Antimicrobiele geneesmiddelen

Antibiotica
Inhoudsopgave
De ontwikkeling van chemotherapeutica _____________________________ 2
De ontdekking van antibiotica _____________________________________ 2
Het werkingsspectrum van een antibioticum __________________________ 3
Hoe werken antibiotica? __________________________________________ 4
1. De remming van de celwandsynthese __________________________ 4
2. De penicillinegroep _________________________________________ 5
3. De remming van de eiwitsynthese _____________________________ 7
4. Beschadiging van de celmembraan ____________________________ 7
5. De remming van de nucleinezuursynthese. _____________________ 8
De remming van de synthese van essentiële (onmisbare)
stofwisselingsproducten. __________________________________________ 9
Het combineren van antimicrobiële geneesmiddelen __________________ 10
Resistentieontwikkeling __________________________________________ 10
6. Het mechanisme van de resistentie ___________________________ 13
7. Gewoonten die tot resistentie leiden __________________________ 13
8. MRSA. __________________________________________________ 14
Bepalingen op het lab ___________________________________________ 16
9. De gevoeligheid van micro-organismen en de bepaling ervan. ____ 16
De gevoeligheidsbepalingen ______________________________________ 17
10.
De MIC-bepaling________________________________________ 17
11.
Het maken van een antibiogram d.m.v. de agardiffusiemethode. 18
De bepaling van de (aanwezigheid en de) concentratie van antimicrobe
stoffen. _______________________________________________________ 21
12.
De verdunningsmethode __________________________________ 21
13.
De agardiffusiemethode __________________________________ 21
14.
De groeiremmingstest ____________________________________ 22
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
1
Antibiotica
De ontwikkeling van chemotherapeutica
Het ontstaan van de chemotherapie (en de naam zelf) is te danken
aan Paul Ehrlich (zie video).( In dit verband verstaat men onder
chemotherapie het bestrijden van een ziekteverwekker in een patiënt
met behulp van een chemische stof zodat de patiënt geneest).Deze
onderzoeker slaagde er begin 20e eeuw in bacteriën selectief te
kleuren waardoor de bacteriën gekleurd worden maar niet het
weefsel waarin ze aanwezig zijn..
Hij kwam zo op het idee van een ‘magic bullet’ een stof die wel
schadelijk is voor de pathogene micro-organismen maar niet voor de
gastheer (patiënt).Zo ontwikkelde ( bij de 606de poging) de
arsenicumverbinding salvarsan een goed geneesmiddel tegen syfilis.
Dankzij dit idee zijn nog meer selectieve stoffen gevonden die als
geneesmiddel dienst doen zoals de sulfaprepraten.
De ontdekking van antibiotica
In 1928 nam Alexander Fleming waar dat de bacterie
Staphylococcus aureus in zijn groei geremd werd op de plaats waar
een schimmel(infectie) aanwezig was.
De schimmel was een Penicillium. Fleming kwam op het idee de
schimmel te gaan kweken om de werkzame stof te gebruiken als
geneesmiddel. Na uitvoerig onderzoek werd een stof
aangetroffen penicilline genoemd die werkt(e) tegen gram-positieve
bacteriën Aanvankelijk was de gevormde hoeveelheid zeer klein: de
eerste patiënt kon met deze hoeveelheid niet
gered worden. 10 jaar later (net voor de 2e wereldoorlog) en ook
tegenwoordig wordt Penicillium in torenhoge vaten gekweekt voor
de penicillineproductie.
Soortgelijke remmende reacties tussen kolonies op vaste
voedingsbodems worden vaak waargenomen in de microbiologie,
dit verschijnsel wordt antibiose genoemd. Van dit woord komt de
term antibioticum( meervoud: antibiotica), een stof geproduceerd
door een micro-organisme welke in zeer lage concentraties de groei
van andere micro-organismen remt. Naderhand zijn nog vele andere
antibiotica ontdekt. Meer dan de helft van alle toegepaste antibiotica
zijn gevormd door Streptomycessoorten, draadvormige bacteriën die
voorkomen in de grond.Een ander deel door het geslacht Bacillus en
de rest door de schimmels
Strikt genomen zijn de eerder genoemde sulfa-preparaten geen
antibiotica ,in de praktijk maakt men echter geen onderscheid , de
termen chemotherapie en antibiotica worden beide gebruikt bij het
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
2
Antibiotica
behandelen van infectieziekten zowel met behulp van antibiotica als
met chemotherapeutica.
Antibiotica zijn tamelijk makkelijk te ontdekken, echter maar
weinige zijn van medische betekenis. Veel antibiotica zijn te giftig
voor mensen en bieden geen voordelen boven de al in gebruik
zijnde antibiotica.
Het werkingsspectrum van een antibioticum
Het is relatief gemakkelijk om een stof te vinden of te ontwikkelen
die werkt tegen prokaryote cellen (bacteriën) en die niet werkt tegen
eukaryote cellen (de mens = patiënt). De oorzaak is dat deze cellen
vele verschillen vertonen : de aanwezigheid/ afwezigheid van een
celwand, de bouw van de ribosomen, en details in de stofwisseling.
Dus de selectieve giftigheid heeft veel mogelijke doelen waar het
op kan ingrijpen.
Een probleem ontstaat als de pathogeen ook een eukaryoot is:
schimmels, protozoën en wormen.
Deze laatste lijken door hun eukaryote cel zo veel op de te
behandelen gastheer dat er veel minder aangrijpingspunten voor een
selectief remmende of dodende stof zijn, er zijn dan ook minder van
dergelijke geneesmiddelen.
Voor virussen is het nog moeilijker een selectief remmende stof te
vinden omdat deze organismen in de gastheer gebruik maken van de
stofwisseling en de organellen van de gastheer. Rem je het virus dan
leg je ook de stofwisseling van de gastheer plat.
Kijken we weer naar de antibacteriële antibiotica dan zijn er ook
onderlinge verschillen. Sommige antibiotica hebben een smal
werkingsspectrum, dat wil zeggen dat ze tegen een beperkt aantal
groepen van bacteriën werkzaam zijn. Zo werkt penicilline tegen
grampositieve bacteriën en slechts tegen enkele gramnegatieve
bacteriën. Antibiotica die tegen een groot aantal zowel
gramnegatieve als grampositieve bacteriegroepen werken noemt
men breed-spectrumantibiotica,
Een verklaring is gelegen in het feit dat gramnegatieve cellen een
buitenmembraan om de celwand hebben . Hierin bevinden zich
poriën, kleine met water gevulde kanaaltjes. Stoffen die deze
kanaaltjes kunnen passeren moeten niet al te groot zijn en bij
voorkeur hydrofiel. Erg grote moleculen en stoffen die lipofiel zijn
komen niet gemakkelijk een gramnegatieve cel binnen.
Omdat de identiteit van een ziekteverwekker niet altijd direct
bekend is lijkt een breed-spectrumantibioticum op het eerste gezicht
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
3
Antibiotica
het meest aantrekkelijk doordat een tijdrovende identificatie niet
nodig is en men direct met de behandeling kan beginnen.
Een nadeel is echter dat de normale (darmflora) van de patiënt
door een breed-spectrumantibioticum vernietigd wordt. Deze flora
is nuttig omdat deze een competitie voert met eventueel
binnendringende pathogene micro-organismen. Deze vorm van
natuurlijke afweer gaat zo verloren. Ook kunnen overlevende microorganismen van de flora van de patiënt zich gaan ontwikkelen en
pathogeen worden (opportunistisch pathogenen). Een bekend
voorbeeld is de groei van Candida albicans. Dit verschijnsel wordt
ook wel superinfectie genoemd. Deze term superinfectie wordt ook
gebruikt als er groei optreedt van het te bestrijden m.o. doordat dit
m.o. een resistentie heeft ontwikkeld. Het resistente microorganisme kan ongehinderd doorgroeien en vervangt zo de
oorspronkelijk ongevoelige stam.
Antimicrobiele stoffen zijn hetzij bactericide-, ze doden bacteriën
direct ,of ze zijn bacteriostatisch, ze voorkomen de groei van
micro-organismen.
De verschillende werkingsmechanismen worden hieronder
besproken.
Hoe werken antibiotica?
1. De remming van de celwandsynthese
Zoals je misschien nog weet bestaat de celwand van bacteriën uit
peptidoglycaan . Andere organismen bezitten deze structuur niet.
Penicilline en nog enkele andere antibiotica remmen de synthese
van peptidoglycaan. Het gevolg is een sterk verzwakte celwand
waardoor de cel lyseert. Het is een bactericide middel. Omdat alleen
de synthese wordt verstoord, werkt penicilline uitsluitend in op
groeiende cellen.
Penicilline voorkomt de binding tussen de aminosuikers NAG en
NAM, waardoor er geen stevige celwand kan ontstaan en de cel
lyseert.
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
4
Antibiotica
.
2. De penicillinegroep

Penicilline afkomstig uit culturen van de schimmel Penicillium
bestaat in verschillende nauw aan elkaar verwante vormen. Zij
worden de zogenaamde natuurlijke penicillinen genoemd. Het
prototype is penicilline G. Het heeft een smal maar nuttig
werkingsspectrum en is vaak de eerste keus tegen de meeste
staphylococcen, streptococcen, en enkele spirochaeten. Hoewel veel
gebruikt zijn er ook enkele nadelen:
het antibioticum kan slecht tegen een lage pH, een nadeel voor
oraal (pilletje) gebruik .
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
5
Antibiotica

en kan slecht tegen penicillinase een enzym gevormd door
resistente bacteriestammen. Penicillinase verbreekt de ß- lactam ring
van het penicillinemolecuul reden om penicillinases ook wel ßlactamases te noemen.
In beide gevallen dus verminderde of geen werkzaamheid van het
antibioticum. Om deze nadelen op te heffen is men gaan sleutelen
aan het penicillinemolecuul om dit zuurbestendig te maken en
ongevoelig voor penicillinase dit kan op twee manieren
 het stoppen van de penicillinesynthese door de schimmel en de kern
(ß-lactamring= werkzaam gedeelte, de vierkante ring in
bovenstaande structuurformule) van het molecuul gebruiken voor
verdere aanbouw van zijketens met als doel deze ongevoelig te
maken voor zuur en penicillinase.
 Van het al complete molecuul de zijketen verwijderen en vervangen
door een andere keten
In beide gevallen is er sprake van een gedeeltelijke aanmaak door de
schimmel een een gedeeltelijk chemisch proces, vandaar de naam
semi-synthetische of halfsynthetische penicillinen.
Methicilline was een van de eerste penicillinen, bedoeld om aan de
penicillinasewerking van de resistente stammen te ontkomen (door
de andere ruimtelijke structuur paste het niet meer in het
penicillinasemolecuul van de bacterie) werd zeer veel gebruikt.
Echter vele bacteriesoorten ontwikkelden opnieuw resistente
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
6
Antibiotica
stammen , nu tegen deze stof, zodat als opvolger oxacilline is
ontwikkeld.
Ook kan men semi-synthetische penicillinen ontwikkelen met een
breder werkingsspectrum, zoals ampicilline en amoxicilline.. Toen
de resistentie tegen deze stoffen gebruikelijk werd werden de
carboxypenicillinen ontwikkeld.
Zo gaat de ontwikkeling steeds verder: men ontwikkelt een
nieuw antibioticum, de bacterie ontwikkelt een resistentie en
men zal weer een nieuw antibioticum moeten ontwikkelen: zie
ook het krantenartikel aan het eind van dit moduleboekje, lees dit
goed door het hoort gewoon bij de leerstof. Behalve voor penicilline
geldt deze resistentieproblematiek ook voor alle andere antibiotica
(met de andere werkingsmechanismen die hieronder worden
besproken)
Een andere benadering van het penicillinaseprobleem is het
toevoegen van een penicillinaseremmer aan het antibioticum, zo
wordt aan amoxicilline de stof clavulaanzuur toegevoegd
3. De remming van de eiwitsynthese
Omdat de eiwitsynthese een gemeenschappelijk verschijnsel is bij
zowel eukaryote als prokaryote cellen, lijkt het een ongeschikt
doelwit voor een selectief giftige stof. Er is echter een verschil: de
structuur van de ribosomen. Eukaryote cellen hebben 80S
ribosomen, prokaryote cellen 70S ribosomen. Hierdoor kunnen
antibiotica toch selectief de eiwitsynthese van de prokaryote cel
verstoren. De mitochondriën van de eukaryote cel bevatten echter
ook 70S ribosomen: oorzaak van de bijwerkingen die deze
antibiotica kunnen vertonen. Bekende voorbeelden zijn
streptomycine, chlooramfenicol en tetracycline..
4. Beschadiging van de celmembraan
Bepaalde antibiotica, de polypeptideantibiotica, veranderen de
permeabiliteit van de bacteriele celmembraan, waardoor belangrijke
stofwisselingsproducten uit de cel lekken. Zo maakt polymyxine B
door zijn hechting aan de fosfolipiden de celmembraan kapot.. het
middel is bactericide. het werkt uitsluitend tegen gram-negatieve
cellen. Omdat het tegen de celmembraan werkt is het ook giftig voor
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
7
Antibiotica
de mens het wordt dan ook slechts in speciale gevallen gebruikt.
(zalven, sterilisatie van het maag-darmkanaal: mogelijk omdat de
stof niet geresorbeerd wordt). In de analytische microbiologie is de
stof geschikt voor de bereiding van selectieve voedingsmedia. .
Er zijn ook antibiotica die (tamelijk selectief) tegen schimmels
werken dankzij het feit dat ze zich hechten aan de sterolen die in de
schimmelcelmembraan aanwezig zijn, waardoor deze kapot gaat.
Omdat bacteriecelmembraan geen sterolen bevat, werken deze
stoffen niet tegen bacteriën De zoogdiercel bevat echter wel sterolen
in zijn celmembraan, zodat deze antibiotica giftig kunnen zijn voor
de gastheer. Gelukkig bevat de zoogdiercel voornamelijk het sterol
cholesterol en de schimmelcel het sterol ergosterol in de
celmembraan, zodat meestal de voordelen groter zijn dan de
nadelen. Voorbeeld van zo'n stof is nystatine (ook wel natamycine
) genoemd, veel gebruikt bij huidinfecties veroorzaakt door
schimmels en in de kaasindustrie om beschimmelen van de
kaaskorst te voorkomen.
5. De remming van de nucleinezuursynthese.
Een aantal antibiotica interfereren met de DNA-transcriptie en
translatie in micro-organismen. De meeste stoffen met deze werking
zijn ook zeer giftig voor de gastheer; enkele niet ,zoals rifampicine
dat zich bindt aan het enzym RNA-polymerase van bacteriën en
sommige virussen..
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
8
Antibiotica
De remming van de synthese van essentiële (onmisbare)
stofwisselingsproducten.
Als een antibioticum in staat is de synthese van een voor de bacterie
belangrijk stofwisselingsproduct te verhinderen, dan zal de bacterie
niet meer kunnen groeien.
Meestal wordt de synthese geblokkeerd doordat het antibioticum
zoveel op een substraat lijkt dat het de plaats van dit substraat gaat
innemen op het enzym dat verantwoordelijk is voor de synthese van
de onmisbare stof: competitieve remming. Een heel bekend
voorbeeld is de synthese van foliumzuur. Foliumzuur is onmisbaar
voor de aanmaak van de basen in het RNA en DNA en vele
aminozuren.
Para-amino-benzoezuur moet door een enzym omgezet worden in
dit foliumzuur.
Echter sulfanilamide het door Ehrlich ontdekte chemotherapeuticum
lijkt zeer veel op para-amino-benzoezuur , gaat op het enzym zitten,
verhindert zo de omzetting in foliumzuur en stopt de groei van het
micro-organisme.
Zoogdieren nemen dit foliumzuur op met het voedsel, microorganismen kunnen dit niet door de celmembraan opnemen, hetgeen
de selectieve werking van sulfanilamide verklaart.
Stoffen die de stofwisseling verstoren (blokkeren) worden ook wel
antimetabolieten genoemd.
Paraaminobenzoezu
ur
sulfanilamide
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
9
Antibiotica
Het combineren van antimicrobiële geneesmiddelen
Soms dient men twee antibiotica tegelijk toe; in spoedgevallen
waarbij de ziekteverwekker niet bekend is, bij menginfecties van
bacteriën die verschillen in gevoeligheid, maar ook om een betere
werkzaamheid te krijgen danmet één middel het geval is.
Dit verschijnsel wordt synergisme genoemd, zo wordt bij een
ernstige streptococceninfectie wel een combinatie van ampicilline
en gentamycine gebruikt. Ampicilline verzwakt de wand van de
streptococ zodat het gentamycine gemakkelijker toegang krijgt tot
de cel.
Het tegenovergestelde ongewenste effect dat twee antibiotica elkaar
in werking verzwakken heet antagonisme, zo kan de combinatie
van een bacteriostatisch middel met een bactericide middel
problemen opleveren; het bacteriostatische middel bijvoorbeeld
chlooramfenicol legt de groei van de bacterie plat waardoor een
bactericide middel dat de bouw van de celwand verstoort zijn werk
niet kan doen.
Resistentieontwikkeling
Zoals al duidelijk zal zijn is een m.o. niet voor alle antibiotica
gevoelig. Is de bacterie ongevoelig dan spreekt men van resistentie.
Een micro-organisme kan van nature ongevoelig=resistent zijn. De
oorzaak is dan dat het m.o. geen aangrijpingspunt bezit waar het
antibioticum op kan inwerken: zo zal een gist nooit gevoelig zijn
voor penicilline!
Een ander type resistentie is de verworven resistentie , een
resistentie die oorspronkelijk niet aanwezig is maar die het m.o.
heeft verworven.Deze ongevoeligheid wordt bepaald door het DNA,
de verworven resistentie ontstaat dan ook altijd doordat de erfelijke
eigenschappen van het m.o. zijn veranderd. Deze genetische
verandering kan ontstaan in het bacteriechromosoom zelf maar ook
in de plasmiden.
Het ontstaan van de resistentie (de genetische verandering)
Een bacterie kan op verschillende manieren genetisch veranderen:

Mutatie
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
10
Antibiotica
Hoewel de vermeerdering van bacteriën een kwestie van delen is en
er dus in feite sprake is van een eindeloze herhaling van hetzelfde
proces, namelijk het kopiëren van hetzelfde DNA-molecule. zal er
af en toe een foutje optreden bij het kopiëren, waardoor het DNA
van samenstelling verandert met als mogelijk gevolg een veranderde
betekenis van de code en dus een ander eiwit als product, en dus een
andere eigenschap bij de bacterie die dit veranderde DNA heeft
gekregen.

Conjugatie
Een andere manier is de overdracht van DNA van de ene bacteriecel
naar de andere. Dit proces heet conjugatie. Dit proces kan
plaatsvinden tussen bacteriën van dezelfde soort maar ook tussen
bacteriën van verschillende soorten of zelfs geslachten. De
donorbacterie is in het bezit van de F-factor, die ervoor zorgt dat er
een hol buisje gevormd wordt welke een verbinding legt met de
ontvangende bacterie. Door dit buisje wordt DNA overgebracht
waarna de verbinding weer wordt verbroken. Zeer vaak betreft het
gedeeltes van plasmiden. Betrof het een resistentiefactor dan is de
gevoelige bacterie na ontvangst van het DNA resistent geworden.
Deze overdracht komt vooral voor bij gramnegatieve
(darm)bacteriën Berucht zijn de multi-resistente E.colibacteriën
bijvoorbeeld een Salmonella die in de darm hun resistentie kunnen
overbrengen op een pathogeen .Deze pathogeen is daardoor niet
meer te bestrijden met de gangbare antibiotica waardoor de patiënt
dus niet te behandelen is.
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
11
Antibiotica
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
12
Antibiotica
 Transductie.
Dit is de overdracht van DNA door tussenkomst van een
bacteriofaag. Dit komt in de volgende studie-eenheid aan de orde.
Wat hier van belang is dat een virus in staat is om een stukje DNA,
en dus een stukje erfelijke informatie, over te brengen van de ene
naar de andere bacteriecel.. Een voorbeeld is de multi(oorspronkelijk methicilline) resistente Staphylococcus aureus,
afgekort als mrsa bacterie.
6. Het mechanisme van de resistentie
De gevolgen van de DNA-veranderingen die tot resistentie leiden
kunnen zijn:




een veranderde permeabiliteit van de celenveloppe ( de buitenste
membraan van de gramnegatieve celwand)
de productie van enzymen die het antibioticum onwerkzaam maken
voordat het antibioticum de bacterie aantast, voorbeeld het enzym
penicillinase, nu meestal ß-lactamase genoemd, het enzym dat de ßlactamring bij de antibiotica van de penicillinegroep aantast
waardoor deze hun werking verliezen.
het wijzigen van de ribosomen waardoor deze geen aangrijpingspunt
meer zijn voor de voorheen wel werkzame antibiotica.
wijziging van een stofwisselingsproces. Is een voorheen
sulfanilamide gevoelige bacterie na een genetische verandering in
staat om foliumzuur uit de omgeving op te nemen dan is hij vanaf
dat moment ongevoelig voor sulfanilamide.
7. Gewoonten die tot resistentie leiden
Een groot aantal gewoontes leidt tot een toename van het aantal
resistente stammen.
1. Het op grote schaal toepassen en voorschrijven van antibiotica door
artsen (vooral in Amerika)
2. De vraag van patiënten om antibiotica bij een verkoudheid of griep
3. Het gebruik van antibiotica bij immuun-deficiente patiënten om
infecties te voorkomen
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
13
Antibiotica
4. Het niet opvolgen van het gebruiksvoorschrift door de patiënt
(bijvoorbeeld de kuur niet afmaken)
5. Langdurige behandeling met lage doseringen antibioticum,
6. Het gebruik van antibiotica in veevoer.(West-Europa waaronder
Spanje)
7. Het transport van resistente bacteriën over de wereld door de
toegenomen mobiliteit.
Zie ook het krantenartikel aan het eind van dit moduleboekje,
lees dit goed door het hoort gewoon bij de leerstof.
8. MRSA.
Overal in de wereld duikt een bacterie, die met de afkorting MRSA
(methicillin resistant Staphylococcus aureus) aangeduid wordt, als
veroorzaker van ziekenhuisinfecties op. Waar komt deze bacterie
vandaan? Hoe wordt deze bacterie verspreid in het ziekenhuis en
wat doet men om deze bacterie te beteugelen als hij onverhoopt in
een ziekenhuis opduikt?
In de jaren 1940-1950 bleken vele S. aureus-stammen (veroorzakers
van bloedvergiftigingen longinfecties en operatiewond-infecties) als
gevolg van de selectiedruk door het gebruik van penicilline,
penicilline-resistent. Methicilline, een door de farmaceutische
industrie gesynthetiseerd derivaat van penicilline, was toen een
effectief bestrijdingsmiddel. Men vermoedt dat S. aureus enkele
jaren geleden, door een op zich zeldzame mutatiegebeurtenis, een
hoge resistentiegraad heeft verworven tegen methicilline en
daardoor resistent is geworden tegen alle synthetische penicillinederivaten die inmiddels op de markt waren. Antibioticumtherapie
tegen zulke MRSA-stammen is dus niet eenvoudig. In feite is er ter
beteugeling van de MRSA nog maar één enkel effectief
antibioticum, het vancomycine. De vrees is groot dat wanneer ook
dit laatste redmiddel niet meer werkt, we echt met lege handen
staan.
MRSA-bacteriën worden via dragers – mensen bij wie de bacterie
zich op de huid of in de neus bevindt om zich daar, zonder verdere
nadelige invloeden voor de betrokkene te handhaven – en uiteraard
door patiënten verspreid. De drager kan zelf patiënt worden wanneer
de MRSA-bacterie die hij bij zich draagt in de bloedbaan komt, of
een wondinfectie veroorzaakt. Een drager, verpleger of verzorger
bijvoorbeeld, kan een patiënt die verpleegd wordt direct besmetten
of indirect, via instrumentarium dat voor onderzoek wordt gebruikt.
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
14
Antibiotica
Bij de in onze ziekenhuizen optredende infecties met MRSA is
achteraf vastgesteld dat de besmetting vaak vanuit het buitenland
werd binnengebracht. Mogelijk is dat een gevolg van een minder
strikt antibioticum-beleid, en dus grotere selectiedruk in sommige
landen. Mensen die direct vanuit het buitenland komen en als
patiënt op een intensive care-afdeling of op een chirurgische
afdeling verpleegd moeten worden, worden uit voorzorg eerst
geïsoleerd verpleegd. Bacteriologisch onderzoek kan dan uitwijzen
of de gevreesde MRSA eventueel aanwezig is.
.
Betrekkelijk eenvoudig bacteriologisch onderzoek van een huid- of
neusuitstrijk is toereikend om vast te stellen of bij een patiënt een
resistente stafylococ aanwezig is. Onder de gevonden MRSAstammen zijn stammen aangetroffen die epidemieën kunnen
veroorzaken naast stammen die over het algemeen geen
epidemische uitbraak veroorzaken. Het is nu nog niet goed mogelijk
om ondubbelzinnig vast te stellen of een gevonden MRSA-bacterie
in hoge mate infectief is en zich snel epidemisch zal kunnen
verpreiden, dan wel of het gaat om een type dat zich, anders dan via
directe contacten, nauwelijks verspreidt.
Inperking van de MRSA
Als in een ziekenhuis een MRSA-stam van het epidemische type
gevonden wordt, zijn de meest rigoureuze maatregelen ter
beteugeling geboden. De zich snel verspreidende bacterie kan
immers veel slachtoffers maken. De patiënt bij wie de gevaarlijke
MRSA-bacterie aanwezig is, wordt onmiddellijk overgebracht naar
een gesloten afdeling, en alle mensen die met de patiënt in contact
zijn geweest, worden onderzocht om te zien of ze soms besmet zijn
met de bacterie, waardoor ze ongewild als drager voor verdere
verspreiding zouden kunnen zorgen.
Eventuele dragers onder het ziekenhuispersoneel worden
onmiddellijk op non-actief gesteld, of met taken belast die hen
verwijderd houden van patiënten of verpleegafdelingen. Deze
personen worden vervolgens regelmatig bacteriologisch onderzocht,
waarbij in het merendeel van alle gevallen na enige tijd het sein op
veilig raakt, doordat de koloniserende bacterie meestal vanzelf weer
verdwijnt. Incidenteel echter blijken dragers blijvende verspreiders;
in feite zijn ze dan – hoe hard het ook moge klinken – ongeschikt
voor een groot aantal functies binnen de gezondheidszorg. Verder
wordt heel vaak besloten om de afdeling waar de met de MRSAbacterie besmette patiënt verbleef nog gedurende enige tijd te
sluiten, waarna de bacterie door schoonmaak en sterilisatie
uitgeroeid wordt.
.
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
15
Antibiotica
Als men daarentegen een MRSA-stam als niet-epidemisch kan
karakteriseren, dan zal men met minder ingrijpende en minder
kostbare maatregelen kunnen volstaan. Met normale hygiënische
maatregelen en een goede behandeling van de patiënt kan dan
verder onheil worden voorkomen.
Uitbannen van de methicilline-resistente stafylococ zal, nu deze
eenmaal wereldwijd is verspreid, niet goed mogelijk zijn. Inperking
van de verspreiding binnen goed toegeruste ziekenhuizen is echter
wel mogelijk, zij het dat daarvoor veel inspanningen nodig zijn.
Bepalingen op het lab
9. De gevoeligheid van micro-organismen en de bepaling ervan.
Wil men een patiënt met een infectieziekte doeltreffend met een
antibioticum genezen dan zal men er zeker van moeten zijn dat het
antibioticum het micro-organisme doodt of in de groei remt.
Anderzijds moet het middel geen of zo weinig mogelijk schade
toebrengen aan de lichaamscellen. Hiertoe zijn of worden (bij
nieuw ontdekte middelen)van alle antibiotica vastgesteld welke
concentraties kritisch zijn.
Het gaat dan om de volgende concentraties:
 de maximaal toelaatbare, voor de mens onschadelijke concentratie.
 de minimaal bacterieremmende concentratie: MRC
 de minimaal bactericide concentratie: MBC
Met behulp van dierproeven en vrijwilligers komt men vervolgens
tot een optimale toedieningswijze van het antibioticum: de dosis die
per keer wordt toegediend en het aantal keren dat het antibioticum
per etmaal moet worden toegediend.
De dosis per keer hangt samen met de maximaal toelaatbare dosis
en met de MRC.
Het aantal malen hangt af van de tijd waarin het lichaam het middel
opneemt en vervolgens weer verwijdert. Deze tijd hangt onder
andere af van de conditie van de patiënt ; vermoedt men een
gebrekkige uitscheiding dan dient het schema te worden aangepast
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
16
Antibiotica
en van tijd tot tijd de concentratie in de lichaamsvloeistoffen
bepaald worden..
Op een ziekenhuis wil men van een bij een patiënt aangetroffen
micro-organisme weten met welke antibiotica het micro-organisme
te bestrijden is. Dit kan op verschillende manieren kwalitatief of
kwantitatief worden onderzocht. Ook kan voor een product de
antimicrobe werking worden nagegaan waardoor de aanwezigheid
van conserveermiddelen of antibiotica in het product aan het licht
komt. Deze aanwezigheid kan gewenst zijn (contactlensvloeistoffen,
medicijnen) of ongewenst en zelfs verboden (penicilline in melk of
vlees). Hieronder volgt een algemene beschrijving.
Allemaal redenen om deze bepalingen te bespreken:
De gevoeligheidsbepalingen
10. De MIC-bepaling
Deze methode maakt een kwantitatieve beoordeling van de
gevoeligheid mogelijk. Hiertoe wordt het micro-organisme geënt in
een serie buizen met voedingsmedia met verschillende concentraties
van het te onderzoeken antibioticum. De laagste concentratie die
geen groei te zien geeft is de M.I.C. (Minimal Inhibitory
Concentration) of M.R.C.(Minimale Remmende Concentratie) van
dit middel voor die bacterie. De concentraties die ingezet moeten
worden dienen (zo dicht mogelijk) rond deze waarde te liggen.
Gebeurt dit niet dan is geen M.I.C.(of een te onnauwkeurige M.I.C.)
af te lezen.
De in te zetten concentraties zijn niet altijd bekend.
Het hieronder gegeven voorbeeld kan in de praktijk dus onjuist zijn
en dient dan aangepast te worden aan de situatie (bijv. beschikbare
literatuurwaarden voor de M.I.C.).
UITVOERING.
Maak van de te onderzoeken stof een concentratiereeks in duplo.
Maak hiertoe een stamoplossing van het antibioticum of andere stof
bijv. 128 µg/ml. in steriele bouillon van geschikte samenstelling
Steriliseer zonodig de oplossing door filtratie.
Maak van deze stamoplossing een 1:1 verdunning met het vloeibare
medium door 1 deel stamoplossing bij 1 deel medium te pipetteren.
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
17
Antibiotica
Herhaal dit een aantal malen tot 12 concentraties (in duplo) zijn
bereid.
Beent elke buis met een druppel bacteriesuspensie (d.m.v. een
Pasteurpipet). De suspensie is bereid uit een overnachtcultuur en
bevat 105 a 106 kve/ml .Neem controles en blanco’s mee.
Incubeer 24 uur bij geschikte temperatuur.
Beoordeel controles en blanco's op respectievelijk aan- en
afwezigheid van groei en zoek de M.I.C. * waarde op. Bij
geleidelijke overgangen in groeiremming dient hiervan melding
gemaakt te worden.
11. Het maken van een antibiogram d.m.v. de agardiffusiemethode.
Inleiding:
Een antibiogram geeft de gevoeligheid weer van een microorganisme voor een aantal verschillende potentieel antimicrobe
stoffen.
In de agardiffusiemethode wordt dit vastgesteld.
Hiervoor gebruikt men agarplaten waarop het te onderzoeken microorganisme egaal wordt aangebracht , zodat na incubatie alle
kolonies net tegen elkaar zijn gegroeid en er een bacteriedek over de
hele plaat is gegroeid.
Voor incubatie brengt men echter ook de te onderzoeken antibiotica
aan.
Deze stoffen kunnen in papierschijfjes zijn gedrenkt (waarna de
papiertjes gedroogd zijn). Ook kunnen de stoffen in tabletvorm
worden opgebracht.
Vervolgens wordt de plaat geincubeerd.
Voor, maar vooral tijdens de incubatie vinden twee processen
plaats:
Groei van de bacterie.
Diffusie van de stof. De stof diffundeert in de agar net zolang totdat
de concentratie in de hele plaat hetzelfde is. Voor het zover is zal er
een concentratiegradiënt heersen, met een. hoge concentratie
rondom de opbrengplaats en steeds lagere concentraties naarmate de
afstand tot deze plaats groter wordt.
Deze concentraties verschillen per tijdstip.
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
18
Antibiotica
Na een bepaalde incubatietijd (deze ligt vast) wordt de groei op de
plaat beoordeeld en zal er rond een opgebrachte stof al of niet een
remzone te zien zijn. .
Niet iedere remzone (hoe klein ook) betekent dat een bacterie gevoelig
is voor dat speciale middel. Er bestaan tabellen die aangeven hoe
groot een remzone rond een schijfje met een bepaald middel minstens
moet zijn om de bestudeerde bacterie gevoelig voor dat middel te
kunnen noemen. Bij kleinere remzone wordt de bacterie ongevoelig of
resistent genoemd. Op sommige laboratoria benoemt men de
tussenliggende groottes met intermediair.
UITVOERING.
Bereiding van de voedingsbodem.
Bereid en steriliseer een voor dit doel geschikte vaste
voedingsbodem volgens de gebruiksaanwijzing. Giet platen met een
dikte van overal 4 mm (waterpas.') wat correspondeert met 25 ml
medium voor schalen met een binnendiameter van 9 cm.
De platen moeten voor het enten gedroogd zijn en op
kamertemperatuur.
Het maken van het inoculum.
Van elke te onderzoeken stam worden 4 kolonies (die van een plaat
gehaald worden die 24 uur van te voren beënt is en die bij 37 C is
bebroed geweest) in 4 ml Trypton Soya Bouillon geënt. De buizen
worden 2-5 uur bij 37 C geïncubeerd. Daarna wordt de dichtheid van
de cultuur met fysiologisch zout op de juiste waarde gebracht door de
troebelheid ervan te vergelijken met een McFarland No. 0,5 standaard
(de bacterieverdunning bevat dan ca. 106 kve per ml).
Beënting van de platen.
De platen worden met het inoculum door middel van een
wattendrager (swab) beënt.
Beënt hiertoe met de eenmaal tot verzadiging bevochtigde
wattendrager 4 maal één helft van de plaat door egaal over het totale
oppervlak uit te strijken:
Hierbij overlapt de te beënten helft steeds de vorige helft.
Plaatjes Anton
Laat de plaat enkele minuten drogen door het deksel er schuin op te
zetten (max. 15 minuten)
.
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
19
Antibiotica
Het opbrengen van te onderzoeken stoffen.
Breng de schijfjes waarin zich de te onderzoeken stoffen bevinden
op de voedingsbodem met een steriele pincet of dispenser en druk
ze tegen de agar aan.
Incubatie
Zet de plaat binnen 15 minuten na opbrengen van de stoffen in de
stoof (bodem naar boven).
Tenzij anders vermeld bij 37ºC en gedurende 24 uur.
Beoordeling resultaten.
Bij juiste inoculatie zal de groei net niet confluent zijn. Meet nu met
een schuifmaat de diameter van de remzone . nauwkeurig. De grens
is gelegen op de plaats waar met het blote oog geen duidelijke groei
meer valt waar te nemen. Geisoleerde kolonies binnen deze grens
worden buiten beschouwing gelaten. Dit geldt eveneens voor latere
groei binnen een oorspronkelijke remzone.
Interpretatie resultaten.
De mate waarin een m.o. gevoelig is voor een bepaald middel is met
gebruikmaking van een tabel (zie inleiding) na te gaan.immers de
mate van gevoeligheid kan men per antibioticum niet onderling
vergelijken, elke stof heeft zijn eigen diffusiesnelheid en dus bij een
bepaalde MIC zijn eigen specifieke remzone.Maar dan moeten wel
de proefomstandigheden gestandaardiseerd geweest zijn.
TABEL
Omdar er zeer veel factoren van invloed zijn op zowel de diffusie
van het antibioticum als de groeisnelheid van het te onderzoeken
m.o. is het van groot belang alle omstandigheden en handelingen
tijdens de proef zo veel als mogelijk is te standaardiseren.
De suspensie met het op te brengen micro-organisme. dient altijd
een concentratie van 106 per ml te hebben.
De platen moeten een vaste dikte hebben.
Incubatietijd en temperatuur dienen altijd hetzelfde te zijn.
Een schijfje dat eenmaal met de agar in contact geweest is kan men
daarna niet meer verplaatsen
Gemeten wordt de zone met de complete remming zoals die met het
blote of bebrilde oog zichtbaar is.
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
20
Antibiotica
Zeer kleine nauwelijks zichtbare kolonies worden niet meegerekend.
Grote kolonies die midden in de remzone groeien dienen opnieuw
getest en geïdentificeerd te worden.
Zwermzones binnen de remzones worden niet meegerekend,
Lichte groei binnen een zone kan veroorzaakt zijn door mutanten
binnen een populatie, of aan de aanwezigheid van een andere soort,
men zal dan opnieuw moeten reinkweken , identificeren en
gevoeligheid bepalen.
De bepaling van de (aanwezigheid en de) concentratie van
antimicrobe stoffen.
Of er een groeiremmende stof aanwezig is in een vloeistof
(lichaamsvloeistof van een patient , melk,) of vaste stof (kaas, vlees)
kan bepaald worden met methoden die ook verdunningsmethode en
agardiffusiemethode worden genoemd.
Let op! De namen zijn hetzelfde en de methoden lijken veel op
elkaar dat maakt het erg verwarrend!
12. De verdunningsmethode
Bij deze methode maakt men een concentratiereeks van het te
bepalen antbioticum (ijkreeks) en een verdunningsreeks van het te
bepalen monster.
Aan beide reeksen wordt een gevoelig micro-organisme toegevoegd
en na incubatie wordt van de ijkreeks de MIC vastgesteld. Van de
verdunningsreeks van het monster wordt de hoogste verdunning
vastgesteld waarbij nog groeiremming plaatsvindt. In deze
verdunning moet dan (als het dezelfde remmende stof betreft)
ongeveer dezelfde concentratie zijn als de MIC die met de ijkreeks
is vastgesteld.
Op deze wijze kan men na terugrekenen naar het geconcentreerde
monster de concentratie groeiremmende stof in het monster te weten
komen.
Een en ander wordt geoefend in de leeropdrachten.
13. De agardiffusiemethode
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
21
Antibiotica
Ook bij deze methode worden de resultaten van een ijkreeks
vergeleken met de resultaten van een verdunningsreeks van het te
bepalen monster.

De ijkreeks
Van een concentratiereeks van het te bepalen antibioticum wordt de
(een vaste hoeveelheid) vloeistof met behulp van papieren schijfjes
of in gaatjes in de agar op een egaal met een gevoelig microorganisme. bente plaat in contact gebracht.
De verdunningsreeks van het monster
Van de verdunningsreeks van het te bepalen monster wordt op
dezelfde wijze vloeistof op papieren schijfjes of in gaatjes gebracht;
hiervoor wordt dezelfde plaat gebruikt als van de ijkreeks.
Na incubatie worden alle remzones opgemeten. Van de ijkreeks
wordt een ijklijn gemaakt.
Dit zal een rechte lijn opleveren als de logaritme van de concentratie
tegen de diameter van de remzone wordt uitgezet.
Vervolgens wordt de diameter van de remzone veroorzaakt door het
monster (of een verdunning ervan) in deze ijklijn opgezocht en de
bijbehorende concentratie afgelezen.
Deze methode wordt in de leeropdrachten verder behandeld.
14. De groeiremmingstest
Ee n veel gebruikte snelle methode om de aanwezigheid van
groeiremmende stoffen in melk op te sporen is de Delvotest. Deze
heeft vooral als doel penicilline in melk te bepalen, maar ook andere
stoffen waarvoor het testorganisme, Bacillus stearothermophilus
gevoelig voor is worden aangetoond.
Dit is geen bezwaar, groeiremmende stoffen horen niet thuis in
melk, er kan dan geen kaas van worden gemaakt , ook zijn er
consumenten die overgevoelig zijn voor deze antibiotica .
Bovendien wordt het antibioticum onnodig blootgesteld aan diverse
milieus waarin andere micro-organismen voorkomen ; daardoor kan
zich resistentie ontwikkelen.
Nu de test zelf: Als men Bacillus stearothermophilus in een medium
met een vergistbare suiker en een pH-indicator laat groeien bij 60C
dan zal binnen 3 uur een kleuromslag zichtbaar worden. Voegt men
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
22
Antibiotica
echter een monster toe waarin zich een groeiremmende stof bevindt
dan zal deze groei en dus de kleuromslag uitblijven of vertraagd
worden.
Sinds kort is deze test ook geschikt om antibiotica in vlees aan te
tonen: dit gebeurt nu nog door de agardiffusietest, waarbij men in de
nier van het slachtdier een papieren schijfje vocht leit opzuigen en
vervolgens dit schijfje op een bente plaat bracht. Deze test is
bewerkelijker en tijdrovender dan de Delvotest.
Origineel 99 waarin de knipsels?
Test antibiotica in vlees
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
23
Antibiotica
Krantenknipsels resistentie
Rriesland College C.M.Wiersema 24-07-17
24