Vleesidentificatie met soort ID

Resultaatverwerking
Vleessoort Identificatie met SoortID
De identificatie van verschillende diersoorten in een product wordt
op basis van DNA gedaan. Aanwezigheid van bijvoorbeeld paarden
DNA wordt bepaald door middel van real-time qPCR. Deze methode
is gebaseerd op het vermenigvuldigen van specifieke stukken DNA,
die bijvoorbeeld uniek zijn voor paard, waardoor ze met gevoelige
apparatuur te meten zijn.
mtDNA
Energie voorziening
Mitochondriaal DNA, of mtDNA, is klein ringvormig DNA dat zich in
de mitochondriën bevindt. De mitochondriën voorzien de cellen van
energie. Er zijn enkele tot honderden kopieën van het mitochondriaal
DNA aanwezig per cel, afhankelijk van de functie die de cel vervult in
het lichaam. Zo zijn grotere aantallen DNA te vinden in organen die
veel energie nodig hebben, zoals bijvoorbeeld de hartspier, lever en
spieren. In bijvoorbeeld huidcellen en vetweefsel zijn er slechts een
paar kopieën aanwezig.
DNA isolatie
Het mtDNA zal voor deze analyse allereerst uit het product geïsoleerd worden. Om het DNA te isoleren worden de cellen afgebroken
en de eiwitten weggespoeld, waarna het DNA gezuiverd wordt.
Real-time qPCR
Het DNA kan vervolgens gebruikt worden om een PCR reactie uit te
voeren. De polymerasekettingreactie, vaak afgekort tot PCR (Polymerase Chain Reaction), is een manier om uit zeer kleine hoeveelheden DNA specifiek een of meer gedeeltes te vermenigvuldigen
(amplificeren) tot er genoeg is om aan te tonen.
1
2
3
Cyclus: drie fasen
1 Dubbelstrengs DNA wordt gesplitst door
middel van verhitting
2 Synthetisch stuk DNA (primer), wat precies
past op het gewenste stuk DNA, hecht zich
aan de gesplitste DNA streng
3 Primers worden verlengd tot volledige
kopie door enzym Taq polymerase
Na iedere cyclus twee maal zoveel van het
gewenste DNA (exponentiële groei)
Cyclus wordt 50x herhaald
Ct-waarden onder meer afhankelijk
van productsoort:
primair vlees: veel DNA, lage
Cq-waarden
samengesteld: weinig DNA,
hoge Cq-waarden
Additionele reactie: universal meat
maat voor de hoeveelheid DNA
Semi-kwantitatief
Enkele tot duizenden kopieën per cel
Cellen die veel energie nodig hebben, bevatten meer mtDNA dan cellen die
weinig energie nodig hebben
7 diersoorten in diverse pakketten:
rund, varken, paard, schaap,
geit, kip en kalkoen
Aan-/afwezigheid
bij aanwezigheid zal een relatief
percentage per diersoort gerapporteerd worden
In de pakketten die ALcontrol aanbiedt, wordt de aanwezigheid van
het DNA van maximaal zeven diersoorten bepaald in aparte PCR runs.
Tevens wordt een additionele PCR
reactie uitgevoerd voor universal
meat, waarbij de totale hoeveelheid
aanwezig DNA van gewervelde diersoorten gemeten wordt. Indien het
product enkel uit vlees bestaat, zal
de universal meat reactie een lage
Cq hebben (Cq 15). Indien het een
samengesteld product betreft, zoals
bijvoorbeeld het geval is bij een kroket, zal de Cq-waarde van de universal meat reactie hoger zijn.
De relatieve percentages van de verschillende diersoorten op het totale
DNA kunnen op basis van de verkregen Cq-waarden berekend worden.
Een monster met Cq-waarde van
22 bevat twee keer zoveel DNA als
een monster met een Cq-waarde
van 23.
Evenzo bevat een monster met
een Cq-waarde van 22 vier keer zoveel DNA als een monster met een
Cq-waarde van 24.
Wanneer er geen of niet voldoende startmateriaal is (geïsoleerd
DNA), zal geen fluorescent signaal
waargenomen worden binnen 35 cycli en zal het resultaat gerapporteerd
worden als “niet aangetoond”. In
andere gevallen zal de hoeveelheid
berekend en gerapporteerd worden.
Interpretatie
Detectie
Bij de realtime qPCR-methode kan tijdens de reactie het DNA worden
aangetoond middels fluorescentie. Een extra stukje synthetisch DNA
bindt aan het DNA, tussen de twee primers in. Aan dit stukje DNA,
probe genaamd, zitten twee labels. De eerste is een fluorescent label, wat licht uitstraalt en hierdoor gedetecteerd kan worden. Naast
dit label zit een extra label aan de probe vast, die ervoor zorgt dat dit
licht gedimd wordt, zolang deze in de buurt van het fluorescente label
zit. Zolang dit synthetisch stukje DNA intact is, zal er geen licht gedetecteerd kunnen worden door de aanwezigheid van deze dimmer.
Fluorophore: fluorescent label
Quencher: dimt het fluorescente licht
Bij verlenging: probe wordt afgebroken
Dimmer komt los van label
Label kan licht uitstralen
Fluorescentie wordt in een grafiek
uitgezet tegen de Ct-waarde
Resultaat: moment dat signaal > ruis
Zodra de primer verlengd wordt tot een volledige kopie, zal het enzym langs de te kopiëren streng lopen om de juiste bouwstenen te
koppelen. Hierbij komt hij de probe tegen. De bouwstenen waar de
probe uit bestaat, zullen vervolgens één voor één losgemaakt worden van de te kopiëren streng en van elkaar, waardoor het fluorescente label vrij komt van de dimmer. Hierdoor kan het label zijn licht
uitzenden en kan dit gedetecteerd worden. Bij iedere vermeerdering
van het DNA, zullen er dus extra probes afgebroken worden en zal er
meer licht gedetecteerd worden. Het signaal wordt bij iedere cyclus
van de PCR gemeten.
De relatieve percentages die gerapporteerd worden, geven het percentage DNA van een diersoort op het
totale DNA in verhouding tot de overige diersoorten die bepaald worden.
Op basis van de resultaten verkregen met SoortID kan derhalve niet
altijd onderscheid gemaakt wordt
tussen bijvoorbeeld ‘kruisbesmetting
tijdens het verwerken van meerdere
diersoorten op één locatie’ en ‘bewuste fraude’.
Paard
Op basis van de Europese richtlijn
EG/1169/2011 is het wettelijk verplicht om de ingrediënten en dus ook
de aanwezigheid van paardenvlees
op de verpakking te declareren. Indien paardenvlees niet in de ingrediëntenlijst genoemd wordt, maar toch
aangetroffen wordt in het product,
hanteert de NVWA een grenswaarde van max. 1 %, om het aanwezige
paardenvlees als mogelijk frauduleus aan te merken (EG/99/2013).
Deze grens van 1 % vlees in het
product is een moeilijk te hanteren
definitie. DNA onderzoek geeft namelijk altijd een percentage van het
DNA van een diersoort op het totaal
geïsoleerde DNA. De vertaling naar
het percentage op het product valt
niet te maken. Bij een product wat
enkel uit vlees bestaat, kan een ruwe
schatting gegeven worden. Wanneer
het echter een samengesteld product betreft, zal de schatting van het
percentage paardenvlees gemaakt
kunnen worden op basis van het totaal aanwezige vlees, maar niet op
het product.
Daarnaast wordt het hanteren van
deze definitie bemoeilijkt door de
meetonzekerheid van de methode.
Bij herhaalde typering kan een monster dat de eerste keer net onder de
1 % relatief valt, een tweede resultaat geven van bijvoorbeeld 1,15 %
in verhouding met een andere vleessoort.
Beschikbare pakketten
(Ct value)
Dit signaal kan in een grafiek uitgezet worden tegen het aantal cycli
van de PCR. Hier zal een exponentiële grafiek uitkomen. Het moment dat het lichtsignaal boven de ruis uitkomt (Cq-waarde), wordt
gebruikt om het eindresultaat te berekenen. Hoe eerder het licht gedetecteerd kan worden, hoe minder verdubbelingen hiervoor nodig
zijn geweest en dus hoe meer DNA er in het product aanwezig is.
DP04 - Detectie paard, rund, varken
DP05 - Detectie kip, kalkoen
DP06 - Detectie schaap, geit
DP08 - Detectie 7 diersoorten
ALcontrol Food & Water
Everdenberg 41
4902 TT, Oosterhout
T: 0162 488 488; E: [email protected]