Stage programma 2010/2011 25 EBV2 ROL VAN HET BARF1 EIWIT

Stage programma 2010/2011
EBV2
25
ROL VAN HET BARF1 EIWIT IN EPSTEIN-BARR VIRUS- GEASSOCIEERDE
CARCINOMEN (2 DEEL PROJECTEN)
Instelling
Afdelingshoofd
Unit:
Begeleiding
Contactpersoon
:
:
:
:
:
Afdeling Pathologie, VU medisch centrum, Amsterdam
Prof. dr. G.A. Meijer
Moleculaire pathologie
Prof. dr. J.M. Middeldorp, hoofd EBV research unit
Prof. dr. J.M. Middeldorp, hoofd EBV research unit
Achtergrond van het beoogde onderzoek
Epstein-Barr virus (EBV) is een wereldwijd voorkomend humaan herpesvirus, dat vooral bekend staat als de
veroorzaker van de ziekte van Pfeiffer. EBV blijkt ook een rol te spelen in de pathogenese van enkele chronische aandoeningen en is onlangs erkend als groep-1 carcinogeen, vanwege de sterke associatie bij het
ontstaan van diverse vormen van kanker, zowel van lymphoide (lymfomen) als epitheliale oorsprong (carcinomen). Het virus is transcriptioneel actief in alle tumorcellen.
De twee stage projecten zullen zich met name richten op de genetische en immunologische analyse van
het EBV- gecodeerde BARF1 eiwit. Dit genproduct is gebleken een carcinoomspecifieke marker te zijn, die
dus niet tot expressie komt in EBV-geassocieerde lymfomen. In een 1ste project zal vanuit diverse tumor
biopten het BARF1-DNA worden geamplificeerd om middels DNA-sequentie analyse het genetische polymorfisme van dit gen te onderzoeken, gekoppeld aan BARF1-RNA expressie analyse in de betreffende biopten. Een 2de aspect is de immunohistochemische detectie van BARF1 expressie in situ middels nieuw te
ontwikkelen monoclonale antilichamen alsmede de analyse van B-cel responsen tegen BARF1 eiwit, waarvoor recombinanteiwit en diverse peptiden beschikbaar zijn.
Korte inhoud
Project 1:
Vanuit tumor en controle biopten wordt DNA geïsoleerd en geamplificeerd met BARF1specifieke primers. Met een geautomatiseerde sequencer kan vanuit partiele PCR fragmenten de gehele BARF1 sequentie worden achterhaald en eventuele polymorfisme tussen EBV
stammen in tumorpatiënten en gezonde virus dragers gedefinieerd.
Project 2:
Voor BARF1 zijn expressieconstructen in E.Coli en het Baculovirussysteem voorhanden,
alsmede diverse syn-thetische peptiden en specifieke polyclonale referentie sera. De expressie producten zullen worden gezuiverd middels selectieve extractie en affiniteitchromatografie en vervolgens worden gebruikt voor het analyseren van de immuunrespons en
opwekken van specifieke monoclonale antilichamen. Hiervoor worden ELISA, immunoblot
en immunohistochemische testen opgezet. Gezuiverde recombinant BARF1 eiwit en synthetische peptiden wordt gebruikt om de humorale immuun respons gericht tegen BARF1 te
bestuderen in panels van patiënten met diverse EBV- gerelateerde aandoeningen, zoals
EBV-positieve maagtumoren, nasopharynx carcinoom, Burkitt Lymfoom, Hodgkin Lymfoom
en ziekte van Pfeiffer. Eventuele nieuwe monoclonale antistoffen worden gebruikt voor
analyse van de in situ expressie van BARF1 in tumormateriaal naast de analyse van RNA
expressie middels RT-PCR en NASBA.
Technieken
1.
2.
3.
4.
5.
6.
PCR-sequencing technieken
Eiwitexpressie en -zuiveringstechnieken
ELISA en spotblot, SDS-PAGE en Immunoblotting
Baculovirus productie, (insect) celkweken en celfusies
In situ immunohistochemie
RNA expressie analyse
Studierichtingen
-
Biochemie
Biotechnologie