Patiënt-specifieke stamcel gederiveerde gameten in de muis en de
advertisement
Academiejaar 2015 - 2016 Patiënt-specifieke stamcel gederiveerde gameten in de muis en de mens: efficiëntie, veiligheid en ethische aspecten Swann Crabbé Promotor: Prof. Dr. De Sutter Masterproef voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE Academiejaar 2015 - 2016 Patiënt-specifieke stamcel gederiveerde gameten in de muis en de mens: efficiëntie, veiligheid en ethische aspecten Swann Crabbé Promotor: Prof. Dr. De Sutter Masterproef voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE VOORWOORD Deze masterproef was een boeiende ervaring over een fascinerend onderwerp, stamceltechnologie in de reproductieve geneeskunde. Graag zou ik hierbij mijn promotor Prof. Dr. Petra De sutter willen bedanken voor haar tijd, motiverende ondersteuning en snelle, constructieve feedback. Ik wil ook mijn moeder bedanken voor het nalezen van mijn thesis op taalfouten. Een bijzondere dank gaat naar het OCMW Gent en Loes voor de financiële ondersteuning die mij de kans geeft om mijn studie verder te zetten. Ten slotte wil ik mijn vrienden en familie bedanken voor hun luisterend oor en steun. INHOUD 1. ABSTRACT 1 2. INLEIDING 3 2.1 Infertiliteit ....................................................................................................................... 3 2.2 Gametendonatie en adoptie ............................................................................................ 3 2.3 Patiënt-specifieke stamcel-gederiveerde gameten .......................................................... 4 3. DOELSTELLING 4 4. METHODE 5 5. RESULTATEN 6 5.1 ACHTERGRONDINFORMATIE 6 5.1.1 Stamcellen ................................................................................................................... 6 5.1.1.1 Embryonale stamcellen (ESCs) ......................................................................... 6 5.1.1.2 Somatische cel nucleaire transfer (ntESCs) ...................................................... 6 5.1.1.3 Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)................................................. 7 5.1.2 Gametogenese .............................................................................................................. 8 5.1.2.1 Meiose................................................................................................................ 9 5.1.2.2 Epigenetica ........................................................................................................ 9 5.2 METHODE OM PSCDGs TE DERIVEREN 10 5.2.1 Stap 1: PGCLC-inductie .............................................................................................10 5.2.1.1 EBs versus monolayer cultuur ..........................................................................11 5.2.1.2 Identificatie en isolatie van PGCLCs ...............................................................11 5.2.1.3 Verhogen van de efficiëntie ..............................................................................12 5.2.2 Stap 2: in vivo-stap .....................................................................................................12 5.3 MUIS PSCDGs 14 5.3.1 PGCLC-inductie .........................................................................................................14 5.3.2 In vivo-stap .................................................................................................................14 5.3.3 Evaluatie van GLCs o.b.v. merkers en morfologie ....................................................14 5.3.4 Meiose ........................................................................................................................16 5.3.4.1 Evaluatie van de meiose ...................................................................................16 5.3.4.2 Pre-meiose ........................................................................................................16 5.3.4.3 Beoordeling meiose moeilijk ............................................................................16 5.3.4.4 Initiatie van meiose...........................................................................................17 5.3.4.5 Volledige meiose ...............................................................................................17 5.3.5 Epigenetica .................................................................................................................17 5.3.5.1 Inprenting verwijdering ....................................................................................18 5.3.5.2 Instellen paternaal inprenting-patroon ............................................................18 5.3.5.3 X-chromosoom activatie ...................................................................................18 5.3.6 Hormonen ...................................................................................................................19 5.3.7 Fertilisatie van mESC-gederiveerde gameten ............................................................19 5.3.8 miPSC-gederiveerde gameten ....................................................................................20 5.4 HUMANE PSCDGs 21 5.4.1 PGCLC-inductie .........................................................................................................21 5.4.2 Evaluatie van GLCs o.b.v. merkers en morfologie ....................................................21 5.4.3 XY-OLCs en XX-SLCs ..............................................................................................22 5.4.4 Meiose ........................................................................................................................22 5.4.4.1 Pre-meiose .......................................................................................................22 5.4.4.2 Beoordeling meiose moeilijk ............................................................................23 5.4.4.3 Iniatie van meiose ............................................................................................23 5.4.4.4 Volledige meiose? Onzekerheid over haploïde cellen ......................................23 5.4.4.5 Volledige meiose ..............................................................................................24 5.4.4.6 Volledige meiose m.b.v. overexpressie van genen ............................................24 5.4.4.7 Meiose van OLCs en FLSs grootste barrière ...................................................24 5.4.5 Epigenetica .................................................................................................................24 5.4.5.1 PGCLCs: geen inprenting-verwijdering ..........................................................24 5.4.5.2 PGCLCs: initiatie inprenting-verwijdering .....................................................25 5.4.5.3 SLCs: correct instellen van paternaal inprenting-patroon ..............................25 5.4.5.4 PGCLCs: correcte histonen-modificatie ..........................................................25 5.4.6 Sertoli- en leydigcellen ...............................................................................................26 5.4.6.1 Detectie van merkers ........................................................................................26 5.4.6.2 Detectie van hormonen .....................................................................................26 5.4.7 hESC- versus hiPSC-gerderiveerde GLCs .................................................................27 5.4.7.1 hESCs beter dan hiPSCs ..................................................................................27 5.4.7.2 hiPSCs beter dan hESCs ..................................................................................27 5.5 ETHISCHE EN SOCIALE ASPECTEN 29 5.5.1 Natuurlijk versus synthetisch......................................................................................29 5.5.2 Genetisch ouderschap .................................................................................................30 5.5.3 Veiligheid ...................................................................................................................30 5.5.4 Psychologische consequenties voor het kind..............................................................33 5.5.5 Informed consent ........................................................................................................33 5.5.6 Destructie van embryo’s en vergelijking ESCs vs iPSCs...........................................34 5.5.7 Humane experimenten met PSCDGs .........................................................................35 5.5.8 Financiering van PSCDGs en invloed op (on)gelijkheid ...........................................37 5.5.9 Valse hoop en sociale druk .........................................................................................38 5.6 TOEPASSINGEN 39 5.6.1 PSCDGs voor wetenschappelijk onderzoek ...............................................................39 5.6.2 Klinische toepassingen van PSCDGs .........................................................................40 5.6.2.1 Bieden PSCDGs een oplossing voor al deze patiënten? .................................40 5.6.2.2 Fertiliteitspreservatie ......................................................................................40 5.6.3 Nieuwe vormen van ouderschap.................................................................................41 6. DISCUSSIE 46 6.1 Efficiëntie ......................................................................................................................46 6.1.1 Samenvatting van resultaten................................................................................46 6.1.2 Waarom is de meiose bij OLCs moeilijker dan bij SLCs? ..................................47 6.1.3 Is de derivatie van PSCDGs even (in)efficiënt bij de muis als bij de mens? .......47 6.1.4 Is de derivatie van PSCDGs even (in)efficiënt bij iPSCs als ESCs? ...................48 6.1.5 Derivatie van gameten uit ntESCs .......................................................................48 6.1.6 Variabiliteit tussen de verschillende studies .......................................................48 6.2 Veiligheid ......................................................................................................................49 6.2.1 Morfologie en merkers ........................................................................................49 6.2.2 Meiose..................................................................................................................51 6.2.3 Epigenetica ..........................................................................................................51 6.2.4 Fertilisatie ...........................................................................................................52 6.2.5 Veiligheid voor de patiënt ...................................................................................52 6.3 Conclusie .......................................................................................................................53 7. REFERENTIES 57 8. BIJLAGEN 61 BIJLAGE 1 ...............................................................................................................................62 1. Afkortingenlijst BIJLAGE 2 ...............................................................................................................................63 Tabel 1: mESC-gederiveerde gameten. BIJLAGE 3 ...............................................................................................................................64 Tabel 2: Effecten van inducerende factoren bij mESC-gederiveerde gameten. BIJLAGE 4 ...............................................................................................................................65 Tabel 3: mESC-gederiveerde gameten: RNA- en proteïne merkers. BIJLAGE 5 ...............................................................................................................................67 Tabel 4 Moleculaire evaluatie van mESC-gederiveerde OLCs BIJLAGE 6 ...............................................................................................................................69 Tabel 5: Moleculaire evaluatie van mESC-gederiveerde SLCs BIJLAGE 7 ...............................................................................................................................71 Tabel 6: Overzicht miPSC-gederiveerde GLCs. BIJLAGE 8 ...............................................................................................................................72 Tabel 7: Merkers van hESC- en hiPSC-gederiveerde gameten. BIJLAGE 9 ...............................................................................................................................73 Tabel 8: Overzicht hESC- en hiPSC-gederiveerde gameten. 1. ABSTRACT Inleiding Infertiliteit kan een verwoestende aandoening zijn. Ongeveer 1 op 6 koppels kampt met vruchtbaarheidsproblemen, waarvan 20% niet geholpen kan worden met de bestaande geassisteerde voortplantingstechnieken. Gametendonatie en adoptie zijn geen ideale alternatieven, o.a. omdat de patiënt niet genetisch verwant zal zijn met het kind. De creatie van patiënt-specifieke stamcel-gederiveerde gameten zou mogelijks een oplossing kunnen bieden. Bij de muis werden reeds functionele gameten bekomen obv stamceltechnologie, maar bij de mens staan we nog niet zo ver. Naast wetenschappelijke zijn er nog tal van ethische hindernissen te overwinnen. In de masterproef geven we een overzicht van de ‘state of the art’ van de derivatie van gameten uit stamcellen (ESCs en iPSCs) bij de muis en de mens. Daarnaast bespreken we de ethisch-sociale aspecten en potentiële toepassingen. Op basis van deze informatie willen we onderzoeken of deze niewe techniek efficiënt, veilig en ethisch verantwoord zou kunnen zijn in de toekomst. Methode Er werd een systematisch literatuuronderzoek uitgevoerd. M.b.v. verschillende zoektermen en combinaties werd in de online databank Pubmed gezocht naar relevante studies waarin onderzoek is gedaan naar stamcel-gederiveerde gameten. Om een antwoord te vinden op de ethisch-sociale vraagstukken en potentiële toepassingen werd eveneens gebruik gemaakt van Pubmed. Resultaten Sinds de eerste creatie van mESC-gederiveerde OLCs in 2003 heeft men m.b.v. ESCs en iPSCs reeds heel wat kunnen realiseren: zowel bij de muis als de mens is men in staat om PGCLCs in vitro te deriveren en deze te differentiëren tot SLCs, OLCs en FLSs. De vorming van functionele OLCs en FLSs vormt de grootste uitdaging. De FLSs ontwikkelden zich slechts tot secundaire follikels, antrale follikels werden (nog) niet gecreëerd. Volledige meiose en vorming van mature en bewezen functionele gameten werd tot op heden uitsluitend gerapporteerd bij mannelijke muizen. De PSCDGs vertoonden frequent een afwijkende meiose en epigenetische herprogrammatie (inprenting). Zowel de efficiëntie als de kwaliteit van de meiose waren slecht, de meeste cellen ondergingen louter een initiatie van de meiose, in het bijzonder bij OLCs. Abnormale -1- inprenting manifesteerde zich reeds bij de ‘eerste’ stap van herprogrammatie, inprentingverwijdering, en werd tevens gezien bij de ‘tweede’ stap, herinstellen van parentaal inprenting-patroon. Ten slotte werd de fertilisatie van zowel muis SLCs als FLSs succesvol uitgevoerd. Gezonde en vruchtbare nakomelingen werden geboren, met normale epigenetische kenmerkern. De efficiëntie van de fertilisatie van FLSs was echter laag, vermoedelijk door triploïdie-afwijkingen. De bevruchting van humane GLCs is om ethische redenen (nog) niet mogelijk. De potentiële toepassing van PSCDGs bij de mens roept heel wat ethische en sociale vragen op. Zijn PSCDGs slecht omdat ze niet natuurlijk zijn? Wat is de waarde van genetisch ouderschap? Hoe veilig moet deze techniek zijn om het welzijn van het kind te garanderen? Zouden PSCDGs een psychologische belasting zijn voor de resulterende kinderen? Zal informed consent een probleem zijn? Zijn ESCs ethisch even aanvaardbaar als iPSCs? Zouden humane experimenten met PSCDGs verantwoord zijn? Zal de techniek betaalbaar zijn voor iedereen? Moeten we opletten met valse verwachtingen die gecreëerd worden bij patiënten? Voor wie zou deze techniek beschikbaar mogen zijn: enkel voor onvruchtbare mensen, of ook voor homoseksuele koppels, alleenstaanden, post-menopauzale vrouwen...? Discussie De derivatie van PSCDGs is een relatief inefficiënt proces. Voornamelijk de vorming van OLCs is een uitdaging, de oorzaak hiervan is echter onduidelijk. Mogelijks is de derivatie van PSCDGs even (in)efficiënt bij de muis als bij de mens, en zijn ESCs even (in)efficiënt als iPSCs. Onderzoek met ntESCs zouden nodig zijn als men patiënt-specifieke gameten zou willen creëren met embryonale stamcellen. Er bestaat een grote variabiliteit tussen de verschillende studies, mogelijks door het gebruik van verschillende methodes of door een heterogeen intrinsiek differentiatie potentieel van stamcellijnen. Momenteel zijn PSCDGs absoluut niet veilig. M.a.w. als PSCDGs ooit toegepast zouden worden in de kliniek, zal veiligheid de overheersende bezorgdheid zijn. De meeste studies besteden echter relatief weinig aandacht aan de klinische toepasbaarheid van PSCDGs. Als men pre-klinische of klinische evaluatie zou willen uitvoeren, zal een meer extensieve analyse van de PSCDGs noodzakelijk zijn. Mogelijks zullen PSCDGs nooit ‘volledig’ veilig zijn. Conclusie Er bestaat een mogelijkheid dat PSCDGs ooit efficiënt, veilig en ethisch verantwoord zouden kunnen zijn. Er zijn echter veel wetenschappelijke en ethische uitdagingen. -2- 2. INLEIDING 2.1 Infertiliteit De omvang en de impact van infertiliteit zijn zeer groot. Infertiliteit kan een verwoestende aandoening zijn voor koppels met een kinderwens en kan leiden tot depressie, een negatief zelfbeeld, echtscheiding en financiële problemen. [1] Ongeveer 15% tot 20% van alle koppels heeft vruchtbaarheidsproblemen. [2] De prevalentie van infertiliteit is aan het stijgen, o.a. door een trend de kinderwens uit te stellen, verhoogde blootstelling aan chronische stress en milieuvervuiling en gonadotoxische, oncologische behandelingen. [3] Afhankelijk van de oorzaak kan infertiliteit medisch of chirurgisch behandeld worden, hierbij kunnen geassisteerde reproductieve technieken (ARTs) gebruikt worden, zoals IVF en ICSI. Sinds de geboorte van Louise Brown in 1978, de eerste baby in de wereld geboren dankzij IVF, [4] is er veel vooruitgang geboekt in de ontwikkeling van ART. Momenteel kan 80% van de koppels met vurchtbaarheidsproblemen geholpen worden om hun kinderwens te vervullen. [5] 2.2 Gametendonatie en adoptie Als de beschikbare behandelingen m.b.v. ARTs met eigen gameten niet succesvol of geen optie zijn, kunnen gametendonatie of adoptie overwogen worden. Adoptie kan goedkoper en soms minder psychologisch belastend zijn voor een koppel dan ARTs. [6] Er zijn echter lange en stijgende wachttijden. [7] Bovendien zal het kind niet genetisch verwant zijn met de ouders, voor veel patiënten heeft genetisch ouderschap echter een belangrijke waarde. Bij gametendonatie zal het kind meestal wel genetisch verwant zijn met de partner van de patiënt. Volgens cijfers van het ESHRE werden in 2009 in totaal 21604 cycli uitgevoerd met donor oöcyten en 29235 met donor sperma in Europa. [8] Gametendonatie is echter geen ideale oplossing. Ten eerste zal het kind niet genetisch verwant zijn met de patiënt. Ten tweede bestaat er een prangend tekort aan oöcytdonoren in een aantal landen. [9] Ondermeer omdat oöcytdonatie een intensieve en risicovolle procedure is. [10] Dit tekort zou volgens sommigen kunnen worden opgelost door donoren te betalen. Maar dit is ethisch controversieel, aangezien er een risico bestaat op exploitatie of commercialisatie van de oöcytdonor. [11] Ten slotte is anonimiteit een complex probleem. De ouders hebben het recht op autonomie en privacy, de donor het recht op privacy en het kind het recht om zijn/haar afkomst te kennen. Deze rechten kunnen niet altijd verzoend worden. [12] Daarnaast bestaat er sinds jaren onenigheid of men het kind moet vertellen over het gebruik van gedoneerde -3- gameten, alhoewel er recent een trend bestaat om het ‘wel te vertellen’. Omdat dit minder ontwrichtend blijkt te zijn voor het kind dan men vroeger verwacht had. [13] 2.3 Patiënt-specifieke stamcel-gederiveerde gameten Gametendonatie en adoptie zijn geen ideale alternatieven voor onvruchtbare patiënten, o.a. omdat de patiënt niet genetisch verwant zal zijn met het kind. De creatie van patiëntspecifieke stamcel-gederiveerde gameten zou mogelijks een oplossing kunnen bieden. Dit zijn oöcyten of spermatozoa die men genereert uit pluripotente stamcellen, meer bepaald embryonale stamcellen na somatische cel nucleaire transfer of geïnduceerde pluripotente stamcellen. In 2003 slaagden Hübner et al. er voor de eerste keer in om muis stamcelgederiveerde oöcyten te creëren. [14] Sindsdien is er in snel tempo reeds heel wat gerealiseerd. In 2011 werden met deze techniek muizen geboren, nadat stamcel-gederiveerde spermatozoa bevrucht werden met oöcyten. [15] Bij de mens staat men nog niet zo ver, maar sommigen beweren dat deze techniek binnen een aantal jaren reeds haalbaar zou kunnen zijn bij de mens [16] Maar als het technisch haalbaar zou zijn, zal het dan ook veilig zijn? Want als men stamcel-gederiveerde gameten bestudeert, merkt men dat deze afwijkingen vertonen, ondermeer bij de meiose en epigenetische herprogrammatie. Met deze nieuwe techniek dringen zich ook heel wat ethische en sociale vragen op. Wat is de waarde van genetisch ouderschap? Hoe belangrijk is het welzijn van het resulterend kind? Voor wie zou deze techniek beschikbaar mogen zijn: enkel onvruchtbare mensen, of ook homoseksuele koppels, alleenstaanden, post-menopauzale vrouwen...? Kortom, de opkomst van stamcel-gederiveerde gameten brengt heel wat wetenschappelijke, ethische en sociale vragen met zich mee. 3. DOELSTELLING Het doel van deze masterproef is om te onderzoeken of stamcel-gederiveerde gameten een efficiënt, veilig en ethisch verantwoord proces is of zou kunnen zijn in de toekomst. We beschrijven de methode om gameten te deriveren uit stamcellen (ntESCs en iPSCs) en geven een overzicht van de ‘state of the art’ bij de muis en de mens. We focussen ons op de evaluatie van stamcel-gederiveerde gameten, gecreëerd in verschillende studies, o.b.v. bepaalde criteria die mogelijks een invloed hebben op de functionaliteit en veiligheid van gameten: morfologie, merkers, meiose, epigenetica en hormoondetectie. Daarnaast zullen we een overzicht geven van ethische en sociale aspecten van deze techniek. Ten slotte beschrijven we potentiële toepassingen van stamcel-gederiveerde gameten. -4- 4. METHODE De uitwerking van deze thesis werd gestart met een oriënterend onderzoek. Hierdoor kon een beeld geschetst worden over de thematiek van de thesis. Vervolgens werd een integraal overzicht samengesteld van relevante studies waarin onderzoek is gedaan naar stamcelgederiveerde gameten. Dit liet toe resultaten m.b.t. de evaluatie en moleculaire analyse van de gederiveerde gameten te vergelijken. De zoektocht naar relevante artikels werd gestart in de online databank Pubmed. Er werden verscheidene combinaties toegepast. Aan de ene kant werden volgende termen gebruikt: ‘germ cells’, ‘germ line’, ‘sperm’, ‘oocyte’, ‘egg’, ‘gametes’, ‘primordial germ cell’, ‘primordial germ cell-like cell’… Deze termen werden gecombineerd met één van de volgende: ‘artificial’, ‘synthetic’, ‘stem cell-derived’, ‘stem cells’, ‘pluripotent stem cells’, ‘embryonic stem cells’, ‘induced pluripotent stem cells’, ‘somatic cell nuclear transfer’, ‘therapeutic cloning’... Naast het rechtstreeks zoeken van artikels werd ook een significant deel van de artikels gevonden met behulp van de befaamde ‘sneeuwbalmethode’. Dit is een methode waarbij men systematisch alle referenties van geselecteerde artikels doorzoekt. Waarna de nieuw verkregen artikels opnieuw worden nagekeken, enz. De publicaties werden zorgvuldig gescreend en geselecteerd, volgende exclusie-criteria werden toegepast: de identificatie en/of differentiatie van spermatogoniale of ovariele stamcellen; derivatie van gameten uit andere types pluripotente stamcellen dan ESC en iPSC, zoals foetale SC (FSC), amnionvocht SC,...; in vitro derivatie van spermatozoa en oöcyten uit voorlopercellen; andere organismen dan muis of mens; in een andere taal dan het engels zijn geschreven. Ten slotte werd aandacht geschonken aan de ethische vraagstukken die stamcel gederiveerde gameten met zich meebrengen. Er is gezocht geweest met de basiswoorden: ‘ethics’ of ‘ethical’. Deze werden gecombineerd met verscheidene termen: ‘artificial’, ‘synthetic’, ‘stem cells’, ‘pluripotent stem cells’, ‘embryonic stem cells’, ‘induced pluripotent stem cells’, ‘somatic cell nuclear transfer’, ‘therapeutic cloning’, ‘pluripotent stem cell-derived gametes’,... samen met de begrippen: ‘germ cells’, ‘germ line’, ‘sperm’, ‘oocyte’, ‘egg’, ‘gametes’, ‘primordial germ cell’, ‘primordial germ cell-like cell’. -5- 5. RESULTATEN 5.1 ACHTERGRONDINFORMATIE 5.1.1 Stamcellen Stamcellen (SCs) zijn niet gedifferentieerde cellen en worden gekenmerkt door hun vermogen tot onbeperkte zelfvernieuwing en proliferatie. SC kunnen differentiëren in meer mature en gespecialiseerde cellen. Er zijn 3 soorten SCs: totipotent, pluripotent en multipotent. Een zygote is totipotent, omdat deze zich kan ontwikkelen tot een volledig organisme. Pluripotente cellen kunnen differentiëren tot cellen van alle drie de kiemlagen van het embryo, maar niet meer tot extra-embryonaal weefsel, zoals amnion en chorion. [17] Pluripotente stamcellen kunnen verkregen worden op 3 manieren: embryonale stamcellen (ESCs), embryonale stamcellen gederiveerd uit gekloonde embryo’s na SCNT (ntESCs), en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC). 5.1.1.1 Embryonale stamcellen (ESCs) De eerste derivatie van embryonale stamcellen gebeurde bij de muis in 1981. [18, 19] ESCs worden verkregen uit de binnenste cellaag (inner cell mass, ICM) van de blastocyst. De doorbraak kwam in 1998 met de isolatie van humane ESCs, [20] sindsdien heeft stamcelonderzoek zich op een adembenemend tempo ontwikkeld. Dit zorgde voor nieuwe mogelijkheden om inzicht te verkrijgen in de ontwikkelingsbiologie, ziektepathologie en ontwikkeling van medicatie. Bovendien bezit het een enorm potentieel voor toekomstige therapeutische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde, om ernstige ziektes te behandelen, zoals ruggenmergletsels, ziekte van Parkinson, type 1diabetes en blindheid door maculaire degeneratie. [21] Embryonale stamcellen zijn meestal afkomstig van overtollige embryo’s bij IVF en dus genetisch verschillend van de patiënt. Twee andere types stamcellen kunnen wel genetisch patiënt-specifiek zijn: somatische cel nucleaire transfer en geïnduceerde pluripotente stamcellen. 5.1.1.2 Somatische cel nucleaire transfer (ntESCs) In 1952 ontwikkelden Briggs en King de techniek ‘somatische cel nucleaire transfer’. [22] Bij deze ‘nucleaire transfer’ transplanteert men de kern van een somatische cel van een donor in een oöcyt die geënucleëerd is (de kern werd verwijderd). Deze samengestelde oöcyt kan zich ontwikkelen tot een embryo. Na plaatsing van dit embryo in de baarmoeder van een -6- draagmoeder, ontwikkelt zich een organisme met identiek genetisch materiaal als de donor. Dit noemt men reproductief klonen. In 1996 slaagde men er voor het eerst in om een zoogdier te klonen, met de geboorte van het wereldberoemde schaap Dolly. [23] Omwille van ethische en veiligheidsredenen is het algemeen aangenomen dat reproductief klonen van mensen verboden is. [24] Fig.1: Schematische voorstelling somatische cel nucleaire transfer. [25] Naast reproductief klonen, kan men SCNT ook toepassen voor het ontwikkelen van ESCs: therapeutisch klonen. Bij therapeutisch klonen zijn de eerste stappen van de procedure met SCNT dezelfde als bij reproductief klonen, maar het gekloond embryo wordt niet ingeplant bij een draagmoeder, er ontstaat dus geen nieuw organisme. [24] De verkregen blastocyst dient als bron voor de islolatie van ESCs (nucleaire transfer gederiveerde ESCs, ntESCs), die hetzelfde genetische materiaal zullen hebben als de donor van de somatische cel-nucleus. Zowel bij de muis als de mens is men er reeds in geslaagd ntESCs te creëren. [26, 27] De efficiëntie om muizen te klonen is laag (1-2%). [28] De meeste klonen sterven snel na de implantatie van het embryo of worden geboren met ernstige afwijkingen. [29] Daarom is het belangrijk om te beoordelen of patiënt-specifieke ntESCs therapeutisch bruikbaar en veilig zijn. Men kon echter geen moleculaire of biologische verschillen waarnemen tussen ntESCs en klassieke ESCs. [26] Bovendien ligt de efficiëntie voor de derivatie van ntESCs veel hoger (~20%) dan de efficiëntie voor het klonen van organismen (1-2%). [29] Dit indiceert dat ntESCs even geschikt zijn voor therapeutische applicatie als ESCs. [30] 5.1.1.3 Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) In 2006 verbaasden Takahashi en Yamanaka de wetenschappelijke wereld met de introductie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) bij de muis. [31] Hierbij forceerden ze een volwassen, gedifferentieerde huidcel, een fibroblast, om te de-differentiëren naar een pluripotente toestand. Dit herprogrammeren kan men door het terug ‘aanschakelen’ van de -7- genen verantwoordelijk voor pluripotentie, meer bepaald het tot expressie brengen van vier transcriptiefactoren in een gedifferentiëerde cel m.b.v. vectoren: Oct4, Sox2, Klf4, and cMyc. Amper een jaar later slaagden verschillende onderzoeksgroepen erin iPSCs te genereren uit humane somatische cellen. [32, 33] Geïnduceerde pluripotente stamcellen zijn veelbelovend, maar momenteel stellen zich nog een aantal problemen. Ten eerste is het onduidelijk of iPSCs even potent en ongedifferentieerd zijn als ESCs, aangezien er mogelijks een risico bestaat dat iPSCs na herprogrammatie een ‘epigenetisch geheugen’ bewaren afkomstig van hun somatische bron. [34] Ten tweede zijn er bezorgdheden m.b.t. de veiligheid van iPSCs voor klinische toepassing. Sommige transcriptiefactoren zijn potentieel oncogeen, zoals c-Myc, deze factor zou echter niet essentieel zijn voor herprogrammatie. [35] Daarnaast bestaat er een risico op genetische recombinatie of insertie mutagenese, door onwillekeurige integratie van de vector in het genoom. Men is echter alternatieve strategieën aan het ontwikkelen om dit probleem op te lossen, zoals het gebruik van niet-integratieve methodes en DNA-vrije methodes. [35, 36, 37] 5.1.2 Gametogenese De gameten, geslachtscellen, zorgen voor de transmissie van genetische informatie tussen generaties en zijn essentieel voor het overleven van een soort. Gameten ontstaan uit primordiale kiemcellen (primordial germ cells, PGCs). Deze PGCs zijn voor het eerst waarneembaar op embryonale dag (E) 6.25 in het epiblast aan de basis van de allantoïs. [38] PGCs ontstaan door een combinatie van inducerende en inhiberende signalen. BMP4, BMP2 en BMP8b zijn belangrijke stimulerende signalen, afkomstig van het extra-embryonaal ectoderm en het visceraal endoderm. [39] Deze induceren de expressie van transcriptiefactoren (DPPA3, BLIMP1, PRDM14 en AP2γ), [40] die verantwoordelijk zijn voor essentiële veranderingen: inductie van PGC genen, repressie van somatische genen, herverwerven van pluripotentie [41] en epigenetische herprogrammatie. [42] Na de vorming van PGCs, migreren deze langs de wand van de dooierzak naar de primitieve gonaden. Tijdens de reis prolifereren de ~40 PGCs zich enkele keren, waarna een ~1000 PGCs zich nestelen in de primitieve geslachtsstrengen op E11.5. Na de kolonisatie van de gonaden begint de de seksuele differentiatie. [43] De PGCs ontwikkelen zich tot de mannelijke en vrouwelijke precursoren van de gameten, respectievelijk spermatogonia en oögonia. -8- 5.1.2.1 Meiose De differentiatie van spermatogonia en oögonia naar respectievelijk mature spermatozoa en oöcyten noemt men de spermatogenese en oögenese. De spermatogonia en oögonia ondergaan mitose en groei. Hieruit ontstaan diploïde primaire spermatocyten en oöcyten. Deze vormen na meiose haploïde spermatiden en oöcyten. Bij de man zal spermatogenese beginnen vanaf de puberteit en levenslang worden verder gezet. [44] Bij de vrouw vormen zich tijdens de embryonale ontwikkeling miljoenen primaire oöcyten die zich in de profase van de eerste meiotische deling bevinden, de meerderheid van deze cellen zal degenereren. Bij de ovulatie wordt meiose I voltooid en meiose II gestart tot in de metafase. Meiose II wordt afgerond op het moment de oöcyt bevrucht. [45] De meiose bestaat uit een fase van DNA replicatie (de interfase) en 2 celdelingen (met elk profase, metafase, anafase en telofase). De eerste meiotische deling wordt voorafgegaan door een lange profase I, waarbij het chromatine condenseert tot chromosomen. De profase kan onderverdeeld worden in verschillende stadia (leptoteen, zychoteen, pachyteen, diploteen en diakinese). Crossing-over doet zich voor tijdens het zychoteen en pachyteen tijdens de paring van de homologe chromosomen, waarbij chiasmata ontstaan. Dit proces is essentieel voor de recombinatie van genetisch materiaal en een correcte meiose. Het positioneren van de homologe chromosomen noemt men synaps-vorming en gebeurt m.b.v. het synaptonemaal complex (SC), dat bestaat uit verschillende meiose-specifieke proteïnen (waaronder SCP3 en SCP1). De vorming van het SC is essentieel voor het proces van crossing-over. Tijdens anafase I worden de homologe chromosomen van elkaar weggetrokken en tijdens anafase II worden de zusterchromatiden gesplitst. [46] 5.1.2.2 Epigenetica Genomische inprenting is een epigenetisch regulatie mechanisme dat een essentiële rol speelt bij de ontwikkeling, groei en gedrag van een individu. De epigenetische regulatie van de genexpressie van inprenting-genen is afhankelijk van de parentale oorsprong: genen die paternaal of maternaal tot expressie komen. Bij maternaal ingeprente genen (zoals Igf2r en Snrpn) zal het maternale allel ‘uitgeschakeld’ zijn d.m.v. methylatie. Analoog zal bij paternaal ingeprente genen (H19 en Peg3), het paternale allel inactief zijn. De inprenting-patronen worden gevormd tijdens de gametogenese: eerst worden de oude methylatie-patronen verwijderd, erna worden ze opnieuw ingesteld, afhankelijk van het geslacht van het individu. [47, 48] -9- 5.2 Methode om PSCDGs te creëren In theorie zou men voor een patiënt die onvruchtbaar is gameten kunnen creëren uit patiëntspecifieke, pluripotente stamcellen: pluripotente stamcel-gederiveerde gameten (PSCDGs). De resulterende spermatozoa en oöcyten noemt men SLCs (spermatozoon-like cells) en OLCs (oocyte-like cells) respectievelijk, of GLCs (gamete-like cells). Na ICSI met deze patiëntspecifieke PSCDGs zouden ‘onvruchtbare’ patiënten, in principe, genetisch verwante kinderen kunnen krijgen. Als bron voor patiënt-specifieke pluripotente stamcellen zou men gebruik kunnen maken van ntESCs of iPSCs. De eerste stap is dus de creatie van deze stamcellen, en de tweede stap is de generatie van PSCDGs (Fig 2.). Voor de verklaringen van afkortingen in deze masterproef, zie Bijlage 1. Fig.2: Patiënt-specifieke stamcel-gederiveerde gameten. ICSI met gameten afkomstig van patiënt-specifieke pluripotente stamcellen (ntESCs of iPSCs). SLCs = spermatozoön-like cells. OLC = oöcyt-like cell. ICSI = intracytoplasmatische sperma-injectie (Illustratie gebaseerd op Fig1.B van Yao et al., 2011). [49] We zullen de algemene methode om PSCDGs te creëren bespreken (Fig 3.). Deze methode is van toepassing op zowel ESCs als iPSCs bij de muis en de mens. De differentiatie van PSCDGs gebeurt meestal in 2 stappen: eerst worden stamcellen geïnduceerd om te differentiëren tot PGC-achtige cellen (PGCLCs) in vitro en erna worden de PGCLCs verder gedifferentieerd tot GLCs. Deze tweede stap is doorgaans een in vivo stap: rijping in een testiculaire of ovariele niche. 5.2.1 Stap 1: PGCLC-inductie Pluripotente SCs kunnen in een ongedifferentieerde staat behouden en geprolifereerd worden door cultuur van deze stamcellen met LIF (leukemia inhibitory factor) en/of feeder cellen (MEFs, mouse embryonic fibroblasts). Als men deze factoren verwijderd uit de cultuur zullen - 10 - de stamcellen spontaan differentiëren tot verschillende cellijnen afkomstig van de drie kiemlagen en eveneens tot PGCLCs. Fig.3: Stamcel-gederiveerde gameten bij de muis: methode. mESCs of miPSCs kunnen geïnduceerd worden om te differentiëren tot PGCLCs, door wegname van LIF en MEFs. EBs en monolayer zijn 2 belangrijke cultuur-vormen. Transfectie van een transgen is een methode voor isolatie van PGCLCs. De efficiëntie van PGCLC-inductie kan verhoogd worden door inducerende factoren toe te voegen aan de cultuur of door genetische manipulatie. De PGCLCs kunnen na een in vivo rijping SLCs of FLSs/OLCs vormen. Na ICSI worden mogelijks muizen geboren. Afkortingen: zie tekst en Bijlage 1 (Illustratie gebaseerd op Fig2 van Imamura et al., 2014). [50] 5.2.1.1 EBs versus monolayer cultuur Er bestaan 2 veelgebruikte soorten cultuur voor de derivatie van PGCLCs uit mESCs: adherente cultuur (monolayer vorming) en suspensie cultuur met de vorming van embryoid bodies (EBs). Deze 2 methodes hebben zowel voor- en nadelen. Een adherente monolayer cultuur is een planaire structuur, een voordeel hiervan is dat ieder deel van de cultuur uniform zal blootgesteld worden aan oplosbare medium componenten. [51] De efficiëntie van deze methode om PGCLCs te induceren was echter laag in verschillende studies. [14, 52] EBs zijn driedimensionale structuren, waardoor de spatio-temporale organisatie tijdens de in vivo embryogenese beter nagebootst wordt. [51] 5.2.1.2 Identificatie en isolatie van PGCLCs Men kan PGCLCs identificeren door de expressie van genen te analyseren die geassocieerd - 11 - zijn aan de gametogenese in vivo: mRNA- en proteïne merkers. De isolatie van PGCLCs kan men op 2 manieren uitvoeren. Een eerste manier gebeurt m.b.v. de transfectie van de stamcellen met een reporter transgen. [53] Deze reporter kan zowel gelinkt zijn aan vroege PGC-merkers, als late merkers (spermatogenese-merkers en oögenese-merkers). Een tweede manier is de isolatie m.b.v. cel-oppervlakte merkers, zoals EpCAM [54] en CXCR4. [55] De identificatie en isolatie van PGCLCs in de cultuur is een moeilijke opgave, aangezien weinig merkers 100% specifiek zijn voor PGCLCs. PGCs zijn transcriptioneel en fenotypisch zeer gelijkaardig aan pluripotente stamcellen, ze hebben veel merkers gemeenschappelijk. [56] 5.2.1.3 Verhogen van de efficiëntie PGCLCs kunnen spontaan gedifferentieerd worden uit stamcellen. Deze spontane methode, zonder externe stimuli, heeft echter een bijzonder lage efficiëntie en is onvoorspelbaar. [14,57] Er bestaan 2 strategieën om de efficiëntie van PGCLC-inductie te verhogen: modificatie van de cultuur d.m.v. toevoegen van externe, inducerende factoren en genetische manipulatie. 5.2.2 Stap 2: in vivo-stap De meeste studies slaagden erin PGCLCs in vitro te induceren, de differentiatie tot mature en competente gameten is echter een grotere uitdaging. Daarom introduceerde men een in vivostap: de creatie van een gonadale niche die de rijping stimuleert, meestal door transplantatie van de PGCLCs naar gonaden van de muis. Men heeft nog geen bewezen functionele GLCs kunnen deriveren zonder deze in vivo-stap. [58] Transplantatie is bij de mens (nog) niet mogelijk. De PGCLCs kunnen rechtstreeks getransplanteerd worden naar de gonaden. [59] Meestal wordt echter gebruik gemaakt van een tussenstap: co-cultuur met gonadale cellen. Hierdoor vormen zich aggregaten, gereconstitueerde testes of ovaria (Fig.4), die getransplanteerd worden naar de gonaden voor maturatie van de PGCLCs. [52] Ectopische transplantatie onder het nierkapsel van de muis is eveneens mogelijk. [60] Bij de transplantatie bestaat er een risico op vorming van teratomen, veroorzaakt door een onvoldoende zuiverheid van de PGCLC-populatie. [52] - 12 - Fig.4: Vorming van aggregaten van PGCLCs en gonadale cellen: gereconstitueerde testes. . [61] Soms wordt de transplantatie-stap niet gedaan, maar creëert men wel een gonadale niche in vitro: ofwel m.b.v een co-cultuur met gonadale cellen, [58,62] ofwel m.b.v. een cultuur met geconditioneerd medium (CM) van gonadale cellen. [63] - 13 - 5.3 MUIS PSCDGs 5.3.1 PGCLC-inductie Om de efficiëntie van PGCLC-inductie te verhogen werd reeds geëxperimenteerd met een groot aantal inducerende factoren toegevoegd aan de cultuur (zie Bijlage 3 voor een meer uitgebreid overzicht dan hier beschreven). 5.3.2 In vivo-stap Zoals eerder beschreven wordt er frequent gebruik gemaakt van een in vivo-stap voor de differentiatie van PGCLCs tot GLCs (zie 5.2.2). Voor een overzicht van de gebruikte methodes voor deze stap verwijzen we naar Bijlage 2. 5.3.3 Evaluatie van GLCs o.b.v. merkers en morfologie Enkele studies genereerden uitsluitend PGCLCs, omdat geen in vivo-stap werd toegepast. Meerdere studies toonden aan dat het mogelijk is mature geëlongeerde spermatiden in vitro te creëren uit mESCs. Morfologisch zagen deze spermatiden er normaal uit, met een goede mobiliteit, vorming van een staart-achtige structuur en acrosoom, en nucleaire condensatie. [52,66,67] Bovendien werden spermatogenese-merkers tot expressie gebracht. [58,59,65,66] Deze SLCs vertoonden echter epigenetische- en meiose-afwijkingen. Voor een overzicht van de moleculaire afwijkingen geobserveerd bij mSLCs verwijzen we naar Bijlage 6. Een aantal studies deriveerden uitsluitend OLCs. [58,67] Anderen vonden wel een beginnende follikelvorming, maar deze FLSs ontwikkelden zich slechts tot primordiale en primaire follikels, bovendien was de zona pellucida abnormaal of afwezig. [14,60,63] Ten slotte genereerden Nitta et al. (2013) en Hayashi et al. (2012) secundaire follikels. Ze observeerden grote OLCs omgeven door meerdere lagen van granulosa- en theca- achtige cellen. [61,68] De OLCs hadden echter een abnormale ellips vorm (vermoedelijk door cytoskeletale immaturiteit en/of fragiliteit), en waren niet omringd door cumulus cellen (COC). [61] Men is er nog niet in geslaagd tertiaire follikels te creëren. Nitta et al. (2013) stelden dat het falen van de ontwikkeling tot tertiaire follikel mogelijks veroorzaakt werd door een aantal moleculaire afwijkingen: het falen van de meiose, ambigue seks determinatie, en abnormale genomische inprenting, hormonenregulatie en cel-cel interactie. [68] Voor een overzicht van de moleculaire afwijkingen geobserveerd bij mOLCs verwijzen we naar Bijlage 5. - 14 - Fig.5: Schema dat een samenvatting toont van de moleculaire afwijkingen van mESC-gederiveerde gameten in vitro. [68] De indentiteit van PGCLCs en GLCs werd bevestigd a.d.h.v. de detectie van een verscheidenheid aan merkers (zie Bijlage 4). Vroege merkers (PGC-geassocieerde merkers) werden frequenter geëvalueerd dan late merkers (meiose, spermatogenese, oögenese). Soms waren specifieke merkers niet detecteerbaar, zoals een aantal meiose-merkers. [69] en oögenese-merkers (ZP1). [14] Silva et al. (2009) onderzochten de temporele expressie van 12 genen geassocieerd aan de gametogenese bij mESC-gederiveerde kiemcellen en concludeerden dat deze expressiepatronen niet volledig correct de in vivo gametogenese imiteerden. Bij de meeste genen waren de temporele veranderingen relatief gelijklopend met de geanticipeerde sequentie van de gametogenese in vivo, maar bij sommige genen vond men discordante patronen. [65] De meeste studies observeerden echter dat het dynamisch expressie-patroon wel correct gereproduceerd werd. [15,69,70] Nitta et al. vergeleken de kwantitatieve expressie van genen van mES-gederiveerde FLSs met deze van ovaria. Hieruit kon men concluderen dat de genexpressie profielen van de FLSs eerder gelijkaardig zijn aan embryonale ovaria dan aan neonatale of volwassen ovaria, wat betekent dat de FLSs nog niet volledig ontwikkeld waren. - 15 - [68] Ten slotte ondervonden Hayashi et al. m.b.v. microarray analyse dat de PGCLCs grote gelijkenissen vertoonden met E9.5 PGCs. [61] 5.3.4 Meiose Meiose is een uniek en complex proces tijdens de gametogenese. De recapitulatie van de meiose in vitro is niet evident, en blijkt een grote uitdaging te zijn voor de ontwikkeling van functionele stamcel-gederiveerde gameten. Momenteel werd volledige meiose uitsluitend gerapporteerd bij SLCs. Meiose bij OLCs werd wel geïnduceerd in sommige studies, maar deze ontwikkelden niet verder dan de profase van meiose I. [60] Eerst wordt uitgelegd o.b.v. welke criteria de meiose geëvalueerd kan worden. Daarna beschrijven we de resultaten m.b.t. de meiose, die we indelen in 4 groepen afhankelijk van de progressie van de meiose. 5.3.4.1 Evaluatie van de meiose Er worden verschillende criteria gebruikt om de meiose te beoordelen. Tijdens de meiose worden specifieke proteïnen tot expressie gebracht, zoals SCP3. In vivo is SCP3 voor het eerst detecteerbaar als een punctiform patroon t.h.v. de nucleus tijdens het leptoteen. Daarna zal SCP3 gelokaliseerd zijn t.h.v. de volledige lengte van de zusterchromatiden (= geëlongeerd patroon) tijdens het pachyteen, waarbij MLH1 noduli plaatsen van chromosoom recombinatie markeren. Bovendien kan de vorming van een synaps recombinatie doen vermoeden. [71,72] SCP3 lokalisatie langs de chromosomen (geëlongeerd patroon) is een significante indicator van de meiose en veel specifieker voor de progressie van meiose dan de expressie van mRNA of proteïnen. [73] 5.3.4.2 Pre-meiose Novak et al. (2006) en Qing et al. (2007) deriveerden OLCs/FLSs, maar deze ondergingen geen meiose. Er werden wel enkele eigenschappen van de meiose waargenomen, die suggereren dat de cellen zich in een voorbereidingsfase van de meiose bevonden. Novak et al. detecteerden SCP3, maar verschillende andere proteïnen essentieel voor de meiose waren niet detecteerbaar. Bovendien was SCP3 niet chromosomaal gelokaliseerd werd er geen synaps gevormd. [69] Qing et al. (2007) detecteerden eveneens SCP3, maar deze was cytoplasmatisch gelokaliseerd. [58] 5.3.4.3 Beoordeling meiose moeilijk Sommige studies onderzochten enkel de expressie van SCP3, deze merker is suggestief voor - 16 - een pre-meiose of meiose-stadium. Deze merker is echter aspecifiek waardoor conclusies m.b.t. een correcte meiose niet mogelijk zijn. [65,67] 5.3.4.4 Initiatie van meiose De mESC-gederiveerde FLSs van Nicholas et al. (2009) vertoonden een initiatie van de meiose, maar de meiose werd niet volledig volbracht. Verschillende meiose-merkers waren nucleair lokaliseerbaar na toevoegen van FAC-medium, wat betekent dat de meiose werd geïnduceerd. SCP3 en SCP1 vertoonden echter een onvolledige chromosomale alignatie en synaps-vorming. Bepaalde eigenschappen van de synaps waren wel waarneembaar, zoals de co-lokalisatie van het centromeer t.h.v. SCP3 en de chromosomen. Deze resultaten betekenen dat de FLSs zich waarschijnlijk slechts ontwikkelden tot profase I van de meiose. De efficiëntie van meiose inductie was bovendien heel laag (slechts 1-3% van de PGCLCs). [60] Hübner et al. (2003) observeerden poollichaampjes-achtige cellen nadat gonadotrofines werden toegevoegd aan de cultuur, wat betekent dat de eerste meiotische deling mogelijks volbracht was. [14] Deze bevindingen bewijzen echter geen correcte meiose. Ten slotte deriveerden Hayashi et al. OLCs met een nucleair, geëlongeerd SCP3 patroon, deze OLCs bevonden zich m.a.w. in het zygoteen stadium van profase I. Deze observaties waren suggestief voor een correcte crossing-over tijdens de meiose. [15] 5.1.5 Volledige meiose Enkel wanneer mannelijke SLCs gederiveerd werden kon een volledige meiose geöbserveerd worden. [59,66] Geijsen et al. (2004) observeerden dat slechts een kleine hoeveelheid van de cellen in de cultuur aankleurden voor het proteïne FE-J1 (0.01%), dat normaal gezien tot expressie wordt gebracht door spermatocyten en spermatiden. Bovendien bleef de meerderheid van deze FE-J1-positieve cellen diploïd, wat betekent dat de meiose een heel lage efficiëntie had. [66] Nayernia et al. (2006) genereerden een meer succesvolle meiose. Na RA-stimulatie en transplantatie in de testes van muizen werden haploïde SLCs gederiveerd. Bovendien kon synaps-vorming waargenomen worden met een elektronen microscoop. [59] 5.3.5 Epigenetica De GLCs vertoonden heel wat afwijkingen m.b.t. hun epigenetische status, zowel in de eerste stap ‘inprenting-verwijdering’ als de tweede stap ‘instellen paternaal inprenting-patroon’. Deze epigenetische fouten manifesteerden zich zowel bij OLCs als SLCs. - 17 - 5.3.5.1 Inprenting verwijdering Young et al. (2010) observeerden geen inprenting-verwijdering van H19. [70] Zij stelden dat dit overeen kwam met PGCLCs vóór de kolonisatie. [74] Bij Nayernia et al. (2006) werd de inprenting-verwijdering correct uitgevoerd bij 2 van de 3 bestudeerde genen (H19 en Igf2r), maar de methylatie van Snrpn steeg contradictorisch. [59] Ten slotte observeerden Wei et al. (2008) en Hayashi et al. (2011) een volledig correcte inprenting-verwijdering van een aantal genen. Het herinstellen van een paternaal inprenting-patroon kon echter niet waargenomen worden. [75] 5.3.5.2 Instellen paternaal inprenting-patroon Na demethylatie moeten nieuwe inprenting-patronen ingesteld worden, hierbij is een juiste seksuele differentiatie belangrijk. Bij Nayernia et al. (2006) vertoonden de SLCs een gedeeltelijk correcte inprenting regulatie. Een aantal genen initieerden namelijk het instellen van het paternaal inprenting-patroon (Igf2r en Snrpn), terwijl dit proces bij andere genen nog niet was begonnen (Igf2r en H19). Ten slotte analyseerden ze dat de SLCs een correcte chromatine condensatie vertoonden die overeenstemde met mature spermatozoa. [59] Bij de derivatie van OLCs uit XY-mESCs, observeerden Nitta et al. (2013) een paternale inprenting i.p.v. een verwachte maternale inprenting. [68] Dit zou mogelijks toegeschreven kunnen worden aan de expressie van Dnmt3L bij de OLCs, wat zorgt voor een androgenetische genomische inprenting. [76] Andere spermatogenese-geassocieerde genen (Sry, Nanos, Miwi) werden echter niet tot expressie gebracht. 5.3.5.3 X-chromosoom activatie Hayashi et al. onderzochten eveneens de activiteit van het X-chromosoom bij PGCLCs. De EpiLCs vertoonden een correcte initiatie van X-inactivatie. In tegenstelling tot het Xchromosoom van de PGCLCs dat gereactiveerd werd bij de PGCLCs, zoals bij in vivo PGCs. [15] 5.3.6 Hormonen Detectie van oestradiol in de cultuur bij mESC-differentiatie toonde een functionele activiteit aan van theca- en granulosacellen en mogelijke ondersteuning van de folliculogenese in vitro. [14,69] Naast de detectie van oestradiol constateerden Hübner et al. (2003) een stijging van mRNA van enzymen betrokken bij de productie van oestradiol. [14] Deze merkers werden echter niet waargenomen door Nitta et al. (2013). [68] - 18 - Hübner et al. (2003) rapporteerden dat het toevoegen van gonadotrofines aan de cultuur resulteerde in het uitstoten van OLCs uit de FLSs en de vorming van poollichaampjes-achtige cellen. Dit suggereert dat receptoren aanwezig zijn voor gonadotrofines en dat de FLSs kunnen reageren op gonadotrofines. [14] Nitta et al. (2013) konden echter geen expressie van de gonadotrofine receptoren (FSH-R en LH-R) detecteren. [68] Als gonadotrofine-signalen afwezig zouden zijn, zal de folliculaire ontwikkeling blokkeren voor het antraal en preovulatoir stadium respectievelijk. [77] Contrasterend kon men in deze vrouwelijke FLSs een abnormaal hoge expressie van het mannelijk-geassocieerde antimulleriaans hormoon (AMH) waarnemen, wat wijst op een aberrante seksuele differentiatie. [78] Hormonen bij SLCs werden nauwelijks onderzocht. Enkel Geijsen et al. (2004) detecteerden een expressie van LH-R en AMH, wat de aanwezigheid van respectievelijk leydig- en sertolicellen suggereert. [66] 5.3.7 Fertilisatie van mESC-gederiveerde gameten De ultieme test voor het onderzoeken van de competentie en functionaliteit van PSCDGs is fertilisatie met de PSCDGs en oöcyten of spermatozoa (zie Bijlage 6 en 6). Hübner et al. (2003) observeerden dat zich na 43 dagen spontaan blastocyst-achtige structuren vormden in de cultuur, waarschijnlijk veroorzaakt door parthenogenetische activatie van de OLCs. [14] Geijsen et al. (2004) waren de eersten die oöcyten bevruchten met mESC-gederiveerde SLCs m.b.v. ICSI. Er vormden zich blastocyst-achtige structuren, deze werden echter niet getransfereerd naar een uterus. [66] Dit werd wel uitgevoerd door Nayernia et al. (2006). Na ICSI met SLCs vormden zich embryo’s die resulteerden in de geboorte van 12 nakomelingen. Deze waren allemaal te klein of te groot vergeleken met controle muizen, bovendien bleven ze niet langer dan 6 maanden in leven. Nayernia et al. associeerden deze afwijkingen met een gestoorde paternale inprenting van de SLCs. [59] De nakomelingen bij Hayashi et al. (2011) waren wel grotendeels gezond, wanneer SLCs zich ontwikkelden tot embryo’s na ICSI en getransfereerd werden naar draagmoeders. Zowel mannelijke als vrouwelijke nakomelingen van de PGCLCs ontwikkelden zich normaal tot vruchtbare volwassen muizen. [15] De fertilisatie van OLCs werd ook reeds gerealiseerd. Vijf vruchtbare nakomelingen met normale inprenting werden geboren. De efficiëntie was echter laag.Mogelijk werd dit veroorzaakt door het falen van de extrusie van het 2de poollichaampje, waardoor triploïde zygotes ontstonden, die niet verenigbaar zijn met het leven. [61] Hayashi et al. zijn de enigen die bewezen functionele GLCs ontwikkelden, aangezien vruchtbare - 19 - nakomelingen geboren werden. We willen echter opmerken dat de meiose niet bestudeerd werd bij de gederiveerde SLCs, bovendien vertoonden de SLCs epigenetische afwijkingen. [15] Daarom is het onduidelijk of deze functionele GLCs ook veilig waren. 5.3.8 miPSC-gederiveerde gameten Okita et al. toonden in 2007 aan dat miPSCs-chimere muizen in staat zijn om in vivo bij te dragen aan de vorming van gameten. [79,80] Het was in 2010 dat Imamura et al. er voor het eerst in slaagden om OLCs in vitro te genereren uit miPSCs. [81] Men heeft reeds FLCs en SLCs kunnen deriveren uit miPSCs (zie Bijlage 7). De gebruikte miPS-cellijnen zijn afkomstig van verschillende celtypes. De meest gebruikte bron voor miPSCs zijn fibroblastcellen, deze zijn meer geschikt, aangezien ze gemakkelijker te verkrijgen zijn dan b.v. hepatocyten van een patiënt. [82] Er bestaat een grote heterogeniteit in de capaciteit van miPS-cellijnen om PGCLCs te induceren, sommigen produceerden zelfs geen PGCLCs. [83] Het is onduidelijk waarom dit zo is. Mogelijks werd dit veroorzaakt wordt door een mineure kwaliteit van de miPSCs, omdat deze onvoldoende geherprogrammeerd zouden zijn. Daarom is het belangrijk om de verschillen tussen de miPSC-klonen, hun oorsprong en generatie-protocol, te evalueren. [81] Imamura et al. demonstreerden een pre-screening om de optimale klonen te selecteren voor in vitro kiemcel differentiatie. Ze voerden deze screening uit door de miPSC-klonen te beoordelen op hun morfologie en expressie van kiemcelmerkers (Mvh). De verdere analyse in hun studie werd uitgevoerd met de miPSC-kloon met de hoogste Mvh-expressie. [81] De meiose werd minder uitvoerig geëvalueerd bij de miPSC-gederiveerde gameten vergeleken met deze bij mESC-gederiveerde gameten, voornamelijk de expressie van meiosemerkers werd gerapporteerd. [81] Daarnaast observeerden Li et al. de vorming van haploïde cellen, ondanks het feit dat de mannelijke kiemcellen volledig in vitro werden gederiveerd. [83,84] De epigenetische eigenschappen werden nauwelijks onderzocht bij miPSC-gederiveerde gameten. Enkel Imamura et al. observeerden dat de Mvh promotor van de miPSCgederiveerde OLCs slechts een gedeeltelijke demethylatie vertoonde. Er kon echter geen verband gevonden worden tussen de methylatie-status van Mvh en de kiemcel-competentie van de miPS-cellijnen. [81] - 20 - 5.4 HUMANE PSCDGs De muis en de mens vertonen heel wat verschillen m.b.t. de gametogenese en stamcelonderzoek. [85,86] Daarom kan men de resultaten van stamcel-gederiveerde gameten bij de muis niet volledig extrapoleren naar de mens. We beschrijven eerst methodes om PGCLCs te induceren, daarna bespreken we de functionele evaluatie van GLCs (o.b.v. merkers, morfologie, meiose en epigenetica) en ten slotte vergelijken we de derivatie van GLCs uit hESCs en hiPSCs. 5.4.1 PGCLC-inductie Clark et al. differentieerden EBs uit hESCs en observeerden na 14 dagen een spontane stijging van PGCLC-merkers. [71] Deze spontane methode werd nadien succesvol herhaald. [87,88] Men heeft echter geprobeerd om de efficiëntie van dit proces te verhogen: door factoren toe te voegen aan de cultuur, een co-cultuur of geconditioneerd medium te vormen of door overexpressie van bepaalde genen (zie Bijlage 9). 5.4.2 Evaluatie van GLCs o.b.v. merkers en morfologie In tegenstelling tot eerdere studies die slechts hESC-gederiveerde PGCLCs genereerden, slaagden Aflatoonian et al. (2009) er voor het eerst in om SLCs en FLSs te deriveren uit hESCs. De SLCs hadden de morfologie van ronde spermatiden met een compacte nucleus en sommigen met de vorming van een flagellum. De SLCs brachten proteïne-merkers tot expressie die specifiek zijn voor de spermatogenese. Men kon ook OLCs en FLSs (primordiale follikels) observeren in de EBs. Oögenese-specifieke mRNA merkers waren positief, maar het was niet mogelijk ZP-proteïnen te detecteren. [89] Hierna bevestigden verschillende studies de derivatie van OLCs en SLCs uit hESCs en hiPSCs (zie Bijlage 9). Hun evaluatie gebeurde meestal o.b.v. merkers specifiek voor oögenese of spermatogenese (zie Bijlage 8). De SLCs hadden eveneens de morfologie van ronde spermatiden, [73,90] en sporadisch konden FLSs geobserveerd worden. [91] Mature spermatozoa en follikels konden echter niet gegenereerd worden. Tijdens het proces van GLC-derivatie verliepen de expressie-patronen van verscheidene mRNA-merkers temporeel consistent met de gametogenese in vivo. [55,71,89,92] Hierbij werden eerst de vroege kiemcel-specifieke genen (PGC-merkers) tot expressie gebracht en erna pas de latere stadia van kiemcel-specifieke merkers (geassocieerd aan de meiose, - 21 - oögenese en spermatogenese). Het is echter opmerkelijk dat de in vitro inductie-tijd véél korter is dan de gametogenese in vivo. Het expressie niveau van een aantal PGC-merkers was bij Tilgner et al. (2008) kwantitatief equivalent aan deze van humane testes. [92] Lim et al. vergeleken m.b.v. microarray analyse de expressie van 118 genen van de hESC-gederiveerde SLCs met spermatogonia afkomstig van humane testes. Van deze 118 genen, werden 112 genen tot expressie gebracht door zowel de SLCs als spermatogonia. Wanneer men echter het expressie niveau analyseerde bleken slechts 48 genen een gelijkaardige expressie te hebben tussen beiden. [90] 5.4.3 XY-OLCs en XX-SLCs We kunnen een merkwaardig fenomeen waarnemen bij de seksuele differentiatie van de humane pluripotente stamcel-gederiveerde GLCs. [71,89,93,94] De GLCs kunnen simultaan oögenese- en spermatogenese-specifieke merkers tot expressie brengen, onafhankelijk van het vrouwelijk of mannelijk karyotype (XX of XY) van de oorspronkelijke hESCs. Dit zou betekenen dat XX-hESCs zowel SLCs als FLSs kunnen genereren in vitro en dat XY-hESCs kunnen differentiëren tot zowel SLCs als FLSs. Het is onduidelijk wat de oorzaak van dit fenomeen is en of deze gederiveerde XX-SLCs en XY-OLCs functioneel en veilig zijn. Een geslachtsomkering bij mannelijke muizen resulteerde in XY-oöcyten die een afwijkende meiose vertoonden en niet in staat waren om embryo’s te vormen na fertilisatie. [68,95] Dit betekent dat het een uitdaging zou zijn om functionele XY-OLCs te deriveren. Bovendien zou de generatie van XX-SLCs nog moeilijker zijn, aangezien een Y-chromosoom noodzakelijk is voor de spermatogenese. 5.4.4 Meiose De grootste hindernis voor de derivatie van functionele en veilige gameten in vitro uit humane pluripotente stamcellen is de meiose. Er zijn verschillende studies die enkele kenmerken van de meiose kunnen aantonen, maar er zijn weinig tot geen studies die een volledig normale meiose bewijzen (zie Bijlage 9). Op basis van progressie door de meiose kunnen we zes groepen onderscheiden. 5.4.4.1 Pre-meiose In de studie van Park et al. (2009) genereerde men m.b.v. een co-cultuur met hFGS immature PGCLCs die geen meiose-merkers tot expressie brachten. Park et al. stelden de hypothese dat de hFGS (gederiveerd uit humane foetale gonaden) ‘vroegtijdige’ meiose belemmerden - 22 - aangezien deze afkomstig waren van het eerste zwangerschapstrimester. [96] Duggal et al. konden wel Scp3-mRNA opsporen nadat hESC-gederiveerde PGCLCs in cultuur werden gebracht met IVM medium (in vitro maturatie medium). Het proteïne SCP3 kon echter niet gedetecteerd worden, wat suggereert dat de PGCLCs zich nog in een pre-meiotisch stadium bevonden. [97] 5.4.4.2 Beoordeling meiose moeilijk Vaak werd enkel de expressie van “meiose-merker” SCP3 onderzocht. [91,93,98] Als louter SCP3 tot expressie wordt gebracht (zonder expressie van andere meiose-merkers), is dit suggestief dat de cellen zich slechts in een voorbereidings- of initiatie fase van de meiose bevinden. [69] M.a.w. de afwezigheid van SCP3 betekent dat de meiose (nog) niet plaatsvond (of in een optimistisch scenario reeds volledig afgelopen is), terwijl de aanwezigheid van SCP3 aspecifiek is m.b.t. de meiose. West et al. konden wel meerdere meiose-geassocieerde merkers detecteren: SCP1, SCP3 en MLH1. [87] Maar aanwezigheid van deze proteïnen is niet voldoende als bewijs dat deze cellen ‘normale’ meiose hebben ondergaan. [99] 5.4.4.3 Iniatie van meiose In het pionierswerk van Clark et al. kon men wel een stijging van meiotische- en postmeiotische merkers waarnemen bij de spontane derivatie van PGCLCs, maar er werden geen haploïde cellen gevormd. De meiose, met als eindproduct haploïde cellen, werd dus niet vervolledigd; mogelijks omdat deze ‘spontane’ methode ontoereikend was. Er waren wel aanwijzingen dat de meiose werd geïnitieerd. Een klein aantal cellen vertoonde een nucleaire lokalisatie van SCP3 in een punctiform patroon, wat suggestief is voor het leptoteen stadium van de eerste meiotische deling. [71] 5.4.4.4 Volledige meiose? Onzekerheid over haploïde cellen Men kan haploïde cellen detecteren door de DNA inhoud te bepalen van een cel m.b.v. flow cytometrie. Dit is echter een minder specifieke techniek dan het bepalen van het aantal chromosomen m.b.v. FISH. [99] Tilgner et al. (2008) en Aflatoonian et al. (2009) konden beiden een klein aantal (∼0.5%) haploïde cellen waarnemen. [89,92] Of de cellen effectief meiose hadden ondergaan was echter onzeker, o.a. omdat gebruik werd gemaakt van flow cytometrie. Bovendien konden Tilgner et al. geen synaps-vorming observeren en was SCP3 cytoplasmatisch gelokaliseerd (i.t.t. tot de meiose waar SCP3 nucleair gelokaliseerd moet zijn). [92] Deze gebrekkige meiose zou, zoals bij Clark et al. (2004), veroorzaakt kunnen zijn door de toegepaste ‘spontane’ methode. - 23 - 5.4.4.5 Volledige meiose Een aantal studies observeerden tevens haploïde cellen (SLCs), maar a.d.h.v. de meer betrouwbare techniek FISH. [73,90,100] Het bewijs van meiose werd versterkt door de detectie van meiotische- en post-meiotische merkers. Het aantal haploïde cellen was relatief laag: tussen de 0.4% en 4% afhankelijk van de studie. Er werd gebruik gemaakt van verschillende methodes om deze haploïde cellen te creëren. 5.4.4.6 Volledige meiose m.b.v. overexpressie van genen Om de meiose te bevorderen brachten Panula et al. (2011) en Medrano et al. (2012) een aantal genen tot overexpressie (zie Bijlage). Uitsluitend wanneer overexpressie werd toegepast konden haploïde cellen gedetecteerd worden. Het aantal haploïde cellen was lager (0.4-0.7%) vergeleken met de studies zonder overexpressie (0.4-4%). Wat echter een meerwaarde vormt bij de SLCs gederiveerd door Panula et al. en Medrano et al. is dat bij deze cellen SCP3 geëlongeerd aankleurde t.h.v. de chromosomen, wat suggestief is voor crossing-over en recombinatie. [88,94] 5.4.4.7 Meiose van OLCs en FLSs grootste barrière We willen benadrukken dat deze studies met relatief succesvolle meiose, allemaal mannelijke SLCs deriveerden. De meiose van gederiveerde OLCs en FLSs vormt een grotere barriëre, dit kon men tevens waarnemen bij de muis. 5.4.5 Epigenetica De inprenting-status is de meest onderzochte epigenetische eigenschap van stamcelgederiveerde gameten. Net zoals de meiose vormt dit nog een hindernis voor de vorming van functionele en veilige gameten in vitro (zie Bijlage 9). Sommige PGCLCs vertonen namelijk geen inprenting-verwijdering of slechts een initiatie van dit proces. Op basis van epigenetische kwaliteit van de gederiveerde GLCs kunnen we (van ‘slecht’ naar ‘goed’) drie groepen onderscheiden. Ten slotte bespreken we kort de histonen-modifcatie bij PGCLCs. 5.4.5.1 PGCLCs: geen inprenting-verwijdering Verschillende studies observeerden dat de gederiveerde PGCLCs geen significante verwijdering van de inprenting-patronen vertoonden, wat betekent dat de inprentingverwijdering (nog) niet geïnitieerd werd. [87,88,96] Daarnaast konden West et al. geen globale demethylatie waarnemen bij de hESC-gederiveerde cellen, dit versterkt de immature epigenetische status van de PGCLCs. Deze afwijkingen werden mogelijks veroorzaakt door - 24 - een cultuur die de in vivo situatie niet correct zou nabootsen, b.v. door te hoge of te lage concentraties van groeifactoren. [87] Uit de resultaten van Park et al. (2009) bleek dat genen die reeds abnormaal gemethyleerd waren bij de pluripotente stamcellijnen (hypermethylatie van Peg1), eveneens een abnormale methylatie vertoonden bij de resulterende PGCLCs. De abnormale methylatie bij deze hEScellijnen werd hoogstwaarschijnlijk geïnduceerd door manipulatie tijdens de cultuur. Park et al. stelden de hypothese dat de epigenetische status van de ongedifferentieerde pluripotente cellen (onafhankelijk van de bron: hESCs of hiPSCs) bepalend is voor de capaciteit van de PGCLCs om deze inprenting-patronen te verwijderen. Daarom zou het belangrijk zijn om in toekomstige studies meer aandacht te hebben voor het bepalen van de epigenetische eigenschappen van de pluripotente cellen, vooraleer men PGCLCs differentieert. [96] 5.4.5.2 PGCLCs: initiatie inprenting-verwijdering In tegenstelling tot vorige resultaten kon door sommigen wel een correcte initiatie van het proces van inprenting-verwijdering waargenomen worden. De inprenting-genen H19 en Igf2r werden gedeeltelijk gedemethyleerd, maar niet volledig. [88,92,96] Dit betekent dat het inprenting-stadium van de PGCLCs overeenkwam met deze van PGCs. In latere stadia van de GC-ontwikkeling zal het echter noodzakelijk zijn dat alle inprenting-patronen volledig verwijderd worden. Medrano et al. bemerkten dat de overexpressie van VASA de verwijdering van inprenting induceerde. De spontane differentiatie, noch de overexpressie van DAZL, ondersteunden dit proces echter niet. [88] 5.4.5.3 SLCs: correct instellen van paternaal inprenting-patroon Twee studies waarbij een relatief succesvolle meiose geïnduceerd werd, konden een correct herinstellen van inprenting-patronen waarnemen. Bij Easley et al. was de methylatie van de genen H19 en Igf2 van de hESC-gederiveerde SLCs gelijkaardig aan de methylatie-gehaltes van humane spermatozoa. [73] Bij Eguizabal et al. waren vier van de zes pluripotente stamcellijnen competent om SLCs te deriveren met een juist paternaal inprenting-patroon van H19. Bovendien was het expressie niveau van 6 andere inprenting-genen gelijkaardig aan het niveau gezien bij mature spermatozoa. [100] 5.4.5.4 PGCLCs: correcte histonen-modificatie Histonen spelen een belangrijke rol bij de condensatie van DNA en posttranslationele modificaties van deze histonen (methylatie, acetylatie) resulteren in de epigenetische regulatie - 25 - van de expressie van genen. [101] Bepaalde modificaties zijn activerend (zoals H3K4 dimethylatie) en andere zorgen voor de onderdrukking van de expressie van genen (H3K9 dimethylatie, H3K27 trimethylatie). De histonen-modificaties geobserveerd bij PGCLCs in de experimenten van Tilgner et al. (2008) waren sterk gelijkend op deze van PGCs van de muis in vivo. [102] De PGCLCs vertoonden namelijk een stijging van activerende modificaties (H3K4 dimethylatie) en een daling van onderdrukkende modificaties (H3K9 dimethylatie, H3K27 trimethylatie) geassocieerd aan PGC-genen. [92] 5.4.6 Sertoli- en leydigcellen Aangezien de ontwikkeling van spermatozoa afhankelijk is van de ondersteuning en paracriene secretie van sertoli- en leydigcellen, [103] is het interessant om na te gaan of de functie van deze cellen kan teruggevonden worden in de cultuur tijdens GLC-derivatie. Er zijn 2 manieren om dit te evalueren: detectie van merkers of van hormonen. 5.4.6.1 Detectie van merkers Bucay et al. en Eguizabal et al. detecteerden in de cultuur mRNA-merkers die specifiek zijn voor sertoli-en leydigcellen. [55,100] Daarnaast kleurden Bucay et al. de EBs voor sertoligeassocieerde proteïne merkers (o.a. FSH-R). Een interessante oberservatie was dat de cellen die de hoogste concentratie van FSH-R vertoonden zich in de buurt of grenzend aan clusters van VASA-positieve cellen (PGCLCs) bevonden. [55] Uit deze bevindingen kan men de aanwezigheid van deze cellen vermoeden, maar dit geeft slechts beperkte informatie over hun functionaliteit. 5.4.6.2 Detectie van hormonen Een indirecte manier om sertoli- en leydigcellen aan te tonen is de bepaling van hormonen in de cultuur. Aflatoonian et al. (2009) detecteerden dihydrotestosterone (DHT) en oestradiol (E2). Testosteron (T) was niet aanwezig in de cultuur, maar mogelijks werd dit hormoon omgezet naar DHT en E2. Zowel DHT als E2 zijn cruciaal voor de spermatogenese. [104] De totale DHT secretie werd geschat op 5 ng/mg EB weefsel, wat vergelijkbaar is met concentraties gezien bij humane testes (13 ng/ml). [105] Het was echter onduidelijk of deze hormonen afkomstig waren van zich differentiërende testiculaire cellen in de EBs (zoals Leydig cellen) of incidenteel werden geproduceerd door niet-testiculaire cellen (zoals bijniercellen, hepatische cellen,...). [89] - 26 - 5.4.7 hESC- versus hiPSC-gerderiveerde GLCs Park et al. (2004) demonstreerden als eersten de derivatie van PGCLCs uit hiPSCs afkomstig van dermale fibroblasten. [96] Dit werd bevestigd door verschillende studies die tevens hiPSC-gederiveerde GLCs konden genereren. Humane iPS cellijnen hebben veel gelijkenissen met hESCs op vlak van morfologie, gen expressie en capaciteit om te differentiëren tot mesoderm, endoderm en ectoderm, zowel bij in vitro als in vivo teratoma assays. [106] Ondanks dat hiPSCs de criteria van pluripotente stamcellen vervullen, is het nog niet gekend of hiPSC en hESCs significant verschillend of gelijk zijn op klinisch vlak. [107] M.a.w. een belangrijke vraag is of hiPSCs een evenwaardig potentieel bezitten als hESCs om GLCs te deriveren. Hier bestaat onenigheid over: er zijn studies die een vermoeden hebben dat hESCs beter zijn, en andere die vermoeden dat hiPSCs een grotere GLC-potentie bezitten. 5.4.7.1 hESCs beter dan hiPSCs Park et al. (2009) vergeleken de derivatie van PGCLCs uit hESCs en hiPSCs. Het aantal gederiveerde PGCLCs was vergelijkbaar tussen beide types cellijnen. Bij de hiPSCgederiveerde PGCLCs kon men echter een minder goede inprenting-verwijdering waarnemen: slechts 1 gen vertoonde initiatie van inprenting-verwijdering versus 2 genen bij hESCs. [96] Easley et al. ondervonden dat het aantal PGCLCs licht hoger was wanneer deze gederiveerd werden uit hESCs vergeleken met derivatie uit hiPSCs. Het aantal haploïde cellen was echter vergelijkbaar tusse beide cellijnen (4.5% en 3.9% respectievelijk). De hiPSC-gederiveerde SLCs vertoonden eveneens een iets minder goede inprenting-regulatie vergeleken met hESCgederiveerde SLCs. [73] Samenvattend kan men stellen dat de efficiëntie voor de derivatie van GLCs min of meer evenwaardig was tussen hESCs en hiPSCs, maar dat de hiPSC-gederiveerde GLCs een groter risico op epigenetische afwijkingen vertoonden. Volgens Park et al. zou dit mogelijks veroorzaakt kunnen zijn door een onvoldoende de-differentiëren van de hiPSCs wanneer deze gegenereerd werden. [96] 5.4.7.2 hiPSCs beter dan hESCs Panula et al. (2011) ondervonden dat het percentage van PGCLCs dubbel zo hoog was bij de cultuur van hiPSCs (5.27%) vergeleken met de cultuur van hESCs (2.39%). [94] Na overexpressie van de DAZ-familie genen bij zowel de hESCs en hiPSCs kon men observeren dat de meiose in dezelfde mate gevorderd was bij de verschillende cellijnen. - 27 - Dit laatste was echter niet het geval bij de studie van Eguizabal et al. (2011). Zowel de hESCs- als de hiPSCs-gederiveerde SLCs konden de meiose initieren, maar uitsluitend de hiPSCs-gederiveerde SLCs waren instaat om de meiose te vervolledigen en haploïde cellen te genereren. [100] De resultaten van Panula et al. en Eguizabal et al. suggereren dat hiPSC beter waren voor de derivatie van GLCs omdat deze een betere PGCLC-inductie en meiose vertoonden vergeleken met hESCs. Hiervoor gaven Eguizabal et al. een aantal mogelijke verklaringen. Ten eerste zou de licht verschillende epigenetische status tussen hiPSCs en hESCs een verklaring kunnen zijn. Een andere reden zou een predisponerend epigenetisch geheugen kunnen zijn afhankelijk van de originele somatische bron. Eguizabal et al. onderzochten deze hypothese, maar ondervonden dat hiPS-cellijnen van verschillende somatische bronnen een evenwaardig potentieel hadden om te differentiëren tot haploïde cellen in vitro. Ten slotte zou de reactivatie van het transgen Oct4 (een pluripotentie-gen betrokken bij de vroege ontwikkeling van PGCs) een rol kunnen spelen in dit fenomeen. In de studie van Eguizabal et al. was Oct4 slechts licht gereactiveerd bij 3 van de 8 onderzochte cellijnen, waardoor dit waarschijnlijk minder relevant is als verklaring. [100] - 28 - 5.5 ETHISCHE EN SOCIALE ASPECTEN De potentiële introductie van de humane toepassing van PSCDGs (Pluripotent Stem Cell Derived Gametes) roept heel wat ethische vragen op. Het is belangrijk een onderscheid te maken tussen wat technisch mogelijk is of zou zijn in de toekomst en wat sociaal (on)gewenst of ethisch (on)verantwoord zou zijn. Problemen rond technische kwesties en veiligheid hebben het potentieel om opgelost te worden in de toekomst door bijkomend wetenschappelijk onderzoek en ontwikkelingen, maar de morele overwegingen zouden mogelijks de focus kunnen blijven van het maatschappelijke debat. Dit wijst op de noodzaak van publieke discussie en betrokkenheid van zowel wetenschappers, het publiek als beleidsmakers. [15,108,109] 5.5.1 Natuurlijk versus synthetisch Eén van de ethische bezwaren rond PSCDGs is dat het de menselijke waardigheid en de betekenis van wat menselijk is zou kunnen ondermijnen, omdat reproductie met PSCDGs niet 'natuurlijk' is. Dit argument kan ook gebruikt worden bij IVF, maar het proces van IVF kan als natuurlijker beschouwd worden dan de toepassing van PSCDGs. [110] Volgens Testa et al. (2005) is de redenering dat de natuurlijke reproductie superieur is aan artificiële methodes van reproductie niet ethisch gefundeerd is. Bij de introductie van IVF werd er gesuggereerd dat ‘reageerbuis’ baby’s geen ziel zouden hebben. Kinderen geboren m.b.v. geassisteerde reproductie zijn echter genetisch hetzelfde en hebben dezelfde morele status als kinderen geboren via natuurlijke voortplanting. De natuurlijke reproductie zou misschien aangenamer kunnen zijn dan synthetische reproductie, of goedkoper, veiliger, meer privé,.. dit zijn redenen om het te verkiezen. Maar het is niet gegrond om een natuurlijk proces te verkiezen gewoon omdat het natuurlijk is. Het natuurlijke per se is moreel neutraal, alhoewel er mensen zijn die natuurlijk gezond en gelukkig zijn, is het even natuurlijk om ongezond en ongelukkig te zijn. Bovendien kan het natuurlijke zelfs heel schadelijk zijn: ziektes, mutaties, overstromingen, orkanen, brand, aardverschuivingen,… Als we altijd het natuurlijke zouden verkiezen, dan zouden we de volledige toepassing van de geneeskunde, waaronder vaccinaties en antibiotica, moeten afzweren, aangezien men de geneeskunde als een poging zou kunnen zien om de loop van de natuur te dwarsbomen. [111] - 29 - 5.5.2 Genetisch ouderschap Het meest geciteerde voordeel van de klinische applicatie van PSCDGs is dat ze onvruchtbare mensen kunnen helpen om een kind te krijgen dat genetisch verwant is. Een voordeel die ook van toepassing was bij de ontwikkeling van andere ARTs zoals ICSI. De waarde van genetisch ouderschap werd als vanzelfsprekend beschouwd in de wereld van medisch geassisteerde voortplanting. [112] Mertes & Pennings (2010) stelden deze waarde in vraag door ze te evalueren op basis van 2 verschillende theorieën: welzijn veroorzaakt door een positieve bewuste ervaring of welzijn veroorzaakt door een wens die vervuld wordt. Vanuit deze eerste theorie bestaat er geen verschil tussen een vader die geniet van de effectieve genetische relatie met zijn kind en een vader die geniet van de relatie met een kind waarvan hij foutief gelooft dat het zijn kind is. Miljoenen mannen hebben kinderen opgevoed waarvan ze foutief overtuigd waren dat het hun genetische nakomelingen waren, terwijl ze het zelfs niet eens merkten dat het hun eigen genetisch kind niet was. Een genetische relatie op zichzelf leidt niet tot een andere bewuste ervaring voor de ouders en kinderen. [113] Volgens de tweede theorie betekent dit echter dat deze mannen werden aangetast, aangezien hun wens niet werd gerealiseerd. Mensen willen niet gelukkig zijn omdat ze (al dan niet foutief) geloven dat hun kinderen genetisch verwant zijn, maar ze willen gelukkig zijn omdat ze effectief genetisch verwante kinderen hebben. Ondanks dat het welzijn van mensen kan vergroot worden als we hun wens naar genetisch verwante kinderen invullen, kunnen deze theorieën niet verklaren of het rationeel is om deze wens te hebben. [113] De therapiekeuzes die onvruchtbare patiënten maken tonen echter aan dat de voorkeur voor genetisch verwante kinderen wijdverspreid is. Sommige koppels verkiezen b.v. een gekende donor boven een een anonieme donor, uit ‘schrik voor genetisch materiaal van ongekende oorsprong’ (56%) en ‘de genetische link tussen de donor en hunzelf’ (33%). [112,114] Dit kan o.a. verklaard worden omdat koppels verwachten dat gedeeld genetisch ouderschap bewijs geeft aan hun relatie en resulteert in gedeelde verantwoordelijkheid. Bovendien kan men schrik hebben dat contact tussen het kind en de donor een bedreiging zou zijn voor de familie. [112,115] 5.5.3 Veiligheid Het wordt algemeen aangenomen dat de psychologische en fysieke gezondheid van de kinderen resulterend uit ART primair belang heeft. ART beoefenaars en patiënten beweren hier grote waarde aan te hechten, maar dit strookt meestal niet met de realiteit. Sinds decennia - 30 - worden er hoge risico’s genomen door meerdere embryo’s terug te plaatsen bij IVF. De complicaties van een meerlingzwangerschap worden gerechtvaardigd door een hogere slaagkans. Meerlinggeboortes zouden nooit getolereerd worden als het welzijn van het kind werkelijk de voornaamste zorg zou zijn. [116] Als we een nieuwe ART techniek willen toepassen is het belangrijk verschillende criteria te overwegen. Er moet o.a. een afweging gemaakt worden tussen de wens van de ouders om een genetisch verwant kind te hebben en de levenskwaliteit van het kind. De potentiële toepassing van stamcel-gederiveerde gameten zou waarschijnlijk grote risico’s met zich meedragen voor de mogelijke nakomelingen. Hierbij moeten we ons de vraag stellen wat de drempel is van aanvaardbaarheid van deze risico’s. [113] Er zijn verschillende benaderingen mogelijk om deze drempel van aanvaardbaarheid te bepalen. [113] Een eerste benadering gebruikt de natuurlijke reproductie als referentiepunt, waarbij men alle reproductieve methodes met een gelijkaardig of minder aantal risico’s aanvaardt. Eén van de belangrijkste bezwaren tegen het reproductief klonen van een mens was dat bv. in het geval van het schaap Dolly slechts één kloon succesvol geproduceerd werd na 277 pogingen, wat betekent dat dit een inefficiënt proces is en leidt tot een grote verspilling van embryo’s. Maar volgens Testa et al. (2005) kan de verspilling van embryo’s per se geen bezwaar zijn voor reproductief klonen als men de natuurlijke reproductie accepteert. Want ongeveer 80% van de embryo’s sterven af bij natuurlijke voortplanting. Natuurlijke reproductie is niet alleen inefficiënt, het is tevens onveilig: ongeveer 3-5% van de baby’s worden geboren met een abnormaliteit en bovendien is de zwangerschap en bevalling onveilig voor de moeder. [111] Mertes & Pennings (2010) stellen zich echter een aantal vragen bij het aannemen van natuurlijke reproductie als referentie. Waarom zouden we natuurlijke voortplanting als de standaard stellen? En wat betekent ‘gelijkaardig’? Ondanks dat ICSI een hoger risico op malformaties van de nakomelingen met zich meedraagt, kiest de meerderheid van de ouders toch voor deze techniek. Dus als 7% geaccepteerd wordt, is 10% dan ook ‘gelijkaardig’? En wat zou er gebeuren als er eenvoudige manieren (zoals bv. een goedkoop en non-invasief screening programma om de meeste malformaties te detecteren) zouden bestaan om de risico’s van 3-5% malformaties te verminderen? Dan zouden we anders kijken naar ouders die het zogenaamde ‘natuurlijke risico’ zouden nemen als referentie. [113] Een tweede benadering om de drempel van aanvaardbaarheid van de potentiële risico’s voor de kinderen resulterend uit PSCDGs te bepalen, probeert een standaard op te stellen om het - 31 - welzijn van het kind te evalueren. Wanneer men wil bepalen of een kind resulterend uit een infertiliteitsbehandeling benadeeld wordt omdat het gecreëerd werd, kan men zich baseren op 3 verschillende principes: het ‘maximale welzijn’, de ‘minimumdrempel’ en het ‘redelijke welzijn’. [117] Het principe van ‘maximale welzijn’ stelt dat een kind niet gecreëerd zou mogen worden in minder dan ideale omstandigheden. Als deze standaard conservatief opgevat wordt kan kritiek gegeven worden op verschillende toepassingen van ART, [117] stamcel-gederiveerde gameten en de hiermee gepaarde risico’s zouden waarschijnlijk niet voldoen aan deze veeleisende standaard. We kunnen het ‘maximale welzijn’ principe ook milder interpreteren: als een bepaalde optie leidt tot een hogere kans op een gelukkiger kind vergeleken met andere opties, dan heeft deze eerste optie de voorkeur. Mertes & Pennings (2010) stellen dat ouders zouden moeten kiezen tussen een kind dat genetisch niet verwant maar gezond is of een genetisch verwant kind met een groot risico om een genetische ziekte te hebben. Het referentiepunt om het risico te evalueren voor een kind gecreëerd met PSCDGs is niet ‘geen kind’ maar een kind gecreëerd met gedoneerde gameten. [113] Het principe van de ‘minimumdrempel’ is veel minder streng dan deze van het ‘maximale welzijn’: voortplanting zou enkel afgekeurd worden als het welzijn van het potentiële kind zeer laag is, m.a.w. onder een minimumdrempel ligt. De meest gebruikte minimumdrempel is deze van het ‘onrechtmatige leven’: een kind zou niet gecreëerd mogen worden als en slechts als het beter zou zijn om nooit geboren te worden. [118] M.a.w. stamcel-gederiveerde gameten zouden enkel veroordeeld kunnen worden als het resulterende kind een leven zou hebben dat niet de moeite waard zou zijn om te leven, want het alternatief zou zijn dat het kind nooit zou bestaan zonder de medische interventie. [119] Pennings (1999) stelt echter dat dit een extreem lage drempel is, die beter niet toegepast zou worden voor de morele beoordeling van voortplanting, maar wel als referentie zou kunnen dienen voor het opstellen van wettelijke bepalingen. [117] Ten slotte is het ‘redelijke welzijn’ een intermediaire standaard die stamcel-gederiveerde gameten zou accepteren als het resulteert in de geboorte van een redelijk gelukkig kind. [113,117] Het is echter moeilijk om een omvattende beschrijving te geven van geluk of welzijn. Pennings (1999) suggereert dat een individu een behoorlijk welzijn heeft als hij de mogelijkheden bezit om doelstellingen te bereiken die in het algemeen een mensenleven waardevol maken. [117] - 32 - 5.5.4 Psychologische consequenties voor het kind Een bezwaar tegen het gebruik van PSCDGs is dat het een psychologische last zou kunnen zijn voor de kinderen als ze te weten komen dat ze op een artificiële manier gecreëerd werden. [120] Studies tonen echter aan dat het psychologisch welzijn van kinderen gecreëerd m.b.v. IVF en donor inseminatie gelijkaardig is aan deze van kinderen die met natuurlijke reproductie geboren werden. [110] Daarnaast bestaat er een bijkomend probleem bij hESCgederiveerde gameten, aangezien het gekloond embryo van de patiënt strikt genomen als de 'ouder' van het resulterende kind zou kunnen beschouwd worden. Dit zou psychologische gevolgen kunnen hebben voor een kind, wetende dat zijn/haar ouder nooit geleefd heeft en vernietigd werd in het proces van zijn/haar eigen creatie. [120] De vraag kan hierbij gesteld worden óf kinderen wel geïnformeerd moeten worden over de manier waarop ze gecreëerd werden met PSCDGs. Mertes & Pennings suggereren dat er geen rechten van het kind geschonden wordt als men het kind niets vertelt. Hoewel er geen plicht bestaat om het kind te informeren, zou het geen kwaad kunnen, aangezien ze de kans op nadelige psychologische gevolgen klein inschatten. [113] Uiteraard moet het kind wel geïnformeerd worden wanneer het betrokken is bij een lange termijn follow-up studie. [121] Men kan tevens bezwaar hebben tegen de toepassing van PSCDGs uit angst dat nieuwe vormen van ouderschap, afwijkend van de klassieke familie structuur, psychologische schade zou kunnen veroorzaken bij het kind (zoals b.v. homoseksuele koppels), deze stelling is controversieel en vatbaar voor interpretatie (zie 5.6.3). Bovendien tonen studies bij kinderen afkomstig van reeds bestaande ARTs aan dat deze vrees waarschijnlijk onterecht is. [120,122] Master (2006) speculeert dat de psychologische ontwikkeling van een kind afkomstig van PSCDGs afhankelijk zal zijn van een aantal factoren, zoals de liefdevolle zorg door de ouders en socio-economische factoren, en niet zal afhangen van de manier waarop ze gecreëerd werden. [123] 5.5.5 Informed consent Het toepassing van hESC-gederiveerde gameten roept vragen op over het verkrijgen van informed consent voor hun gebruik. Strikt genomen zijn deze gameten geproduceerd door het gekloond embryo. Als het embryo beschouwd wordt als een uniek wezen, zou het embryo zijn informed consent moeten geven om 'zijn' gameten te mogen gebruiken. [110] Maar een embryo heeft uiteraard niet de capaciteit om dit te doen, een gelijkaardig probleem stelt zich bij het gebruik van oöcyten afkomstig van geaborteerde foetussen. De beste oplossing lijkt - 33 - dan om beslissingsbevoegdheid te geven aan de patiënt die de nucleus biedt (waarvan het embryo gemaakt is). [113] Dit is echter niet altijd mogelijk, b.v. bij foetussen, minderjarigen en overleden personen (zie 5.6.3). Mathews et al. wijzen op het belang van een geldig informed consent, daarom zou men geen gameten mogen deriveren in voorgenoemde situaties. Een uitzondering op deze vereiste informed consent zou zijn als de PSCDGs enkel gebruikt worden voor in vitro onderzoek. [108] Een heel ander probleem met informed consent is deze van diefstal van gameten en onvrijwillig ouderschap. Het is veel gemakkelijker om zonder toestemming biologisch materiaal zoals huidcellen te verkrijgen van iemand anders dan toegang tot de gameten van een persoon. Dit betekent dat de derivatie van PSCDGs en genetische reproductie mogelijk zouden zijn zonder dat de 'genetische ouder' hiervan op de hoogte is. Men kan financiële motieven hebben om kinderen te hebben die genetisch verwant zijn aan heel rijke en/of invloedrijke mensen. Vrouwen zouden b.v. kunnen bewijzen dat de paus of de president de vader is van hun kinderen. Dit betekent dat het niet voldoende zou zijn om ouderlijke verantwoorderlijkheid (zowel legaal, financieel als sociaal) enkel te baseren o.b.v. genetische testen. Smajdor & Cutas argumenteren dat genetische relaties overgewaardeerd worden en suggereren dat het eventueel beter zou zijn als de intentie tot voortplanting meer wettelijke waarde zou hebben dan de genetische link. [120] 5.5.6 Destructie van embryo’s en vergelijking ESCs vs iPSCs Iedere techniek die gebruik maakt van SCNT heeft als gevolg dat een embryo vernietigd wordt. Dit vormt ethisch een groot probleem voor diegenen die een intrinsieke waarde hechten aan een embryo, voor hun zullen ntESC-gederiveerde gameten niet aanvaardbaar zijn. [124] Wanneer iPSCs geïntroduceerd werden in de wetenschappelijke wereld had men hier vanuit ethisch standpunt een sterke voorkeur voor omdat geredeneerd werd dat bij de derivatie van iPSCs geen embryo’s worden vernietigd. Maar in 2009 slaagde men erin om volwassen muizen te genereren van iPSCs m.b.v. de techniek tetraploïde complementatie. [125,126] Waardoor zowel hESCs als hiPSCs als potentiële humane wezens kunnen aanzien worden, wat betekent dat er weinig verschil is tussen beiden op vlak van morele waarde. Devolder argumenteert bovendien dat het ‘potentie’ argument zwak is. Het is niet omdat iets de potentie heeft om iets anders te worden, dat we het al moeten beschouwen alsof het deze potentie reeds gerealiseerd heeft. Alle mensen delen een onverbiddelijke potentie: we zijn allemaal - 34 - potentieel dood. Maar dat betekent niet dat we behandeld moeten worden alsof we reeds dood zijn. [127] Het gebruik van embryo’s met als doel gameten te creëren verschilt licht met het standaard gebruik van embryo’s voor onderzoek. Deze embryo’s werden namelijk gecreëerd voor reproductie, maar pas na hun transformatie in stamcellen en gameten. Embryo’s met reproductieve doeleinden worden als ethisch meer aanvaardbaar beschouwd dan embryo’s met andere onderzoeksredenen. [113,127] Ondanks dat hiPSCs en hESCs dezelfde morele waarde hebben, zijn gameten gederiveerd uit iPSCs ethisch te verkiezen boven hESCs. Aangezien hESCs-gederiveerde gameten een aantal extra ethische problemen vormen omtrent psychologische gevolgen voor het kind en informed consent (zie hierboven). [113] 5.5.7 Humane experimenten met PSCDGs Indien men PSCDGs zou willen toepassen in de kliniek dan is het belangrijk om zeker te zijn dat de techniek veilig is voor het welzijn van het resulterende kind (afhankelijk van wat men als ‘veilig’ beschouwd, zie 5.5.3). Experimenten op dieren kunnen een idee geven over de veiligheid. Maar aangezien deze resultaten niet volledig kunnen vertaald worden naar de mens, zou men uiteindelijk genoodzaakt zijn om experimenten uit te voeren op de mens, in eerste instantie door pre-klinisch onderzoek te doen met PSCDGs-gederiveerde humane embryo's. Dit betekent echter dat men embryo’s zou moeten creëren en vernietigen voor onderzoek, dit is ethisch controversieel en verboden in verschillende landen. [113,119,128] Voor velen zijn gecreëerde embryo's specifiek voor onderzoek onrespectvol en veel problematischer dan het gebruik van overtollige embryo's na succesvolle IVF-behandeling (men vindt o.a. dat deze overtollige embryo's anders verspild zouden zijn). Devolder argumenteert dat er echter geen moreel onderscheid bestaat tussen gecreëerde en overtollige embryo's. Ze worden namelijk allebei geïnstrumentaliseerd. Bovendien hebben ze beiden het potentieel om te ontwikkelen tot een mens. Dus als men de creatie van overtollige embryo's bij een IVF behandeling en onderzoek op deze overtollige embryo's toestaat, is het niet logisch om bezwaar te hebben tegen het creëren van embryo's voor onderzoek, onafhankelijk van de waarde die men hecht aan een embryo. [127] Als de doelstellingen hoog gewaardeerd worden door de maatschappij dan zou het dus gerechtvaardigd zijn om embryo's te creëren voor onderzoek. - 35 - Daarnaast kan men de bedenking maken dat het verbod op de creatie van embryo's voor onderzoek zou kunnen leiden tot een verlies aan pre-klinisch veiligheidsonderzoek, waardoor kinderen blootgesteld worden aan onnodige risico's. [129] Het antwoord van de tegenstanders is heel eenvoudig: pas deze nieuwe techniek niet toe. [113] Er zijn 15 landen waar de creatie van embryo’s voor onderzoek onder bepaalde omstandigheden en criteria wel is toegelaten, waaronder België. De cultuur van het gecreëerde embryo is wettelijk beperkt tot 14 dagen of tot de vorming van de primitieve streep (wat de start van een uniek humaan wezen zou betekenen) . [128] Pas als intensief en voldoende pre-klinisch onderzoek is uitgevoerd waaruit blijkt dat de PSCDGs hoogstwaarschijnlijk veilig zijn, zou men eventueel mogen overgaan naar de volgende stap: de klinische toepassing bij de mens. Het is belangrijk dat deze introductie uitgevoerd wordt m.b.v. een heel strikt uitgevoerde en goed ontworpen RCT. Aangezien men complicaties en problemen kan verwachten, is een continue evaluatie noodzakelijk, eveneens lange termijn follow-up (zelfs transgenerationeel), met informed consent van zowel ouders als het kind (vanaf deze bekwaam is). [113,121] De reproductieve geneeskunde is berucht voor haar (te) snelle implementatie en wereldwijde verspreiding van innovatieve technieken, zonder voldoende evaluatie van de effectiviteit, veiligheid en sociale en economische gevolgen. [112] Het aanbod door wetenschappelijk onderzoek en de vraag van ART beoefenaars die de laatste technieken willen bieden en de patiënten die hun eigen genetisch verwant kind willen is moeilijk te weerstaan. [113,121] Daarom is het aangeraden dat de klinische studies uitgevoerd zouden worden door een onafhankelijk onderzoeksteam die niet betrokken zijn bij infertiliteitsbehandelingen. [130] Mertes & Pennings zeggen zelfs dat regulatie, controle en toezicht door een onafhankelijk instituut noodzakelijk zou zijn om te verzekeren dat veiligheid centraal blijft staan. [113] Bij iedere stap naar de klinische toepassing van PSCDGs bij de mens worden we geconfronteerd met onzekerheid. Palacios-González et al. relativeren dat onzekerheid eigen is aan innovatieve technieken die voor het eerst worden uitgetest bij de mens. Als onpraktisch hoge voorzorgsmaatregelen bepalend zouden zijn dan zou men geen vaccinaties, IVF of andere ontwikkelingen hebben. Niets is volledig veilig, we moeten beslissen wat 'veilig genoeg' is (zie 5.5.3). [119] - 36 - 5.5.8 Financiering van PSCDGs en invloed op (on)gelijkheid De toepassing van PSCDGs zal hoogstwaarschijnlijk een hoogtechnologische en arbeidsintensieve procedure met een hoge kostprijs zijn, en dit zal waarschijnlijk niet snel veranderen. [131] Alhoewel men dit zou kunnen relativeren als men kijkt naar andere technologische ontwikkelingen in de gezondheidszorg: de prijs om de sequentie van het humaan genoom te bepalen is gekelderd van ongeveer US$10 million naar enkele duizend dollar in slechts zes jaar tijd. [132] Men moet als maatschappij beslissen óf en hoeveel men wil investeren in de ontwikkeling en toepassing van PSCDGs. Wanneer er slechts een beperkt financieel budget is, is men genoodzaakt om prioriteiten te stellen. M.a.w. de voordelen van PSCDGs moeten afgewogen worden tegenover de mogelijke investering in andere belangrijke(re) gezondheidsnoden. Hierbij speelt het belang van het genetische ouderschap een centrale rol. In het bijzonder wanneer goedkopere en technisch eenvoudigere alternatieven bestaan die resulteren in een kind dat niet genetisch verwant is. [112,113] Dit sociaal debat is afhankelijk van culturele waarden, lokale religie en rijkdom van een land (b.v. Saoedi-Arabië). [112] Daarnaast is het belangrijk om de lokale schaarste van donor gameten (vnl. van oöcyten) in rekening te brengen, in Spanje is er b.v. voldoende aanbod van gedoneerde gameten voor reproductie. [131] Palacios-González et al. stellen dat de ontwikkeling van PSCDGs zou kunnen helpen bij de democratisering van de reproductieve gezondheidszorg. [119] Maar het zou ook een tegengesteld effect kunnen veroorzaken en net meer ongelijkheid creëren. Wie zal toegang krijgen tot deze nieuwe vruchtbaarheidsbehandeling? Een vraag die reeds een probleem vormde bij de terugbetalingsregulatie van IVF en andere ARTs, maar nu nog veel meer onder druk zou kunnen staan. Men zou b.v. kunnen opteren dat homoseksuele koppels geen toegang krijgen tot de behandeling met PSCDGs, wat sociale ongelijkheid en conflict zou kunnen versterken. Of men zou kunnen kiezen om helemaal niemand een behandeling met PSCDGs terug te betalen. Hierdoor zou de mogelijkheid van PSCDGs beperkt zijn tot een heel kleine groep van patiënten die het zich financieel kan veroorloven. Waardoor de reeds bestaande financiële ongelijkheid in de gezondheidszorg nog groter zou kunnen worden. [131] - 37 - 5.5.9 Valse hoop en sociale druk De berichtgeving in de media over de vooruitgang van het onderzoek rond PSCDGs is vaak onrealistisch of te optimistisch. Met b.v. boodschappen dat 'het einde van de onvruchtbaarheid' nabij is. [133] Deze kunnen echter valse hoop en verwachtingen creëren bij potentiële gebruikers. Daarom is het belangrijk dat wetenschappers verantwoordelijk en voorzichtig zijn met de informatie die naar de buitenwereld wordt gecommuniceerd. [131] Daarnaast zou de introductie van PSCDGs en de verkeerde perceptie van 'het einde van de onvruchtbaarheid' de sociale druk kunnen verhogen om tot het extreme te gaan om ouders te worden die een genetische link hebben met hun kind: als je een kind wilt, moet je koste wat het kost alles proberen. [131] - 38 - 5.6 TOEPASSINGEN PSCDGs hebben nu reeds hun nut in wetenschappelijk onderzoek bewezen en zullen in de toekomst tevens van groot belang zijn. Het is momenteel nog onduidelijk of de medische toepassing van PSCDGs voor de behandeling van onvruchtbare mensen ooit werkelijkheid zal zijn. Daarnaast bespreken we tevens de gevolgen van PSCDGs op nieuwe vormen van ouderschap. 5.6.1 PSCDGs voor wetenschappelijk onderzoek Er zijn veel redenen waarom PSCDGs interessant zouden zijn voor wetenschappelijk onderzoek naar de biologie van de humane gametogenese en de pathologie van infertiliteit. Momenteel wordt dit onderzoek voornamelijk uitgevoerd bij de muis. Alhoewel er veel gametogenese-processen geconserveerd zijn onder zoogdieren, bestaan er ook belangrijke verschillen die de translatie van kennis verworven bij de muis naar de mens belemmeren. [134,135] Het is mogelijk om onderzoek uit te voeren op humane foetale oöcyten van geaborteerde foetussen, oöcyten gedoneerd voor onderzoek door vrouwen na een IVF behandeling of van ovaria verwijderd tijdens hysterectomie. Het aantal oöcyten dat op deze manier verkregen kan worden is beperkt, en iedere oöcyt zal afkomstig zijn van een ander individu, waardoor het moeilijk is om vergelijkingen te maken tussen experimenten. Voor bepaalde onderzoeken is een groot aantal oöcyten echter noodzakelijk: bv. het bepalen van hot spots bij recombinatie of om het effect van chemische en toxische stoffen op non-disjunctie te screenen, enz. PSCDGs zouden mogelijks een oplossing bieden om grote hoeveelheden van verschillende stadia van de gametogenese te verkrijgen. Onderzoek van PSCDGs van onvruchtbare patiënten zou de pathogenese van bepaalde vormen van infertiliteit eventueel kunnen ontrafelen. Samengenomen zouden deze nieuwe inzichten verworven met PSCDGs potentieel kunnen helpen bij de ontwikkeling van nieuwe manieren voor de preventie en behandeling van infertiliteit, genetische ziektes en sommige kankers, waaronder kiemceltumoren. [108,136,140] Als illustratie van het wetenschappelijk potentieel van PSCDGs vergeleken Dominguez et al. (2014) PSCDGs afkomstig van patiënten met het Turner syndroom met PSCDGs van controle individuen. De resultaten suggereerden dat twee intacte X-chromosomen niet noodzakelijk - 39 - zijn voor de vorming van humane gameten, maar eerder nodig zijn voor het behoud van humane gameten tot de volwassenheid. [137] Ten slotte zouden PSCDGs tevens een nut kunnen hebben in het algemeen stamcelonderzoek. Het onderzoek met PSCDGs zou tot nieuwe inzichten kunnen leiden over stamcellen. Bovendien zouden stamcel-gederiveerde oöcyten het groot gebrek aan oöcyten kunnen opvullen die nodig zijn voor SCNT. Op voorwaarde dat deze gederiveerde oöcyten even efficiënt zijn als natuurlijke oöcyten voor deze techniek. [140] 5.6.2 Klinische toepassingen van PSCDGs Als PSCDGs ooit veilig gebruikt zouden kunnen worden voor reproductieve doelen zou een grote en diverse groep van onvruchtbare patiënten, die momenteel niet geholpen kan worden met de bestaande ARTs, de mogelijkheid krijgen om een genetisch verwant kind te krijgen. PSCDGs zouden een oplossing kunnen bieden wanneer de infertiliteit veroorzaakt is door o.a. prematuur ovarieel falen (POF), slechte kwaliteit van de oöcyt bij de vrouw of nietobstructieve azoöspermie bij de man. 5.6.2.1 Bieden PSCDGs een oplossing voor al deze patiënten? Bij een groot deel van de patiënten die niet kunnen geholpen worden met de bestaande ARTs zouden PSCDGs waarschijnlijk een oplossing kunnen bieden. Bij patiënten met een genetische oorzaak is de situatie echter complexer. Stel dat het genetisch defect ook aanwezig is t.h.v. andere lichaamscellen zoals huidcellen dan zou de vorming van PSCDGs vermoedelijk problematisch zijn. Tenzij men germline genetische modificatie toepast (zie 5.6.3 – 10). [108] 5.6.2.2 Fertiliteitspreservatie PSCDGs bieden een nieuwe manier van fertiliteitspreservatie voor kinderen die chemotherapie moeten ondergaan voor een maligniteit of voor vrouwen die een zwangerschap willen uitstellen tot een latere leeftijd. PSCDGs zouden een voordeel betekenen t.o.v. bestaande methodes van fertiliteitspreservatie: vrouwen zouden waarschijnlijk geen chirurgie voor ovarieel weefsel of een hormonale stimulatie voor oöcyten moeten ondergaan. Bovendien zou men PSCDGs pas deriveren als ze werkelijk nodig zijn, terwijl men bij de bestaande methodes soms jaren op voorhand een beslissing moet maken. Hierdoor zouden onnodige interventies op vrouwen, omdat ze b.v. op tijd een partner hebben gevonden, kunnen vermeden worden. [113] - 40 - 5.6.3 Nieuwe vormen van ouderschap Men zou PSCDGs in een veel ruimer toepassingsspectrum kunnen plaatsen dan de relatief nauwe medische indicaties hierboven beschreven. De mogelijkheid om patiënt-specifieke PSCDGs te genereren suggereert dat mensen die medisch niet per se beschouwd worden als onvruchtbaar, maar door hun context belemmerd worden in hun voortplanting (zoals homokoppels, postmenopauzale vrouwen, alleenstaande vrouwen,…) genetisch verwante kinderen zouden kunnen krijgen. Deze nieuwe vormen van ouderschap zijn voorlopig hypothetisch, maar zouden wel een revolutie kunnen betekenen binnen de reproductieve geneeskunde. Sommige van deze potentiële toepassingen vormen technisch een grote uitdaging, bij andere zijn er al dan niet sterke sociale of ethische bezwaren. Een argument dat het gebruik van al deze ‘nieuwe’ toepassingen afkeurt is dat dokters zich zouden moeten beperken tot het genezen van ziektes i.p.v. het heruitvinden van de natuur. Reproductie m.b.v. PSCDGs zou dan enkel beschikbaar mogen zijn voor diegenen die worden geconfronteerd met ‘authentieke infertiliteit’. [131] 1. Een eerste toepassing van PSCDGs heeft betrekking op stamcellijnen. Een individu of een koppel zou de voorkeur kunnen geven om PSCDGs te genereren uit een welbepaalde, bestaande stamcellijn, i.p.v. een individu, op basis van de genetische superioriteit. Er zijn echter meerdere wetenschappelijke en ethische redenen om dergelijk gebruik af te raden. De verlengde cultuur kan een groter risico op DNA schade vormen. Bovendien kan het herhaaldelijk gebruik van een beperkt aantal cellijnen voor reproductie, evenals bij te frequente spermadonaties, mogelijks problematisch zijn voor het risico op ongewilde inteelt tussen nakomelingen. [119,128] 2 Een tweede groep betreft embryo’s, foetussen en kinderen (dit wordt louter beschouwd als een academische hypothese). Een mogelijk argument tegen de reproductie met PSCDGs gecreëerd uit deze groep is de schending van hun reproductieve autonomie, gezien hun onvermogen om te beslissen over óf en hoe ze een genetisch ouder zouden willen worden. [119] 3. Een derde groep betreft overleden individuen, m.a.w. postume conceptie. [119,128] Conceptie van een kind met behulp van sperma-cryopreservatie van een overleden man wordt over het algemeen als ethisch verantwoord beschouwd wanneer de overleden man zijn ‘informed consent’ heeft gegeven. [138,139] Maar PSCDGs zouden vermoedelijk eerder hun - 41 - toepassing vinden wanneer een individu reeds gestorven is en ‘informed consent’ niet meer mogelijk is, waardoor de autonomie van de overleden persoon in het gedrang komt. Tremellen et al. argumenteren echter dat het welzijn van de levenden (de weduwe en het toekomstige kind) de primaire focus zou moeten zijn. [138] 4. Een vierde groep betreft alleenstaande individuen die een kind willen waarvan ze de enige genetische ouder zijn (dus zonder partner of gedoneerde gameten). Het gecreëerde kind zou geen kloon zijn van zijn ouder zoals bij reproductief klonen, aangezien de meiose zorgt voor de herschikking van genetische informatie. [140] Dit scenario verhoogt echter het risico dat schadelijke heterozygote mutaties homozygoot kunnen worden bij de nakomelingen, dit zou zelfs meer risicovol zijn dan bij inteelt tussen broers en zussen. [119] 5. De vijfde groep betreft postmenopauzale vrouwen, [140] een groep die steeds belangrijker wordt aangezien er een trend bestaat om de zwangerschap uit te stellen in de westerse wereld. Vrouwen ouder dan 45 jaar hebben een zeer kleine kans om zwanger te worden, mogelijks bieden PSCDGs hier een oplossing. Het zou echter kunnen dat een adulte cel van een oudere vrouw reeds aanzienlijke DNA schade heeft opgelopen, waardoor de kwaliteit van de PSCDGs slecht zou zijn met nadelige gevolgen voor het kind. [113] Vanuit een ethisch standpunt redeneerden Palacios-González et al. (2014) dat als postmenopauzale zwangerschappen met gedoneerde gameten aanvaard worden, de toepassing van PSCDGs voor deze vrouwen eveneens gerechtvaardigd zou moeten zijn. [119] Een belangrijke vraag die zich hier echter stelt is of er een leeftijdsgrens zou moeten bestaan om zwanger te worden. Daarvoor houden we best rekening met een aantal zaken: het welzijn van het kind, de gezondheidsrisico’s voor de moeder (een zwangerschap op oudere leeftijd), de maatschappelijke impact, enz. [113] 6. De zesde groep betreft homoseksuele koppels. Resultaten suggereren dat het eventueel mogelijk zou zijn om spermatozoa te creëren bij een vrouw en oöcyten bij een man. Hierdoor zouden homoseksuele koppels samen een kind kunnen krijgen dat genetisch verwant is aan beiden. Momenteel is het onduidelijk of dit technisch mogelijk zou zijn, in het bijzonder bij de vrouw aangezien een aantal genen noodzakelijk voor de spermatogenese gelokaliseerd zijn t.h.v. het Y chromosoom. Daarnaast zou deze derivatie waarschijnlijk extra risico’s meedragen vergeleken met ‘normale’ PSCDGs. [113] Er bestaan reeds intermediaire oplossingen voor koppels van hetzelfde geslacht die een genetisch band willen met hun kind. Zo kan b.v. een lesbisch koppel vragen aan de broer van de ‘sociale’ moeder om spermadonor te zijn, zodat de ‘sociale’ moeder toch een 25% - 42 - genetische link heeft met het kind. Het scenario van PSCDGs voor homoseksuele koppels zou een volledige genetische link betekenen voor beide ouders, er bestaan echter sterke meningsverschillen over deze toepassing: sommigen zijn hier heel enthousiast over. [119] anderen noemen het “zonder twijfel een controversieel en hoogst onwaarschijnlijk potentieel doel van dit onderzoek” . [108] Sommige mensen veroordelen het gebruik van PSCDGs door homoseksuele koppels als moreel onaanvaardbaar omdat ze reproductie en/of opvoeding door homoseksuele koppels afwijzen, onafhankelijk van de manier waarop het kind gecreëerd werd. Deze argumenten zijn meestal gebaseerd op religieuze overtuigingen of opvattingen over de natuur. [113,141] Volgens Testa et al. (2005) kan men zelfs spreken van homofobie of discriminatie o.b.v. gender of seksuele oriëntatie. [111] Een ander mogelijk bezwaar is dat de extra risico’s om PSCDGs te deriveren van het andere geslacht onaanvaardbaar zouden zijn. [113] Testa et al. verdedigen het gebruik van PSCDGs door homoseksuele koppels o.b.v. een aantal argumenten. ARTs zijn momenteel reeds beschikbaar voor homoseksuele koppels in veel landen, waardoor het eigenaardig zou zijn om PSCDGs te verbieden. Studies tonen aan dat kinderen van homoseksuele koppels niet verschillend zijn van andere kinderen op vlak van hun psychologische ontwikkeling. [142] Bovendien zijn Testa et al. van mening dat PSCDGs zouden helpen om de reproductie verder te democratiseren. [111] Daarnaast stelt Mertes (2010) dat als men de wens voor een genetisch verwant kind zou accepteren voor heteroseksuele koppels, dan is het onduidelijk waarom deze wens onaanvaardbaar of onbelangrijk zou zijn voor homoseksuele koppels. [113] 7. Een zevende hypothetische toepassing is meervoudig genetisch ouderschap. Vier mensen in een relatie zouden samen een kind kunnen hebben. Hierbij zouden eerst m.b.v. IVF 2 embryo’s gegenereerd worden van 2 koppels, waarna hESCs afkomstig van de embryo’s gedifferentieerd kunnen worden tot PSCDGs, die kunnen gebruikt worden voor een tweede IVF ronde. Het resulterend kind zou genetisch verwant zijn aan de vier aanstaande ouders, die technisch gezien de genetische grootouders zouden zijn. Er zijn verschillende variaties mogelijk op dit scenario. Vanuit een ethisch standpunt kunnen Palacios- González et al. (2014) geen overtuigend argument vinden om de mogelijkheid van genetisch verwantschap m.b.v. PSCDGs te beperken tot specifieke categorieën van individuen of koppels. Het argument dat meervoudig genetisch ouderschap slecht zou zijn voor het kind verdedigen ze met het principe van ‘het onrechtvaardige leven’ (zie 5.5.3). [119] - 43 - 8. Een achtste mogelijkheid voor PSCDGs betreft iteratieve in vitro reproductie. Sparrow (2014) beschreef een hypothetisch scenario waarbij meerdere generaties van humane embryo’s in vitro gecreëerd zouden kunnen worden. Hierbij zou men een embryo creëren uit spermatozoa en oöcyten gederiveerd uit verschillende stamcellijnen, waarna men nieuwe gameten zou kunnen genereren uit de stamcellen afkomstig van dit eerste embryo. Dit proces zou, in principe, tot in het oneindige herhaald kunnen worden. Ofwel zou het proces onderbroken kunnen worden zodat één van de resulterende embryo’s geïmplanteerd zou worden in de uterus van een vrouw, met mogelijks de geboorte van een kind. [143] Een belangrijke praktische barrière zou echter zijn dat verlengde cultuur van cellijnen epigenetische veranderingen zouden veroorzaken, die zouden doorgegeven worden aan de volgende generaties. Daarnaast stelt hij dat de creatie van embryo’s voor onderzoek een ethisch probleem zou vormen. Sparrow schat dat in een 10-jaars project men 20-30 humane generaties in vitro zou kunnen genereren. Iteratieve in vitro reproductie zou volgens Sparrow een aantal interessante toepassingen kennen: onderzoek naar de erfelijkheid van genetische aandoeningen; de productie van cellijnen met specifieke genotypes voor onderzoeks- en therapeutische doeleinden; de creatie van kinderen met gewenst fenotype . Deze laatste toepassing, het maken van ‘betere baby’s’ of m.a.w. eugenetica, is echter een heel controversieel doel. [143] Het voorgestelde scenario en stellingen die Sparrow maakte heeft veel reacties en kritiek uitgelokt. Men argumenteerde o.a. dat de visie van Sparrow wetenschappelijk en ethisch te optimistisch is. [144] 9. Zoals reeds aangehaald bij 'iteratieve in vitro reproductie' zouden PSCDGs mogelijks nieuwe eugenetische technologieën kunnen bevorderen. Dit is echter een heel controversieel gegeven en zou kunnen beschouwd worden als een argument contra PSCDGs. Men zou namelijk grote hoeveelheden PSCDGs en embryo’s kunnen produceren, waardoor toekomstige ouders hun ‘beste’ embryo zouden kunnen selecteren o.b.v. genetisch profiel gerelateerd aan bv. ziekterisico of fenotypische eigenschappen zoals oogkleur. Deze toepassing is zorgwekkend omdat men ten eerste een groot aantal embryo’s zou creëren, meer dan klinisch noodzakelijk, en ten tweede omdat het zou kunnen leiden tot ‘designer baby’s’. [108,128,140] 10. Daarnaast zou men PSCDGs kunnen gebruiken voor germline genetische modificatie. Door stamcellen genetisch te manipuleren en hieruit gameten te deriveren, zou men gemodificeerde embryo’s kunnen creëren (ofwel voor de correctie van ziekte-geassocieerde mutaties of voor eugenetische toepassingen). [113,140] Momenteel is germline genetische - 44 - modificatie verboden in de meeste landen, o.a. omdat het technisch nog niet efficiënt en veilig is en uit angst voor misbruik van de technologie voor eugenetische doelen. [145,146] PSCDGs zijn echter niet noodzakelijk voor germline genetische modificatie, want men kan humane embryo's tevens direct genetisch modificeren. [147] Oppositie tegen germline genetische modificatie betekent dus niet automatisch de oppositie tegen PSCDGs. [113] - 45 - 6. DISCUSSIE 6.1 Efficiëntie 6.1.1 Samenvatting van resultaten Sinds de eerste creatie van mESC-gederiveerde OLCs in 2003 heeft men m.b.v. ESCs en iPSCs reeds heel wat kunnen realiseren: zowel bij de muis als de mens is men in staat om PGCLCs in vitro te deriveren en deze te differentiëren tot SLCs, OLCs en FLSs. [14] Er bestaat echter een onmiskenbare discrepantie tussen de ontwikkeling van mannelijke SLCs en vrouwelijke OLCs en FLSs: volledige meiose en vorming van mature en bewezen functionele gameten werd tot op heden uitsluitend gerapporteerd bij mannelijke muizen. [15] De FLSs ontwikkelden zich slechts tot primordiale, primaire of soms secundaire follikels, maar hierna ondergingen ze degeneratie; antrale follikels werden (nog) niet gecreëerd. De meiose blijft één van de grootste hindernissen om PSCDGs te deriveren. Men is er nog niet in geslaagd om OLCs te creëren die de meiose konden volbrengen, hoogstens een initiatie van de meiose kon geobserveerd worden. De meiose van muis- en humane SLCs kon wel relatief succesvol gerealiseerd worden. Alhoewel bij de mens een aantal studies geen meiose of slechts een initiatie van de meiose van de SLCs konden waarnemen. Daarnaast is het aantal gegenereerde haploïde cellen laag (max 4% werd gerapporteerd; [73]), m.a.w. er is zowel een slechte kwaliteit als een lage efficiëntie van de meiose. Epigenetische herprogrammatie vormt een tweede grote hindernis voor de derivatie van PSCDGs. Zowel bij de muis als de mens en bij de man als de vrouw blijken fouten op te treden bij de inprenting van PSCDGs. Deze fouten manifesteren zich reeds bij de ‘eerste’ stap van herprogrammatie, inprenting-verwijdering, en worden tevens gezien bij de ‘tweede’ stap, herinstellen van parentaal inprenting-patroon. Ten derde bestaat zowel bij de muis als de mens aanwijzingen voor de vorming van gonadale hormoon-producerende cellen in de cultuur. Ten slotte werd de fertilisatie van zowel SLCs als FLSs succesvol uitgevoerd door Hayashi et al. Gezonde en vruchtbare nakomelingen werden geboren, met normale epigenetische kenmerkern. De efficiëntie van de fertilisatie van FLSs was echter laag, vermoedelijk door triploïdie-afwijkingen. [14,61] - 46 - 6.1.2 Waarom is de meiose bij OLCs moeilijker dan bij SLCs? Men observeerde meer frequent de differentiatie van SLCs dan de ontwikkeling van OLCs. Bovendien vertoonde de meerderheid van de gederiveerde OLCs zowel bij de muis als de mens een abnormale meiose en inprenting-fouten. Het is echter onduidelijk wat de oorzaak is van deze inefficiënte OLC-derivatie. Meestal werden XY-stamcellen gebruikt voor de derivatie van OLCs en FLSs. Als bepaalde spermatogenese-geassocieerde genen niet juist tot expressie worden gebracht, zullen mannelijke PGCs zich ontwikkelen tot oöcyten. [14,148] Nitta et al. stelt de hypothese dat een abnormale seksuele differentiatie de oorzaak kan zijn van een afwijkende meiose en folliculogenese van de OLCs/FLSs. M.a.w. XX-stamcellen zouden meer geschikt zijn voor de derivatie van FLSs. Nochtans toonden studies met XX-mESCs aan dat de productie van FLSs eveneens onsuccesvol was. [68] Mogelijks werd dit veroorzaakt door genetische en epigenetische instabiliteit van XX ESCs. [68,149] Een tweede hypothese voor het gebrek aan OLCs is dat meest frequent gebruik werd gemaakt van EBs i.p.v. een monolayer cultuur. Er bestaan namelijk vermoedens dat een monolayer cultuur de neiging heeft om de oögenese te stimuleren en EBs eerder de spermatogenese bevorderen. [66,150,151] Ten slotte is de oögenese in vivo tevens minder efficiënt dan de spermatogenese. Ongeveer 80-90% van de aneuploïdie gezien bij de humane embryo’s wordt veroorzaakt door non-disjunctie tijdens de 1ste maternale meiotische deling MI. [152] De oorzaak van deze vrouwelijke MI ‘kwetsbaarheid’ is nog niet volledig duidelijk, maar zou kunnen verklaard worden omdat meer fouten optreden tijdens de oögenese of (meer waarschijnlijk) door een gebrek aan herkennen en corrigeren of elimineren van cellen met afwijkingen. Dit zou niet merkwaardig zijn aangezien de oögenese complexer verloopt dan de spermatogenese, met verschillende start en stop signalen i.p.v. een continu proces. [153] 6.1.3 Is de derivatie van PSCDGs even (in)efficiënt bij de muis als bij de mens? Het is moeilijk om een antwoord te geven op deze vraag, aangezien fertilisatie-experimenten (nog) niet werden uitgevoerd bij de mens, dit is echter het ultieme bewijs voor functionele gameten. Als we echter andere parameters bestuderen, zoals meiose en epigenetische herprogrammatie, merken we dat de muis en humane PSCDGs min of meer dezelfde zwaktes en sterktes vertoonden. Bij allebei werden vroege- en late merkers tot expressie gebracht. De meiose en oögenese van OLCs was zowel bij muis als humane PSCDGs overwegend - 47 - abnormaal. Allebei vertoonden ze haploïde SLCs met vermoedelijk recombinatie. Bovendien konden epigenetische afwijkingen bij beiden gedetecteerd worden. Bij humane PSCDGs rapporteerden echter 2 studies een volledig correct instellen van inprenting-patronen, [73,100] hoewel dit bij de muis slechts gedeeltelijk geobserveerd werd. [59] Ten slotte konden mature spermatozoa gecreëerd worden uit muis stamcellen, maar humane SLCs differentieerden slechts tot ronde spermatiden. We moeten in rekening brengen dat bij de mens geen in vivo-transplantatie-stap werd uitgevoerd, in tegenstelling tot muis PSCDGs, waardoor men de efficiëntie van humane PSCDGs mogelijks zou kunnen onderschat. Om de efficiëntie van humane PSCDG-derivatie te verhogen zou men, in principe, PSCDGs (of voorstadia hiervan) kunnen transplanteren in de gonaden van de patiënt. [99] De vraag stelt zich echter of dit haalbaar zou zijn in de kliniek. Sommige patiënten beschikken b.v. niet over functionele testes, zoals patiënten met bilaterale criptorchidie. Het is wel reeds mogelijk een xenotransplantatie uit te voeren met humane PSCDGs naar muis-testes om de functionaliteit van de gameten te beoordelen. [90] We kunnen concluderen dat er een mogelijkheid bestaat dat de derivatie van muis en humane PSCDGs even (in)efficiënt is, maar het is nog te vroeg om hierover een sluitend antwoord te bieden. 6.1.4 Is de derivatie van PSCDGs even (in)efficiënt bij iPSCs als ESCs? Zijn iPSCs even efficiënt als ESCs? Hier bestaat discussie over: sommige studies vermoeden dat hESCs efficiënter zijn, andere dat hiPSCs efficiënter zijn. Epigenetische verschillen tussen hESCs en hiPSCs zou de variatie in efficiëntie kunnen verklaren. Ofwel werd dit louter veroorzaakt door het heterogeen, intrinsiek differentiatie potentieel van stamcellijnen. Verder onderzoek is nodig om hierover een besluit te kunnen vormen. 6.1.5 Derivatie van gameten uit ntESCs Momenteel werden uitsluitend ESCs (of iPSCs) gebruikt voor de derivatie van PSCDGs, ntESC-gederiveerde gameten werden nog niet onderzocht. Maar als men patiënt-specifieke gameten zou willen creëren met embryonale stamcellen, volstaan ESCs niet. Dit toont het belang aan om de mogelijkheid van ntESC-gederiveerde gameten te exploreren. 6.1.6 Variabiliteit tussen de verschillende studies Er bestaat een aanzienlijke heterogeniteit in efficiëntie van in vitro GLC-derivatie tussen verscheidene studies, maar eveneens in één studie wanneer meerdere stamcellijnen onderzocht werden. Hoewel iedere studie in staat was om PGCLCs te induceren, bleek de - 48 - progressie door de meiose en correcte epigenetische herprogrammatie complexer en sterk variërend te zijn. Wat verklaart deze heterogeniteit? De meest evidente reden is de variabiliteit in differentiatie-methodes tussen de studies . [88,100] Het aantal uitgevoerde studies rond GLC-derivatie is relatief beperkt in verhouding met de verscheidenheid aan methodes. Dit is echter geen allesomvattende verklaring, aangezien ook binnen een studie met één bepaalde methode variatie kan opgemerkt worden tussen meerdere stamcellijnen. Zowel ESals iPS-cellijnen zijn heterogeen in hun intrinsiek differentiatie potentieel. Sommige stamcellijnen vertonen een sterke neiging om te differentiëren naar een specifiek celtype. Dit wordt veroorzaakt door epigenetische en transcriptionele variatie tussen de cellijnen. [154,155] Het zou nuttig zijn om ES- en iPS-cellijnen te screenen o.b.v. DNA-methylatie en genexpressie, zodat de meest geschikte cellijn geselecteerd kan worden voor de differentiatie van GLCs. [96,97] Ten slotte kunnen ongecontroleerde en/of ongekende variabelen in het protocol mede een oorzaak zijn voor de heterogeniteit. [100] 6.2 Veiligheid Als PSCDGs ooit toegepast zouden worden in de kliniek, zal veiligheid de overheersende bezorgdheid zijn. In de eerste plaats de veiligheid van het resulterend kind, maar ook de veiligheid van de generaties na het kind en van de patiënt zelf zijn belangrijk. De functionaliteit en de veiligheid van de GLCs kunnen geëvalueerd worden o.b.v. een aantal parameters: morfologie, merkers, meiose, epigenetica en fertilisatie. Het is echter niet voor iedere parameter volledig duidelijk wat het effect is op de functionaliteit en/of veiligheid. De meeste studies besteden relatief weinig aandacht aan de klinische toepasbaarheid van PSCDGs, waardoor vaak onvoldoende informatie beschikbaar is om de functionaliteit en veiligheid van de PSCDGs te evalueren. Als men pre-klinische of klinische evaluatie zou willen uitvoeren, zal een meer extensieve analyse van de PSCDGs absoluut noodzakelijk zijn. Daarom bespreken we welke beperkingen zich stelden in de evaluatie van deze PSCDGs. Ten slotte beschrijven we de potentiële risico’s van PSCDGs voor de patiënt zelf. 6.2.1 Morfologie en merkers In de kliniek beoordeelt men mannelijke infertiliteit m.b.v. sperma-analyse gebaseerd op enkele parameters zoals de morfologie. Deze analyse is echter niet indicatief voor potentiële fertiliteit, maar identificeert slechts extreme gevallen van infertiliteit zoals azoöspermie of - 49 - globozoöspermie. Onder normale omstandigheden worden oöcyten die een afwijkende morfologie vertonen niet gebruikt in klinische procedures. Als PSCDGs echter blijvend een abnormale morfologie zullen vertonen, zullen specifieke merkers voor functionaliteit noodzakelijk zijn, zodat men de meest levensvatbare oöcyten kan selecteren voor de klinische toepassing. [150] Daarnaast kan men stellen dat een cel die lijkt op een oöcyt o.b.v. morfologie, niet noodzakelijk een ‘echte’ oöcyt is. Succesvolle gametogenese vereist zowel ‘meiose’ als ‘het ontwikkelen’ van de gameet, deze 2 processen zijn genetisch gescheiden van elkaar. In een studie door Dokshin et al. werden Stra8-deficiënte muizen gegenereerd die Stra8-deficiënte OLCs produceerden (Stra8 is noodzakelijk voor de meiose). Deze OLCs waren morfologisch niet te onderscheiden van normale oöcyten en ontwikkelden zich na fertilisatie tot 2-cellige embryo’s. Er was echter geen bewijs voor meiose, dus deze OLCs konden niet geïdentificeerd worden als ‘echte’ oöcyten. [156,157,99] De meeste studies evalueren GLCs voornamelijk o.b.v. gametogenese-merkers, deze aanpak heeft echter een aantal nadelen. Ten eerste bestaat er een grote verscheidenheid van toegepaste merkers tussen de studies (m.a.w. iedere studie maakte gebruik van een ander panel van merkers voor identificatie en isolatie), waardoor betrouwbare vergelijkingen moeilijk en niet praktisch zijn. Ten tweede vormen aspecifieke merkers een probleem voor de identificatie van GLCs (b.v. merkers die ook tot expressie komen door o.a. ESCs). Bovendien is er discussie over de specificiteit van sommige ‘specifieke’ GLC-merkers: is de merker 100% specifiek voor een gameet (en wordt deze dus niet tot expressie gebracht door andere celtypes)? En is de merker 100% specifiek voor een bepaald stadium van de gametogenese (b.v. specifiek voor de meiose)? Ten derde werd de transcriptionele analyse meestal beperkt tot een aantal merkers, hoewel in werkelijkheid een veel groter aantal genen een rol spelen in de gametogenese. [90] Bovendien werd in de meeste studies de nadruk gelegd op vroege PGC-merkers en niet op late meiotische- en post-meiotische merkers, waardoor evaluatie van latere stadia moeilijk is. Ten slotte bestaat er een prangende noodzaak om te achterhalen wat de betekenis is van de aan- of afwezigheid van deze merkers en de gevolgen op de functionaliteit en veiligheid van de GLCs. [150] Samengevat zouden deze problemen deels kunnen opgelost worden door een panel van merkers te creëren die essentieel zijn voor de functie en veiligheid van gameten en cruciale informatie bieden voor de klinische toepasbaarheid van PSCDGs. [150] Daarnaast lijkt - 50 - microarray analyse meer geschikt voor de vergelijking tussen het transcriptoom van GLCs en gameten. 6.2.2 Meiose Een correcte meiose is essentieel voor de funcionaliteit en veiligheid van de GLCs. Nondisjunctie en aneuploïdie zijn niet verenigbaar met het leven of veroorzaken mentale retardatie of andere ernstige afwijkingen. [152] De meiose werd in de meeste studies die PSCDGs deriveren niet of slechts beperkt bestudeerd. Doorgaans werden meiose-merkers geanalyseerd, deze bieden echter geen bewijs dat de meiose ‘correct’ werd uitgevoerd. Daarnaast werd de detectie van haploïde cellen vaak als ‘meiose-bewijs’ aangewend, maar wanneer de analyse met flow cytometrie gebeurde zijn deze resultaten betwistbaar. [99] Eguizabal et al. rapporteerden “volledige” in vitro meiose (bij zowel hESCs als hiPSCs) o.b.v. post-meiose merkers en de detectie van haploïde cellen. Deze resultaten suggereren dat de gederiveerde cellen een meiotische deling hadden ondergaan. Maar andere belangrijke aspecten van de meiose werden niet geëvalueerd, zoals het aantonen van recombinatie, waardoor men geen uitsluitend bewijs had dat alle cruciale aspecten van de meiose correct verliepen. Geen enkele studie voldoet aan de ‘gouden standaard’ criteria voor een correcte meiose voorgesteld door Handel et al. (2014). [99,100] Als PSCDGs (pre)-klinisch geëvalueerd zouden worden, zou een grondige evaluatie van de meiose o.b.v. strenge criteria echter noodzakelijk zijn. 6.2.3 Epigenetica Inprenting genen reguleren de foetale en placentale groei. [158] Afwijkende expressie van ingeprente genen kunnen een aantal syndromen en ziektes veroorzaken, zoals Angelman- en Prader-Willi syndroom. Ze spelen tevens een rol in meerdere multifactoriële aandoeningen (zoals diabetes, astma en psoriasis) en maligne aandoeningen zoals borst-en ovariumkanker. [159,160] In vitro manipulatie van cellen kan leiden tot epigenetische veranderingen die de stamcellen of de PSCDGs kunnen beïnvloeden. [136,161] Verschillende studies suggereren dat kinderen resulterend uit ARTs een verhoogd risico zouden hebben op bepaalde syndromen, veroorzaakt door epigenetische afwijkingen gecreëerd tijdens manipulatie van de gameten. [150,161] Vergeleken met de gameten bij ICSI en IVF worden PSCDGs nóg meer gemanipuleerd en blootgesteld aan epigenetische risico’s. In 2006 werd de geboorte van muizen bereikt door de - 51 - fertilisatie van mESC-gederiveerde SLCs en oöcyten. Deze vertoonden echter fenotypische afwijkingen en een korte levensduur, waarschijnlijk veroorzaakt door epigenetische afwijkingen van de SLCs. [59] Deze observaties tonen aan dat men epigenetische afwijkingen kan verwachten bij PSCDGs en wijzen op het belang van een grondige epigenetische evaluatie van deze cellen. De minderheid van de studies die PSCDGs deriveerden, onderzocht de epigenetische herprogrammatie van de PSCDGs. Bovendien werden slechts een beperkt aantal inprentinggenen geanalyseerd. De observatie van hESC-gederiveerde SLCs met correct paternaal inprenting-patroon van 2 genen (H19 en Igf2r) werd reeds gerapporteerd. [73] Momenteel zijn er echter 112 genen gekend die via inprenting gereguleerd worden: 53 bij de mens en 96 bij de muis. [159] Als men de functionaliteit en veiligheid van de GLCs wil garanderen zal het noodzakelijk zijn om, i.p.v. slechts 2 genen, veel meer inprenting-genen te screenen. Daarnaast werden andere epigenetische eigenschappen van gameten nauwelijks onderzocht: globale DNA demethylatie, histonen-modificatie en reactivatie van het X-chromosoom. [74] 6.2.4 Fertilisatie De ultieme gouden standaard voor het bewijs van ‘functionele gameten’ is de productie van gezonde nakomelingen met een normale ontwikkeling en normaal karyotype, transcriptoom en epigenetisch landschap. Hayashi et al. (2011) zijn de enigen die bewezen functionele gameten hebben kunnen creëren bij de muis. [15] De derivatie van functionele gameten betekent echter niet dat deze ‘veilig’ waren. Want de SLCs vertoonden epigenetische afwijkingen en de meiose werd niet bestudeerd. Bovendien heeft ‘veiligheid’ evident een andere betekenis bij de muis dan bij de mens. Verscheidene afwijkingen kunnen moeilijk bestudeerd worden bij de muis, zoals b.v. een verhoogd risico op de ontwikkeling van schizofrenie. Om te bepalen of de PSCDGs effectief ‘veilig’ zijn zou bevruchting met humane PSCDGs en lange termijn follow-up noozakelijk zijn. Omwille van ethische redenen werden (nog) geen fertilisatie-experimenten uitgevoerd met humane PSCDGs. 6.2.5 Veiligheid voor de patiënt Indien men de efficiëntie van humane PSCDG-derivatie zou willen verhogen zou men kunnen experimenteren met een in vivo-transplantatie-stap naar humane testes of ovaria. Dit zou echter een potentieel risico kunnen inhouden voor de patiënt m.b.t. de vorming van tumoren, zowel bij hESCs als hiPSCs. [136,162] Bovendien bestaat er een risico op immunologische rejectie, zelfs bij autologe therapie zou dit mogelijks een probleem kunnen vormen. [136,163] - 52 - 6.3 Conclusie Is de derivatie van PSCDGs efficiënt? Ondanks intensief onderzoek naar stamcelgederiveerde gameten sinds 2003 blijft dit een relatief inefficiënt en slecht reproduceerbaar proces. Dit is misschien niet verrassend aangezien de gametogenese in vivo eveneens een uniek en complex proces is. [89] De derivatie van functionele FLSs vormt momenteel de grootste uitdaging. Verder onderzoek naar de optimalisering van de derivatie-cultuur en ontwikkeling van nieuwe methodes zullen bijdragen aan het verhogen van de efficiëntie van PSCDG-derivatie. [164] Als de efficiëntie laag zou blijven, kan de bedenking gemaakt worden dat men slechts één functionele spermatozoïde en één oöcyt nodig heeft voor een fertilisatie. Bovendien zou men o.b.v. screening de ‘beste’ PSCDGs kunnen selecteren. Zijn humane PSCDGs veilig? Veiligheid is de grootste bezorgdheid rond PSCDGs. De meeste studies besteden echter relatief weinig aandacht aan de moleculaire evaluatie van PSCDGs. Bovendien zijn de resultaten heterogeen. Er zijn aanwijzingen dat er een mogelijkheid bestaat dat PSCDGs (tot op een bepaald niveau) veilig zouden kunnen zijn in de toekomst. Maar waakzaamheid is geboden, want mogelijks zullen PSCDGs nooit ‘volledig’ veilig zijn. Een meer extensieve evaluatie van PSCDGs zou noodzakelijk zijn om een antwoord te kunnen bieden op deze vraagstelling. Is de toepassing van PSCDGs voor de behandeling van onvruchtbare patiënten efficiënt, veilig en ethisch verantwoord? Momenteel is het antwoord op deze vraag: nee. Maar er bestaat een mogelijkheid dat dit wel zo zal zijn in de toekomst. In 2008 werd door de Hinxton Group geschat dat de derivatie van PSCDGs mogelijk zal zijn binnen 5-15 jaar. [16] Dit lijkt een optimistische schatting als men PSCDGs zou willen deriveren die volledig veilig zijn. De complexiteit van de nieuwe techniek van PSCDGs is in de eerste plaats een wetenschappelijktechnische uitdaging, maar er zijn tevens ethische en sociale problemen m.b.t. de veiligheid van de resulterende kinderen en de potentiële hoge kosten van deze techniek. Als maatschappij zullen we moeten beoordelen hoever we willen gaan om de wens voor genetisch ouderschap te vervullen. - 53 - 7. REFERENTIES 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. Chachamovich JR, Chachamovich E, Ezer H, Fleck MP, Knauth D, Passos EP. Investigating quality of life and health-related quality of life in infertility: a systematic review. J Psychosom Obstet Gynaecol 2010, 31:101–110. Boivin J, Bunting L, Collins JA, Nygren KG. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Hum Reprod. 2007 Jun;22(6):1506-12. Petraglia F, Serour GI, Chapron C. The changing prevalence of infertility. Int J Gynaecol Obstet. 2013 Dec;123 Suppl 2:S4-8. Steptoe PC, Edwards RG. Birth after the reimplantation of a human embryo. Lancet, 2 (1978), p. 366. Schlegel PN. Evaluation of male infertility. Minerva Ginecol. 2009 Aug;61(4):261-83. Yassini SM, Taghavi Shavazi M, Taghavi Shavazi N. Factors associated with adoption acceptance rate from the view point of infertile couples. Iran J Reprod Med. 2012 Sep;10(5):413-8. Kind&Gezin. Hoe lang duurt het om een kind te adopteren? Beschikbaar via: http://www.kindengezin.be/contact-en-help/veelgestelde-vragen/adoptie/hoe-lang-duurt-het-om-eenkind-te-adopteren.jsp. Geraadpleegd op juli 2015. Ferraretti AP1, Goossens V, Kupka M, Bhattacharya S, de Mouzon J, Castilla JA, et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2009: results generated from European registers by ESHRE. Hum Reprod. 2013 Sep;28(9):2318-31. Hoge gezondheidsraad. Publicatie nr. 8639 van 7 juli 2010. Eiceldonatie: Medische en psychologische evaluatie van eiceldonor en gevolgen voor haar gezondheid.2007 Bodri D, Guillén JJ, Polo A, Trullenque M, Esteve C, Coll O. Complications related to ovarian stimulation and oocyte retrieval in 4052 oocyte donor cycles. Reprod Biomed Online. 2008 Aug;17(2):237-43. Dickenson D. Commodification of human tissue: implications for feminist and development ethics. Dev World Bioeth. 2002 May;2(1):55-63. Gong D, Liu YL, Zheng Z, Tian YF, Li Z. An overview on ethical issues about sperm donation. Asian J Androl. 2009 Nov;11(6):645-52. Jadva V, Freeman T, Kramer W, Golombok S. The experiences of adolescents and adults conceived by sperm donation: comparisons by age of disclosure and family type. Hum Reprod. 2009 Aug;24(8):1909-19. Hübner K, Fuhrmann G, Christenson LK, et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science. 2003;300(5623):1251-1256. Hinxton Group. Consensus Statement: Science, Ethics and Policy Challenges of Pluripotent Stem Cell Derived Gametes. (2008). Beschikbaar via: http://www.hinxtongroup.org/au_pscdg_cs.html (geraadpleegd op april 2016). Hayashi K, Ohta H, Kurimoto K, Aramaki S, SaitouM. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 2011;146 519-532. Shanthly N, Aruva MR, Zhang K, Mathew B, Thakur ML. Stem cells: a regenerative pharmaceutical. Q J Nucl Med Mol Imaging. 2006 Sep;50(3):205-16. Review. Evans MJ, Kaufman MH. 1981. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. Jul;292:154–156. Martin GR. 1981. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. Dec;78:7634–7638. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. 1998. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. Nov;282:1145–1147. Puri MC, Nagy A. Concise review: Embryonic stem cells versus induced pluripotent stem cells: the game is on. Stem Cells. 2012 Jan;30(1):10-4. Briggs R, King TJ. Transplantation of Living Nuclei From Blastula Cells into Enucleated Frogs' Eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 1952 May;38(5):455-63. Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature. 1997 Feb 27;385(6619):810-3. National Academy of Sciences (US), National Academy of Engineering (US), Institute of Medicine (US) and National Research Council (US) Committee on Science, Engineering, and Public Policy. Scientific and Medical Aspects of Human Reproductive Cloning. Washington (DC): National Academies Press (US); 2002. Yamanaka S, Blau HM. Nuclear reprogramming to a pluripotent state by three approaches. Nature. 2010 Jun 10;465(7299):704-12. - 54 - 26. Munsie, M.J. et al. Isolation of pluripotent embryonic stem cells from reprogrammed adult mouse somatic cell nuclei. Curr. Biol. 2000; 10, 989–992. 27. Tachibana M, Amato P, Sparman M, Gutierrez NM, Tippner-Hedges R, Ma H, et al. Human embryonic stem cells derived by somatic cell nuclear transfer. Cell. 2013 Jun 6;153(6):1228-38. 28. Wakayama S, Jakt ML, Suzuki M, Araki R, Hikichi T, Kishigami S, et al. Equivalency of nuclear transfer-derived embryonic stem cells to those derived from fertilized mouse blastocysts. Stem cells. 2006; 24:2023–2033. 29. Wakayama, T. et al. Differentiation of embryonic stem cell lines generated from adult somatic cells by nuclear transfer. Science. 2001; 292, 740–743. 30. Byrne JA, Pedersen DA, Clepper LL, Nelson M, Sanger WG, Gokhale S, et al. Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature. 2007 Nov 22;450(7169):497-502. 31. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126: 663–676. 32. Park I-H, Zhao R, West JA et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2007; 451: 141–146. 33. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007; 131: 861–872. 34. Bar-Nur O, Russ HA, Efrat S et al. Epigenetic memory and preferential lineage-specific differentiation in induced pluripotent stem cells derived from human pancreatic islet beta cells. Cell Stem Cell 2011; 9: 17–23. 35. Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat Biotechnol. 2008 Jan;26(1):101-6. 36. Soldner F, Hockemeyer D, Beard C, Gao Q, Bell GW, Cook EG. Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 2009 Mar 6;136(5):964-77. 37. Botman O, Wyns C. Induced pluripotent stem cell potential in medicine, specifically focused on reproductive medicine. Front Surg. 2014 Mar 24;1:5. 38. Lawson KA, Hage WJ. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. Ciba Found. 1994; Symp. 182, 68–84, discussion 84-91. 39. Lawson KA, Dunn NR, Roelen BA, Zeinstra LM, Davis AM, Wright CV, et al. Bmp4 is required for the generation of primordial germ cells in the mouse embryo. Genes Dev.1999; 13, 424–436. 40. Saitou M, Yamaji M. Germ cell specification in mice: signaling, transcription regulation, and epigenetic consequences. Reproduction. 2010 Jun;139(6):931-42. 41. Arnold SJ1, Robertson EJ. Making a commitment: cell lineage allocation and axis patterning in the early mouse embryo. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Feb;10(2):91-103. 42. Magnúsdóttir E, Surani MA. How to make a primordial germ cell. Development. 2014 Jan;141(2):24552. 43. Magnúsdóttir E, Dietmann S, Murakami K, Günesdogan U, Tang F, Bao S, et al. A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice. Nat. Cell Biol. 2013; 15, 905–915. 44. Phillips BT, Gassei K, Orwig KE. Spermatogonial stem cell regulation and spermatogenesis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2010 May 27;365(1546):1663-78. 45. Abban G, Johnson J. Stem cell support of oogenesis in the human. Hum Reprod. 2009 Dec;24(12):2974-8. 46. Page SL, Hawley RS. The genetics and molecular biology of the synaptonemal complex. Annu Rev Cell Dev Biol, 2004. 47. Urani MA, Barton SC, Norris ML. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature. 1984; 308, 548-550. 48. Reik W, Walter J. Genomic imprinting: parental influence on the genome. Nat. Rev. Genet. 2001; 2, 2132. 49. Yao L, Yu X, Hui N, Liu S. Application of iPS in assisted reproductive technology: sperm from somatic cells? Stem Cell Rev. 2011 Sep;7(3):714-21. 50. Imamura M, Hikabe O, Lin ZY, Okano H. Generation of germ cells in vitro in the era of induced pluripotent stem cells. Mol Reprod Dev. 2014 Jan;81(1):2-19. 51. Bratt-Leal AM, Carpenedo RL, McDevitt TC. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 2009 Jan-Feb;25(1):43-51. 52. Toyooka Y, Tsunekawa N, Akasu R, Noce T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. PNAS. 2003;100 11457-11462. 53. Payer B, Chuva de Sousa Lopes SM, Barton SC, Lee C, Saitou M & Surani MA 2006 Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis 44 75–83. - 55 - 54. Chuang CY, Lin KI, Hsiao M, Stone L, Chen HF, Huang YH. Meiotic competent human germ cell-like cells derived from human embryonic stem cells induced by BMP4/WNT3A signaling and OCT4/EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) selection. J Biol Chem. 2012 Apr 27;287(18):14389401. 55. Bucay N, Yebra M, Cirulli V, Afrikanova I, Kaido T, Hayek A, Montgomery AM. A novel approach for the derivation of putative primordial germ cells and sertoli cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 2009 Jan;27(1):68-77. 56. Zwaka TP, Thomson JA. A germ cell origin of embryonic stem cells? Development. 2005 Jan;132(2):227-33. 57. Lacham-Kaplan O, Chy H, Trounson A.Testicular cell conditioned medium supports differentiation of embryonic stem cells into ovarian structures containing oocytes. Stem Cells. 2006 Feb;24(2):266-73. Epub 2005 Aug 18. 58. Qing T, Shi Y, Qin H, Ye X, Wei W, et al. Induction of oocyte-like cells from mouse embryonic stem cells by co-culture with ovarian granulosa cells. Differentiation. 2007;75:902–911. 59. Nayernia K, Nolte J, Michelmann HW, et al. In vitro-differentiated embryonic stem cells give rise to male gametes that can generate offspring mice. Developmental Cell. 2006;11(1):125-132. 60. Nicholas CR, Haston KM, Grewall AK, Longacre TA, Reijo Pera RA. Transplantation directs oocyte maturation from embryonic stem cells and provides a therapeutic strategy for female infertility. Hum Mol Genet. 2009 Nov 15;18(22):4376-89. 61. Hayashi K, Ogushi S, Kurimoto K, et al. Offspring from oocytes derived from in vitro primordial germ cell-like cells in mice. Science. 2012;338(6109):971-975. 62. Miryounesi M, Nayernia K, Dianatpour M, Mansouri F, Modarressi MH. Co-culture of Mouse Embryonic Stem Cells with Sertoli Cells Promote in vitro Generation of Germ Cells. Iran J Basic Med Sci. 2013 Jun;16(6):779-83. 63. Lacham-Kaplan O, Chy H, Trounson A.Testicular cell conditioned medium supports differentiation of embryonic stem cells into ovarian structures containing oocytes. Stem Cells. 2006 Feb;24(2):266-73. Epub 2005 Aug 18. 64. Lawson KA, Dunn NR, Roelen BA, Zeinstra LM, Davis AM, Wright CV, et al. Bmp4 is required for the generation of primordial germ cells in the mouse embryo. Genes Dev.1999; 13, 424–436. 65. Silva C, Wood JR, Salvador L, Zhang Z, Kostetskii I, Williams CJ, Strauss JF 3rd. Expression profile of male germ cell-associated genes in mouse embryonic stem cell cultures treated with all-trans retinoic acid and testosterone. Mol Reprod Dev. 2009 Jan;76(1):11-21. doi: 10.1002/mrd.20925. 66. Geijsen N, Horoschak M, Kim K, Gribnau J, Eggan K, et al. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells. Nature. 2004;427:148–154. 67. Hu Y, Sun J, Wang J, Wang L, Bai Y, Yu M, Lian Z, Zhang S, Hua J. Characterization of female germlike cells derived from mouse embryonic stem cells through expression of GFP under the control of Figla promoter. J Cell Biochem. 2012 Apr;113(4):1111-21. doi: 10.1002/jcb.24044. 68. Nitta M, Imamura M, Inoue Y, Kunitomo Y, Lin ZY, Ogawa T, et al. Aberrant gene expression and sexually incompatible genomic imprinting in oocytes derived from XY mouse embryonic stem cells in vitro. PLoS One. 2013;8(3):e58555. doi: 10.1371/journal.pone.0058555. Epub 2013 Mar 5. 69. Novak I, Lightfoot DA, Wang H, Eriksson A, Mahdy E, Höög C. Mouse embryonic stem cells form follicle-like ovarian structures but do not progress through meiosis. Stem Cells. 2006 Aug;24(8):19316. 70. Young JC, Dias VL, Loveland KL. Defining the window of germline genesis in vitro from murine embryonic stem cells. Biol Reprod. 2010 Feb;82(2):390-401. doi: 10.1095/biolreprod.109.078493. Epub 2009 Oct 21. 71. Clark AT, Bodnar MS, Fox M, Rodriquez RT, Abeyta MJ, Firpo MT, Pera RA. Spontaneous differentiation of germ cells from human embryonic stem cells in vitro. Hum Mol Genet. 2004 Apr 1;13(7):727-39. 72. Hassold T, Hunt P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2001 Apr;2(4):280-91. Review. 73. Easley CA 4th, Phillips BT, McGuire MM, Barringer JM, Valli H, Hermann BP, et al. Direct differentiation of human pluripotent stem cells into haploid spermatogenic cells. Cell Rep. 2012 Sep 27;2(3):440-6. 74. Hajkova P, Erhardt S, Lane N, Haaf T, El-Maarri O, Reik W, Walter J, Surani MA. Epigenetic reprogramming in mouse primordial germ cells. Mech Dev 2002; 117: 15 23. 75. Wei W, Qing T, Ye X, Liu H, Zhang D, Yang W, Deng H. Primordial germ cell specification from embryonic stem cells. PLoS One. 2008;3(12):e4013. doi: 10.1371/journal.pone.0004013. Epub 2008 Dec 24. - 56 - 76. Kato Y, Kaneda M, Hata K, Kumaki K, Hisano M, et al. (2007) Role of the Dnmt3 family in de novo methylation of imprinted and repetitive sequences during male germ cell development in the mouse. Hum Mol Genet 16: 2272–2280 77. McGee EA, Hsueh AJ. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles. Endocr Rev. 2000; 21: 200– 214. 78. Lee MM1, Donahoe PK. Mullerian inhibiting substance: a gonadal hormone with multiple functions. Endocr Rev. 1993 Apr;14(2):152-64. 79. Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 2007 Jul 19;448(7151):313-7. 80. Aoi T, Yae K, Nakagawa M, Ichisaka T, Okita K, Takahashi K, Chiba T, Yamanaka S. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 2008 Aug 1;321(5889):699702. 81. Imamura M, Aoi T, Tokumasu A, Mise N, Abe K, Yamanaka S, Noce T. Induction of primordial germ cells from mouse induced pluripotent stem cells derived from adult hepatocytes. Mol Reprod Dev. 2010 Sep;77(9):802-11. 82. Li Y, Wang X, Feng X, Liao S, Zhang D, Cui X, Gao F, Han C. Generation of male germ cells from mouse induced pluripotent stem cells in vitro. Stem Cell Res. 2014 Mar;12(2):517-30. 83. Li P, Hu H, Yang S, Tian R, Zhang Z, Zhang W, Ma M, Zhu Y, Guo X, Huang Y, He Z, Li Z. Differentiation of induced pluripotent stem cells into male germ cells in vitro through embryoid body formation and retinoic acid or testosterone induction. Biomed Res Int. 2013;2013:608728. 84. Yang S, Bo J, Hu H, Guo X, Tian R, Sun C, Zhu Y, Li P, Liu P, Zou S, Huang Y, Li Z. Derivation of male germ cells from induced pluripotent stem cells in vitro and in reconstituted seminiferous tubules. Cell Prolif. 2012 Apr;45(2):91-100. 85. Swanson W.J., Vacquier V.D. The rapid evolution of reproductive proteins. Nat. Rev., Genet. 2002;3:137–144. 86. Nichols J, Smith A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 2009 Jun 5;4(6):487-92. 87. West FD, Roche-Rios MI, Abraham S, Rao RR, Natrajan MS, Bacanamwo M, Stice SL. KIT ligand and bone morphogenetic protein signaling enhances human embryonic stem cell to germ-like cell differentiation. Hum Reprod. 2010 Jan;25(1):168-78. 88. Medrano JV, Ramathal C, Nguyen HN, Simon C, Reijo Pera RA. Divergent RNA-binding proteins, DAZL and VASA, induce meiotic progression in human germ cells derived in vitro. Stem Cells. 2012 Mar;30(3):441-51. 89. Aflatoonian B, Ruban L, Jones M, Aflatoonian R, Fazeli A, Moore HD. In vitro post-meiotic germ cell development from human embryonic stem cells. Hum Reprod. 2009 Dec;24(12):3150-9. 90. Lim JJ, Shim MS, Lee JE, Lee DR. Three-step method for proliferation and differentiation of human embryonic stem cell (hESC)-derived male germ cells. PLoS One. 2014 Apr 1;9(4):e90454. 91. Chen HF, Jan PS, Kuo HC, Wu FC, Lan CW, Huang MC, Chien CL, Ho HN. Granulosa cells and retinoic acid co-treatment enrich potential germ cells from manually selected Oct4-EGFP expressing human embryonic stem cells. Reprod Biomed Online. 2014 Sep;29(3):319-32. 92. Tilgner K, Atkinson SP, Golebiewska A, Stojkovic M, Lako M, Armstrong L. Isolation of primordial germ cells from differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 2008 Dec;26(12):3075-85. 93. Xuemei L, Jing Y, Bei X, Juan H, Xinling R, Qun L, Guijin Z. Retinoic acid improve germ cell differentiation from human embryonic stem cells. Iran J Reprod Med. 2013 Nov;11(11):905-12. 94. Panula S, Medrano JV, Kee K, Bergström R, Nguyen HN, Byers B, et al. Human germ cell differentiation from fetal- and adult-derived induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 2011 Feb 15;20(4):752-62. 95. Alton M, Lau MP, Villemure M, Taketo T (2008) The behavior of the X- and Y-chromosomes in the oocyte during meiotic prophase in the B6. Y(TIR)sexreversed mouse ovary. Reproduction 135: 241– 252. 96. Park TS, Galic Z, Conway AE, Lindgren A, van Handel BJ, Magnusson M, et al. Derivation of primordial germ cells from human embryonic and induced pluripotent stem cells is significantly improved by coculture with human fetal gonadal cells. Stem Cells. 2009 Apr;27(4):783-95. 97. Duggal G, Heindryckx B, Warrier S, Taelman J, Van der Jeught M, Deforce D, et al. Exogenous supplementation of Activin A enhances germ cell differentiation of human embryonic stem cells. Mol Hum Reprod. 2015 May;21(5):410-23. 98. Kee K, Angeles VT, Flores M, Nguyen HN, Reijo Pera RA. Human DAZL, DAZ and BOULE genes modulate primordial germ-cell and haploid gamete formation. Nature. 2009 Nov 12;462(7270):222-5. 99. Handel MA, Eppig JJ, Schimenti JC. Applying "gold standards" to in-vitro-derived germ cells. Cell. 2014 Jun 5;157(6):1257-61. - 57 - 100. Eguizabal C, Montserrat N, Vassena R, Barragan M, Garreta E, Garcia-Quevedo L, et al. Complete meiosis from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 2011 Aug;29(8):1186-95. 101. Song N, Liu J, An S, Nishino T, Hishikawa Y, Koji T (Aug 2011). "Immunohistochemical Analysis of Histone H3 Modifications in Germ Cells during Mouse Spermatogenesis". Acta Histochemica et Cytochemica 44 (4): 183–90. 102. Seki Y, Yamaji M, Yabuta Y et al. Cellular dynamics associated with the genome-wide epigenetic reprogramming in migrating primordial germ cells in mice. Development 2007; 134: 2627–2638. 103. Griswold MD. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 1998;9(4):411–416. 104. Sharpe RM. The regulation of spermatogenesis. In: Knobil E, Neil JD, editors. The Physiology of Reproduction. 2nd edn. New York: Raven Press; 1993. p. 1363-1434. 105. Jarrow J, Zirkin B. The androgen microenvironment of the human testis and hormonal control of spermatogenesis. Ann N Y Acad Sci 2005;1061:208-220. 106. Yamanaka S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2008;363:2079–2087. 107. Bilic J, Izpisua Belmonte JC. Concise review: Induced pluripotent stem cells versus embryonic stem cells: close enough or yet too far apart? Stem Cells. 2012 Jan;30(1):33-41. 108. Mathews DJ, Donovan PJ, Harris J, Lovell-Badge R, Savulescu J, Faden R. Pluripotent stem cellderived gametes: truth and (potential) consequences. Cell Stem Cell. 2009 Jul 2;5(1):11-4. 109. Cutas D, Dondorp W, Swierstra T, Repping S, de Wert G. Artificial gametes: perspectives of geneticists, ethicists and representatives of potential users. Med Health Care Philos. 2014 Aug;17(3):339-45. 110. Human Fertilisation and Embryology Authority, Ethics and Law Committee. (2006). In vitro derived gametes. Report of the Meeting of 16th January 2006. 111. Testa G, Harris J. Ethics and synthetic gametes. Bioethics. 2005 Apr;19(2):146-66. 112. Hendriks S, Dondorp W, de Wert G, Hamer G, Repping S, Dancet EA. Potential consequences of clinical application of artificial gametes: a systematic review of stakeholder views. Hum Reprod Update. 2015 May-Jun;21(3):297-309. 113. Mertes H, Pennings G. Ethical aspects of the use of stem cell derived gametes for reproduction. Health Care Anal. 2010 Sep;18(3):267-78. 114. Baetens P, Devroey P, Camus M, van Steirteghem AC, Ponjaert-Kristoffersen I. Counseling couples and donors for oocyte donation: the decision to use either known or anonymous oocytes. Hum Reprod 2000;15:476–484. 115. Nuffield Council of Bioethics. Donor Conception: Ethical Aspects of Information Sharing. London: Nuffield Council, 2013. 116. Pennings, G. (2000). Multiple pregnancies: A test case for the moral status of medically assisted reproduction. Human Reproduction, 15, 2466–2469. 117. Pennings, G. (1999). Measuring the welfare of the child: In search of the appropriate evaluation criterion. Human Reproduction, 14, 146–150. 118. Robertson, J. (1994). Children of choice. Princeton, New Jersey: Princeton University Press. 119. Palacios-González C, Harris J, Testa G. Multiplex parenting: IVG and the generations to come. J Med Ethics. 2014 Nov;40(11):752-8. 120. Smajdor A, Cutas D. Artificial gametes and the ethics of unwitting parenthood. J Med Ethics. 2014 Nov;40(11):748-51. 121. ESHRE Task Force on Ethics and Law, Pennings G, de Wert G, Shenfield F, Cohen J, Tarlatzis B, Devroey P. ESHRE Task Force on Ethics and Law 13: the welfare of the child in medically assisted reproduction. Hum Reprod. 2007 Oct; 22(10):2585-8. 122. Golombok, S. 2005. Unusual families. Reproductive BioMedicine Online. 10(Supplemental 1):9-12. 123. Master, Z. 2006. Embryonic stem cell gametes: the new frontier in human reproduction. Human Reproduction. 21(4):857-863. 124. Mertes H. Gamete derivation from stem cells: revisiting the concept of genetic parenthood. J Med Ethics. 2014 Nov;40(11):744-7. 125. Kang L, Wang J, Zhang Y, Kou Z, Gao S. iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos. Cell Stem Cell. 2009 Aug 7;5(2):135-8. 126. Zhao XY, Li W, Lv Z, Liu L, Tong M, Hai T, Hao J, Guo CL, Ma QW, Wang L, Zeng F, Zhou Q. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature. 2009 Sep 3;461(7260):86-90. 127. Devolder K. To be, or not to be? Are induced pluripotent stem cells potential babies, and does it matter? EMBO Rep. 2009 Dec;10(12):1285-7. doi: 10.1038/embor.2009.244. Epub 2009 Nov 20. 128. Ishii T, Pera RA, Greely HT. Ethical and legal issues arising in research on inducing human germ cells from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2013 Aug 1;13(2):145-8. - 58 - 129. McLaren A. IVF: regulation or prohibition? Nature 1989;342:469-470. 130. Leese, H. J., & Whittall, H. (2001). Regulation of the transition from research to clinical practice in human assisted conception. Human Fertility, 4, 172–176. 131. Smajdor A. Artificial gametes. Background paper. December 2015. Beschikbaar via: http://nuffieldbioethics.org/wp-content/uploads/Background-paper-2016-Artificial-gametes.pdf. Geraadpleegd maart 2015. 132. Hayden EC. Technology: The $1,000 genome. Nature. 2014 Mar 20;507(7492):294-5. 133. Boseley S. End of infertility within a decade, say doctors. Beschikbaar via: http://www.theguardian.com/uk/2003/jul/25/science.research1. Geraadpleegd maart 2015. 134. Irie N, Weinberger L, Tang WW, Kobayashi T, Viukov S, Manor YS, et al. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate. Cell. 2015;160:253–268. 135. Sugawa F, Arauzo-Bravo MJ, Yoon J, Kim KP, Aramaki S, Wu G, et al. Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile. EMBO J. 2015;34:1009– 1024. 136. Moreno I, Míguez-Forjan JM, Simón C. Artificial gametes from stem cells. Clin Exp Reprod Med. 2015 Jun;42(2):33-44. 137. Dominguez AA, Chiang HR, Sukhwani M, Orwig KE, Reijo Pera RA. Human germ cell formation in xenotransplants of induced pluripotent stem cells carrying X chromosome aneuploidies. Sci Rep.2014;4:6432. 138. Tremellen K, Savulescu J. A discussion supporting presumed consent for posthumous sperm procurement and conception. Reprod Biomed Online. 2015 Jan;30(1):6-13. 139. Ethics Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Posthumous collection and use of reproductive tissue: a committee opinion. Fertil Steril. 2013 Jun;99(7):1842-5. 140. Newson AJ, Smajdor AC. Artificial gametes: new paths to parenthood? J Med Ethics. 2005 Mar;31(3):184-6. 141. Murphy TF. The meaning of synthetic gametes for gay and lesbian people and bioethics too. J Med Ethics. 2014 Nov;40(11):762-5. 142. Golombok S, Blake L, Casey P, Roman G, Jadva V. Children born through reproductive donation: a longitudinal study of psychological adjustment. J Child Psychol Psychiatry 2013;54:653–660. 143. Sparrow R. In vitro eugenics. J Med Ethics. 2014 Nov;40(11):725-31. 144. Douglas T. Stem cell-derived gametes, iterated in vitro reproduction, and genetic parenthood. J Med Ethics. 2014 Nov;40(11):723-4. 145. Ishii T. Germ line genome editing in clinics: the approaches, objectives and global society. Brief Funct Genomics. 2015 Nov 27. 146. Pennings G. New Belgian law on research on human embryos: trust in progress through medical science. J Assist Reprod Genet. 2003 Aug;20(8):343-6. 147. Liang P, Xu Y, Zhang X, Ding C, Huang R, Zhang Z, Lv J, Xie X, Chen Y, Li Y, et al. CRISPR/Cas9mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 2015;6:363–372. 148. Colvin JS, Green RP, Schmahl J, Capel B, Ornitz DM. Male-to-female sex reversal in mice lacking fibroblast growth factor 9. Cell. 2001 Mar 23;104(6):875-89 149. Zvetkova I, Apedaile A, Ramsahoye B, Mermoud JE, Crompton LA, et al. Global hypomethylation of the genome in XX embryonic stem cells. Nat Genet. 2005;37: 1274–1279. 150. Kashir J, Jones C, Child T, Williams SA, Coward K. Viability assessment for artificial gametes: the need for biomarkers of functional competency. Biol Reprod. 2012 Nov 8;87(5):114. 151. Daley GQ. Gametes from embryonic stem cells: a cup half empty or half full? Science 2007; 316:409 410. 152. Hassold T, Hunt P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2001 Apr;2(4):280-91. Review. 153. Hunt PA, Hassold TJ. Sex matters in meiosis. Science. 2002 Jun 21;296(5576):2181-3. Review. 154. Osafune K, Caron L, Borowiak M, Martinez RJ, Fitz-Gerald CS, Sato Y, et al. Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines. Nat Biotechnol 2008;26:313–315. 155. Bock C, Kiskinis E, Verstappen G, Gu H, Boulting G, Smith ZD, et al. Reference Maps of human ES and iPS cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell. 2011 Feb 4;144(3):439-52. 156. Dokshin GA, Baltus AE, Eppig JJ, Page DC. Oocyte differentiation is genetically dissociable from meiosis in mice. Nat Genet. 2013;45:877–883. 157. Morgan CT, Noble D, Kimble J. Mitosis-meiosis and sperm-oocyte fate decisions are separable regulatory events. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:3411–3416. 158. Coan PM, Burton GJ, Ferguson-Smith AC. Imprinted genes in the placenta—A review. Placenta. 2005;26:S10–S20. - 59 - 159. Morison IM, Ramsay JP, Spencer HG. A census of mammalian imprinting. Trends Genet. 2005 Aug;21(8):457-65. 160. Yinhua Yu, Fengji Xu, Hongqi Peng, Xianjun Fang, Shulei Zhao, Yang Li, et al. (1999) NOEY2 (ARHI), an imprinted putative tumor suppressor gene in ovarian and breast carcinomas. Proc Natl Acad Sci U S A.; 96(1): 214–219. 161. Hiura H, Okae H, Miyauchi N, Sato F, Sato A, Van De Pette M, et al. Characterization of DNA methylation errors in patients with imprinting disorders conceived by assisted reproduction technologies.Hum Reprod. 2012;27:2541–2548. 162. Ben-David U, Benvenisty N. The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nat Rev Cancer. 2011;11:268–27. 163. Zhao T, Zhang ZN, Rong Z, Xu Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature.2011;474:212–215. 164. Esfandiari F1, Mashinchian O2, Ashtiani MK3, Ghanian MH3, Hayashi K4, Saei AA5, et al. Possibilities in Germ Cell Research: An Engineering Insight. Trends Biotechnol. 2015 Dec;33(12):73546. - 60 - BIJLAGEN - 61 - BIJLAGE 1 Afkortingenlijst Afkorting AMH CM EpiLCs ESESCs FAC FISH FLSs FSH-R GC GCLCs GDNF GLCs hESCs hFGS hiPSCs ICSI Igfr2 iPSiPSCs LH-R LIF MEFs mESCs miPSCs mSLCs OLCs PGCs PGCLCs PSCDGs RA RT-PCR SCP3 SLCs Snrpn SSC Verklaring anti-mullerian hormone (anti-mulleriaans hormoon) conditioned medium (geconditioneerd medium) epiblast-like cells (epiblast-achtige cellen) embryonal stem cell- (embryonale stam-) embryonal stem cells (embryonale stamcellen) factor cocktail: BMP4, RA, cytochroom P450, CYP26 inhibitor R115866, SDF1, SCF, bFGF, n-acetyl-cysteïne en forskoline. fluorescence-in situ hybridization (fluorescentie-in-situhybridisatie) follicle-like structures (follikel-achtige structuren) follicle stimulating hormone-receptor (follikel stimulerend hormoon-receptor) germ cell (kiemcel) germ cell-like cells (kiemcel-achtige cellen) glial-derived neurotrophic factor (gliale cel- gederiveerde neurotrofische factor) gamete-like cells (gameet-achtige cellen) human embryonal stem cells (humane embryonale stamcellen) humane foetale gonadale stromale cellen human induced pluripotent stem cells (humane geïnduceerde pluripotente stamcellen) intracytoplasmic sperm-injection (intracytoplasmatische sperma-injectie) insulin-like growth factor 2 receptor gene induced pluripotent stem- (geïnduceerde pluripotente stam-) induced pluripotent stem cells (geïnduceerde pluripotente stamcellen) luteinizing hormone-receptor (luteïniserend hormoon-receptor) leukemia inhibitory factor mouse embryonic fibroblasts mouse embryonal stem cells (muis embryonale stamcellen) mouse induced pluripotent stem cells (muis geïnduceerde pluripotente stamcellen) mouse spermatogonial like cells (muis spermatozoön-achtige cellen) oocyte-like cells (oöcyt-achtige cel) primordial germ cells (primordiale kiemcellen) primordial germ cell-like cell (primordiale kiemcel-achtige cel) pluripotent stem cell-derived gametes (pluripotente stamcel-gederiveerde gameten retinoic acid (retinoïnezuur) reverse transcription polymerase chain reaction synaptonemal complex protein spermatozoon-like cell (spermatozoïde-achtige cel) small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N spermatogonial stem cell (spermatogoniale stamcel) - 62 - BIJLAGE 2 Tabel 1: mESC-gederiveerde gameten. Overzicht van gebruikte methodes bij de derivatie van PGCLCs, SLCs, OLCs of FLSs uit mESCs. Opmerking 1.: deze cellen werden enkel geëvalueerd o.b.v. merkers. Referentie Hübner et al., 2003 Toyooka et al., 2003 mESC-gederiveerde gameten Bron van cellen Derivatie Cultuur (geslacht) van mESCs (XY,XX) FLSs N/A mESCs (XY) SLCs BMP4, BMP8b Methode N/A Transplantatie van testesaggregaten naar testes N/A Testiculair celcultuur-CM Geijsen et al., 2004 Lacham-Kaplan et al., 2006 Nayernia et al., 2006 Novak et al., 2006 Qing et al., 2007 mESCs (XY) mESCs (XY) SLCs FLSs RA mESCs (XY) SLCs RA Transplantatie naar testes mESCs (XY) mESCs (XY) FLSs OLCs BMP4 RA Wei et al., 2008 mESCs (N/A) PGCLCs1 Nicholas et al., 2009 mESCs (XX) FLSs BMP4, BMP8b, BMP2, Wnt3a, ActivineA FAC N/A co-cultuur met ovariële granulosacellen N/A Silva et al., 2009 Young et al., 2010 mESCs (XY) mESCs (XY) SLCs1 PGCLCs1 RA, testoseron BMP4, BMP8b, BMP2 Hayashi et al., 2011 mESCs (XY) miPSCs (XY) SLCs *EpiLCs inductie: Activine A, bFGF en KSR *PGCLC-inductie: BMP4, BMP8b, LIF, SCF, EGF, WNT3 Co-cultuur + transplantatie naar testes Hayashi et al., 2012 mESCs (XX) miPSCs (XX) FLSs N/A Hu et al., 2012 mESCs (XY) OLCs1 RA Miryounesi et al., 2013 Nitta et al., 2013 mESCs (N/A) SLCs1 RA mESC (XX) FLSs BMP4 Talaei-Khozani et al., 2014 mESC (N/A) PGCLCs1 BMP4 Co-cultuur + transplantatie van ovarium-aggregaten naar ovaria Transplantatie van ovarium-aggregaten onder nierkapsel co-cultuur met sertolicellen Transplantatie onder nierkapsel N/A - 63 - Transplantatie van ovarium-aggregaten onder nierkapsel N/A N/A BIJLAGE 3 Tabel 2: Effecten van inducerende factoren bij mESC-gederiveerde gameten. mESC- en miPSC- gederiveerde gameten Inducerende factor BMP4 RA BMP8b Effect Referentie resulteert in een hogere efficiëntie van PGCLCinductie Toyooka et al., 2003 Wei et al., 2008 onduidelijk of een continue stimulatie met BMP4 noodzakelijk is Toyooka et al., 2003 Wei et al., 2008 Young et al., 2010 Toyooka de inductie is concentratie-afhankelijk: optimale concentratie is 100ng/ml Young et al., 2010 Wei et al., 2008 de inductie is tijdsafhankelijk Talaei-Khozani et al., 2014 geen stimulatie van de meiose Novak et al., 2006 stimulatie van folliculogenese Nitta et al., 2013 Combinatie van BMP4, LIF, SCF, BMP8b en EGF is krachtiger Hayashi et al., 2011 resulteert in een hogere efficiëntie van PGCLCinductie Silva et al., 2009 stimulatie van folliculogenese en spermatogenese Hu et al, 2012 Silva et al., 2009 stimulatie van de meiose Silva et al., 2009 Nayernia et al., 2006 de inductie is concentratie-afhankelijk: optimale concentratie is 2 μM Qing et al., 2007; Silva et al., 2009 de inductie is tijdsafhankelijk Silva et al., 2009 geen inducerend effect Young et al., 2010 Wei et al., 2008 een even sterk inducerend effect als BMP4 Young et al., 2010 geen synergistisch effect bij combinatie met BMP4 Young et al., 2010 Wnt3 onduidelijk effect Wei et al., 2008 Hayashi et al., 2011 Activine A geen inducerend effect Wei et al., 2008 Testosteron resulteert in een hogere efficiëntie van PGCLCinductie Silva et al., 2009 BMP2 synergistisch effect bij combinatie met RA de inductie is tijdsafhankelijk FAC resulteert in een hogere efficiëntie van PGCLCinductie en OLC-differentiatie - 64 - Nicholas et al., 2009 BIJLAGE 4 Tabel 3: mESC-gederiveerde gameten: RNA- en proteïne merkers. Opmerking: vetgedrukte termen zijn merkers die niet detecteerbaar waren. Merkers met kleine letters zijn mRNA-merkers, deze met hoofdletters zijn proteïne-merkers. Referentie RNA-merkers PGC Hübner et al., 2003 Proteïne merkers Meiose c-Kit, Mvh Oögenese Spermatogenese alkaline phosphatase, cKIT, E-cadherin, MVH OCT3-4, SSEA1 Toyooka et al., 2003 Geijsen et al., 2004 PGC Gdf9, Fig-alfa, StAR, P450 aromatase, CYP17, Zp2, Zp3, Zp1 Dazl, Gcnf, Rnf17, Tdrd1 Meiose Oögenese SCP1, SCP3, COR1, SYN1 GDF9, ZP2, ZP3, ZP1 Spermatogenese GCNA1, SCP3 acrosin, haprin, Piwil2, Rnh2, Sry, Tex14 C-KIT, MVH, OCT3-4 Lacham-Kaplan et al., 2006 Nayernia et al., 2006 Novak et al., 2006 Mvh, Fragilis, Oct4, stella, Rnf17 Qing et al., 2007 c-Kit, Fragilis, Mvh, Oct4, Stella Wei et al., 2008 Blimp1, Fgf8, Oct4, Sox2, Stella, T Sycp3 acrosin, Prm1, Tp2 DAZL, RBMY, STRA8 acrosin, haprin, Rfp, Sry MVH , OCT3-4 Sycp3 Sycp1, Sycp2, Stag3, Rec8, Smc1 Figa, Gdf-9, Zp1, Zp2, Zp3, Nobox C-KIT, MVH, OCT3-4, SSEA1 65 HSP-90alfa, PIWIL2 Vervolg tabel 3 Referentie RNA-merkers PGC Nicholas et al., 2009 Silva et al., 2009 Mvh, Nanos, Oct4, Stella, Stra8 Young et al., 2010 Acvr1, Blimp1, Dazl, Fragilis, Mvh, Nanog, Oct4, Smad1, Smad5, Stella Blimp1, Prdm14, Tcfap2c, Nanos3, stella, Tdrd5, Dnd1, Mvh (Ddx4) and Dazl Pou5f1, Sox2, Nanog, Prdm1, Prdm14, Tcfap2c, Dppa3, Nanos3, Uhrf1, Dnmt3a, Dnmt3b, Ddx4, Dazl Stella, Fragilis, Dazl, Oct4, ERas, c-Kit, Boule, Dmc1, Foxo3a Hayashi et al.¸ 2011 Hayashi et al., 2012 Nitta et al., 2013 Akap3, Dazl, Odf2, Stella, Stra8 Proteïne merkers Meiose Oögenese Spermatogenese PGC Meiose Piwil2, Prm1, Tex14, Prm2, Act DAZL MSY2, SCP1, SCP3 Oögenese Spermatogenese Gdf9 Sycp1, Sycp3, Msy2 PRM1, ACT NANOG, OCT4, STELLA Stra8, Smc1b Sycp3 DDX4 Zp1, Zp3, Gdf9, Figlα, Fgf8, Nobox, BMP15, Fshr, Lhcgr, StAR, Cyp11a1, Cyp19a1, Ptgs2 Amh SCP3 GDF9, ZP3 66 BIJLAGE 5 Tabel 4 Moleculaire evaluatie van mESC-gederiveerde oöcyten: meiose, hormonen, epigenetica en fertilisatie. mESC-gederiveerde OLCs Referentie Meiose Abnormaal Hormonen Normaal Abnormaal *expressie meiose-merkers SCP3, SCP1 Hübner et al., 2003 Normaal *oestradiol detectie *stijging mRNA steroidogenese-enzymen (StAR, P450 aromatase, CYP17) *vorming van poollichaampjesachtige cellen *reactie bij toevoegen van gonadotrofines Novak et al., 2006 *geen expressie van meiosemerkers SCP1, SCP2, STAG3, REC8 en SMC1 *expressie meiose-merker SCP3 *oestradiol detectie *SCP3 niet chromosomaal gelokaliseerd *geen synaps-vorming Qing et al., 2007 *cytoplasmatische lokalisatie van SCP3 *expressie meiose-merker SCP3 Nicholas et al., 2009 *abnormale chromosomale alignatie van SCP3 (gedeeltelijk) en SCP1 * expressie meiose-merkers SCP3, SCP1 en γ-H2AX *onvolledige synaps-vorming *nucleaire lokalisatie van SCP3, γ-H2AX en SCP1 67 Epigenetica Abnormaal Fertilisatie *blastocyst-achtige structuren, vermoedelijk door parthenogenetische activatie Vervolg tabel 4 mESC-gederiveerde oöcyten Referentie Meiose Abnormaal Hu et al., 2012 Hayashi et al., 2012 Epigenetica Normaal Abnormaal * expressie meiose-merker SCP3 *nucleair gelokaliseerd SCP3 Hormonen *normale inprentingverwijdering van H19, Igf2r, Kcnq1ot1 *geëlongeerd SCP3-patroon Fertilisatie Normaal *Na IVM en IVF: 2cellige embryo’s *40% ontwikkeling tot blastocyst *initiatie X-inactivatie bij EpiLCs *Na transfer: 5 nakomelingen geboren *reactivatie Xchromosoom bij PGCLCs: 2 actieve X-chromosomen *Normale inprenting *ontwikkeling tot volwassen, vruchtbare muizen *efficiëntie was laag, mogelijks door triploïdie (3 pronuclei) Nitta et al., 2013 *abnormale paternale inprenting van Snrpn en H19 *geen expressie van steroidogenesegeassocieerde genen *geen expressie van FSH-R en LH-R 68 *abnormale expressie van AMH BIJLAGE 6 Tabel 5: Moleculaire evaluatie van mESC-gederiveerde spermatozoa: meiose, hormonen, epigenetica en fertilisatie. Referentie Geijsen et al., 2004 mESC-gederiveerde spermatozoa Meiose Hormonen Abnormaal Normaal Normaal Abnormaal *lage efficiëntie *klein aantal haploïde cellen (nadeel flow cytometrie) Epigenetica Fertilisatie Normaal *expressie van LH-R en AMH *50% onderging 1 celdeling tot het 2-cellig stadium (n-125) *20% ontwikkelde zich tot blastocyst-achtige structuren *geen transfer naar uterus Nayernia et al., 2006 (SSC7) *haploïde cellen (nadeel flow cytometrie) *synaps-vorming *expressie meiosemerkers SCP3 en acrosin Nayernia et al., 2006 (SSC12) *geen inprenting-verwijdering Snrpn *initiatie inprentingverwijdering H19 en Igf2r *vorming poollichaampjes en pronucleaire formatie * onvolledig instellen paternaal inprenting-patroon H19 en Igf2r *gedeeltelijk correct instellen paternaal inprenting-patroon Snrpn *ontwikkeling zygotes tot preimplantatie embryo’s met normale kenmerken *geen inprenting-verwijdering Snrpn *verwijdering inprenting H19 en Igf2r *onvolledig instellen paternaal inprenting-patroon H19 *gedeeltelijk correct instellen paternaal inprenting-patroon Igf2r en Snrpn *initiatie inprentingverwijdering Peg3 en Igf2r Wei et al., 2006 Silva et al., 2009 Young et al., 2010 *expressie meiosemerker SCP3 *geen inprenting-verwijdering H19 69 *65 embryo’s transfer naar uterus *12 nakomelingen geboren: abnormaal gestalte en premature mortaliteit Hayashi et al., 2011 *geen inprenting-verwijdering Igf2r en Snrpn *initiatie inprentingverwijdering Kcnq1ot1 en H19 *normale placenta’s en inprenting patronen *globale hypomethylatie *detectie van transgenen (BV en SC) bij de nakomelingen *gezonde en vruchtbare mannelijke en vrouwelijke muizen 70 BIJLAGE 7 Tabel 6: Overzicht miPSC-gederiveerde GLCs. miPSC-gederiveerde GLCs Referentie Imamura et al., 2010 Bron (geslacht; bron iPSCs) miPSCs (XY, hepatocyten) Inductiefactoren Derivatie van OLCs BMP4, GDNF, EGF Hayashi et al., 2011 miPSCs (XY,MEFs) en mESCs (XY) SLCs BMP4, BMP8b, LIF, SCF, EGF, WNT3 Yang et al., 2012 miPSCs (XY, neurale progenitorcellen) mannelijke kiemcellen RA Zhu et al., 2012 miPSCs (XY, neurale progenitorcellen) SLCs RA Hayashi et al., 2012 miPSCs (XX, MEFs) en mESCs (XX) miPSCs (MEFs) FLSs BMP4, BMP8b, LIF, SCF, EGF, WNT3 RA en testosteron miPSCs (MEFs en TTFs) SLCs Li et al., 2013 Li et al., 2014 mannelijke kiemcellen BMP4, BMP8b, SCF Meiose Methode N/A transplantatie rechtstreeks in tubuli seminiferi testes injectie samen met testiculaire cellen in de dorsale huid van muizen transplantatie rechtstreeks in tubuli seminiferi testes Transplantatie van ovarium-aggregaten naar ovarium N/A Transplantatie rechtstreeks in tubuli seminiferi testes 71 Abnormaal *geen detectie van late meiose merkers (Miwi, Crem, Tp1, Tp2, Prm1) Normaal *expressie meiosemerkers Sycp1, Sycp3, Hox4A, Haprin *geen detectie van late meiose merkers (Tp1, Prm1) *expressie meiosemerkers Sycp3, Haprin Epigenetica *slechts gedeeltelijke demethylatie van Mvh *demethylatie van Nanog *expressie van meiosemerker sycp3 * detectie van meiosemerkers (sycp1, sycp3) en late meiose-merkers (Msy2, Akap3) *2-8% haploïde cellen BIJLAGE 8 Tabel 7: Merkers van hESC- en hiPSC-gederiveerde gameten. Een overzicht van verscheidene mRNA- en proteïne-merkers tijdens GLCderivatie. Vetgedrukte termen zijn merkers die niet detecteerbaar waren in de cultuur. hESC- en hiPSC-gederiveerde gameten Referentie PGC / pre-meiose mRNA-merkers Meiose Oögenese Clark et al., 2004 Kee et al., 2006 Tilgner et al.¸2008 Bucay et al., 2009 Nanos1, Dazl, Vasa Scp1 Vasa Scp3 Vasa, Stella, Oct4 Scp1, Scp3 Park et al., 2009 Vasa, Prdm1, Stella, Dazl Aflatoonian et al., 2009 West et al., 2010 Oct4, Vasa, Dazl Scp3 Oct4, Vasa, Dazl, Fragilis, Stella, c-kit, Nanog, Cxcr4, Nanos1 Vasa, Ifitm1, Pelota, Prdm1a, Stellar, Gcnf Mlh1, Scp1, Scp3 Panula et al., 2011 Eguizabal et al., 2011 Easley et al.¸ 2012 Prdm1, Stella, Dazl, c-kit, Vasa Gdf9 Zp1, Zp2, Zp3 Gdf9, ZP1 Spermatogenese Tekt1 PGC DAZL, VASA SCP3, MLH1 c-KIT, SSEA4, VASA SCP3 Acrosin, Mis, Fshr, Sox-9 Prm1, Prm2, Tnp1, Tnp2, H1t Spermatogenese FSHR, HS14 VASA, SSEA1, c-KIT, PLAP C-KIT, DAZL, VASA, SSEA1 ZP PRM1, 1.97 Pum2, Piwil2 Dmc1 Scp3, γH2ax Proteïne merkers Meiose Oögenese VASA, DAZL ACROSIN Zp1, Zp3, FIG1α Vasa, Dazl CD9, CD49f, CD90, SSEA Plzf, Cxcr4, Acrosin, Piwil1, Utf1, Cdh1, Ret, Gfr α1 Medrano et al., 2012 Xuemei et al., 2013 Lim et al., 20141 Vasa, Dazl, Ifitm1, Prdm1a, Gcnf, Gdf3, cKit, Pelota Scp3, Mlh1, Dmc1 Gdf9, Zp4 Vasa Scp3 Gdf9 Chen et al., 2014 Duggal et al., 2015 Vasa, c-Kit Scp3 c-Kit, Vasa, Dazl, Stella, Oct4 Scp3 c-Kit HILI SCP3 SCP3, CENPA Tekt1 Tp-1, Iap, integrine α6, Th2b Gdf9, Zp3 VASA, GFR-α1 SSEA1, OCT4, VASA VASA, OCT4 72 SCP3 PIWIL1, ACROSIN, PROTAMINE 1, TRANSITION PROTEIN 1 ACROSIN BIJLAGE 9 Tabel 8: Overzicht hESC- en hiPSC-gederiveerde gameten. Een samenvatting van verscheidene studies die humane GLCs genereerden. De functionele parameters van de GLCs, meiose en epigenetica, worden ingedeeld in ‘onvolledig’ en ‘volledig’. hESC- en hiPSC-gederiveerde gameten Referentie Clark et al., 2004 Bron (geslacht; bron iPSCs) hESCs (XX en XY) Derivatie van mannelijke en vrouwelijke gonocytachtige cellen Methode spontaan Meiose Epigenetica ‘Volledig’ Onvolledig ‘Volledig’ *vermoedelijk klein aantal haploïde cellen (nadeel: flow cytometrie) *initiatie inprentingverwijdering H19 en Igf2r *histon modificatie PGCLCs equivalent aan PGCs Onvolledig *expressie meiosemerker SCP3 *geen expressie meiosemerker MLH1 *vooral cytoplasmatische lokalisatie van SCP3 *subgroep nucleaire lokalisatie SCP3: punctiforme SCP3 kleuring Kee et al.¸ 2006 Tilgner et al., 2008 hESCs (XX) PGCLCs hESCs (XX) PGCLCs BMP4, BMP7, BMP8b spontaan, (BMP4)1 *geen haploïde cellen *expressie meiosemerker SCP3 *expressie meiosemerkers SCP1 en SCP3 *cytoplasmatische lokalisatie van SCP3 *geen synaps-vorming Bucay et al.¸ 2009 hESCs PGCLCs cultuur hESCs: kleine clusters en minder ‘feeding cycles’ N/A 73 Park et al., 2009 hESCs (XX, XY), hiPSCs (XY, dermale fibroblasten) Aflatoonian hESCs (XX, XY) et al.¸ 2009 West et al., 2010 hESCs (XY) PGCLCs 3 methodes: -co-cultuur met hFGS2 -CM hFGS -monolayer zonder hFGS *geen expressie meiosemerkers FLSs, SLCs RA *expressie meiosemerker SCP3 PGCLCs BMP4 *expressie van meiose merkers SCP1, SCP3, MLH1 * initiatie inprentingverwijdering H19 en Igf2r *geen inprentingverwijdering Peg1 *vermoedelijk ∼0.5% haploïde cellen (nadeel: flow cytometrie) * geen inprentingverwijdering H19, Igf2, Snrpn, Snurf *geen globale demethylatie Panula et al., 2011 Eguizabal et al., 2011 hESCs (XY, XX), hiPSCs (XY, adulte fibroblasten; XX, foetale fibroblasten) hESCs (XX, XY), hiPSCs (XX, XY; keratinocyten en navelstrengbloed) SLCs SLCs BMP4, BMP7, BMP8b + overexpressie van DAZL, BOULE en DAZ *meerderheid geen SCP3 kleuring *max ~0.4% haploïde cellen (FISH) *subgroep met ‘slechts’ initiatie meiose (punctiforme SCP3 kleuring) * klein aantal cellen met geëlongeerd SCP3 patroon 3 stappen: 1. monolayer 2. +RA 3. +LIF, bFGF, FRSK, CYP26 inhibitor *co-lokalisatie van SCP3 met chromosomen * tussen de 0.4% en 2.3% haploïde cellen (FISH) *expressie van meiose merkers (mRNA): Scp3, γH2ax 74 *fout instellen paternaal inprentingpatroon H19 bij 2 hiPS-cellijnen *correct instellen paternaal inprentingpatroon H19 bij 4 van de 6 cellijnen *expressie gelijkaardig aan spermatozoa van paternaal (Phlda en Cdkn1c) en maternaal (Mest, Igf2, Nnat, Snrpn) inprenting-genen Easley et al., 2012 Medrano et al., 2012 hESCs (XX3, XY) en hiPSCs (XY; fibroblasten) hESCs (XX, XY), hiPSCs (XX) SLCs SLCs muis-SSC cultuur (GDNF+)4 *spontane differentiatie *overexpressie van Vasa *~4% haploïde cellen (FISH) die acrosineexpressie vertonen *meerderheid geen SCP3 kleuring *subgroep met ‘slechts’ initiatie meiose (punctiforme SCP3 kleuring) *expressie meiose-merker SCP3 *max ~0.7% haploïde cellen (FISH) die acrosineexpressie vertonen *klein aantal cellen met geëlongeerd SCP3 patroon *expressie meiose-merkers Scp3, Mlh1, Dmc1, Cenpa Xuemei et al., 2013 Lim et al., 2014 hESCs (XX, XY) FLSs, SLCs RA hESCs (XY) SLCs Chen et al.¸2014 hESCs (XX) OLCs Duggal et al., 2015 hESCs (XX, XY) PGCLCs 3 stappen: 1. BMP4 + RA 2. GC-proliferatie medium met EGF, bFGF, GDNF en LIF 3. 3D-co-cultuur o.b.v. alginaat met testiculaire cellen *RA * SCF, BMP4, BMP7, BMP8b *co-cultuur met granulosacellen *CM o.b.v. granulosacellen *BMP4 + ActivineA *IVM *enkel detectie Scp3mRNA *~3% haploïde cellen (FISH) *enkel detectie Scp3mRNA *enkel detectie Scp3-mRNA, niet van het proteïne SCP3 75 *correct instellen paternaal inprentingpatroon H19 en Igf2r * geen inprentingverwijdering H19 (zonder overexpressie of met DAZL overexpressie) *initiatie inprenting verwijdering H19 bij VASAoverexpressie
