteisreductie van 19,8% gezien na 48h behandeling met
0,64"M. Bij hogere concentraties wordt een sterk effect gezien, zoals te zien is bij de CLBGA cellijn
(zie afbeelding 7).
TAE-684 BEHANDELING
)#%"$
)#""$
"#("$
"#'"$
"#&"$
"#%"$
"#""$
PF-2341066 BEHANDELING
%&4$
&(4$
5%4$
"$*+$ "/)'$ "/0%$ "/'&$ )/%($
,-.$ *+$,-.$*+$,-.$*+$,-.$*+$,-.$
)#%"$
)#""$
"#("$
"#'"$
"#&"$
"#%"$
"#""$
123-1$
)#%"$
)#""$
"#("$
"#'"$
"#&"$
"#%"$
"#""$
&(4$
5%4$
9:;!<-$
&(4$
5%4$
"$*+$67$ "/8$*+$ )$*+$67$ %$*+$67$
67$
123-1$
%&4$
"$*+$ "/)'$ "/0%$ "/'&$ )/%($
,-.$ *+$,-.$*+$,-.$*+$,-.$*+$,-.$
%&4$
)#%"$
)#""$
"#("$
"#'"$
"#&"$
"#%"$
"#""$
%&4$
&(4$
5%4$
"$*+$ "/)'$ "/0%$ "/'&$ )/%($ %/8'$
67$ *+$67$*+$67$*+$67$*+$67$*+$67$
9:;!<-$
31
)#%"$
)#""$
"#("$
"#'"$
"#&"$
"#%"$
"#""$
%&4$
&(4$
5%4$
)#%"$
)#""$
"#("$
"#'"$
"#&"$
"#%"$
"#""$
%&4$
&(4$
5%4$
"$*+$ "/)'$ "/0%$ "/'&$ )/%($ %/8'$
67$ *+$67$*+$67$*+$67$*+$67$*+$67$
"$*+$ "/)'$*+$"/0%$*+$"/'&$*+$)/%($*+$
,-.$
,-.$
,-.$
,-.$
,-.$
1=1>8>$
1=1>8>$
Afbeelding 7: Viabiliteitsanaylse voor 3 NB cellijnen SKNAS (ALKWT), CLBGA (ALKR1275Q) en SHSY5Y (ALKF1174L) na
behandeling met 0,00"M, 0,16"M, 0,32"M, 0,64"M en 1,28"M TAE-684. Behandeling van SKNAS (ALKWT) na 0,0"M,
0,5"M, 1,0"M en 2,0"M PF-2341066 en CLBGA (ALKR1275Q) en SHSY5Y (ALKF1174L) na 0,00"M, 0,16"M, 0,32"M,
0,64"M, 1,28"M en 2,56"M PF-2341066 behandeling.
Uit de IC50 waarden voor de TAE-684 behandeling wordt duidelijk vastgesteld dat TAE-684 op de
SHSY5Y (ALKF1174L) cellijn een sterke reductie in celviabiliteit veroorzaakt, aangezien zeer kleine
concentraties voldoende zijn om de helft van de cellen te inhiberen. De vereiste concentratie is veel
lager dan voor de CLBGA cellijn (ALKR1275Q), waar de impact van de tijdsduur door de IC50 waarden
goed wordt weergegeven. Voor de wild type cellijn wordt een celviabiliteitsreductie van 50%
bekomen wanneer behandeld wordt met lage concentraties inhibitor. Hier dient opgemerkt te worden
dat deze waarden voornamelijk beïnvloed worden door de twee hoogste concentraties, die mogelijks
toxisch zijn voor alle cellen.
Wanneer behandeld wordt met de PF-2341066 inhibitor wordt voor de SHSY5Y cellijn (ALKF1174L),
zoals met TAE-684 behandeling, eveneens een zeer goed effect gezien. Voor de andere mutante cellijn,
CLBGA (ALKR1275Q), wordt indien kort (24h) behandeld een grote concentratie inhibitor vereist
(92,92). Wanneer echter langer (48h en 72h) behandeld wordt, daalt de nodige concentratie inhibitor
uitgesproken. Bijgevolg is in dit experiment de F1174L mutante cellijn gevoeliger voor PF-2341066
behandeling in vergelijking met de R1275Q cellijn. Voor de wild type cellijn wordt reeds
celviabiliteisreductie bekomen wanneer een zeer lage concentratie inhibitor gebruikt wordt. Deze
waarden worden voornamelijk beïnvloed door de twee hoogste en mogelijks toxische concentraties
(zie tabel 4).
TAE-684
IC50
IC50
IC50
24h
48h
72h
SKNAS
1,697
0,781
0,686
CLB-GA
52,590
5,231
SHSY5Y
1,366
0,149
PF-2341066
IC50
IC50
IC50
24h
48h
72h
SKNAS
3,390
1,708
1,646
0,501
CLBGA
92,920
6,652
2,989
0,121
SHSY5Y
2,913
1,042
1,016
Tabel 4: De IC50 waarden voor de cellijnen SKNAS (ALK
WT
), CLBGA (ALK
R1275Q
) en SHSY5Y (ALKF1174L) na
behandeling met TAE-684 en PF-2341066 inhibitor.
32
b) Genexpressie analyse
In een voorgaand experiment werd een NB cellijnpanel (n=10) behandeld gedurende 6 uur met 0,3"M
TAE-684 en als controle met DMSO, aangezien TAE-684 is opgelost in DMSO. Vervolgens werden
deze cellijnen onderworpen aan genexpressie profilering. Door data-analyse werd een lijst verkregen
van genen die differentieel tot expressie kwamen na behandeling. Na de behandeling werd een lagere
expressie gezien voor een aantal genen waaronder het Ferm Domain Containing Protein 3 (FRMD3)
gen, dat hier geselecteerd werd voor verdere validatie met behulp van qPCR en Western Blot.
Aangezien geweten is dat TAE-684 een inhibitor is van ALK, kan gesteld worden dat ALK een
opregulatie van dit gen in NB cellijnen veroorzaakt.
qPCR
Doel
Dit experiment heeft als doel het effect van TAE-684 op genexpressie niveau voor het FRMD3 gen na
te gaan. Dit experiment vormt een validatie van de gegevens verkregen door de genexpressie
profilering. Hier worden verschillende cellijnen met verschillende ALK mutatie-status gebruikt.
Voorafgaande experimenten: RNA isolatie, DNAse behandeling, cDNA synthese en testen van de
primerparen
Alvorens onderzoek kan uitgevoerd worden op RNA, moet dit geïsoleerd worden uit cellen. Op het
RNA materiaal kan vervolgens een DNAse behandeling worden toegepast. Het gebruikte ‘Turbo
Dnase’ heeft een hogere affiniteit voor DNA dan het originele ‘DNAse I’, hierdoor kan het efficiënter
DNA verwijderen. Dit is nodig aangezien vermeden moet worden dat naast RNA, DNA mee opgepikt
wordt door de primers. Hierna kan uit het RNA materiaal cDNA gesynthetiseerd worden. Dit cDNA is
nodig voor het uitvoeren van een qPCR experiment. Het is belangrijk bij het gebruiken van RNA dat
steeds op ijs wordt gewerkt, aangezien dit bij kamertemperatuur snel degradeert.
Experiment
Concreet wordt het FRMD3 gen onderzocht aan de hand van de cellijnen CLBGA (ALKR1275Q),
SKNSH (ALKF1174L), NB1 (ALKamplificatie) en SKNAS (ALKWT). In het experiment wordt een
vergelijking gemaakt van de cellijnen na 6 uur behandeling met 0,3"M TAE-684 en DMSO. Er wordt
een uitgesproken daling in de genexpressie gezien voor NB1 (95,0%) en CLBGA (82,4%). Voor
SKNSH wordt de genexpressie gehalveerd (51,1%) en voor SKNAS kan na behandeling met TAE684 geen daling in de expressie worden vastgesteld (zie afbeelding 8).
33
!"#$%&$'()%
(#%"!
(#$"!
(#""!
"#'"!
23.4#!&5!!
"#&"!
"#673!8-9:&'%#!&5!
"#%"!
"#$"!
"#""!
)*+,-!
./0.1!
0,(!
./0-.!
Afbeelding 8: qPCR voor de evaluatie van FRMD3 genexpressie op de CLBGA (ALKR1275Q), SKNSH (ALKF1174L), NB1
(ALK amplificatie) en SKNAS (ALKWT) cellijn. De waarden worden bekomen na 6h behandeling met TAE-684 ten opzichte van
DMSO.
c) Eiwit analyse
Uit dezelfde stalen wordt naast RNA ook eiwit geïsoleerd. Het effect van de inhibitoren op NB1 en
CLBGA wordt in parallel op eiwitniveau nagegaan door Western Blot.
Western Blot
Algemeen
Voor het detecteren van eiwitten dienen de cellen eerst geoogst te worden en hierna kunnen de
eiwitten geïsoleerd worden. Vervolgens wordt cellyse uitgevoerd met Radio ImmunoPrecipitation
Assay (RIPA) buffer, die toelaat om de proteïnen vrij te maken. Na de isolatie is het mogelijk de
concentratie van de verschillende NBstalen te meten en kunnen deze gebruikt worden voor een
Western Blot experiment. Dit is een biochemische techniek waardoor een specifiek proteïne in een
mengsel kan gedetecteerd worden. De proteïnen worden op basis van grootte (moleculair gewicht)
gescheiden door SDS Polyacrylamide Gel Electrophorese (SDS-PAGE). Vervolgens worden de
eiwitfragmenten overgebracht op een nitrocellulose of PVDF membraan waarop ze vasthechten. Door
het aanleggen van een elektrisch veld, worden de negatief geladen DNA-fragmenten aangetrokken
door de positieve pool van het blotting apparaat. Hoe kleiner de fragmenten, hoe sneller deze in de
agarosegel bewegen. Het target eiwit kan gedetecteerd worden door een specifiek antilichaam voor
detectie te gebruiken (57). De data kunnen gekwantificeerd worden door het programma “Image J”. In
het programma “Image J” kunnen via de functie “Analyse gels” de verschillende zones in de blot
geselecteerd worden en op deze manier kan men de bijpassende waarden in excel verkrijgen.
34
Doel
Het doel van dit experiment is het effect van de inhibitor TAE-684 voor FRMD3 te testen op
eiwitniveau aan de hand van de cellijnen NB1 en CLBGA. Preliminaire resultaten, die gegenereerd
werden als onderdeel van een optimalisatie experiment voor FRMD3 Western Blot, toonden aan dat er
een mogelijke reductie van FRMD3 eiwitexpressie plaatsvindt in TAE-684 behandelde ALK mutante
stalen. Het uitvoeren van dit experiment fungeert bijgevolg als validatie.
Experiment
Western Blot wordt uitgevoerd voor FRMD3 en #-actine op de cellijnen NB1 en CLBGA. #-actine
wordt gebruikt als referentie-proteïne aangezien dit proteïne onder normale omstandigheden stabiel
voorkomt in de NBcellen. Proteïnen van NB1 en CLBGA worden op de Western Blot weergegeven
wanneer enkel DMSO wordt toegevoegd en na respectievelijk 5 uur (u) en 6u behandeling met TAE684. Aangezien visuele inspectie van de Western Blot moeilijk tot een onmiddellijke conclusie kan
leiden worden deze data gekwantificeerd met het programma “Image J” (zie afbeelding 9). In de
Western Blot kan de intensiteit van de band worden geselecteerd (een band geeft het moleculair
gewicht van een gevisualiseerd proteïne aan). Deze intensiteit wordt in het programma “Image J”
omgezet tot de overeenkomstige getalwaarde en kan vervolgens worden uitgezet in een grafiek. Voor
de cellijn CLBGA daalt na 6u behandeling de expressie met 62,2%, na normalisatie met #-actine.
Voor NB1 wordt na 5u behandeling met TAE-684 een stijging van 404,8% vastgesteld (zie afbeelding
10). Door het grote verschil in lading voor de referentie-proteïne, bekomen voor (8723,88) en na
(526,04) behandeling, moet het experiment voor NB1 herhaald worden. (De uitvoering van het
Western Blot experiment werd niet zelf meegevolgd.)
Afbeelding 9: Western Blot voor FRMD3 en de cellijnen CLBGA en NB1. Onderaan wordt de referentie-proteïne #-actine
weergegeven.
35
*+,-+./%012-%&$'()%
&#""!
;#""!
%#""!
0<=>!?@326!23.4!
6#""!
0<=>!?@326!8-9:&'%!
$#""!
(#""!
"#""!
)*,+-!
0,(!
Afbeelding 10: FRMD3 proteïne concentraties voor de cellijnen CLBGA en NB1 vóór en na TAE-684 behandeling. In de
legende staat ‘Norm’ voor de genormaliseerde waarde.
3.2 Analyse van het NF-1 gen
De rol van NF1 als tumorsuppressor bij NB werd reeds beschreven (8). Door middel van een array
CGH experiment wordt een homozygote deletie aangetoond voor het NF1 gen in de SKNF1 cellijn.
qPCR
Doel
Het doel van dit experiment is het aantonen van de homozygote deletie in de SKNF1 cellijn van het
NF1 gen, door het bepalen van het aantal kopieën met qPCR. Dit experiment geldt als validatie voor
het array CGH experiment.
Experiment
Er wordt een kopie-aantal bepaling uitgevoerd aan de hand van een qPCR op het NF1 gen voor
SKNF1 en de controle stalen. Als referentiestalen worden commercieel beschikbaar genomisch DNA
(gDNA) (Roche), gDNA (Promega) en EBV99 gebruikt; deze stalen hebben allen twee kopieën van
elk gen. Het genomisch DNA staal wordt gelijk gesteld aan 1,0. De andere referentiestalen bevinden
zich eveneens rond de 1,0, wat overeenkomt met twee kopieën. Voor de cellijn SKNF1 is het kopieaantal nauwelijks detecteerbaar (0,13) in vergelijking met de referenties (zie afbeelding 11). Dit
bevestigt de homozygote deletie gedetecteerd met behulp van array CGH.
36
%!"#$%3&4%
(#&"!
(#%"!
(#$"!
(#""!
"#'"!
"#&"!
"#%"!
"#$"!
"#""!
0?(!
./0?A!
!
20-!
9,BCC!
!
D=<>EFG!>GHE!
Afbeelding 11: Kopie-aantalbepaling van NF1 met qPCR voor de referentiestalen (commercieel beschikbaar genomisch
DNA (gDNA) (Roche), gDNA (Promega) en EBV99) en de SKNF1 cellijn.
Sanger sequentie analyse
Inleiding
Sanger sequencing is een techniek waarbij gebruik gemaakt wordt van 2’,3’-dideoxynucleotiden. Deze
hebben geen 3’-OH groep zoals de normale desoxyribonuclotiden, waardoor replicatie gestopt wordt.
Aangezien beide nucleotiden in het reactiemengsel aanwezig zijn, ontstaan verschillende fragmenten.
Deze fragmenten worden overgebracht op een polyacryl-amide gel en op lengte gescheiden. Door
autoradiografie worden de fragmenten zichtbaar en wordt de sequentie van de DNA keten
weergegeven. Hierdoor ontstaat een elektroferogram dat geanalyseerd kan worden.
Verschillende afwijkingen zoals puntmutaties, single-nucleotide polymorphism (SNP’S), deleties, ...
kunnen aan de hand van een elektroferogram opgespoord worden. Een SNP is een DNA sequentievariatie van typisch één nucleotide, die vaak gezien wordt bij gezonde individuen. Een SNP
onderscheidt zich van een causale puntmutatie. Er bestaan homozygote puntmutaties, waarbij beide
allelen aangetast zijn en heterozygote puntmutaties, waarbij één allel normaal is en één allel de mutatie
bevat. Een homozygote mutatie wordt weergegeven in een elektroferogram door één piek op met
dezelfde kleur (die verschillend is van de referentiesequentie). Bij een heterozygote mutatie worden
twee pieken met een verschillende kleur zichtbaar. Een deletie of een insertie in één allel wordt
herkend wanneer er zich een dubbellopende sequentie voordoet, waarbij een deel van de sequentie in
het ene allel respectievelijk wegvalt of bijkomt.
Doel
Het doel van dit experiment is aan de hand van 18 cellijnen (NB5/1349, NBL-S/1350, N206 (1347),
NB13 Emetin 10h (1348), SKNSE(2c) Emetin 10h (1351), SKNF1 Emetin 10h (1353), SKNBE
37
Emetin 10h (1354), SHEPTET Emetin 10h (1355), SMS-KAN Emetin 10h (1356), SKNSH Emetin
10h (1357), LAN-1 (4615), STANB-12 (733), IMR32, SKNAS, SKNBE, STANB8, TR14 en SJNB-1)
de sequentie van het NF1 gen te analyseren. Er wordt gezocht naar mutaties, deleties en
polymorfismen.
Experiment
De sequentie van NF1 wordt onderzocht en er wordt een samenvatting gemaakt van de resultaten (de
uitvoering van het experiment werd niet zelf uitgevoerd). Er bestaan drie mogelijke oorzaken van
deleties op DNA-niveau: het exon ontbreekt volledig, het exon en (een deel van) de omliggende
intronen ontbreken of er is een intronische basenpaarverandering in de buurt van het exon waardoor
het signaal voor de verankerings-site van de introns verloren gaat. Bij de analyse van de achttien
cellijnen kunnen vijf deleties worden aangetoond op cDNA niveau met als gevolg het ontbreken (skip)
van exon 4a, 12b->19b en begin 20, 24/25, 31 en 36. Hiernaast worden zestien, reeds beschreven
polymorfismen, gedetecteerd (zie afbeelding 12).
38
NF-1
NB5/1349
NBL-S/1350
1347
1348
1351
1353
1354
1355
1356
1357
4615
primer 1
ok
skipexon 4a
ok
ok
mislukt
ok
-
ok
ok
ok
ok
primer 2
ok
ok
ok
ok
mislukt
ok
-
ok
ok
ok
ok
primer 3
702G>A (homopolymorfisme)
va
primer 4
ok
ok
primer 5
ok
ok
ok
primer 6
ok
ok
mislukt
primer 7
ok
ok
va
primer 8
ok
ok
primer 9
pr. 8 + 9+ homo -> c. 29856 > c.
==> leu --> leu
ok
ok
primer 10
ok
primer 11
702G > A
702 G>A
homozygoot -> polymorfisme
ok
ok
polymorfisme
ok
702 G>A
(homo)
misluktpolymorfisme
ok
mislukt
702 G>A
702 G>A
702 G>A
702 G>A
polymorfisme polymorfismepolymorfismepolymorfisme
va
ok
ok
ok
-
va
ok
-
mislukt
ok
-
mislukt
ok
2034 A>G
2034 A>G 2034 A>G 2034 A>G
polymorfisme polymorfismepolymorfismepolymorfisme
ok
ok
ok
ok
ok
mislukt
va
-
ok
ok
ok
ok
ok
ok
mislukt
ok
-
ok
ok
ok
ok
ok
ok
ok
ok
mislukt
-
ok
ok
ok
ok
positief skip exon 24 + 25
ok
ok
ok
ok
mislukt
-
ok
ok
ok
ok
primer 12
va
ok
va
ok
ok
mislukt
-
ok
mislukt
va
mislukt
primer 14
ok
ok
ok
ok
ok
mislukt
-
mislukt
ok
ok
ok
primer 15
ok
ok
ok
ok
ok
mislukt
-
ok
ok
ok
ok
primer H4
ok
va
ok
ok
ok
-
ok
ok
ok
ok
ok
primer 16
ok
va
ok
ok
ok
-
ok
ok
ok
ok
ok
primer 17
ok
va
ok
ok
ok
-
ok
ok
va
ok
ok
primer 18
ok
va
ok
ok
va
-
ok
ok
va
ok
ok
primer 19
va
skipexon 36
ok
va
va
-
va
va
va
va
va
primer 20
ok
ok
ok
ok
ok
mislukt
ok
ok
ok
ok
ok
primer 21
ok
va
ok
ok
ok
mislukt
ok
ok
va
ok
ok
primer 22
ok
ok
ok
ok
va
mislukt
ok
ok
ok
ok
ok
primer 23
ok
ok
ok
ok
ok
mislukt
va
ok
ok
ok
ok
2034A>G
polymorfisme
ok
ok
ok
ok
ok
39
733
IMR32
SKNAS
SKNBE
STANB8
TR14
SJNB-1
primer 1
mislukt
exon 7 (G<A) - SNP
ok
ok
-
va
-
primer 2
mislukt
ok
ok
-
-
ok
-
primer 3
mislukt
702 G>A polymorfisme
ok
ok
-
mislukt
-
primer 4
mislukt
ok
ok
mislukt
-
va
-
primer 5
mislukt
va
-
ok
-
va
-
primer 6
ok
ok
ok
2034 A>G homo
ok
ok
skipexon 12b->19b + begin 20
c.2659(T<G) / p.759(V<G)
-
beginexon
va 20
primer 7
ok
ok
ok
polymorfisme
ok
primer 8
ok
ok
ok
ok
beschreven als mutatie)
* exon 19
-
va
va
primer 9
ok
ok
ok
ok
va
-
ok
primer 10
mislukt
mislukt
ok
ok
-
-
-
primer 11
mislukt
mislukt
skip exon 31
ok
-
-
-
primer 12
mislukt
ok
ok
ok
-
-
-
primer 14
mislukt
mislukt
ok
ok
-
-
-
primer 15
mislukt
mislukt
ok
ok
-
-
-
primer H4
ok
-
-
ok
-
-
primer 16
ok
-
-
ok
-
-
-
primer 17
ok
-
-
ok
-
-
-
primer 18
ok
-
-
ok
-
-
-
primer 19
ok
-
-
mislukt
-
-
-
primer 20
mislukt
-
-
-
-
-
-
primer 21
mislukt
-
-
-
-
-
-
primer 22
mislukt
-
-
-
-
-
-
primer 23
mislukt
-
-
-
-
-
-
Tabel 4: Samenvattende tabel van de 18 cellijnen van de de Sanger sequentie analyse van het NF1 gen. De skip exonen worden in het oranje weergegeven, de polymorfismen in het groen en
mogelijke mutaties in het blauw.
40
b) Ewing tumoren
Bij een ‘whole genome’ kopie-aantal screening, door middel van array CGH analyse van een panel
van tien Ewing tumor-stalen en twee cellijnen, werd een deletie gevonden in twee stalen met een heel
kleine overlap (2,5 Mb). Hierbij werd gezien dat het PRDM2 gen één van de weinige gedeleteerde
genen was. Dit gen bevat twee promotor-regio’s die verantwoordelijk zijn voor de synthese van twee
transcriptieproducten RIZ1 en RIZ2 (11). Het ‘Retinoblastoma proteïne-Interagerend Zinc finger’ gen
RIZ is een tumorsuppressor gen dat deel uitmaakt van de PR of SET domeinfamilie van chromosomale
regulatoren betrokken bij chromatine gemedieerde genactivatie en repressie (58). RIZ1 (maar niet
RIZ2) bevat een methyltransferase of PR domein in een proteïne-bindend domein en kan interageren
met een motief gelegen in de COOH regio van RIZ (58). Het RIZ1 gen is frequent een target van
frameshiftmutaties in microsatelliet-onstabiele kankers bij de mens (59). RIZ1 (PR+) product wordt
beschouwd als de trigger voor tumorsuppressor(s) gelegen op chromosoom 1 regio p36. Een deletie
van 1p36 is reeds beschreven bij talrijke tumoren. Specifiek voor dit PRDM2 gen werden in de exonen
5, 6, 7 en 8 reeds enkele mutaties beschreven bij andere tumoren zoals het diffuse large B-cell
lymfoom, retinoblastoom, colorectaal carcinoom, hepatocellulair carcinoom, prostaat-, borst- en
longcarcinoom (11). Met dit experiment wordt nagegaan of er ook bij de Ewing tumoren mutaties
terug te vinden zijn in de reeds genoemde exonen.
Deze doelstelling kan onderzocht worden wanneer de sequentie van exon 5a, 6a, 7a, en 8 (opgedeeld
in exon 8a en 8b), van PRDM2 in tien Ewing tumoren en twee Ewing cellijnen, bestudeerd wordt.
3.1 Primers
Alvorens mutaties in een gen kunnen worden opgespoord, dient de sequentie van het desbetreffende
gen achterhaald te worden. Deze sequentie kan worden teruggevonden in ‘Ensembl’. Door een correct
primerpaar te gebruiken, kan de gewenste regio geamplificeerd worden.
De sequentie van de primerparen voor exon 5a, 6a, 7a en 8 wordt opgezocht in literaire bronnen (60).
Hierna werden de primers in silico gevalideerd met behulp van ‘Bisearch’ (http://bisearch.enzim.hu/).
Aan
de
hand
van
de
(http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html)
‘Reverse
kan
complement’
vervolgens
in
sequentie
‘Ensembl’
(http://www.ensembl.org/index.html) de exacte locatie in het gen worden opgezocht. Een ander
validatie middel is het gebruik van ‘UCSC in silico; via deze website is het mogelijk door het ingeven
van een primerpaar een PCR product te genereren. De primers worden eveneens geblast, op deze
manier wordt nagegaan of de primers specifiek tegen één welbepaalde regio in het genoom werkzaam
zijn (http://bisearch.enzim.hu/). Het resultaat verkregen door het blasten is nuttig wanneer resultaten
op de calipergel moeten geïnterpreteerd worden (zie tabel 5).
41
Exon 8 is een groot exon (840 basenparen (bp)), te groot om nauwkeurige experimenten op te kunnen
uitvoeren. Daarom wordt exon 8 opgesplitst en worden twee nieuwe primerparen ontwikkeld die enkel
de regio van interesse targetten. Exon 8 bevat twee regio’s waar typisch mutaties voorkomen,
waardoor deze regio’s als target gekozen worden en exon 8a (104 bp) en 8b (104 bp) ontstaan. Het
volledige Exon 8 wordt wel behouden in ons experiment. De twee nieuwe primerparen (8a en 8b)
worden gecreëerd met behulp van ‘primer3’ en vervolgens besteld. !
Exon
bp
Forward Primer
Reverse Primer
exon 5a
ATGGAGGCATTTTAAAGATACTCC
CACAAGCAGCGTAACTAACAG
260
exon 6a
CCGACAGCTGTTTGCCATC
TCCTACCTTTCCGGCTCTTG
246
exon 7a
AACACATGAGGGAATGAATGAATG TCTGCTTTGCAGATTTGTTTTTCT
222
exon 8a
GCTCAGCAAAATGTCGTCGA
TCTGCTTTGCAGATTTGTTTTTCT
104
exon 8b
GAATAAACACGCCGCCTTC
TACTTGCAGGTGATGAGTGTCC
104
GTCGACAATATGCCGGAGTT
TTCGACGACATTTTGCTGAG
Exon 8
(lang)
grootte
840
Tabel 5: De primerparen en bp grootte van exon 5a, 6a, 7a, 8a, 8b en 8.
Afbeelding 12: De verschillende exonen 5a, 6a, 7a, 8a, 8b en 8 worden weergegeven. De grootte van elk exon wordt
aangeduid.
3.2 PCR
De primers voor exon 5a, 6a, 7a, 8a, 8b en 8 worden eerst geëvalueerd alvorens experimenten worden
uitgevoerd op de stalen. Deze evaluatie gebeurt door elk primerpaar met een PCR experiment op
commercieel beschikbaar gDNA te testen waarbij steeds een blanco controle meegenomen wordt.
42
Op de calipergel wordt voor exon 5a en exon 8a een goed resultaat gezien, aangezien duidelijk één
band waargenomen wordt op de verwachte hoogte, respectievelijk 260bp en 104bp. Voor de exonen,
6a, 7a, 8a en 8b, worden aspecifieke banden gezien, waardoor de primerparen van deze exonen minder
betrouwbaar zijn. Voor exon 8 wordt op de calipergel geen band gezien (zie afbeelding 12). Bijgevolg
worden enkel exon 5a en exon 8a behouden en gebruikt bij het PCR experiment met een panel van
tien Ewing tumoren en twee Ewing cellijnen (A673 en TC71). Voor de meeste tumoren worden
duidelijke en specifieke banden gezien. Bij ew213t exon 5a en ew323t exon 5a kan er naast de
verwachte band op 260bp, nog een aspecifieke band gezien worden op een grootte van 50bp, wat
mogelijks kan wijzen op primerdimeren (zie afbeelding 13).
Afbeelding 13: Calipergel van PCR experiment met de primers voor exon 5a en 8a op de 10 Ewing tumoren en 2 Ewing
cellijnen (deze worden aangeduid met een pijl bovenaan de figuur).
Voor de cellijnen worden minder duidelijke resultaten waargenomen. Voor de cellijn A673 exon 5a
wordt de voorspelde band van 260bp niet gedetecteerd en is enkel een 50bp band zichtbaar. Voor
A673 exon 8a kan geen enkele band gezien worden. Voor de cellijn TC71 exon 5a en 8a kan de band
slechts vaag gedetecteerd worden (zie afbeelding 13). Bijgevolg wordt voor de beide cellijnen de
concentratie opnieuw gemeten en wordt het experiment herhaald met een hogere concentratie aan
43
input materiaal (100ng in plaats van 20ng). Dit maal worden wel banden geobserveerd ter hoogte van
de voorspelde grootte voor de beide cellijnen en exonen (nog steeds vaag voor de A673 cellijn exon 5a
en 8a) (zie afbeelding 14).
.
Afbeelding 14: Calipergel van PCR experiment met de primers voor exon 5a en 8a bij de 2 Ewing cellijnen met een
hoeveelheid input materiaal van 100 ng.
3.2.1 Optimalisatie van PCR voor exon 6a, 7a en 8b
- DMSO
Naast de specifieke banden voor exon 5a en 8a vertonen de andere exonen aspecifieke banden
waardoor het protocol voor deze exonen geoptimaliseerd moet worden, willen deze bruikbaar zijn in
het
experiment.
Dit
wordt
geprobeerd
door
het
toevoegen
van
verschillende
DMSO
(Dimethylsulfoxide) concentraties aan de mastermix. DMSO is een belangrijk polair oplosmiddel.
Wanneer DMSO gebruikt wordt bij een PCR experiment, wordt de vorming van waterstofbruggen
verstoord. Hierdoor wordt de vorming van secundaire structuren verzwakt en worden meer specifieke
banden verkregen op de calipergel (61). Hier worden verschillende DMSO concentraties gebruikt: 0%,
1,5%, 3% en 4,5%
-Touch down PCR
Vervolgens wordt, ter optimalisatie, voor de exonen 6a, 7a en 8b en de verschillende concentraties
DMSO een touch down PCR uitgevoerd. Voor exon 6a zijn de bekomen resultaten niet optimaal. Er
wordt enkel een band zichtbaar voor exon 6a 1,5% en 4,5% DMSO op de verwachte hoogte (248bp),
die gepaard gaat met aspecifieke banden. Voor exon 7a wordt voor de verschillende concentraties
DMSO de verwachte band weergegeven (op 222bp) samen met een aspecifieke band. Bij de laagste
concentraties DMSO wordt de verwachte band het meest zichtbaar maar dit geldt ook voor de
aspecifieke band. Voor exon 7a 4,5% DMSO wordt geen aspecifieke band gezien maar ook de
44
verwachte band is minder sterk zichtbaar. Voor exon 8b wordt een duidelijke band gezien op de
verwachte hoogte (104bp). Deze wordt het best zichtbaar voor 0% DMSO, maar voor alle
concentraties DMSO gaat deze band gepaard met vorming van verschillende aspecifieke banden (zie
Exon 8b 4,5%
Exon 8b 3%
Exon 8b 1,5%
Exon 8b 0%
Exon 7a 4,5%
Exon 7a 3%
Exon 7a 3%
Exon 7a 0%
Exon 6a 4,5%
Exon 6a 3%
Exon 6a 1,5%
Exon 6a 0%
afbeelding 15).
Afbeelding 15: Calipergel van het touch down PCR experimenten op de exonen 6a, 7a en 8b met de verschillende
concentraties DMSO (0%, 1,5%, 3%, 4,5%).
- Gradiënt PCR
Voor verdere optimalisatie, wordt eveneens gebruik gemaakt van varianten van het standaard PCRprotocol. Bij een gradiënt PCR wordt per laan op de plaat een verschillende, constante
annealingstemperatuur ingesteld. Dit in tegenstelling tot een touch down PCR waarbij de hele plaat
onderworpen wordt aan éénzelfde annealingstemperatuur, die vermindert per cyclus. Na evaluatie van
de PCR producten op de gel kan het PCR programma met de beste annealingstemperatuur worden
behouden. Het protocol ‘GRAD’ zal hier gebruikt worden en bestaat uit twee fasen, waar in de eerste
fase een touch down wordt uitgevoerd en in de tweede een gradiënt. Het gebruikte protocol ‘GRAD’
begint met een annealingstemperatuur van 62°C in laan A en wordt gereduceerd tot 52°C in laan H
(zie tabel 6).
45
!!
!!
Tijd
Temperatuur
LAAN
GRADIËNT
annealing
temperatuur
1
initiële
denaturatie
2 min
94°C
A
•
62 ° C
2
denaturatie
20 sec
94°C
B
•
61.4 ° C
C
•
60.3 ° C
D
•
58.4 ° C
E
•
55.9 ° C
F
•
54 ° C
G
•
52.7 ° C
H
•
52 ° C
GRADIËNT
!!
62°C
3
annealing
15 sec
4
extensie
1 min
5
stap 2 – 4
11 X
6
denaturatie
40 sec
94°C
7
annealing
40 sec
62°C->52°C
8
extensie
30 sec
72°C
9
stap 6 – 8
23 X
10
finale
extensie
4 min
INC -1,0°C
72°C
72°C
Tabel 6: Protocol ‘GRAD’ met weergave van de annealing temperatuur per laan.
Er wordt een gradiënt PCR experiment (‘GRAD’ protocol) toegepast op de exonen 6a, 7a en 8b met
de verschillende concentraties DMSO. Op de calipergel wordt voor exon 6a 4.5% de band donkerder
als de temperatuur daalt en wordt het beste resultaat gezien op 52,7 °C. Voor exon 7a 0% DMSO
wordt een goed resultaat gezien wanneer de temperatuur boven de 54°C blijft. De duidelijkste band
wordt gezien met een grootte van 235bp (voorspeld 222bp). Tussen 360bp en 520bp zijn lichtere,
aspecifieke banden zichtbaar. Voor exon 7a 1,5% DMSO wordt duidelijk één band zichtbaar op 200bp,
maar vager dan voor exon 7a 0% DMSO. Deze band wordt het duidelijkst zichtbaar wanneer de
temperatuur 55,9°C bedraagt. Er zijn twee aspecifieke maar toch duidelijk zichtbare banden te
bemerken op 134bp en 50bp. Voor exon 8b en voor de andere DMSO concentraties van exon 6a en 7a,
worden verschillende (>2) aspecifieke banden gezien, waardoor deze resultaten van mindere kwaliteit
zijn en hier niet worden getoond.
Op het einde van de gel worden banden onder de 0bp gezien, wat wijst op een technische fout bij de
caliper waardoor de banden vermoedelijk verschoven zijn (zie afbeelding 16).
46
Afbeelding 16: Calipergel van exon 7a 0% DMSO, exon 7a 1,5% DMSO en exon 6a 4,5% DMSO. De calipergel wordt van
links (laan A) naar rechts (laan H) afgelezen.
3.3 Sequencing
In een volgende stap kan de sequentie van het geamplificeerde PCR product verkregen worden.
Hiervoor moeten het PCR product en de primers worden opgewerkt voor sequentie-analyse. In het
CMGG wordt de uitvoering van dit proces mogelijk dankzij de “Genetic Service Unit” (GSU). Van
deze faciliteit kunnen alle onderzoeksgroepen verbonden aan de Universiteit Gent gebruikmaken. Het
PCR product moet minimaal uit 10!l bestaaan met een concentratie van 10-20ng/!l. De primers
moeten aan een concentratie van 1!M afgegeven worden. !
De PCR producten van exon 5a en 8a voor de tumoren en cellijnen geven een goed resultaat op caliper
en worden vervolgens doorgegeven voor sequencing. De overige amplicons (exon 6a, 7a en 8b)
worden niet doorgegeven voor sequencing aangezien verdere optimalisatie van de PCR aangewezen is.
Dit wordt opgestart maar kon niet afgewerkt worden binnen het tijdsbestek van deze thesis.
Na het verkrijgen van de sequentie, kan deze geanalyseerd worden door gebruik te maken van de
software programma’s ‘Seqscanner’ en/of ‘Seqscape’ (Applied Biosystems). Hier wordt het
programma ‘Sequence scanner’ gebruikt voor de eerste data-analyse en om de kwaliteit van het
experiment na te gaan. De mate van zekerheid wordt aangegeven door de QV (Quality Values)
waarden. Hoe hoger de QV waarde, hoe kleiner de kans op een fout. Met het programma ‘Seqscape’
kan de verkregen sequentie vergeleken worden met de referentiesequentie vanuit ‘Ensembl’.
Wanneer de sequenties van exon 5a en 8a in de tumoren geanalyseerd worden, kan voor exon 5a in
ewingstaal 323 basenpaar positie 1208 een mutatie (C<A) worden vastgesteld, na het vergelijken van
de geanalyseerde sequentie met de beschreven sequentie in ‘Ensembl’ (TGGCTCTGTTGATTTCCA)
47
(zie afbeelding 17). De basenpaar verandering C<A betekent een verandering in een aminozuur codon
G<T. Hierdoor wordt het codon op positie 352 GCC, wat voor alanine staat, vervangen door codon
TCC, wat voor een serine codeert. Exon 5a bestaat uit 51 az en hier is het 44ste az gewijzigd. De
gevonden mutatie wordt verwacht ‘waarschijnlijk schadelijk’ te zijn, aan de hand van de verkregen
resultaten in ‘Polyphen’ (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml). Polyphen (Polymorfism
Phenotyping) is een tool waarmee de mogelijke impact van een aminozuursubstitutie voorspeld kan
worden.
Afbeelding 17: Weergave van het begin van de sequentie, weergegeven door het programma ‘Sequence scanner’. De blauwe
pijl duidt de mutatie aan.
48
4 DISCUSSIE
Aan de hand van array CGH werden verschillende afwijkingen gevonden die belangrijke kankergenen
treffen. Hier worden deze resultaten verder uitgewerkt voor drie genen betrokken bij twee embryonale
tumoren. In het kader van NB worden het ALK gen en het NF1 gen verder uitgewerkt en bij het Ewing
sarcoom het PRDM2 gen. De onderzoeksvraag en het doel van de experimenten is verschillend voor
deze twee embryonale tumoren. In het kader van NB werd reeds een rol van het NF1 gen en het ALK
gen beschreven. In tegenstelling hiermee is een rol van het PRDM2 gen bij ES tot op heden niet
beschreven.
a) Neuroblastoom
4.1 Algemeen
Door de ontdekking van mutaties in het ALK gen bij NB werd een nieuw veld voor experimenten met
vele onderzoeksvragen geopend. In het huidige NB onderzoek wordt een antwoord gezocht op
verschillende vragen omtrent activerende ALK mutaties en hun signalisatie met betrekking tot
diagnose, prognose, familiaal risico en behandelingsopties voor de patiënt. Het zoeken naar en het
ontrafelen van de verschillende pathways betrokken bij ALK gemedieerde tumorvorming is nuttig
aangezien dit een basis zou kunnen betekenen voor het ontwikkelen van mogelijke nieuwe
therapeutische middelen. Deze middelen zouden dan deel kunnen uitmaken van combinatietherapieën
(7, 31, 34, 41).
In een eerste luik van het NB onderzoek worden experimenten uitgevoerd om de effecten van ALK
inhibitoren na te gaan op verschillende niveaus (functioneel en op expressie niveau). Enerzijds worden
de effecten op de viabiliteit van twee ALK inhibitoren TAE-684 en PF-02341066 nagegaan in NB
cellijnen met een verschillende ALK mutatie-status. Anderzijds wordt aan de hand van een TAE-684
inhibitorbehandeling het effect op de expressie (mRNA en eiwit) van een geselecteerd gen, FRMD3,
onderzocht. Dit FRMD3 (Ferm Domain Containing Protein 3) gen is gelegen op de lange arm van
chromosoom 9 (9q21.32) en codeert voor een membraan proteïne (62). Een neerregulatie van FRMD3
en een rol als tumorsupprresorgen werd reeds beschreven bij Non-Small-Cell Lung Carcinoma
(NSCLC) (62). In een tweede luik van het NB onderzoek wordt een genomische analyse uitgevoerd
voor het NF1 gen, reeds gerapporteerd in NB als tumorsuppressorgen.
4.2 ALK inhibitorbehandeling
Viabiliteitsanalyse na ALK small molecule inhibitorbehandeling
Bij deze experimenten wordt als eerste stap het functioneel effect van de inhibitoren (TAE-684 en PF02341066) nagegaan, meer bepaald op viabiliteitsniveau. Het is belangrijk om de effecten van de
inhibitoren afzonderlijk goed te analyseren. Om de optimale werking op de doelwitcellen na te gaan,
49
worden verschillende concentraties onderzocht op verschillende tijdstippen en wordt tevens gezocht
naar die concentratie(s) met een minimaal toxisch effect op de ALK wild type cellen en een maximaal
toxisch effect op de ALK mutante cellen.
Voor de viabiliteitsanalyse worden NB cellijnen geselecteerd met een verschillende ALK mutatiestatus, waarvan de resultaten voor drie cellijnen (representatief voor elk mutatie-type) zullen worden
besproken. Dit laat toe om de respons van de cellijnen met verschillende ALK status (ALK wild type,
R1275Q en F1174L) op de twee inhibitoren te beschrijven.
Voor de wild type cellijn SKNAS wordt, wanneer behandeld met TAE-684 en PF-2341066,
nauwelijks celviabiliteitsreductie gezien bij de lage concentraties. Dit is wat verwacht wordt aangezien
ALK inhibitoren per definitie geen effect uitoefenen op een wild type cellijn (in dit geval met extreem
lage ALK expressie). De celviabiliteitsreductie veroorzaakt na langdurige behandeling met grote dosis
kan verklaard worden door de toxiciteit van de inhibitoren. Inhibitoren kunnen toxisch zijn bij te hoge
concentraties en off-target effecten uitoefenen. Bijgevolg worden er ook effecten uitgeoefend op
gezonde cellen, wat net minimaal wil gehouden worden bij een kankerbehandeling. Op basis van de
IC50 waarde voor de wild type cellijn kan afgeleid worden dat slechts een zeer lage concentratie PF2341066 en TAE-684 vereist is om een 50% celviabiliteitsreductie te induceren. Dit is het resultaat
wat verwacht wordt bij ALK afhankelijke cellijnen en zeker niet bij de wild type. Dit resultaat wordt
vermoedelijk bepaald door de hogere en zeer toxische concentraties. De analyse zou herhaald kunnen
worden waarbij enkel de lage dosissen worden gebruikt.
Voor de hotspotmutante cellijnen CLBGA (ALKR1275Q) en SHSY5Y (ALKF1174L) wordt, in
tegenstelling tot de wild type cellijn, wel een effect gezien wanneer behandeld met TAE-684 en PF2341066 (bij lage concentraties). Voor CLBGA wordt een goed effect gezien bij de lage dosissen
wanneer behandeld met TAE-684. De behandelingsduur speelt hier een grote rol in tegenstelling tot de
gebruikte dosis. Wanneer behandeld met PF-2341066 wordt een effect gezien dat minder uitgesproken
is dan verwacht op basis van bestaande literatuur gegevens (zie inleiding ALK: ‘Gevoeligheid ALK
inhibitoren’). Voor de F1174L mutante cellijn en TAE-684 behandeling wordt het beste resultaat
gezien. Wanneer 72h behandeld wordt met een concentratie van 0,64!M, wordt amper celoverleving
gezien (15,8%). Voor PF-2341066 wordt op de F1174L mutante cellijn een beter effect gezien dan
verwacht op basis van bestaande literatuur gegevens (beschreven resistentie) (zie inleiding ALK:
‘Gevoeligheid ALK inhibitoren’). Bij het gebruik van hoge dosissen (1,28!M-2,56!M) wordt
duidelijk celviabiliteitsreductie gezien, wat opnieuw kan toegeschreven worden aan het toxisch profiel
van de inhibitor.
De interpretatie en conclusies van deze gegevens moeten met enige omzichtigheid worden beoordeeld
aangezien de experimenten slechts éénmaal werden uitgevoerd. Idealiter zou de meting drie maal
herhaald moeten worden en zou een statistische analyse moeten worden uitgevoerd. Bovendien dienen
50
meerdere cellijnen met verschillende mutatie-status (wild type, R1275Q, F1174L en amplificatie)
getest te worden, alvorens een conclusie over de respons (sensitiviteit en/of optredende resistentie) van
een cellijn op een welbepaalde inhibitor kan getrokken worden. Op deze manier kan een beter inzicht
verkregen worden in de beschreven resistentie tegen Crizotinb (ALK inhibitor) voor de F1174L
mutante cellijn.
qPCR en Western Blot analyse na ALK small molecule inhibitorbehandeling
In een grootschalig voorafgaand experiment werden tien NB cellijnen met verschillende ALK mutatiestatus behandeld met TAE-684 (versus DMSO) gedurende 6 uur. Genexpressie-analyse van deze
cellijnen vóór en na behandeling liet toe om een reeks van kandidaat-ALK gereguleerde genen te
identificeren. Enkele genen werden geselecteerd voor verdere validatie. Eén van deze genen was het
FRMD3 gen. Dit gen codeert voor een “single pass” membraan proteïne en is reeds bekend als
tumorsuppressorgen bij NSCLC (62, 63). Op basis van genexpressiedata bleek FRMD3
neergereguleerd te zijn na TAE-684 behandeling in de ALK mutante cellijnen. Als validatie wordt het
effect van ALK-inhibitie (in een onafhankelijke TAE-684 behandelingsexperiment) op het FRMD3
mRNA getest via qPCR maar ook op eiwitniveau via Western Blot. Door NB cellijnen met
verschillende ALK mutatie-status (wild type, R1275Q, F1174L en geamplificeerd) te gebruiken, kan
het verschil in neerregulatie van FRMD3, als gevolg van de TAE-684 inhibitor, nauwkeurig nagegaan
worden.
Voor de cellijn SKNAS, wordt na behandeling met TAE-684, over het algemeen geen effect verwacht
aangezien deze wild type ALK bevat met zeer lage expressie. Hier wordt op genexpressie niveau
bevestigd dat TAE-684 geen neerregulerend effect heeft in een wild type cellijn. Voor de twee
cellijnen met een hotspot mutatie (R1275Q en F1174L), wordt duidelijk een daling in FRMD3
genexpressie gezien. Deze daling is het meest uitgesproken voor CLBGA met de R1275Q mutatie
(82,4%). Voor de NB1 cellijn werd eveneens een zeer forse daling in de genexpressie gezien (95%).
Als conclusie kan gesteld worden dat voor de wild type cellijn na behandeling met TAE-684, zowel
door viabilitietsanalyse als door het qPCR experiment, geen effect kan gezien worden bij lage dosissen.
Dat TAE-684 wel een effect uitoefent op de mutante cellijnen, wordt eveneens vastgesteld door
viabiliteitsanalyse en qPCR. De verschillen in deze resultaten (bij viabiliteitsanalyse wordt het beste
resultaat gezien voor de F1174L cellijn en bij qPCR voor de R1275Q mutante cellijn) kunnen
mogelijks verklaard worden door andere genen, die meer bepalend zijn voor het viabiliteits-fenotype
en sterker gereguleerd worden in deze cellijn.
Voor twee ALK mutante cellijnen (CLBGA en NB1) wordt dit (in een optimalisatie-experiment) getest
op eiwitniveau (door Western Blot). Met behulp van kwantificatie wordt, na een behandeling van 6
uur, voor CLBGA (ALKR1275Q) een expressiedaling van 62,2% gezien en voor NB1 een stijging van
404,8% gezien. Aangezien voor de referentie-proteïne van de geamplificeerde ALK cellijn een zeer
51
sterk ongelijke lading wordt vastgesteld, kan het experiment niet als betrouwbaar worden beschouwd.
Tevens worden voor NB1 op de Western Blot verschillende aspecifieke banden waargenomen. Het
experiment dient herhaald te worden met éénzelfde lading, na nieuwe proteïne concentratiemeting
voor NB1. Voor CLBGA kan een hogere lading CLBGA-eiwit gebruikt worden, aangezien het
resultaat zeer vaag is. Om conclusies te kunnen trekken over specifieke ALK mutatie-status
afhankelijke regulatie van FRMD, kunnen verschillende cellijnen met verschillende mutatie-status
(wild type, R1275Q, F1174L en ALK amplificatie) getest worden of zou een cellijn kunnen
aangemaakt worden met een induceerbaar construct. Hier wordt FRMD3 als enige geselecteerd en
verder geanalyseerd uit de kandidaat-ALK gereguleerde genen screen. Dergelijke analyses worden op
dit moment in het CMGG ook uitgevoerd voor andere genen en mogelijks kunnen op deze manier
genen geïdentificeerd worden die dienst kunnen doen als therapeutisch target. FRMD3 is in die
context niet de beste kandidaat aangezien de expressie van dit beschreven tumorsuppressorgen
opgereguleerd wordt door ALK.
4.3 Analyse van het NF1 gen
Reeds werd een rol van NF1 als tumorsuppressorgen bij NB beschreven. Uit een studie waarin een
homozygote deletie van NF1 werd vastgesteld bij NBcellijnen en primaire tumoren, werd
gesuggereerd dat NF1 inactivatie betrokken is in de pathogenese en progressie van sommige NBen.
Dit zou kunnen verklaard worden aan de hand van het “Knudson two hit hypothese” model. De
tweede en noodzakelijke hit voor tumorinitiatie, zou plaatsvinden in het NF1 tumorsuppressorgen. Bij
NB tumoren werden eveneens ongebelanceerde translocaties (t(1,17)) teruggevonden, met een
breekpunt op chromosoom 17. Deze regio zou kunnen samenvallen met de regio van het NF1 gen (8,
9). Door het uitvoeren van een Western Blot bij NB werd er een verminderde proteïne-expressie in
NF1 aangetoond (8). In een genomische screen werden, via array CGH analyse, deleties opgepikt ter
hoogte van het NF1 gen.
qPCR en samenvatting van de sequnetie-analyse van het NF1 gen
Omdat deze detectie van homozygote deleties via array CGH niet éénduidig was, wordt deze
bevinding in dit onderzoek getest door een analyse van het kopie-aantal (qPCR) op de SKNF1 cellijn
voor het NF1 gen. Dit is de eerste maal dat mutatie-analyse op cellijnen wordt uitgevoerd voor NF1.
Het qPCR experiment bevestigde de homozygote deletie in de SKNF1 cellijn. Aangezien geweten is
dat NF1 een tumorsuppressor is, kan een homozygote deletie in dit gen inactivatie veroorzaken van
beide allelen.
Door de sequentie-analyse van een panel van 18 cellijnen worden vijf deleties aangetoond op cDNA
niveau (27,8%). Het cDNA van de cellijnen wordt behandeld met het antibioticum Emetin (met als
doel ‘nonsense mediated decay’ tegen te gaan). Er bestaan drie mogelijke oorzaken van deleties op
DNA-niveau: het exon ontbreekt volledig, het exon en (een deel van) de omliggende intronen
52
ontbreken of er is een intronische basenpaarverandering in de buurt van het exon waardoor het signaal
voor de verankerings-site van de introns verloren gaat. Verder kan gezocht worden of deze
deleties/polymorfismen een klinische betekenis hebben. Als conclusie kan gesteld worden dat het
huidig onderzoek naar de exacte rol van NF1 bij NB en verdere ontrafeling van de signalisatiecascades moet aangemoedigd worden, aangezien op deze manier mogelijks nieuwe therapie-opties
geïdentificeerd kunnen worden.
b) Ewing tumoren
4.1 Algemeen
In een tweede luik worden experimenten uitgevoerd in het kader van Ewing tumoren en het PRDM2
gen. De selectie van dit gen gebeurde op basis van resultaten uit vorige experimenten, waaruit bleek
dat PRDM2 één van de weinig gedeleteerde genen was en reeds mutaties in verschillende exonen in
andere tumorentiteiten beschreven waren (zie ‘resultaten Ewing’). PRDM2 is een tumorsuppressorgen
dat codeert voor een ‘zinc finger’ proteïne. Er wordt gesuggereerd dat dit proteïne een rol zou spelen
tijdens de neuronale differentiatie en pathogenese van retinoblastoom of zou fungeren als een
transcriptionele activator van het HO-1 (Haem-Oxygenase-1) gen of een effector bij oestrogeen acties
zou zijn (www.genecards.org).
4.2 Sequentie-analyse in het PRDM2 gen
In ons experiment wordt door sequentie-analyse in het tumorstaal 323 exon 5a een
basenpaarverandering gevonden in het codon op positie 352 waardoor alanine omgezet wordt naar
serine. Deze mutatie wordt volgens ‘Polyphen’ als ‘waarschijnlijk schadelijk’ beschouwd. Deze
mutatie zou dus een betekenis kunnen hebben maar dit zijn preliminaire data die bevestigd dienen te
worden in een onafhankelijk experiment. Voor de andere exonen (6a, 7a en 8b) is nog verdere
optimalisatie van de PCR nodig. Deze optimalisatie is reeds opgestart maar kon niet afgewerkt worden
binnen het tijdsbestek van deze thesis. Voor de optimalisatie met als doel de aspecifieke banden te
verwijderen, wordt enerzijds DMSO gebruikt en anderzijds worden enkele verschillende PCR
protocols, zoals de ‘touch down’ en ‘gradiënt’, gebruikt. Er worden echter steeds aspecifieke banden
gedetecteerd voor deze 3 exonen. Als optimalisatiemiddel om secundaire bindingen te voorkomen kan
Betaïne of MgCl2 gebruikt worden in plaats van DMSO. Mogelijks kan in de literatuur gezocht
worden naar gebruikte kits, beschreven protocols, andere bestaande primerparen of kunnen nieuwe
primerparen ontworpen worden. Indien door optimalisatie goede resultaten verkregen worden voor
deze exonen, kan hiervoor eveneens sequentie-analyse worden uitgevoerd en kunnen eveneens SNP’s
of mutaties worden opgespoord.
53
Reeds werden mutaties in exon 5, 6, 7 en 8 vastgesteld bij verschillende tumoren zoals diffuse large Bcell lymfoom, retinoblastoom, colorectaal carcinoom, hepatocellulair carcinoom, prostaat-, borst- en
longcarcinoom. Nu is de vraag of er een link kan gemaakt worden tussen deze verschillende
ziektebeelden door deze mutaties in het PRDM2 gen. Is er sprake van een ‘concept’ waar deze
tumoren kunnen ondergebracht worden en zo ja, waar situeren de Ewing tumoren zich dan hierin. Wat
zou dit betekenen naar therapie, prognose en klinische presentatie toe? Is er sprake van een
erfelijkheid of een overlap tussen deze verschillende ziektebeelden? Voor de Ewing sarcomen werden
tot op heden geen familiale gevallen beschreven (64).
Als algemene conclusie kan gesteld worden dat array CGH analyse in tumoren toelaat om potentieel
belangrijke kankergenen te identificeren. Door detectie van kankergenen en door nieuwe inzichten in
signalisatie-cascades kunnen mogelijks doelwitten geselecteerd worden, die als nieuwe therapie-opties
kunnen fungeren.
54
5 BIJLAGEN
Bijlage 1: Paraneoplastische syndromen
Syndroom
Kenmerken
Syndroom van Pepper
Massieve inname van het leverweefsel bij metastatische ziekte
eventueel samengaand met respiratoire distress.
Syndroom van Horner
Wordt gekenmerkt door unilaterale ptose, myose en anhydrose
veroorzaakt door de aanwezigheid van een cervicale of thoracale
primaire tumor. Symptomen zijn niet reversibel na resectie van de
tumor.
Syndroom van Hutchinson
Hinken en irritatie gezien bij jonge kinderen in aanwezigheid van bot
of beenmerg metastasen.
Opsoclonus
Myoclonus
Ataxie syndroom
Myoclonische trekkingen en willekeurige oogbewegingen eventueel
samengaand met cerebellaire ataxie. Vaak wordt dit ziektebeeld
geassocieerd met een goed gedifferentieerde tumor en biologisch
gunstige prognose. Een auto-immune etiopathogenese wordt vermoed,
en resectie van de primaire tumor resulteert niet in het verdwijnen van
de symtomen van dit syndroom.
Syndroom
van
Kerner-
Morrison
Secretoire diarree door de productie van vasointestinale peptiden
gesecreteerd door de primaire tumor. Meestal geassocieerd met een
biologisch gunstige tumor.
Neurocristopathysundroom
NB geassocieerd met andere neurale crest stoornissen, zoals de ziekte
van Hirsprung en het congenitaal hypoventilatie syndroom. Bij een deel
van deze patiënten kunnen mutaties worden aangetoond in het
PHOX2B gen.
(12)
55
Copyright toelatingen
- Simon Coterill
Dear Jolien,
Yes, I'm very happy for you to use the figure. The copyright for the
article is held by the Journal of Clinical Oncology; if necessary, you
could also check with the journal; which I am sure they would be happy for
you to use.
Good luck with your thesis.
With best wishes,
Simon
- John Maris
Dear Jolien
THis is fine with me, but the New England Journal of Medicine owns the
copyrights. If the thesis will be published, you might want to consider
receiving permission from the journal. Good luck to you and your thesis.
John
John M. Maris, MD
Giulio D'Angio Professor of Pediatrics
Chief, Division of Oncology
Director, Center for Childhood Cancer Research
Children's Hospital of Philadelphia
Perelman School of Medicine
University of Pennsylvania
215 590 5244
267 426 0685 (fax)
http://www.research.chop.edu/programs/cccr
56
6 REFERENTIES
1.
Kaatsch P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 2010 Jun;36(4):277-85.
2.
Gatta G, Ferrari A, Stiller CA, Pastore G, Bisogno G, Trama A, et al. Embryonal cancers in
Europe. Eur J Cancer. 2012 Feb 20.
3.
Van Roy N, De Preter K, Hoebeeck J, Van Maerken T, Pattyn F, Mestdagh P, et al. The
emerging molecular pathogenesis of neuroblastoma: implications for improved risk assessment and
targeted therapy. Genome Med. 2009;1(7):74.
4.
De Brouwer S, De Preter K, Kumps C, Zabrocki P, Porcu M, Westerhout EM, et al. Metaanalysis of neuroblastomas reveals a skewed ALK mutation spectrum in tumors with MYCN
amplification. Clin Cancer Res. 2010 Sep 1;16(17):4353-62.
5.
Maris JM, Hogarty MD, Bagatell R, Cohn SL. Neuroblastoma. Lancet. 2007 Jun
23;369(9579):2106-20.
6.
Mosse YP, Laudenslager M, Longo L, Cole KA, Wood A, Attiyeh EF, et al. Identification of
ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 2008 Oct 16;455(7215):930-5.
7.
Chen Y, Takita J, Choi YL, Kato M, Ohira M, Sanada M, et al. Oncogenic mutations of ALK
kinase in neuroblastoma. Nature. 2008 Oct 16;455(7215):971-4.
8.
Holzel M, Huang S, Koster J, Ora I, Lakeman A, Caron H, et al. NF1 is a tumor suppressor in
neuroblastoma that determines retinoic acid response and disease outcome. Cell. 2010 Jul
23;142(2):218-29.
9.
Martinsson T, Sjoberg RM, Hedborg F, Kogner P. Homozygous deletion of the
neurofibromatosis-1 gene in the tumor of a patient with neuroblastoma. Cancer Genet Cytogenet. 1997
Jun;95(2):183-9.
10.
Shingde MV, Buckland M, Busam KJ, McCarthy SW, Wilmott J, Thompson JF, et al. Primary
cutaneous Ewing sarcoma/primitive neuroectodermal tumour: a clinicopathological analysis of seven
cases highlighting diagnostic pitfalls and the role of FISH testing in diagnosis. J Clin Pathol. 2009
Oct;62(10):915-9.
11.
Huret JL, Dessen P, Bernheim A. Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and
Haematology, year 2003. Nucleic Acids Res. 2003 Jan 1;31(1):272-4.
12.
Park JR, Eggert A, Caron H. Neuroblastoma: biology, prognosis, and treatment. Hematol
Oncol Clin North Am. 2010 Feb;24(1):65-86.
13.
Verissimo CS, Molenaar JJ, Fitzsimons CP, Vreugdenhil E. Neuroblastoma therapy: what is in
the pipeline? Endocr Relat Cancer. 2011 Dec;18(6):R213-31.
14.
George RE, Sanda T, Hanna M, Frohling S, Luther W, 2nd, Zhang J, et al. Activating
mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 2008 Oct 16;455(7215):9758.
15.
Kast R, Rabah R, Wills H, Poulik J, Auner GW, Klein MD. Differentiation of small round
blue cell tumors using Raman spectroscopy. J Pediatr Surg. 2010 Jun;45(6):1110-4.
16.
Bowen KA, Chung DH. Recent advances in neuroblastoma. Curr Opin Pediatr. 2009
Jun;21(3):350-6.
17.
Maris JM. Recent advances in neuroblastoma. N Engl J Med. 2010 Jun 10;362(23):2202-11.
18.
Wang HF, Shih YT, Chen CY, Chao HW, Lee MJ, Hsueh YP. Valosin-containing protein and
neurofibromin interact to regulate dendritic spine density. J Clin Invest. 2011 Dec;121(12):4820-37.
19.
Brisse HJ, McCarville MB, Granata C, Krug KB, Wootton-Gorges SL, Kanegawa K, et al.
Guidelines for imaging and staging of neuroblastic tumors: consensus report from the International
Neuroblastoma Risk Group Project. Radiology. 2011 Oct;261(1):243-57.
57
20.
Matthay KK. Neuroblastoma: biology and therapy. Oncology (Williston Park). 1997
Dec;11(12):1857-66; discussion 69-72, 75.
21.
Cohn SL, Pearson AD, London WB, Monclair T, Ambros PF, Brodeur GM, et al. The
International Neuroblastoma Risk Group (INRG) classification system: an INRG Task Force report. J
Clin Oncol. 2009 Jan 10;27(2):289-97.
22.
Vermeulen J, De Preter K, Naranjo A, Vercruysse L, Van Roy N, Hellemans J, et al.
Predicting outcomes for children with neuroblastoma using a multigene-expression signature: a
retrospective SIOPEN/COG/GPOH study. Lancet Oncol. 2009 Jul;10(7):663-71.
23.
Kyo Y. Identification of therapy-sensitive and therapy-resistant neuroblastoma subtypes in
stages III, IVs and IV. cancer lett. 2011;306(1):27-33.
24.
Combaret V, Gross N, Lasset C, Frappaz D, Peruisseau G, Philip T, et al. Clinical relevance of
CD44 cell-surface expression and N-myc gene amplification in a multicentric analysis of 121 pediatric
neuroblastomas. J Clin Oncol. 1996 Jan;14(1):25-34.
25.
Islam A, Kageyama H, Takada N, Kawamoto T, Takayasu H, Isogai E, et al. High expression
of Survivin, mapped to 17q25, is significantly associated with poor prognostic factors and promotes
cell survival in human neuroblastoma. Oncogene. 2000 Feb 3;19(5):617-23.
26.
Miller MA, Ohashi K, Zhu X, McGrady P, London WB, Hogarty M, et al. Survivin mRNA
levels are associated with biology of disease and patient survival in neuroblastoma: a report from the
children's oncology group. J Pediatr Hematol Oncol. 2006 Jul;28(7):412-7.
27.
Haber M, Smith J, Bordow SB, Flemming C, Cohn SL, London WB, et al. Association of
high-level MRP1 expression with poor clinical outcome in a large prospective study of primary
neuroblastoma. J Clin Oncol. 2006 Apr 1;24(10):1546-53.
28.
Passoni L, Longo L, Collini P, Coluccia AM, Bozzi F, Podda M, et al. Mutation-independent
anaplastic lymphoma kinase overexpression in poor prognosis neuroblastoma patients. Cancer Res.
2009 Sep 15;69(18):7338-46.
29.
Marabelle A, Merlin E, Halle P, Paillard C, Berger M, Tchirkov A, et al. CD34+
immunoselection of autologous grafts for the treatment of high-risk neuroblastoma. Pediatr Blood
Cancer. 2011 Jan;56(1):134-42.
30.
Azarova AM, Gautam G, George RE. Emerging importance of ALK in neuroblastoma. Semin
Cancer Biol. 2011 Oct;21(4):267-75.
31.
Shaw AT, Solomon B. Targeting anaplastic lymphoma kinase in lung cancer. Clin Cancer Res.
2011 Apr 15;17(8):2081-6.
32.
Duijkers FA, Gaal J, Meijerink JP, Admiraal P, Pieters R, de Krijger RR, et al. Anaplastic
lymphoma kinase (ALK) inhibitor response in neuroblastoma is highly correlated with ALK mutation
status, ALK mRNA and protein levels. Cell Oncol (Dordr). 2011 Oct;34(5):409-17.
33.
Murugan AK, Xing M. Anaplastic thyroid cancers harbor novel oncogenic mutations of the
ALK gene. Cancer Res. 2011 Jul 1;71(13):4403-11.
34.
Christensen JG. Proof of principle for crizotinib in anaplastic lymphoma kinase-positive
malignancies was achieved in ALK-positive nonclinical models. Mol Cancer Ther. 2011
Nov;10(11):2024.
35.
Kwon MJ, Choi YL, Sung KW, Kang SY, Park SM, Choi SY, et al. Oncogenic anaplastic
lymphoma kinase (ALK) mutation in neuroblastomas and other pediatric tumors. Pathol Res Pract.
2011 Oct 15;207(10):634-9.
36.
Zhu S, Lee JS, Guo F, Shin J, Perez-Atayde AR, Kutok JL, et al. Activated ALK Collaborates
with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis. Cancer Cell. 2012 Mar 20;21(3):362-73.
37.
O'Donnell PH, Ratain MJ. Germline pharmacogenomics in oncology: Decoding the patient for
targeting therapy. Mol Oncol. 2012 Jan 21.
58
38.
Wood AC. Inhibition of ALK mutated neuroblastomas by the selective inhibitor PF-02341066.
. Clin Oncol 2009;27:15.
39.
Galetta D. The emerging role of ALK inhibitors in the treatment of advanced non-small cell
lung cancer. Informa Healtcare. 2012 April 2012;16(2):S45-S54.
40.
Cole KA, Maris JM. New Strategies in Refractory and Recurrent Neuroblastoma:
Translational Opportunities to Impact Patient Outcome. Clin Cancer Res. 2012 Mar 16.
41.
Sasaki T, Okuda K, Zheng W, Butrynski J, Capelletti M, Wang L, et al. The neuroblastomaassociated F1174L ALK mutation causes resistance to an ALK kinase inhibitor in ALK-translocated
cancers. Cancer Res. 2010 Dec 15;70(24):10038-43.
42.
10.
Riggi N, Stamenkovic I. The Biology of Ewing sarcoma. Cancer Lett. 2007 Aug 28;254(1):1-
43.
Sankar S, Lessnick SL. Promiscuous partnerships in Ewing's sarcoma. Cancer Genet. 2011
Jul;204(7):351-65.
44.
Leavey PJ, Mascarenhas L, Marina N, Chen Z, Krailo M, Miser J, et al. Prognostic factors for
patients with Ewing sarcoma (EWS) at first recurrence following multi-modality therapy: A report
from the Children's Oncology Group. Pediatr Blood Cancer. 2008 Sep;51(3):334-8.
45.
Balamuth NJ, Womer RB. Ewing's sarcoma. Lancet Oncol. 2010 Feb;11(2):184-92.
46.
Cotterill SJ, Ahrens S, Paulussen M, Jurgens HF, Voute PA, Gadner H, et al. Prognostic
factors in Ewing's tumor of bone: analysis of 975 patients from the European Intergroup Cooperative
Ewing's Sarcoma Study Group. J Clin Oncol. 2000 Sep;18(17):3108-14.
47.
Ibrahim GM, Fallah A, Shahideh M, Tabori U, Rutka JT. Primary Ewing's sarcoma affecting
the central nervous system: a review and proposed prognostic considerations. J Clin Neurosci. 2012
Feb;19(2):203-9.
48.
Applebaum MA, Worch J, Matthay KK, Goldsby R, Neuhaus J, West DC, et al. Clinical
features and outcomes in patients with extraskeletal Ewing sarcoma. Cancer. 2011 Jul 1;117(13):302732.
49.
Javery O, Krajewski K, O'Regan K, Kis B, Giardino A, Jagannathan J, et al. A to Z of
extraskeletal Ewing sarcoma family of tumors in adults: imaging features of primary disease,
metastatic patterns, and treatment responses. AJR Am J Roentgenol. 2011 Dec;197(6):W1015-22.
50.
Grohar PJ, Griffin LB, Yeung C, Chen QR, Pommier Y, Khanna C, et al. Ecteinascidin 743
interferes with the activity of EWS-FLI1 in Ewing sarcoma cells. Neoplasia. 2011 Feb;13(2):145-53.
51.
de Alava E, Antonescu CR, Panizo A, Leung D, Meyers PA, Huvos AG, et al. Prognostic
impact of P53 status in Ewing sarcoma. Cancer. 2000 Aug 15;89(4):783-92.
52.
Desjardins P. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J Vis Exp. 2010
22/11/2010;45(45):2565.
53.
Yu S. Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction for the Verification of Genomic
Imbalances Detected by Microarray-Based Comparative Genomic Hybridization. Genetic Testing and
Molecular Biomarkers. 2009;13(6):751-60.
54.
C A Heidi JS, P M Williams. Real time quantitative PCR. Genome Res. 1996 1996;6:986-94.
55.
Wong M. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 2005 JuLy 2005;39:75-85.
56.
Gerald Schochetman CYO. Polymerase Chain Reaction. The Journal of Infectious Diseases.
1988;158(6).
57.
Siu FK, Lee LT, Chow BK. Southwestern blotting in investigating transcriptional regulation.
Nat Protoc. 2008;3(1):51-8.
59
58.
Piao Z, Fang W, Malkhosyan S, Kim H, Horii A, Perucho M, et al. Frequent frameshift
mutations of RIZ in sporadic gastrointestinal and endometrial carcinomas with microsatellite
instability. Cancer Res. 2000 Sep 1;60(17):4701-4.
59.
Steele-Perkins G, Fang W, Yang XH, Van Gele M, Carling T, Gu J, et al. Tumor formation
and inactivation of RIZ1, an Rb-binding member of a nuclear protein-methyltransferase superfamily.
Genes Dev. 2001 Sep 1;15(17):2250-62.
60.
Fang W, Piao Z, Simon D, Sheu JC, Huang S. Mapping of a minimal deleted region in human
hepatocellular carcinoma to 1p36.13-p36.23 and mutational analysis of the RIZ (PRDM2) gene
localized to the region. Genes Chromosomes Cancer. 2000 Jul;28(3):269-75.
61.
Bachmann B. Improvement of PCR amplified DNA sequencing with the aid of detergents.
Nucleic Acids Research. 1990;18(5):1309.
62.
Haase D. FRMD3, a novel putative tumour suppressor in NSCLC. Oncogene.
2007;26(30):4464-8.
63.
Ni X, Ji C, Cao G, Cheng H, Guo L, Gu S, et al. Molecular cloning and characterization of the
protein 4.1O gene, a novel member of the protein 4.1 family with focal expression in ovary. J Hum
Genet. 2003;48(2):101-6.
64.
Randall RL, Lessnick SL, Jones KB, Gouw LG, Cummings JE, Cannon-Albright L, et al. Is
There a Predisposition Gene for Ewing's Sarcoma? J Oncol. 2010;2010:397632.
60