Het opstellen van een microvesikelsignatuur van humane
advertisement
Het opstellen van een microvesikelsignatuur van humane kankercellijnen Freja SCHEYS Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Kris Gevaert Vakgroep GE07 – Biochemie Academiejaar 2013-2014 Het opstellen van een microvesikelsignatuur van humane kankercellijnen Freja SCHEYS Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Kris Gevaert Vakgroep GE07 - Biochemie Academiejaar 2013-2014 “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.” Datum Freja Scheys Prof. Dr. Kris Gevaert VOORWOORD Het maken van deze masterproef was een heel leerrijke ervaring die ik zonder de hulp van anderen niet had kunnen waarmaken. Ik zou daarom graag langs deze weg enkele mensen willen bedanken. Eerst en vooral wil ik mijn promotor Prof. Dr. Kris Gevaert bedanken dat hij het mogelijk heeft gemaakt voor mij om mee te werken aan dit interessante onderwerp. Bedankt voor al de raad, het vele verbeterwerk en de kans om mijn eerste stappen te zetten in het wetenschappelijk onderzoek. Daarnaast gaat mijn dank uit naar mijn begeleidsters Kathleen Moens en An Staes. Kathleen wil ik graag bedanken om mij, in onze korte tijd samen, klaar te stomen voor mijn eerste praktische laboratoriumervaring. An, bedankt om steeds klaar te staan met goede raad en hulp, mij veel kennis bij te brengen en zo veel geduld op te brengen voor mijn beperkte computerkennis. Jullie waren geweldig om mee samen te werken en om van bij te leren! Al mijn collega’s van het Proteomics Onderzoekslaboratorium wil ik bedanken voor alle hulp en de gezellige sfeer op de werkvloer. Hierbij wil ik graag Berdien, Bart en Sander bedanken voor de leuke biomedische jaren, die met jullie erbij voorbijgevlogen zijn! Mijn medestudenten in het labo Britt, Eva C., Eva V. en Sebastiaan wil ik bij deze bedanken voor de toffe babbels, het vele gelach en gezellige middagpauzes. Ten slotte wil ik nog graag mijn ouders en mijn zus Debbie bedanken voor de vele motiverende gesprekken, het nalezen van mijn werkjes ondanks de interesse voor het onderwerp, het printen van stapels cursusmateriaal, de toffe pauzes tijdens het studeren en de vele verwennerij tijdens de examenperiodes. Bedankt voor de vele steun tijdens deze jaren! Bedankt! INHOUDSOPGAVE AFKORTINGEN……………………………………………………………………………………………… SAMENVATTING ................................................................................................................... 1 SUMMARY............................................................................................................................... 2 1.1 KANKER ....................................................................................................................... 3 1.2 EXOSOMEN.................................................................................................................. 3 1.2.1. MICROVESIKELS ....................................................................................................... 3 1.2.2. DE EXOSOMALE INHOUD ........................................................................................... 5 1.2.3. BIOLOGISCHE FUNCTIES VAN EXOSOMEN .................................................................. 6 1.2.4. ISOLATIE EN KARAKTERISERING VAN EXOSOMEN ..................................................... 8 1.2.5. EXOSOMEN ALS BIOMERKERS ................................................................................... 9 1.3. DOELSTELLING ....................................................................................................... 11 2. MATERIAAL EN METHODEN...................................................................................... 12 2.1. CELCULTUUR ........................................................................................................... 12 2.1.1. KEUZE CELLIJNEN ................................................................................................... 12 2.1.2. CULTUURCONDITIES ............................................................................................... 12 2.1.3. Medium exosoomvrij maken ............................................................................... 13 2.1.3.1. Ultracentrifugatie en filtratie ............................................................................... 13 2.1.3.2. Amicon stirred cell ............................................................................................... 13 2.1.4. CELLYSATEN BEREIDEN .......................................................................................... 13 2.1.5. SILAC LABELING ................................................................................................... 14 2.1.6. CELLULAIRE SECRETOOMISOLATIE ......................................................................... 15 2.2. ISOLATIEMETHODEN ............................................................................................ 15 2.2.1. COLLECTIE GECONDITIONEERD MEDIUM ................................................................. 15 2.2.2. EXOQUICK-TC ........................................................................................................ 15 2.2.3. DIFFERENTIËLE CENTRIFUGATIE ............................................................................. 16 2.3. WESTERN BLOT ....................................................................................................... 17 2.3.1. SDS-PAGE ............................................................................................................ 17 2.3.2. BLOTTEN – ODYSSEY SYSTEEM............................................................................... 17 2.3.3. BLOTTEN – ENHANCED CHEMILUMINISCENCE (ECL) ............................................. 17 2.4. MASSASPECTROMETRIE ...................................................................................... 18 2.4.1. STAALVOORBEREIDING ........................................................................................... 18 2.4.1.1. LYSIS EXOSOMEN ........................................................................................................ 18 2.4.1.2. DETERGENT REMOVAL KOLOMMEN ............................................................................. 18 2.4.1.3. IN GEL TRYPSINISATIE ................................................................................................. 18 2.4.2. MASSASPECTROMETRIE .......................................................................................... 19 2.4.3. IDENTIFICATIE VAN DE MS/MS SPECTRA ................................................................ 20 2.4.4. DATA-ANALYSE ...................................................................................................... 21 2.5. EXOCARTA ................................................................................................................ 22 3. RESULTATEN ................................................................................................................... 23 3.1. MEDIUM EXOSOOMVRIJ MAKEN ...................................................................... 23 3.2. EXOSOOMISOLATIE AAN DE HAND VAN DE EXOQUICK-TC KIT ........... 24 3.2.1. AANWEZIGHEID VAN SERUM ................................................................................... 24 3.2.2. CELLEN 24 H SERUMVRIJ ......................................................................................... 25 3.3. EXOSOOMISOLATIE AAN DE HAND VAN DIFFERENTIËLE CENTRIFUGATIE ................................................................................................................ 29 3.3.1. STAALVOORBEREIDING DOOR MIDDEL VAN DETERGENT REMOVAL KOLOMMEN ..... 29 3.3.2. STAALVOORBEREIDING DOOR MIDDEL VAN IN GEL TRYPSINISATIE ......................... 33 3.4. SILAC LABELING EN ANALYSE VAN HET CELLULAIRE SECRETOOM 36 3.5. EXOCARTA ................................................................................................................ 38 3.6. VALIDATIE DOOR WESTERN BLOTTING ........................................................ 39 4. BESPREKING ............................................................................................................. 41 ALGEMEEN BESLUIT ........................................................................................................ 47 REFERENTIELIJST ............................................................................................................. 48 AFKORTINGEN ABC: ammoniumbicarbonaat ACN: acetonitrile CSV: cerebrospinaal vocht DC: differentiële centrifugatie dFKS: ‘depleted’ foetaal kalfsserum; exosoomvrij foetaal kalfsserum DMEM: Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium EGFR: epidermale groeifactor receptor EMEM: Eagle’s minimum essentieel medium ESI: elektronspray ionisatie FKS: foetaal kalfsserum HBMVEC: humane hersenen microvasculaire endotheliale cellen IL-2 : interleukine 2 MS: massasprectrometer/massaspectrometrie NK cellen : natural killer cellen PBS: fosfaat gebufferde zoutoplossing PVDF: polyvinylideen fluoride SDS: natriumdodecylsulfaat SILAC: stabiele isotoop labeling door aminozuren in celcultuur TBS: Tris-gebufferde zoutoplossing TBS-T: Tris-gebufferde zoutoplossing en Tween TEAB: triëthylammoniumbicarbonaat TEM: transmissie elektronenmicroscopie TFA: trifluorazijnzuur TGF-β: transformerende groeifactor beta VEGF: vasculaire endotheliale groeifactor SAMENVATTING Exosomen zijn ronde, komvormige cellulaire vesikels met een gemiddelde diameter van 30 – 100 nm. Ze bevatten intact en functioneel RNA, lipiden en een specifieke eiwitinhoud afkomstig van hun producerende cel. Ze spelen een belangrijke rol in kankerontwikkeling en progressie en hun inhoud werd reeds beschreven als een potentiële bron van diagnostische en prognostische biomerkers. Exosomen kunnen geïsoleerd worden uit diverse lichaamsvloeistoffen zoals bloed, urine, speeksel, alsook in vitro van in cultuur gebrachte cellijnen. Isolatie van deze vesikels en karakterisering van hun inhoud kan bijdragen tot de ontwikkeling van innovatieve methoden voor de diagnose van kanker. Daarom worden in dit onderzoek exosomen geïsoleerd van vier humane kankercellijnen aan de hand van twee isolatiemethoden. Deze methoden worden vergeleken op basis van de opbrengst, zuiverheid en reproduceerbaarheid. Daarnaast worden er eiwitcatalogen bepaald van de geïsoleerde exosomen via massaspectrometrische technieken en vergeleken met totale cellysaten en het cellulaire secretoom. Op basis van de verschillende eiwitcatalogen wordt vervolgens een exosoomsignatuur opgesteld voor de bestudeerde kankercellijnen. Resultaten bekomen door middel van massaspectrometrie tonen aan dat het aangewezen is om gebruik te maken van differentiële centrifugatie, in tegenstelling tot de Exoquick-TC kit, om exosomen te isoleren vanuit celcultuurmedia. Hierbij wordt best gebruik gemaakt van detergent removal kolommen als staalvoorbereiding voor massaspectrometrie. Echter, steeds zijn er wel nog contaminerende serumeiwitten aanwezig in de stalen. Verder worden voor de verscheidene cellijnen zowel gemeenschappelijke exosomale eiwitten geïdentificeerd als unieke eiwitten. Op basis van deze exosomale eiwitten kunnen cellijnspecifieke exosoomsignaturen opgesteld worden. De twee geselecteerde borstkankercellijnen, MDA en MCF7 cellijn, blijken echter weinig overeenkomst te vertonen in exosomale eiwitten. Dit zou eventueel te wijten kunnen zijn aan hun verschillende graad van agressie. 1 SUMMARY Exosomes are membranous vesicles that are secreted by a variety of cell types, including tumor cells, both under normal as well as pathological conditions. They are characterised by their nanometer size (30 – 100 nm diameter), cup-shaped morphology and they contain specific proteins, mRNAs, miRNAs and lipids derived from their originating cell. A detailed study of these exosomes may provide more insights into the role of exosomes in cancer development and cancer progression and new biomarkers can be identified. In the present study, exosomes were isolated from four human cancer cell lines by means of differential centrifugation and the Exoquick-TC kit of System Biosciences, and both isolation methods were compared based on the overall yield, reproducibility and purification. Differential centrifugation appears to be the most favourable when isolating exosomes from cell culture media. However, there still is contamination with proteins derived from serum present in the growth media. The protein content of the exosomes from these different cell lines was determined using mass spectrometry and compared to the proteins found in total cell lysates and cellular secretomes. Common and unique (for the cell studied) exosomal proteins were identified. With this information, proteomic signatures were developed for exosomes derived from the different cell lines. Comparison of these proteomic signatures points out that the proteomic content of exosomes is not necessarily correlated with the origin of their originating cell. Of note is that exosomes isolated from MCF7 or MDA cell lines show little similarities, which can be possibly caused by their difference in metastatic capacity. 2 1. INLEIDING 1.1 Kanker Wereldwijd is kanker, naast hart- en vaatziekten, de meest voorkomende doodsoorzaak (1). Kanker is een dynamische ziekte die ontstaat door defecten in de regulatie van normale celproliferatie en homeostase (2). Het kankerproces is een meerstappenproces dat tot stand komt door veranderingen in het genoom. Kanker omvat een breed ziektebeeld dat veel verschillende types en subtypes bevat en onder andere gepaard gaat met zelfvoorziening van groeisignalen, ongevoeligheid voor anti-groeisignalen, ontsnappen aan apoptose, ongelimiteerde replicatie, angiogenese en weefselinvasie en metastasevorming. Een precieze en tijdige diagnosestelling is belangrijk voor een aangepaste behandeling en het voorkomen van uitzaaiingen (2). De meeste kankergerelateerde sterfgevallen worden veroorzaakt door metastasen. Vaak worden patiënten echter pas gediagnosticeerd in een vergevorderd stadium of is er sprake van overdiagnose (3, 4). Dit is te wijten aan weinig gevoelige en weinig specifieke diagnose- en opvolgingsmethoden (5). Ook zijn deze methoden, zoals cystoscopie en biopsie, vaak invasief, duur en bieden niet altijd informatie over de prognose (5, 6). Daarom is er nood aan meer sensitieve diagnostische en prognostische biomerkers voor een betere en snellere detectie (7, 8). 1.2 Exosomen 1.2.1. Microvesikels Microvesikels zijn membraanafgeleide vesikels die continu afgescheiden worden via exocytose door diverse celtypes (8). Dit gebeurt zowel onder normale als onder pathologische condities (9). Deze microvesikels kunnen worden ingedeeld op basis van hun grootte, vorm en secretiemechanisme in exosomen en micropartikels zoals weergegeven in figuur 1 (10, 11). Exosomen zijn ronde, komvormige vesikels met een gemiddelde diameter van 30 – 100 nm (12). Ze worden gevormd door inwaartse knopvorming van endosomale membranen die intraluminale vesikels vormen binnen intracellulaire multivesiculaire lichamen (13). Deze multivesiculaire lichamen dragen bij tot de afbraak van geïnternaliseerde eiwitten door fusie met lysosomen (9). Ze kunnen ook versmelten met het plasmamembraan en zo hun intraluminale vesikels vrijstellen als exosomen. Exosomen worden gesecreteerd door verschillende celtypes zoals reticulocyten, immuuncellen (dendritische cellen, B cellen, T cellen, mastcellen), epitheliale cellen, bloedplaatjes, levercellen en tumorcellen (3, 11). 3 Micropartikels zijn met een gemiddelde diameter tussen 100 nm en 1 µm groter dan exosomen en hebben een onregelmatigere vorm (10). Ze worden, in tegenstelling tot exosomen, meteen vrijgesteld aan het plasmamembraan. Figuur 1: Vorming en secretie van exosomen en micropartikels. Exosomen worden gevormd door inwaartse knopvorming van endosomale membranen in multivesiculaire lichamen. Deze kunnen versmelten met het plasmamembraan voor vrijstelling van exosomen of opgenomen worden in lysosomen voor degradatie van hun inhoud. Micropartikels worden meteen vrijgesteld aan het plasmamembraan. Exosomen werden reeds bestudeerd in verschillende pathologische aandoeningen zoals atherosclerose, pulmonale hypertensie, thrombose en andere vasculaire aandoeningen alsook bacteriële infecties en kanker (13). Er is vooral veel interesse naar de rol van exosomen in kankerontwikkeling en kankerprogressie. Zo werden exosomen reeds bestudeerd in vele verschillende types kanker zoals prostaat-, borst-, ovarium- en colorectale kankers en melanomen (3, 5). De secretie van exosomen kan gereguleerd worden in verschillende celtypes door ligandherkenning of onder stresscondities (12). Ook is de hoeveelheid van de gesecreteerde exosomen afhankelijk van verschillende factoren zoals celtype, celcyclus en het stadium van de kanker (13). Dit laatste kan verklaard worden door het feit dat oncogene mutaties de mogelijkheid hebben om cellulaire vesiculatie pathways te moduleren (7). Dit werd reeds geobserveerd bij oncogene mutaties in de epidermale groeifactor receptor (EGFR) en Ras, wat een effect had op downstream gelegen moleculen in de pathway zoals Rab27a, waardoor de exosoomsecretie toenam in deze kankercellen. 4 Er worden verschillende termen in de literatuur gebruikt die allemaal verwijzen naar deze extracellulaire vesikels; exosomen, ectosomen, extracellulaire membraanvesikels, nanopartikels, oncosomen en andere (10). In deze masterproef zal verder de term exosomen gebruikt worden. 1.2.2. De exosomale inhoud Exosomen worden omsloten door een tweelagige lipidenmembraan (3, 13). Dit membraan bevat voornamelijk dezelfde lipiden als het plasmamembraan, namelijk fosfolipiden, cholesterol, sphingomyeline en ceramide (10, 14). Exosomen worden verder gekarakteriseerd door een densiteit van 1,13 – 1,19 g/ml in een sucrosegradiënt en ze sedimenteren bij 100.000 g (12). De inhoud en biologische functies van exosomen zijn afhankelijk van de cel van herkomst en de condities waaronder ze geproduceerd werden (15). Ze bevatten verschillende bioactieve moleculen zoals eiwitten, lipiden en genetisch materiaal (mRNA, miRNA, rRNA en tRNA) (3, 5, 10). De online exosoomdatabank ExoCarta (http://exocarta.org) bevat informatie omtrent deze inhoud van exosomen van reeds 146 studies en is gratis raadpleegbaar. Exosomen bevatten een uniek eiwitprofiel (9). Deze eiwitten kunnen ingedeeld worden in twee groepen (16). Een eerste groep bestaat uit een geconserveerde, gemeenschappelijke set van exosomale eiwitten die een rol spelen in adhesie (integrines), biogenese van exosomen (Alix, TSG101 en clathrine), membraantransport (annexines, Rab eiwitten) en het cytoskelet (actine, tubuline en myosine) (3, 16). Een tweede groep bevat eiwitten gerelateerd aan de producerende gastheercel (16). Bijgevolg zijn bij exosomen gesecreteerd door tumorcellen deze laatste groep van eiwitten gerelateerd aan het tumorfenotype en de pathologische functies (10, 16). De inclusie of exclusie van cellulaire eiwitten in exosomen is niet willekeurig maar wordt gecontroleerd door een eiwit sorteermechanisme tijdens de formatie van de vesikels (10). Gesuggereerde sorteermechanismen werken via cargo-eiwitten of gebruiken co-sortering door eiwit- of lipideninteracties. Exosomen beschikken ook over intact en functioneel mRNA en miRNA (8). miRNA’s zijn korte RNA moleculen die vooral binden aan de 3’UTR van targettranscripten en hierdoor repressie van translatie of degradatie van het transcript als gevolg hebben. Ze kunnen hierdoor veel fundamentele biologische processen beïnvloeden zoals tumorsuppressie en oncogenese. Zowel mRNA’s als miRNA’s kunnen na secretie functioneel doorgegeven worden aan naburige of verder afgelegen cellen en daar genexpressie moduleren (10, 14). Zo kunnen 5 mRNA’s aanleiding geven tot een functioneel eiwit (17). Het is mogelijk dat specifieke mRNA’s en miRNA’s ook selectief opgenomen worden in exosomen, maar in de literatuur is hier nog geen duidelijkheid over (10). Naast eiwitten en genetische informatie bevatten exosomen ook lipiden (10). Zoals eerder vermeld bestaat het lipidenmembraan van exosomen voornamelijk uit dezelfde lipiden als deze die we aantreffen in het plasmamembraan, doch in exosomen afkomstig van verschillende celtypes werden verschillen in lipidencompositie vastgesteld. Deze lipiden kunnen bijdragen tot de biologische functies van exosomen zoals bv. de angiogene activiteit van exosomen gesecreteerd door tumorcellen, die voornamelijk gereguleerd wordt door sfingomyeline. Uniek voor exosomen afkomstig van kankercellen is dat ze eiwitten kunnen bevatten die rechtstreeks gelinkt zijn aan het kankerproces (7). Deze eiwitten kunnen mutaties bevatten of gewijzigd tot expressie komen door onder meer een oncogene activatie of repressie van hun translatie. Daarnaast kunnen ze ook kankergerelateerde moleculen bevatten zoals bv. Myc, Ras, PTEN, HER2 en β-catenine. 1.2.3. Biologische functies van exosomen Exosomen oefenen verschillende biologische functies uit zoals antigenpresentatie, intercellulaire communicatie, regulatie van de immuunrespons en kankerontwikkeling en progressie (9). Exosomen spelen een belangrijke rol in cel-cel communicatie (12). Ze interageren met cellen via verschillende mechanismen (12, 16). Ze kunnen ofwel binden op het oppervlak van de cel door middel van exosomale adhesiemoleculen of ligand-receptor interacties ofwel is er interactie door fusie met het plasmamembraan of internalisatie aan de hand van receptorgemedieerde endocytose of fagocytose. De interactie van exosomen met cellen uit hun omgeving leidt tot modulatie van specifieke cellulaire activiteiten en regulatie van fysiologische en pathologische processen (16). Deze intercellulaire communicatie speelt een belangrijke rol in communicatie tussen tumorcellen en hun omgeving (17). Meer specifiek hebben exosomen een grote invloed op kankerontwikkeling en -progressie (8). Ze spelen namelijk een rol in proliferatie, immuunsuppressie, angiogenese, invasie, metastasevorming en druginterferentie zoals weergegeven in figuur 2 (16). Er werd reeds aangetoond in een glioblastoom model dat exosomen gesecreteerd door tumorcellen de proliferatie van andere tumorcellen kunnen bevorderen (17). Dit toegenomen effect van 6 proliferatie en overleving wordt onder meer mogelijk gemaakt door het exosomaal transport van apoptose inhiberende eiwitten zoals survivine (16). Ook dragen exosomen bij tot immuunsuppressie onder meer door inhibitie van interleukine 2 (IL-2) gemedieerde activatie van natural killer (NK) cellen en inhibitie en apoptose van T-cellen. Figuur 2: Biologische functies van exosomen gesecreteerd door tumorcellen. Algemeen spelen exosomen een rol in intercellulaire communicatie en dit op verscheidene manieren. Daarnaast spelen exosomen gesecreteerd door tumorcellen een rol in groei van de tumor door proliferatie en overleving van tumorcellen te bevorderen. Ze dragen bij tot immuunsuppressie door inhibitie van activatie van natural killer (NK) cellen en inhibitie en apoptose van T-cellen. Ze spelen ook een rol in de vorming van premetastatische niches door angiogenese en remodulatie en degradatie van de extracellulaire matrix (ECM). Ook dragen ze bij tot drugresistentie door actieve export van de geneesmiddelen of door interactie met antilichamen. Door middel van een in vitro angiogenese assay werd de rol van exosomen in angiogenese aangetoond (17). Hierbij werden humane hersenen microvasculaire endotheliale cellen (HBMVEC) in cultuur gehouden in matrigel-gecoate platen met medium gesupplementeerd met gezuiverde glioblastoom microvesikels of angiogene groeifactoren. Hieruit bleek dat exosomen angiogenese kunnen initiëren. Dit gebeurt onder meer door middel van angiogene eiwitten (angiogenine), mRNA’s en miRNA’s (16, 17). Tetraspanines bijvoorbeeld kunnen endotheelcellen activeren en vertakking induceren door vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) expressie te induceren in doelcellen (12, 16). 7 Deze stimulatie van angiogenese draagt, samen met het moduleren van stromale cellen en het remoduleren van de extracellulaire matrix, bij tot het vormen van premetastatische niches en stimulatie van tumorinvasie (12). Exosomen beschikken over enkele metalloproteasen die de extracellulaire matrix degraderen en zo tumorinvasie vergemakkelijken. Ook induceren ze door vrijstelling van transformerende groeifactor beta (TGF-) de differentiatie van fibroblasten naar myofibroblasten. Deze stromale cellen dragen bij tot tumorgroei, vascularisatie en metastasen. Op deze manier wordt een ideale omgeving gevormd voor tumorcellen in verder afgelegen sites die bijdragen tot metastasenontwikkeling. Ten slotte wordt de protumorigene rol van exosomen verder duidelijk door inductie van resistentie voor verscheidene geneesmiddelen (12, 16, 18). Dit gebeurt door verscheidene mechanismen. Een eerste steunt op actieve export van de geneesmiddelen uit de tumorcellen via exosoomsecretie. Zo werd vastgesteld dat humane ovarium kankercellen die resistentie ontwikkeld hebben voor Cisplatine het geneesmiddel actief inbrengen in hun exosomen en dat hun exosoomsecretie toeneemt. Een andere manier van drugresistentie komt tot stand door interactie van exosomen met antilichamen. Zo bevatten exosomen gesecreteerd door borstkankercellijnen met HER2-overexpressie een intacte HER2-molecule. Deze molecule laat exosomen toe om te binden met anti-HER2 antilichamen (bv. Trastuzumab) en reduceert zo cytotoxiciteit van deze antilichamen. 1.2.4. Isolatie en karakterisering van exosomen Exosomen kunnen geïsoleerd worden uit diverse lichaamsvloeistoffen zoals plasma, urine, speeksel, ascites en amniotisch vocht of in vitro van in cultuur geëxpandeerde cellijnen (8, 14). Dit wordt mede mogelijk gemaakt daar exosomen stabiel zijn in lichaamsvloeistoffen en stabiel blijven gedurende collectie, opslag en verwerkingscondities door hun lipidenmembraan (6, 14). De isolatie van exosomen kan op verschillende manieren gebeuren zoals door differentiële ultracentrifugatie, densiteitgradiënt centrifugatie, ultrafiltratie of immunoprecipitatie (5, 10). De eerste methode steunt op de eigenschap dat exosomen sedimenteren bij 100.000 g (12). Zo wordt op basis van enkele centrifugatie- en ultracentrifugatiestappen een exosoompellet bekomen (19). Bij densiteitgradiënt centrifugatie wordt ook nog rekening gehouden met de densiteit van exosomen en wordt een sucrosekussen of sucrosegradiënt gebruikt. De ultrafiltratie methode vervangt de eerste centrifugatiestappen door filtratie over een 0,22 µm filter, waarna de exosomen gepelleteerd worden door een laatste ultracentrifugatiestap. 8 Immunoprecipitatie daarentegen maakt gebruik van magnetische beads die gecoat zijn met antilichamen die specifiek gericht zijn tegen exosomale membraaneiwitten, zoals tetraspanines (CD63, CD81 en CD9). Hierbij moet wel rekening gehouden worden met de volgende zaken. Lichaamsvloeistoffen bevatten microvesikels die afkomstig zijn van heterogene celtypes waardoor de verdere analyse van hun samenstelling en de interpretatie van de bekomen resultaten bemoeilijkt kan worden (4). Circulerende exosomen hebben ook vaak maar een korte halfwaardetijd (7). Daarnaast zijn de eigenschappen (morfologie, grootte en inhoud) van exosomen geïsoleerd uit celculturen vaak verschillend van exosomen die vrijgesteld werden door de tumor in vivo. Er heerst ook nog steeds geen consensus over de isolatiemethoden of validatie van de zuiverheid (16). Ook al bevatten exosomen gemeenschappelijke componenten, toch worden verschillende resultaten gevonden door het gebruik van verschillende isolatietechnieken (10). Deze isolatiemethoden resulteren ook vaak nog in een variabele opbrengst, bevatten vaak contaminanten en nemen veel tijd in beslag (20). Daarom zal in dit onderzoek, naast een algemene isolatiemethode, ook een minder arbeidsintensieve isolatiemethode op basis van de Exoquick-TC kit van System Biosciences (SBI) uitgetest en vergeleken worden met andere methoden. Validatie en zuiverheid van de geïsoleerde vesikels gebeurt meestal via transmissie elektronenmiscroscopie (TEM) en Western blotting (13). De eerste methode steunt op de specifieke morfologie van exosomen terwijl bij de laatste enkele exosoomspecifieke eiwitten worden gevisualiseerd zoals tetraspanines (CD9, CD63 en CD81), Alix en TSG101 (21). 1.2.5. Exosomen als biomerkers Exosomen werden reeds beschreven als potentiële bron van diagnostische biomerkers. Ze kunnen aangewend worden voor klinische applicaties zoals nieuwe diagnostische mogelijkheden en therapieën, en kunnen informatie verschaffen over de prognose en medicatierespons van de patiënt (10, 14). Door het vrijstellen van exosomen geven cellen immers informatie over hun aanwezigheid, abundantie en status (7). Het gebruik van exosomen in de diagnostiek biedt enkele voordelen ten opzichte van de huidige technieken zoals cystoscopie en biopsie, waarbij er met behulp van een cystoscoop in de blaas wordt gekeken of een stukje weefsel wordt weggenomen. Daar exosomen aanwezig zijn in verschillende toegankelijke lichaamsvloeistoffen, kunnen ze op een niet-invasieve wijze geïsoleerd worden (8). Daarnaast kan de diagnose van aandoeningen op moeilijk te 9 benaderen plaatsen, zoals de hersenen, gebeuren door isolatie van exosomen uit serum of cerebrospinaal vocht (CSV) (7, 22). Verder kunnen exosomen aangewend worden om evoluerende, genetische veranderingen gerelateerd aan tumorprogressie en behandeling te detecteren, waardoor deze detectie een dynamisch karakter krijgt (17). Ze bevatten ook informatie over het genotype van de tumor en bieden zo informatie om nieuwe therapieën te ontwikkelen. Naast diagnosticum kunnen exosomen zelf ook in therapie ingezet worden als bv. drug afgiftesystemen (2). We kunnen dus concluderen dat exosomen aangewend kunnen worden als een niet-invasieve en dynamische detectiemethode van maligniteiten en kunnen bijdragen tot de ontwikkeling van nieuwe therapiemogelijkheden daar ze een rol spelen in het kankerproces en voorkomen in verschillende toegankelijke lichaamsvochten (5, 8, 13, 17). 10 1.3. Doelstelling Isolatie van exosomen en karakterisering van hun inhoud kan bijdragen tot de ontwikkeling van verschillende innovaties op het vlak van detectie. Daarom worden in dit onderzoek exosomen geïsoleerd van vier verschillende humane kankercellijnen aan de hand van twee isolatiemethoden; differentiële centrifugatie en de Exoquick-TC kit. De eerste methode is gebaseerd op opeenvolgende (ultra)centrifugatiestappen. De tweede methode versnelt het centrifugatieproces door gebruik te maken van de Exoquick-TC precipitatieoplossing. Deze methoden zullen vergeleken worden op basis van de opbrengst, zuiverheid en reproduceerbaarheid. Vervolgens zullen de eiwitcatalogen bepaald worden van deze geïsoleerde exosomen aan de hand van massaspectrometrische technieken en vergeleken met de eiwitinhoud van totale cellysaten en het secretoom van de corresponderende cellijnen. Dit heeft het opstellen van specifieke exosoomsignaturen voor de verschillende kankercellijnen als doel. 11 2. MATERIAAL EN METHODEN 2.1. Celcultuur 2.1.1. Keuze cellijnen In dit onderzoek werd geopteerd voor vier humane kankercellijnen als bron van exosomen. Een eerste set bestaat uit twee borstkankercellijnen; de MCF7 cellijn en de agressievere MDA-MB-231 cellijn (MDA). Zo kunnen eventuele verschillen aangetoond worden in exosoominhoud tussen zelfde types kanker, maar met een verschillende graad van agressie. Verder werd de HepG2 cellijn, afkomstig van een levercarcinoom geselecteerd alsook de HeLa cellijn, afkomstig van een patiënt met een cervicale kanker. Op deze manier beschikken we over cellijnen afkomstig van drie verschillende origines, waartussen ook eventuele verschillen kunnen aangetoond worden. De MDA cellijn werd bekomen via het Departement voor Moleculair Biomedisch Onderzoek (UGent) en de HepG2 cellijn was aanwezig in het Departement voor Medisch Proteïne Onderzoek (UGent). De HeLa en MCF7 cellijnen werden aangekocht via het American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, VS). 2.1.2. Cultuurcondities Deze verschillende cellijnen werden gegroeid tot 70 – 80% confluentie in hun standaardmedium verrijkt met 10% foetaal kalfsserum (FKS, HyClone, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, VS) en 0,5% van een 5000 U/ml streptomycine/penicillineoplossing (Gibco Life Technologies, Grand Island, New York, VS). Dit medium werd eerst exosoomvrij gemaakt door middel van de methode van Théry et al. (20), zie ook verder. Voor de MDA en HepG2 cellijn was dit standaardmedium het Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium (DMEM, Gibco Life Technologies). De MCF7 en HeLa cellijn werden in cultuur gehouden in Eagle’s minimum essentieel medium (EMEM, Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, VS). Voor deze laatste cellijn werd het medium verrijkt met niet-essentiële aminozuren (NEAA, 1/100, Sigma-Aldrich). De cellen werden in cultuur gehouden in T75 en T175 Falcon flessen (Thermo Scientific) en geïncubeerd bij 37°C in 5% CO2 (Forma, Thermo Scientific). 12 2.1.3. Medium exosoomvrij maken 2.1.3.1. Ultracentrifugatie en filtratie Na optimalisatie werd gekozen om het medium exosoomvrij te maken aan de hand van de methode van Théry et al. (20). Medium (DMEM en EMEM) werd bereid met 20% FKS en 1% van een 5000 U/ml streptomycine/penicilline-oplossing. Vervolgens werd dit medium onderworpen aan ultracentrifugatie. Hiervoor werden 6 ultracentrifugatietubes (Beckman Coulter, Fullerton, Californië, VS) gevuld met elk 50 - 60 ml medium en geultracentrifugeerd bij 4°C onder vacuüm voor minimum 17 h bij 35.000 tpm (45 Ti rotor, Beckman Coulter). Hierna werd het medium afgenomen door middel van een pipet. Hierbij werd steeds 5 ml op de bodem van de centrifugatietubes achtergelaten om contaminatie met de pellet te vermijden. Aansluitend werd dit medium opeenvolgend gefiltreerd door een 0,22 µm filter (Corning Incorporated, Corning, New York, VS) en een 0,1 µm filter (VWR International, Radnor, Pennsylvania, VS) (5). Dit exosoomvrij medium werd vervolgens aangelengd met medium zonder additieven tot medium bekomen werd met 10% FKS en 0,5% van een 5000 U/ml streptomycine/penicilline-oplossing. 2.1.3.2. Amicon stirred cell Medium (DMEM) werd bereid met 10% FKS en 0,5% van een 5000 U/ml streptomycine/penicilline-oplossing. Dit medium (200 ml) werd gefiltreerd met een Amicon stirred cell (Millipore, Billerica, Massachusetts, VS) en aansluitend gefiltreerd door een 0,22 µm filter (Corning Incorporated). Dit werd uitgevoerd in samenwerking met Dr. Koen Raemdonck en Stephan Stremersch (Vakgroep Geneesmiddelenleer, VIB Zwijnaarde, UGent). 2.1.4. Cellysaten bereiden Cellysaten werden bereid van de vier verschillende kankercellijnen. Hierbij werd uitgegaan van een T175 Falcon als startmateriaal (gemiddeld 10 – 20 miljoen cellen). De cellen werden voor het lyseren 24 h serumvrij geplaatst (9). Het medium werd zo volledig mogelijk verwijderd en de cellen werden twee maal gewassen met een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Hierna werd 300 µl 20 mM ammoniumbicarbonaat (ABC) toegevoegd en de cellen losgemaakt met een celschraper en overgebracht naar een 1,5 ml Eppendorf tube. Hierna werd drie maal een vries-dooi cyclus 13 toegepast voor lysis van de cellen waarna het cellysaat 20 min gecentrifugeerd werd bij 13.000 g en 4°C (centrifuge 5415R, Eppendorf, Hamburg, Duitsland). Aansluitend werd de eiwitconcentratie bepaald met de Bradford methode (Bio-Rad, Hercules, Californië, VS). Na overnacht digereren met 2,5 µl van een 0,2 µg/µl trypsine-oplossing (Promega, Madison, Wisconsin, VS) bij 37°C (Thermomixer, Eppendorf, Hamburg, Duitsland) werden de stalen geanalyseerd via massaspectrometrie (MS). Dit werd voor elke cellijn in triplicaat uitgevoerd. 2.1.5. SILAC labeling De HeLa cellen werden SILAC gelabeld in een 1/1 verhouding met zwaar (13C6) en licht gelabelde (12C6) arginines en lysines zodat een verschil van 6 Da bekomen werd tussen de lichte en zware aminozuren (Silantes, München, Duitsland). Hierbij werden de HeLa cellen in cultuur gebracht in DMEM vrijgemaakt van natuurlijk arginine, lysine en glutamine, met 10% gedialyseerd FKS (Gibco, Life Technologies), 0,5% van een 5000 U/ml streptomycine/penicilline-oplossing en Glutamax (1/100, Gibco, Life technologies). Hieraan werden de licht en zwaar gelabelde arginines (16,8 mg/l) en lysines (183 mg/l) na filtratie toegevoegd. De cellen werden minimum 8 dagen in cultuur gehouden om volledige labeling te bekomen. Dit medium werd ook eerst exosoomvrij gemaakt volgens de methode beschreven in deel 2.1.3.1. Hierbij werd het medium, met reeds 10% gedialyseerd FKS, geültracentrifugeerd en vervolgens gefiltreerd waarna de overige componenten werden toegevoegd. Door deze SILAC labeling kon later de oorsprong (humaan, rund) van de verschillende geïsoleerde eiwitten onderscheiden worden na massaspectrometrische analyse zoals weergegeven in figuur 3. Figuur 3: MS spectra bekomen na SILAC labeling van HeLa cellen. A: Eiwitten aangemaakt door de HeLa cellen zullen zowel zwaar als licht gelabeld arginine en lysine bevatten. Hierdoor zullen hun peptiden, bekomen na digestie met trypsine, voorkomen als een koppel met 6 Dalton verschil in de MS spectra. B: Serumeiwitten zullen niet gelabeld zijn en enkel licht arginine en lysine bevatten. 14 Van deze gelabelde cellen werden exosomen geïsoleerd via differentiële centrifugatie (zie deel 2.2.3). Hiernaast werd ook het cellulaire secretoom geanalyseerd volgens de methode besproken in deel 2.1.6. Deze analyses werden steeds in triplicaat uitgevoerd. 2.1.6. Cellulaire secretoomisolatie Cellulaire secretomen werden geïsoleerd van SILAC gelabelde HeLa cellen (deel 2.1.5.) Hiervoor werd uitgegaan van een T175 Falcon (gemiddeld 15 miljoen cellen) met 25 ml medium als startmateriaal. De cellen werden eerst 24 h serumvrij geplaatst voor de isolatie (9). Het medium werd gefiltreerd over een 0,45 µm filter en aansluitend werd protease inhibitor toegevoegd (cOmplete, EDTA-vrij, Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland). Vervolgens werd het secretoom geconcentreerd door middel van een Macrosep filter met een begrenzing van 3 kDa (Pall corporation, Port Washington, New York, VS). Het secretoom werd gedurende 5 min opgekookt bij 95°C en aansluitend 10 min op ijs geplaatst. Na overnacht digestie met 2,5 µl van een 0,2 µg/µl trypsine-oplossing (Promega) bij 37°C (Thermomixer, Eppendorf) werd het secretoom geanalyseerd via MS. Dit werd in triplicaat uitgevoerd. 2.2. Isolatiemethoden 2.2.1. Collectie geconditioneerd medium De cellen werden gegroeid tot een confluentie van 70 – 80 % in hun standaardmedium verrijkt met 10% FKS en 0,5% van een 5000 U/ml streptomycine/penicilline-oplossing. Vervolgens werden de cellen gedurende 24 h geïncubeerd met serumvrij medium om de achtergrond van serumeiwitten te beperken (9). Hierna werd het cultuurmedium afgenomen met een pipet en overgebracht naar 15 ml of 50 ml centrifugatietubes (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Duitsland), afhankelijk van het volume van het geconditioneerd medium dat nodig was voor de isolatiemethode. 2.2.2. Exoquick-TC Deze isolatiemethode werd uitgevoerd volgens de handleiding van de Exoquick-TC kit van het SBI (Mountain View, Californië, VS). Een T75 Falcon (gemiddeld 1 miljoen cellen) werd gebruikt als startmateriaal. Het geconditioneerde medium (14 ml) werd afgenomen met een pipet en overgebracht naar een 15 ml centrifugatietube. Dit medium werd gecentrifugeerd gedurende 15 min bij 3.000 x g en 4°C (Z400K, Hermle). De bovenste 10 ml van het supernatans werd afgenomen met een pipet en overgebracht naar een nieuwe centrifugatietube. 15 Vervolgens werd 2 ml Exoquick-TC (SBI) toegevoegd aan het supernatans. Dit geheel werd goed gemengd en overnacht geïncubeerd (min. 12 h) bij 8°C. Hierna werd het staal terug gecentrifugeerd gedurende 30 min bij 1.500 x g en 4°C (Z400K, Hermle). Vervolgens werd het supernatans afgenomen met een pipet. Hierbij werd 2 ml supernatans achtergelaten boven de pellet. Het overgebleven supernatans werd een laatste maal gecentrifugeerd gedurende 5 min bij 1.500 x g en 4°C (Z400K, Hermle). Het supernatans werd daarna zo volledig mogelijk afgenomen door middel van een micropipet (Gilson, Middleton, Wisconsin, VS). Ten slotte werd de exosoompellet geresuspendeerd in 50 µl 0,4% natriumdodecylsulfaat (SDS) voor lysis van de exosomen. 2.2.3. Differentiële centrifugatie Deze methode is gebaseerd op het protocol van Théry et al. (20). Als startmateriaal werden 4 T175 Falcons (gemiddeld 40 – 80 miljoen cellen) gebruikt die elk 25 ml medium bevatten. Het medium werd afgenomen met een pipet en overgebracht naar 50 ml centrifugatietubes. Vervolgens werden deze tubes 20 min gecentrifugeerd bij 2000 x g en 4°C (Z400K, Hermle). Het supernatans werd overgebracht naar nieuwe centrifugatietubes (Beckman Coulter) waarbij 5 ml supernatans achtergelaten werd boven de pellet om eventuele contaminatie met componenten van deze pellet te reduceren. Hierna werd het supernatans gecentrifugeerd gedurende 30 min bij 4000 tpm en 4°C (45 Ti rotor, Beckman Coulter) en werd het supernatans terug overgebracht naar nieuwe centrifugatietubes (Beckman Coulter). Hierbij werd terug 5 ml supernatans achergelaten boven de pellet. Het supernatans werd vervolgens gedurende minimum 70 min gecentrifugeerd bij 35.000 tpm en 4°C (45 Ti rotor, Beckman Coulter). Hierna werd het supernatans zo volledig mogelijk verwijderd en werden de exosoompellets geresuspendeerd in 1 ml PBS. De geresuspendeerde pellets werden vervolgens samengevoegd in één centrifugatietube (Beckman Coulter) en aangelengd met 45 ml PBS. Er werd nog een laatste maal gecentrifugeerd gedurende 1 h bij 35.000 tpm en 4°C (45 Ti rotor, Beckman Coulter). Het supernatans werd terug zo volledig mogelijk afgenomen en de exosoompellets werden geresuspendeerd in 50 µl 0,4% SDS voor lysis van de exosomen. 16 2.3. Western Blot 2.3.1. SDS-PAGE De stalen werden voorbereid voor SDS-PAGE door toevoeging van ladingsbuffer (4x, BioRad, Hercules, Californië, VS) en reducerend agens (20x, Bio-Rad). Vervolgens werden de stalen opgewarmd gedurende 10 min bij 95°C (Thermomixer, Eppendorf). De eiwitten werden gescheiden via SDS-PAGE bij 120 V. Er werd gebruik gemaakt van een 4 – 12% BisTris Criterion XT-gel (Bio-Rad) en MOPS buffer (Bio-Rad). 2.3.2. Blotten – Odyssey systeem De eiwitten werden gedurende 30 min bij 100 V in Tris-Boor buffer geblot naar een polyvinylideen fluoride (PVDF) membraan (Immobilon, Millipore, Billerica, Massachusetts, VS). Hierna werd het membraan minimum een half uur geblokkeerd met Odyssey blocking buffer (LI-COR, Odyssey, Lincoln, Nebraska, VS) en aansluitend 10 min gewassen met 1 x Tris gebufferde zoutoplossing en Tween (TBS-T) om de blokkeerbuffer te verwijderen. Vervolgens werd het membraan gedurende 3 uur of overnacht geïncubeerd met het primaire antilichaam (anti CD63, polyklonaal, 1/2.000, SBI). Hierna werd de blot 3 maal gedurende 10 min gewassen met TBS-T om het overtollige primaire antilichaam te verwijderen. Aansluitend werd het membraan gedurende 1 h geïncubeerd met een geit anti-konijn secundair antilichaam (1/20.000, Odyssey). Vervolgens werd de blot 3 keer gewassen gedurende 10 min met TBS-T. Een laatste wasstap gebeurde met TBS gedurende 10 min. Ten slotte werd de blot gescand via de Odyssey Infrared Imager (LICOR, Odyssey). 2.3.3. Blotten – Enhanced chemiluminiscence (ECL) De eiwitten werden gedurende 30 min bij 100 V in Tris-Boor buffer geblot naar een HybondP membraan (GE Healthcare Limited, Life Sciences, Buckinghamshire, Engeland). Hierna werd het membraan minimum gedurende een half uur geblokkeerd met TBS-T met 3% runder serum albumine (BSA) en aansluitend 10 min gewassen met TBS-T om de overmaat blokkeerbuffer te verwijderen. Vervolgens werd het membraan geïncubeerd met het primaire antilichaam (anti CD63 of anti CD81, polyklonaal, 1/5.000, SBI) gevolgd door 4 wasstappen zoals eerder beschreven (deel 2.3.2.). Aansluitend werd het membraan gedurende 1 h geïncubeerd met een geit anti-konijn HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (1/50.000, SBI) waarna het membraan terug gewassen werd zoals eerder beschreven (deel 2.3.2.). Ten slotte werd het membraan 1 min geïncubeerd in Select HRP chemiluminiscent substraat kit (Amresco, Solon, Ohio, VS) en ontwikkeld (SRX-101A, Konica Minolta, Tokyo, Japan). 17 2.4. Massaspectrometrie 2.4.1. Staalvoorbereiding 2.4.1.1. Lysis exosomen De bekomen exosoompellet werd geresuspendeerd in 50 µl 0,4% SDS. Het staal werd aansluitend 10 min geïncubeerd bij kamertemperatuur voor een complete lysis. 2.4.1.2. Detergent removal kolommen SDS is niet compatibel met MS en moet na lyse verwijderd worden uit het staal. Hiervoor werd gebruik gemaakt van detergent removal kolommen (Thermo Scientific) die een concentratie tot 0,1% SDS verlagen tot 0,01% (23). Eerst werden deze kolommen drie maal gewassen met 200 µl 20 mM triethylammoniumbicarbonaat (TEAB, pH 8,4 – 8,6). Vervolgens werd 25 µl van het staal aangelengd tot 100 µl met 20 mM TEAB, zodat een concentratie van 0,1% SDS bekomen werd, en dit werd op de kolom geladen. Het geheel werd gevortext (MS2 minishaker, IKA, Staufen, Duitsland) en vervolgens 10 min geïncubeerd op kamertemperatuur. Hierna werd het staal 2 min gecentrifugeerd bij 1500 x g (centrifuge 5415R, Eppendorf). Het staal werd vervolgens overgebracht naar een 1,5 ml Eppendorf tube en opgewarmd bij 95°C gedurende 10 min (Thermomixer, Eppendorf). Voor digestie van de eiwitten werd 2,5 µl van een 0,2 µg/µl trypsine-oplossing (Promega) toegevoegd aan de stalen en aansluitend overnacht geïncubeerd bij 37°C (Thermomixer, Eppendorf). Vervolgens werd trypsine gedeactiveerd door aanzuring met 10% trifluorazijnzuur (TFA). Het staal werd vervolgens gecentrifugeerd gedurende 5 min aan 13.000 x g om eventueel onoplosbaar materiaal uit de oplossing te verwijderen waarna het supernatans overgebracht werd in een proefbuisje voor MS analyse. Het staal werd vervolgens geconcentreerd onder vacuüm (Savant Speedvac Concentrator, SVC100H, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, VS) en daarna opgelost in 40 µl laadsolvent (0,1% TFA en 2% acetonitrile (ACN)). 2.4.1.3. In gel trypsinisatie Exoquick-TC bevat nog ongekende bestanddelen die storend kunnen zijn voor de LC-MS/MS analyse. Daarom zullen deze aanwezige contaminanten verwijderd worden na SDS-PAGE scheiding van de eiwitten. Het staal werd voorbereid door toevoeging van ladingsbuffer (4x, Bio-Rad) en reducing agent (20x, Bio-Rad) en vervolgens opgewarmd gedurende 10 min bij 18 95°C (Thermomixer, Eppendorf). Het staal werd geladen op een 4 - 12% Bis-Tris polyacrylamidegel (Criterion XT-gel, Bio-Rad) en gescheiden met MOPS buffer (Bio-Rad) bij 120 V. Electroforese werd gestopt nog voor een volledige scheiding van de eiwitten optrad. De eiwitbanden werden gekleurd met Coomassie (SimplyBlue SafeStain, Life Technologies) en daarna uit het gel gesneden en overgebracht naar 0,5 ml Eppendorf tubes. Hierna volgden verschillende wasstappen. Eerst werd 100 µl Milli-Q water (Millipore), toegevoegd en het geheel goed gemengd. Vervolgens werden de gelbandjes gedurende 15 min geïncubeerd bij kamertemperatuur. Hierna werden de stalen terug gemengd en gedurende 2 min gecentrifugeerd bij 13.000 x g (centrifuge 5415R, Eppendorf). Vervolgens werd het supernatans afgenomen. Deze stappen werden herhaald met 100 µl 50% ACN en 100 µl ACN. Vervolgens werden de stalen onder vacuüm gedroogd (Savant Speedvac Concentrator, SVC100H). Hierna werden de eiwitten in gel gedigereerd met trypsine (Promega). Trypsine werd verdund tot 0,2 µg/µl in 50 mM TEAB met 10% ACN (digestiebuffer) en van deze oplossing werd 6 µl toegevoegd aan de stalen. De gelblokjes werden 15 min geïncubeerd bij kamertemperatuur zodat ze de trypsine-oplossing konden absorberen. Vervolgens werd extra digestiebuffer toegevoegd zodat de gelblokjes volledig ondergedompeld werden en de stalen werden overnacht geïncubeerd bij 37°C (Thermomixer, Eppendorf). Na digestie werden de stalen gedurende 2 min gecentrifugeerd bij 13.000 x g (centrifuge 5415R, Eppendorf) en het supernatans werd overgebracht naar een nieuwe 1,5 ml Eppendorf tube. Hieraan werd 2 µl 10% TFA toegevoegd zodat de pH daalde tot 2-3 en trypsine gedeactiveerd werd. De stalen werden goed gemengd en aansluitend gedurende 2 min gecentrifugeerd bij 13.000 x g. Ten slotte werden de stalen overgebracht in een proefbuisje voor MS/MS analyse en gedurende minimum 3 h gedroogd onder vacuüm (Savant Speedvac Concentrator, SVC100H). Finaal werden de stalen geresuspendeerd in 40 µl laadsolvent (2% ACN en 0,1% TFA). 2.4.2. Massaspectrometrie Het bekomen peptidenmengsel (2 µl) werd geladen met solvent A (0,1% TFA, 2% ACN) op de trapping kolom (geprepareerd in het labo, 100 µm interne diameter (ID) x 20 mm, 5 µm beads C18 Reprosil-HD, Dr. Maisch) van de nano-LC die online geconnecteerd is met de LTQ Orbitrap Velos massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Duitsland). Na een wasstap op de trapping kolom met solvent A, werden de peptiden geïntroduceerd in de reverse-phase analytische kolom (geprepareerd in het labo, 75 µm ID x 150 mm, 5 µm beads 19 C18 Reprosil-HD, Dr. Maisch). De peptiden werden geladen met solvent A* (0.1% mierenzuur) en gescheiden met een lineaire gradiënt (30 min) van 2% naar 50% solvent B (0,1% mierenzuur en 80% ACN) bij een flowsnelheid van 300 nl/min. Deze lineaire gradiënt werd gevolgd door een wasstap waarbij 100% solvent B bekomen werd. De geëlueerde peptiden werden geïoniseerd in de nano-Electron Spray Ionisation (ESI) bron om zo de massaspectrometer binnengebracht te worden. De MS spectra werden bekomen in de Orbitrap waarbij de 10 meest abundante ionen geïsoleerd werden voor fragmentatie en detectie van deze fragmenten in de lineaire ion trap. Figuur 4. Opbouw van de LTQ Orbitrap Velos massaspectrometer. Overgenomen van de productspecificaties van de LTQ Orbitrap Velos van Thermo Fisher Scientific. (www.thermoscientific.com) 2.4.3. Identificatie van de MS/MS spectra De identificatie van de opgenomen MS/MS spectra gebeurde met het MASCOT algoritme (http://www.matrixscience.com). Hierbij werd gebruik gemaakt van de Mascot Daemon software (versie 2.4.0., Matrix Science). Eerst werden de gewenste parameters ingevuld. Er werd gezocht tegen de Swiss-Prot databank (versie 2014_04 van de UniProtKB/Swiss-Prot eiwitdatabank). Hierbij werden de humane en runder eiwitsets gecombineerd om na te gaan in hoeverre er contaminatie aanwezig was van serumeiwitten. Wanneer uit deze resultaten bleek dat er weinig achtergrond was van serumeiwitten, werd verder gezocht op de humane set alleen, met een aparte controle in de runder eiwitset. Als variabele modificaties werden acetylatie van de N-terminus van de eiwitten, omzetting van N-terminaal glutamine naar pyroglutaminezuur, oxidatie van methionine en vorming van een propionamide van cysteïne opgegeven wanneer de staalvoorbereiding in gel trypsinisatie inhield. Indien dit niet het geval was, werd deze laatste modificatie weggelaten. Als gebruikte protease werd trypsine/P opgegeven, wat erop wijst dat trypsine ook kan knippen na lysines en arginines die door een proline gevolgd worden. Als maximum gemiste knipplaatsen werd 1 ingesteld. De accuratesse 20 werd voor massa’s van de peptiden ingesteld op ± 10 ppm en voor de fragmentionen op ± 0,5 Dalton. De stalen werden geanalyseerd met de LTQ Orbitrap Velos massaspectrometer waarbij als instrumentsetting een ESI-TRAP opgegeven werd. Wanneer de verschillende parameters opgeslagen waren, werden de ruwe data toegevoegd en werd de spectra generatie en zoekopdracht gestart. Alleen peptiden die scoorden boven de ingestelde drempelwaarde, die werd ingesteld op 99% betrouwbaarheid, werden weerhouden. Wanneer de zoekopdracht afgerond was, werden deze bekomen spectra alsook de eerder bekomen ruwe data opgeslagen in het ms_lims systeem (24). Kwantificatie na SILAC labeling werd eveneens uitgevoerd gebruik makend van Mascot Daemon software. 2.4.4. Data-analyse Data-analyse gebeurde door gebruik te maken van het programma KNIME (versie 2.9.0, http://www.knime.org/). Een workflow, zoals weergegeven in figuur 5, werd opgesteld om de vergelijking te maken tussen totale cellysaten en de exosoomstalen bekomen door de verschillende isolatietechnieken (Exoquick-TC kit en differentiële centrifugatie in combinatie met detergent removal kolommen of in gel trypsinisatie). Hierbij werd eerst een algemeen Excel bestand gecreëerd van alle stalen samen met het accessienummer, eiwitomschrijving en procentuele abundantie van elk eiwit. De procentuele abundantie werd bekomen door het aantal spectra voor elk eiwit te delen door het totaal aantal spectra in dat staal en te vermenigvuldigen met 100 zodat procenten bekomen werden. Hierbij werd steeds gebruik gemaakt van het aantal spectra, wat slechts een relatieve kwantificatie toelaat (13). Echter, doordat de experimenten steeds in triplicaat zijn uitgevoerd, biedt dit meer zekerheid over de identificatie en relatieve kwantificatie van de eiwitten. Vervolgens werden de stalen van interesse via een kolomfilter geselecteerd. Aansluitend werden de eiwitten van de exosoomstalen gerangschikt volgens aflopende procentuele abundantie zodat ze vergeleken konden worden met de totale cellysaten. Figuren werden bekomen via het R softwarepakket (versie 3.1.0.) in KNIME. 21 Figuur 5. KNIME workflow voor de vergelijking van de exosoomstalen met de totale cellysaten. De KNIME workflow gevolgd voor de vergelijking van de exosoomstalen, bekomen door de verscheidene aangewende isolatiemethoden, met de totale cellysaten. Kwantificatie van de SILAC gelabelde stalen (exosoomstalen en cellulaire secretomen) werd eveneens uitgevoerd met behulp van KNIME. Hierbij werd voor alle stalen de log2 waarde genomen van de L/H waarden voor een zo goed mogelijke benadering van de normaalverdeling. Vervolgens werd, per staal, van deze waarden de Huber scale en de mediaan berekend en werd via deze waarden een 95% betrouwbaarheidsinterval opgesteld. Omdat er sprake was van veel extreme waarden, was dit interval breed waardoor hetzelfde nogmaals werd herhaald op een selectie van de L/H waarden, uitgedrukt in log2 waarden, gelegen tussen -1 en 1. De distributiecurves werden bekomen via R in KNIME. 2.5. ExoCarta De geïdentificeerde eiwitten van de exosoomstalen, totale cellysaten en cellulaire secretoom werden vergeleken met de online exosoomdatabank ExoCarta (http://www.exocarta.org/). Hiervoor werd de eiwit/mRNA dataset (datum van vrijgave: 29/05/12) gedownload en werden de gennamen van deze eiwitten vergeleken met deze van de gegenereerde dataset van dit onderzoek door verticaal zoeken via Excel. De humane eiwitten gemeenschappelijk voor beide datasets werden weerhouden. In deze eiwitlijst werd specifiek gezocht naar de exosomale eiwitten geïdentificeerd in dit onderzoek. 22 3. RESULTATEN 3.1. Medium exosoomvrij maken Het medium werd exosoomvrij gemaakt door een combinatie van ultracentrifugatie en filtratie (zie deel 2.1.3.1.) (figuur 6). Stalen werden genomen voor ultracentrifugatie, na ultracentrifugatie (staalname aan de top van de centrifugatietube en midden van de centrifugatietube) en na filtratie. Hiernaast werd ook een vergelijking gemaakt met exosoomvrij medium bekomen na filtratie door een Amicon stirred cell (Millipore) en aangekocht exosoomvrij serum van het SBI. Tevens werd als positieve controle DMEM met 20% FKS geanalyseerd. Als primair antilichaam werd gekozen voor een antilichaam specifiek gericht tegen één van de gekende exosomale merkers; anti CD63 (~53 kDa) (21). Figuur 6: Medium exosoomvrij maken. Western blot van het exosoomvrij maken van medium (A - grijswaarden, B – kleur) met 1) DMEM met 20% FKS, 2) DMEM met 20% FKS na ultracentrifugatie(UC) – topfractie, 3) DMEM met 20% FKS na UC – middenfractie, 4) DMEM met 20% FKS na UC - gepoolde fractie, 5) DMEM met 20% FKS na filtratie, 6) DMEM met 10% dFKS, 7) DMEM zonder additieven. Western blot van het exosoomvrij maken van medium (C) met 1) DMEM met 10% aangekocht exosoomvrij medium, 2) EMEM met 10% aangekocht exosoomvrij medium, 3) DMEM met 10% FKS na filtratie door de Amicon stirred cell. Het moleculair gewicht van de merkers wordt weergegeven in kDa. 23 Figuur 6 toont aan dat na ultracentrifugatie de top- en middenfractie van het medium met 20% FKS respectievelijk geen en een zwak signaal geven voor aanwezigheid van CD63, dit in tegenstelling tot de positieve controle (DMEM met 10% FKS) en het aangekochte serum van het SBI. Echter, de gepoolde fractie bevat wel nog een merkelijk aantoonbaar signaal, wat erop wijst dat toch nog exosomen meegenomen werden door het samenvoegen van de fracties. De extra filtratiestappen hebben geen zichtbaar effect op de signaalsterkte voor CD63. Het eindresultaat, medium met 10% FKS, bevat een duidelijk minder aantoonbaar signaal voor CD63 wat vergelijkbaar is met het medium dat bekomen werd na filtratie door de Amicon stirred cell. 3.2. Exosoomisolatie aan de hand van de Exoquick-TC kit 3.2.1. Aanwezigheid van serum Isolatie van exosomen van MDA en MCF7 cellen gegroeid in medium met 10% FKS, vrijgemaakt van exosomen, gebeurde door middel van de Exoquick-TC kit (zie deel 2.2.2.). Dit experiment werd twee maal uitgevoerd met de MDA celllijn en één maal met de MCF7 cellijn. De 15 meest abundante eiwitten voor de drie stalen samen, gerangschikt volgens aflopend aantal unieke peptiden, worden getoond in tabel 1. Tabel 1: Lijst van de 15 meest abundante (unieke) eiwitten aanwezig na isolatie van exosomen van MDA en MCF7 cellen gegroeid in medium met 10% FKS. Accesie A0JN77 A0JN91 A2VDN8 A2I7N0 A1A4R1 A2I7M9 B8Y9S9 A2VE41 F1MY85 Q7SIH1 A2VDL6 A2VDZ0 A5A3E0 P15497 P02769 A4IFL4 A3KMV5 Eiwit Runder Bifunctioneel ATP-afhankelijk dihydroxyaceton kinase/FAD-AMP lyase Runder Complement C3 Humaan Collageen alfa-1(XII) keten Runder Serpin A3-4 (fragment) Runder Alfa-2-macroglobuline Runder Serpin A3-2 Runder Embryo-specifiek fibronectine 1 transcript variant Humaan Fibronectine Runder Complement C5a anafylatoxine Runder Alfa-2-macroglobuline Runder Inter-alfa-trypsine inhibitor zware keten Runder Proteïne fosfatase 2, regulatorische subeenheid B', alfa isoform Runder Coagulatie factor V Runder Apolipoproteïne A-I Runder Serum albumin Runder PPARD protein Humaan Thrombospondine-1 Unieke peptiden Cellijn 189 MDA 83 73 68 64 62 49 46 45 41 36 MDA MDA MDA MDA MDA MCF7 MDA MCF7 MDA MDA 36 35 33 31 30 29 MDA MDA MCF7 MCF7 MDA MDA Tabel 1: De resultaten bekomen na massaspectrometrie van de geïsoleerde exosomen van de MDA en MCF7 cellijn met de Exoquick-TC kit. Weergegeven zijn het accessienummer, de omschrijving van het eiwit en het aantal gevonden unieke peptiden. De lijst is gesorteerd van het meest geïdentificeerde eiwit naar het minst geïdentificeerde eiwit. 24 Tabel 1 toont aan dat er veel achtergrond is van serumeiwitten. Hierdoor werd geopteerd om de cellen steeds 24 h serumvrij te plaatsen voorafgaand aan isolatie van exosomen. 3.2.2. Cellen 24 h serumvrij Exosomen werden geïsoleerd van MDA, MCF7 en HepG2 cellen met de Exoquick-TC kit (zie deel 2.2.2.). Hiervoor werden de cellen eerst 24 h serumvrij geplaatst om achtergrond van serumeiwitten te beperken. De stalen werden voorbereid voor MS/MS analyse door in gel trypsinisatie. Dit experiment werd vier maal uitgevoerd met de MDA cellen, in triplicaat voor de MCF7 cellijn en één maal met de HepG2 cellijn. De herhaalbaarheid van de exosoomisolatie via de Exoquick-TC kit wordt weergegeven in figuur 7.A. De algemene verdeling van de procentuele abundantie (dit is het aantal spectra per eiwit gedeeld door het totaal aantal spectra in dat staal, uitgedrukt in percentages) van de eiwitten aanwezig in de exosoomstalen en de totale cellysaten worden, per cellijn, gevisualiseerd (figuur 7.B). Hieruit kunnen gelijkenissen (MDA, HepG2) of verschillen (MCF7) in distributie van de eiwitten in de exosoomstalen en totale cellysaten afgeleid worden. Enkele eiwitten zijn steeds sterk aanwezig in de exosoomstalen van alle cellijnen en zijn afwezig of duidelijk minder aanwezig in de overeenstemmende totale cellysaten; glucocorticoïd receptor (P04150) en POTE ankyrine domein familielid F (A5A3E0). Een visuele weergave hiervan wordt weergegeven voor het eerst vernoemde eiwit (figuur 8). Vergelijkbare grafieken werden bekomen voor de overige eiwitten. Ook waren in alle exosoomstalen contaminerende eiwitten, zoals keratines, uitgesproken aanwezig en dit is heel wellicht te wijten aan de behandeling van de stalen. 25 Figuur 7: Herhaalbaarheid van exosoomisolatie met Exoquick TC en de algemene verdeling van de procentuele abundantie van de eiwitten. A. Herhaalbaarheid van de exosoomisolatie door de Exoquick TC kit met rood – MDA cellijn, blauw – MCF7 cellijn en groen – HepG2 cellijn. B. Verdeling van de procentuele abundantie van de eiwitten na exosoomisolatie (blauw) en de totale cellysaten (rood) met de Exoquick TC kit. 26 Figuur 8: Aanwezigheid van glucocorticoïd receptor. De grafieken tonen de verdeling aan van de procentuele abundantie van de eiwitten van de exosoomstalen (blauw) en totale cellysaten (rood). De blauwe cirkels tonen de aanwezigheid aan van glucocorticoïd receptor in de exosoomstalen. De rode cirkel toont de aanwezigheid aan van dit eiwit in de totale cellysaten. 27 Ook worden cellijn-specifieke eiwitten aangetroffen, voornamelijk voor de HepG2 cellijn (tabel 2). Deze zijn steeds duidelijk meer aanwezig in de exosoomstalen dan in de overeenstemmende totale cellysaten. De geïdentificeerde exosomale eiwitten worden steeds vergeleken met de eiwitten geïdentificeerd in het onderzoek van Chiasserini et al., dit om gelijkenissen aan te tonen met de eiwitinhoud van in vivo geïsoleerde exosomen (25). Tabel 2: Cellijn-specifieke eiwitten gevonden na exosoomisolatie via de Exoquick TC kit. MCF7 Apolipoproteïne A1 * P02647 HepG2 Apolipoproteïne E * Clusterine Fibrinogeen alfaketen * Fibrinogeen betaketen * Fibrinogeen gammaketen Galectine 3 bindend proteïne Glypican-3 Nucleoline Reeline P02649 P10909 P02671 P02675 P02679 Q08380 P51654 P19338 P78509 Tabel 2: Cellijn-specifieke eiwitten waargenomen in exosoomstalen na isolatie door de Exoquick-TC kit, weergegeven voor de MCF7 en HepG2 cellijn met links de naam van het eiwit en rechts het accessienummer. Er werden geen cellijn-specifieke exosomale eiwitten aangetroffen in de MDA cellijn. De aangeduide eiwitten (*) werden ook reeds geïdentificeerd in humaan CSV (25). Daar met deze isolatiemethode steeds een lage opbrengst bekomen werd en de herhaalbaarheid gering was, werd dit experiment niet uitgevoerd in triplicaat voor de HepG2 cellijn. Ook werd dit experiment niet meer herhaald met de HeLa cellijn. 28 3.3. Exosoomisolatie aan de hand van differentiële centrifugatie 3.3.1. Staalvoorbereiding door middel van detergent removal kolommen Exosomen werden geïsoleerd van de vier verschillende kankercellijnen (MDA, MCF7, HeLa en HepG2 cellijnen) door differentiële centrifugatie (zie deel 2.2.3.). Hiervoor werden de cellen eerst 24 h serumvrij geplaatst om de achtergrond van serumeiwitten te beperken. De stalen werden voorbereid voor LC-MS/MS analyse door middel van detergent removal kolommen (deel 2.4.1.2.). Dit werd voor elke cellijn uitgevoerd in triplicaat (figuur 9). Figuur 9: Reproduceerbaarheid van de exosoomisolatie via differentiële centrifugatie en staalvoorbereiding voor MS via detergent removal kolommen. De grafieken tonen de verdeling aan van de procentuele abundantie van de eiwitten in de exosoomstalen na isolatie door differentiële centrifugatie en voorbereiding voor MS via detergent removal kolommen. De drie experimenten worden steeds weergegeven in een andere kleur; blauw, rood en groen. 29 De algemene verdeling van de procentuele abundantie van de eiwitten wordt weergegeven, zowel voor de exosoomstalen als voor de totale cellysaten, voor de vier cellijnen (figuur 10). Figuur 10: Algemene verdeling van de procentuele abundantie van de eiwitten in de exosoomstalen en de totale cellysaten. De grafieken geven de algemene verdeling weer van de procentuele abundantie van de eiwitten in de exosoomstalen (blauw) en de totale cellysaten (rood) na exosoomisolatie via differentiële centrifugatie gevolgd door voorbereiding voor MS door detergent removal kolommen. Dit wordt getoond voor de 4 cellijnen. 30 Verscheidene eiwitten zijn waarneembaar in alle vier de cellijnen en zijn afwezig of duidelijk minder aanwezig in de totale cellysaten van de overeenkomstige cellijnen (tabel 3). Het voorkomen van de eiwitten 4F2 cell-surface antigen heavy chain en glucocorticoïd receptor wordt visueel weergegeven voor de HeLa cellijn (figuur 11). Vergelijkbare resultaten werden bekomen voor de overige cellijnen, alsook voor de andere vernoemde eiwitten. Tabel 3: Eiwitten specifiek aanwezig in de exosoomstalen van alle cellijnen. Accessienummer P62249 P15880 P08195 P04150 P04908 O60814 Q01650 Q15758 P11166 Eiwitnaam 40 S ribosomaal eiwit S16 40 S ribosomaal eiwit S2 4F2 cell-surface antigen heavy chain Glucocorticoïd receptor Histon H2A type 1-B/E Histon H2B type 1-K Large neutral amino acid transporter small subunit 1 Neutral amino acid transporter B(0) Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 1 Tabel 3: Eiwitten die specifiek voorkomen in de exosoomstalen van de 4 cellijnen na isolatie door differentiële centrifugatie en staalvoorbereiding voor MS via detergent removal kolommen. Deze eiwitten werden nog niet geïdentificeerd in humaan CSV (25). Figuur 11: Aanwezigheid van specifieke exosomale eiwitten in de HeLa cellijn. De grafieken tonen de verdeling aan van de procentuele abundantie van de eiwitten in de exosoomstalen (blauw) en de totale cellysaten (rood). De blauwe cirkels tonen de aanwezigheid aan van 4F2 cell-surface antigen heavy chain (4F2, links) en glucocorticoïd receptor (GR, rechts) in de exosoomstalen. Beide eiwitten werden niet geïdentificeerd in de totale cellysaten. 31 Alle vier de cellijnen bevatten ook steeds hoge aantallen heat shock cognate 71 kDa en verscheidene annexines (onder meer annexine A2, A3 en A4), maar deze eiwitten komen niet meer voor in de exosoomstalen. Ook worden cellijn-specifieke eiwitten gevonden die enkel aanwezig zijn in exosoomstalen van één van de vier cellijnen (tabel 4). Deze eiwitten zijn ook duidelijk minder aanwezig in de totale cellysaten van de overeenstemmende cellijnen. Tabel 4. Cellijn-specifieke eiwitten. MDA Dermcidine Heat shock cognate 71 kDa HLA klasse 1 A2 Hornerine Integrine alfa-3 Lactadherine * Lysozyme C Proteolipide protein 2 HeLa Alkaline fosfatase Annexine A6 Basigine CD 109 CD 99 Flotilline-1 Histon H2AX Histon H2B type 1-J Podocalyxine Ras-related protein Rab-7a Ras-related protein Rab-1A Ras-related protein Ral-A Tubuline beta 4A keten P81605 P11142 P01892 Q86YZ3 P26006 Q08431 P61626 Q04941 P05186 P08133 P35613 Q6YHK3 P14209 O75955 P16104 P06899 O00592 P51149 P62820 P11233 P04350 MCF7 40S ribosomaal S15a Catenine alfa-1 CD63 Nucleoline Ras GTPase activating like protein Semaphorine-3C HepG2 Apolipoproteïne A1 * Apolipoproteïne E * Fibrinogeen alfa keten * Fibrinogeen beta keten * Fibrinogeen gamma keten Fibronectine P62244 P35221 P08962 P19338 Q13283 Q99985 P02647 P02649 P02671 P02675 P02679 P02751 Tabel 4: Cellijn-specifieke eiwitten waargenomen in exosoomstalen na isolatie door differentiële centrifugatie en staalvoorbereiding voor MS via detergent removal kolommen. Voor elke cellijn is links de eiwitnaam weergegeven en rechts het accessienummer. De aangeduide eiwitten (*) werden ook reeds geïdentificeerd in humaan CSV (25). Voorts zijn ook eiwitten teruggevonden die duidelijk meer voorkomen in de exosoomstalen dan in de totale cellysaten en dit steeds voor drie van de vier cellijnen, zoals CD44 antigen (P16070), POTE ankyrine domein familielid F (A5A3E0), clusterine (P10909) e.a. (de volledige lijst is als bijlage beschikbaar). Ook valt op dat de MDA en MCF7 cellijn, beide afkomstig van een borst adenocarcinoom, meer gelijkenissen vertonen met de HeLa cellijn dan met elkaar. Er is slechts één exosomaal eiwit dat uitsluitend voorkomt in de beide borstkankercellijnen; MARCKS related protein (P49006). 32 3.3.2. Staalvoorbereiding door middel van in gel trypsinisatie Exosomen van de vier verschillende kankercellijnen werden geïsoleerd door differentiële centrifugatie (deel 2.2.3.) en voorbereid voor MS via in gel trypsinisatie (deel 2.4.1.3.). Dit werd voor elke cellijn uitgevoerd in triplicaat (figuur 12). Figuur 12: Reproduceerbaarheid van de exosoomisolatie via differentiële centrifugatie en voorbereiding voor MS door in gel trypsinisatie. De grafieken tonen de verdeling aan van de procentuele abundantie van de eiwitten in de exosoomstalen na isolatie via differentiële centrifugatie en voorbereiding voor MS door in gel trypsinisatie. De drie experimenten worden steeds weergegeven in een andere kleur; blauw, rood en groen. De grafieken worden weergegeven voor de 4 cellijnen. 33 De algemene verdeling van de procentuele abundantie van de eiwitten aanwezig in de exosoomstalen en de totale cellysaten worden getoond voor de vier cellijnen (figuur 13). Figuur 13: Algemene verdeling van de procentuele abundantie van de eiwitten in de exosoomstalen en totale cellysaten na isolatie door differentiële centrifugatie en voorbereiding voor MS via in gel trypsinisatie. De grafieken tonen de verdeling aan van de procentuele abundantie van de eiwitten in de exosoomstalen (blauw) en de totale cellysaten (rood). Dit wordt weergegeven voor elke cellijn afzonderlijk. Verschillende eiwitten zijn waarneembaar in de exosoomstalen van alle vier de cellijnen en deze zijn afwezig in de totale cellysaten; glucocorticoïd receptor (P04150) en POTE ankyrine domein familielid F (A5A3E0). Ook werden steeds eiwitten afkomstig van de behandeling van de stalen weergevonden in de exosoomstalen zoals keratines, hornerine en dermcidine, die afwezig waren in de totale cellysaten. Er werden enkel cellijn-specifieke eiwitten, aangetroffen in hoge mate in de exosoomstalen en afwezig of weinig aanwezig in de totale cellysaten, gevonden voor de HeLa en HepG2 cellijn (tabel 5). 34 Tabel 5: Cellijn-specifieke eiwitten gevonden na exosoomisolatie door differentiële centrifugatie en voorbereiding voor MS via in gel trypsinisatie. HepG2 Alfa-2-macroglobuline Fatty acid synthase Fibrinogeen alfa keten * Galectine-3-bindend eiwit P01023 P49327 P02671 Q08380 HeLa 4F2 cell-surface antigen heavy chain Annexine A2 Filaggrine-2 Histon H2B type 1-K Large neutral amino acid transporter small subunit 1 Neutral amino acid transporter B(0) Sodium/pottassium-transporting ATPase subunit 1 * Transferrine receptor protein 1 * P08195 P07355 Q5D862 O60814 Q01650 Q15758 P05023 P02786 Tabel 5: Cellijn-specifieke eiwitten waargenomen in exosoomstalen (HepG2 en HeLa cellijn) na isolatie door differentiële centrifugatie en staalvoorbereiding voor MS via in gel trypsinisatie. Links wordt de eiwitnaam weergegeven, rechts het accessienummer. De aangeduide eiwitten (*) werden ook reeds geïdentificeerd in humaan CSV (25). Op basis van de exosomale eiwitten, bekomen door de verscheidene isolatiemethoden, werden exosoomsignaturen opgesteld voor de vier cellijnen (zie bijlage). Hiernaast werd ook gekeken naar alle eiwitten geïdentificeerd in de exosoomstalen. Ongeveer de helft van deze eiwitten (gemiddeld 46 tot 59%) waren louter aanwezig in de exosoomstalen en afwezig in de totale cellysaten. Hierbij werd een verband opgemerkt tussen de eiwitinhoud van de verschillende cellijnen (figuur 14). Hiervoor werd geen gebruik gemaakt van het aantal spectra maar louter van de aanwezigheid van een eiwit. Het wil echter niet zeggen dat wanneer een eiwit niet geïdentificeerd wordt, het effectief ook afwezig is in het staal. Figuur 14: Overeenkomst van de exosomale eiwitten van de vier cellijnen. De verdeling van de exosomale eiwitten wordt weergegeven in een Venndiagram voor de vier cellijnen. Hierbij wordt steeds het aantal geïdentificeerde eiwitten in de exosoomstalen weergegeven. Zo kan men het aantal unieke en gemeenschappelijke exosomale eiwitten aflezen voor deze cellijnen. 35 3.4. SILAC labeling en analyse van het cellulaire secr etoom HeLa cellen werden gelabeld met zwaar en licht gelabelde arginines en lysines in een 1/1 verhouding (zie deel 2.1.5.) waarna exosoomisolatie gebeurde door differentiële centrifugatie, alsook cellulaire secretoomisolatie (deel 2.1.6.). Hiervoor werden de cellen eerst 24 h serumvrij geplaatst. Deze experimenten werden uitgevoerd in triplicaat. 3.4.1. Vergelijking exosoomstalen met de geïsoleerde cellulaire secretomen De bekomen cellulaire secretomen werden vergeleken met de exosoomstalen bekomen door differentiële centrifugatie in combinatie met detergent removal kolommen. Enkele exosomale eiwitten, die duidelijk meer aanwezig zijn in de exosoomstalen dan in de totale cellysaten, werden ook aangetroffen in het secretoom (tabel 6). Tabel 6: Exosomale eiwitten aangetroffen in het secretoom P10909 P49327 P21333 Q08380 P04150 A5A3E0 Clusterine Fatty acid synthase Filamine A Galectine-3 bindend proteïne Glucocorticoïd receptor POTE ankyrine domein familie lid F S E S S S=E S Tabel 6: Exosomale eiwitten weergevonden in de secretomen van de HeLa cellijn. Links wordt het accessienummer weergegeven, in het midden de eiwitnaam en rechts of het eiwit voornamelijk voorkomt in de secretomen (S) of in de exosoomstalen na isolatie door middel van differentiële centrifugatie in combinatie met detergent removal kolommen (E). 3.4.2. Kwantificatie Distributiecurves werden opgesteld, na SILAC labeling, zowel voor de exosoomstalen als voor de cellulaire secretomen. Ze tonen de distributie van de eiwitten die zich bevinden tussen de 2 limieten van het 95% betrouwbaarheidsinterval dat werd opgesteld gebruik makend van alle data, alsook voor het interval dat werd berekend via de selectie van waarden (L/H = -1;1). Deze curves zijn voor de exosoomstalen, voor twee van de drie experimenten, weergegeven (figuur 15). De derde herhaling van het experiment gaf een vergelijkbaar resultaat als de bovenste curve (bijlage). Voor de secretomen worden deze distributiecurves, voor één experiment, weergegeven (figuur 16). De twee herhalingen van dit experiment gaven vergelijkbare curves (bijlage). 36 Figuur 15: Distributie van de eiwitten in de exosoomstalen na SILAC labeling. De distributiecurves van de eiwitten van de exosoomstalen, na SILAC labeling, worden getoond voor de brede limieten (rood) en de nauwe limieten (blauw). Elke grafiek toont een herhaling van een experiment. Figuur 16: Distributie van de eiwitten in de secretoomstalen na SILAC labeling. De distributiecurves van de eiwitten in het cellulaire secretoomstaal, na SILAC labeling, worden getoond voor de brede limieten (rood) en de nauwe limieten (blauw). 37 De eiwitten die terug te vinden waren binnen het nauwe betrouwbaarheidsinterval, waren met 95% zekerheid afkomstig van de cellijnen en niet van het cultuurmedium. Hierbij werd zowel gekeken naar de eiwitten weergevonden in de exosoomstalen als deze in de cellulaire secretomen. Bijna de helft (43%) van de eiwitten geïdentificeerd in de exosoomstalen, waren afwezig in de cellulaire secretomen (tabel 7). Tabel 7: Exosomale eiwitten weergevonden in de SILAC gelabelde exosoomstalen. P62241 P15880 P62701 P08195 P26373 P84098 P62917 P04083 P07355 P08758 Q562R1 P16070 O43854 Q9UBI6 P01891 P01889 Q01650 P29966 A6NIZ1 P08134 P05023 40S ribosomal protein S2 40S ribosomal protein S4 40S ribosomal protein S8 4F2 cell-surface antigen heavy chain 60S ribosomal protein L13 60S ribosomal protein L19 60S ribosomal protein L8 Annexin A1 Annexin A2 Annexin A5 Beta-actin-like protein 2 CD44 antigen EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3 * Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(O) subunit gamma-12 HLA class I histocompatibility antigen, A-68 alpha chain HLA class I histocompatibility antigen, B-7 Large neutral amino acids transporter small subunit 1 Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate Ras-related protein Rap-1b-like protein Rho-related GTP-binding protein RhoC Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1 * Tabel 7: Exosomale eiwitten weergevonden in de SILAC gelabelde exosoomstalen en afwezig in de SILAC gelabelde secretoomstalen. Links wordt het accessienummer weergegeven en rechts de eiwitnaam. De aangeduide eiwitten (*) werden ook reeds geïdentificeerd in humaan CSV (25). 3.5. ExoCarta De geïdentificeerde eiwitten uit dit onderzoek, zowel voor de exosoom-, totale cellysaat- en cellulaire secretoomstalen, werden vergeleken met de online databank ExoCarta. Hierbij werden 879 gemeenschappelijke humane eiwitten teruggevonden en hiervan waren 47 eiwitten geïdentificeerd als specifieke exosoomeiwitten (bijlage). 38 3.6. Validatie door Western blotting Validatie van de exosoomisolatie werd uitgevoerd via Western blotting en analyse met het Odyssey systeem (LI-COR, Odyssey). Als primair antilichaam werd een gekende exosomale merker, CD63 (~53 kDa), gebruikt en tubuline (~51 kDa) aangewend als ladingscontrole (21). Hierbij werden de geïsoleerde exosomen, bekomen door differentiële centrifugatie en de Exoquick-TC kit, van de MDA en MCF7 cellijn vergeleken met hun totale cellysaten (figuur 17). Figuur 17: Validatie exosoomisolatie – Odyssey systeem. Western blot met CD63 (groen) en tubuline (rood) als primair antilichaam met 1) cellysaat - MCF7 cellen, 2) exosomen na isolatie door differentiële centrifugatie (DC) – MCF7 cellen, 3) exosomen na isolatie door Exoquick-TC – MCF7 cellen, 4) cellysaat – MDA cellen, 5) exosomen na isolatie door DC – MDA cellen, 6) exosomen na isolatie door Exoquick-TC – MDA cellen. Het moleculair gewicht van de merkers wordt weergegeven in kDa. Dit experiment werd herhaald met een meer gevoelige methode gebaseerd op enhanced chemiluminiscence (ECL). Hierbij werden de exosomale merkers CD63 (figuur 18) en CD81 (bijlage) aangewend als primair antilichaam bij de exosoomstalen afkomstig van isolatie door middel van differentiële centrifugatie (21). Voor de exosoomstalen geïsoleerd via de Exoquick-TC kit werd enkel CD63 als primair antilichaam gebruikt (bijlage). 39 Figuur 18: Validatie exosoomisolatie – ECL systeem. Western blot met CD63 als primair antilichaam met laan 1) exosomen - MDA cellen, 2) exosomen – MCF7 cellen, 3) exosomen – HeLa cellen, 4) exosomen – HepG2 cellen, 5) cellysaat – MDA cellen, 6) cellysaat – MCF7 cellen, 7) cellysaat – HeLa cellen, 8) cellysaat – HepG2 cellen. Het moleculair gewicht van de merkers wordt weergegeven in kDa. 40 4. BESPREKING Exosomen zijn membraanvesikels die vrijgesteld worden door verscheidene celtypes en reeds werden bestudeerd in verschillende pathologische aandoeningen zoals vasculaire ziekten, bacteriële infecties en kanker (13). Ze bevatten specifieke eiwitten, lipiden en genetisch materiaal en oefenen verschillende biologische functies uit (3, 9). Onderzoek naar exosomen is recent zeer populair geworden door de mogelijkheid hen aan te wenden als diagnostisch middel en voor nieuwe therapiemogelijkheden (2, 5). In deze studie werden exosomen geïsoleerd van verschillende humane kankercellijnen gebruikmakend van twee verschillende isolatiemethoden. Het doel was om een vergelijking te maken van de eiwitinhoud van exosomen afkomstig van kankercellen met een verschillende oorsprong en agressiegraad en zo gelijkenissen alsook verschillen aan te tonen. Ook werd een vergelijking gemaakt met totale cellysaten van de cellijnen en het secretoom van de HeLa cellijn. De twee aangewende isolatiemethoden werden vergeleken op basis van de opbrengst, zuiverheid en herhaalbaarheid. Een eerste uitdaging bestond uit het exosoomvrij maken van het medium gebruikt om cellen in cultuur te houden. Hierbij werden verschillende methoden uitgetest en vergeleken; differentiële centrifugatie in combinatie met filtratie, de Amicon stirred cell en aangekocht exosoomvrij serum van het SBI. Er werd uitgegaan van differentiële centrifugatie van medium met 10% FKS. Dit gaf initieel goede resultaten en hiervoor was ook alle materiaal voorhanden. Daar steeds weinig medium tegelijk geprepareerd kon worden en de groeisnelheid van de cellen afnam, werd vervolgens overgestapt naar de methode van Théry et al., waarbij uitgegaan werd van medium met 20% FKS wat na centrifugatie aangelengd werd tot het medium 10% FKS bevatte (20). Hierdoor verdubbelde de opbrengst van het geprepareerde medium en de groeisnelheid van de cellen nam terug toe. Deze centrifugatiemethode werd gecombineerd met filtratie ter compensatie voor de extra hoeveelheid serum. Deze methode reduceerde de hoeveelheid exosomen aanwezig in het medium aanzienlijk, zoals aangetoond via Western blotting, en daarom werd ze aangewend in het verder onderzoek. De methode steunend op het gebruik van de Amicon stirred cell werd tevens uitgetest, dit in samenwerking met collega’s van het VIB in Zwijnaarde. Ook deze methode resulteerde in een duidelijke reductie van exosomen in het medium, maar had echter enkele nadelen. Dit toestel 41 was niet voorhanden in ons labo wat dus de aankoop ervan noodzakelijk maakte. Ook kan met dit toestel slechts 200 ml medium tegelijk behandeld worden, waarna ook nog een bijkomende filtratiestap nodig is daar de eerste niet steriel verloopt. Wegens deze verschillende nadelen hebben we niet geopteerd voor deze methode. Ten slotte werd ook een vergelijking gemaakt met aangekocht exosoomvrij serum van het SBI. Dit serum bevatte echter nog meer exosomaal materiaal dan medium dat exosoomvrij werd gemaakt via de overige twee methoden en zou hiernaast ook steeds een dure aankoop vormen waardoor hier geen verder gebruik van gemaakt werd. Verder vormde de achtergrond van heel wat serumeiwitten na isolatie van exosomen van MDA en MCF7 cellen met de Exoquick-TC kit initieel een probleem (tabel 1). Hierbij werden twee methoden gebruikt om dit te omzeilen. Een eerste methode was om de cellen 24 uur voor isolatie van exosomen serumvrij te plaatsen. Dit resulteerde in veel minder achtergrond van serumeiwitten, aangetoond door middel van MS analyse. Daarom werd niet uitgekeken naar eventuele langere tijdstippen. Een tweede methode bestond uit SILAC labeling van de HeLa cellen waardoor via MS een onderscheid gemaakt kon worden tussen de eiwitten afkomstig van de cellen en deze van het serum. Uit dit experiment bleek dat in de exosoomstalen bekomen door differentiële centrifugatie in combinatie met detergent removal kolommen nog steeds een grote meerderheid van de eiwitten afkomstig is van het serum. Enkel voor de derde herhaling van dit experiment was contaminatie met serumeiwitten gering. Dit toont aan dat verdere optimalisatie van de isolatietechniek alsook eventueel een introductie van extra wasstappen noodzakelijk is om deze contaminatie tegen te gaan. Echter, in tegenstelling tot de exosoomstalen, bevatten de secretoomstalen opvallend minder serumeiwitten. Dit kan eventueel verklaard worden daar secretomen veel meer eiwitmateriaal bevatten, in tegenstelling tot exosomen, en hierdoor deze eiwitten meer abundant aanwezig zullen zijn in de stalen ten opzichte van de serumeiwitten en zo sneller opgepikt via MS. Hoewel andere onderzoeksgroepen dit probleem niet aankaarten, wordt via dit experiment duidelijk dat er, voor deze isolatiemethode, toch nog veel achtergrond van serumeiwitten aanwezig is, wat de identificatie van exosomale eiwitten bemoeilijkt. Het is dus aangeraden om in de toekomst meer onderzoek uit te voeren omtrent dit gegeven en te zoeken naar alternatieven om deze contaminatie te beperken. 42 Exosomen werden geïsoleerd gebruik makend van twee isolatiemethoden; differentiële centrifugatie en isolatie aan de hand van de Exoquick-TC kit. Deze isolatiemethoden kunnen vergeleken worden op basis van de opbrengst, zuiverheid en herhaalbaarheid. Hier moet echter rekening gehouden worden met de verschillende voorbereiding van de stalen voor MS. Voor de differentiële centrifugatiemethode was het reduceren van de concentratie van het detergent SDS met detergent removal kolommen voldoende. Echter, bij de Exoquick-TC kit was er nood aan SDS-PAGE om ook de bestanddelen van de Exoquick-TC-oplossing te verwijderen die storen voor trypsine digestie en LC-MS/MS analyse. Deze verschillen in voorbereiding kunnen eventueel ook een effect hebben op de resultaten. Daarom werden stalen na isolatie aan de hand van de differentiële centrifugatie methode voorbereid voor MS zowel door detergent removal kolommen als door in gel digest om het eventuele effect van deze verschillende voorbereidingsmethoden na te gaan. Hieruit blijkt dat het gebruik van in gel trypsinisatie negatieve gevolgen heeft voor de bekomen resultaten. De opbrengst is voor alle cellijnen, behalve de MCF7 cellijn, lager bij in gel trypsinisatie in vergelijking met de detergent removal kolommen. Ook blijkt voor deze eerste MS voorbereidingsmethode de reproduceerbaarheid geringer te zijn. Hiernaast zijn tevens steeds eiwitten aanwezig in de stalen afkomstig van de manuele behandeling waardoor de in gel trypsinisatie ook op het vlak van zuiverheid slechter scoort dan de detergent removal kolommen. Algemeen is het dus aangewezen om, indien mogelijk, gebruik te maken van detergent removal kolommen. Hiermee rekening houdende, blijkt dat de opbrengst en reproduceerbaarheid van exosoomisolatie door de Exoquick-TC kit nog lager zijn dan bij de in gel trypsinisatie na differentiële centrifugatie. Voor elke cellijn is steeds maar één isolatie geslaagd. Ook blijft het probleem van de aanwezigheid van contaminerende eiwitten, afkomstig van manuele behandeling, in de stalen aanwezig. Uit deze bevindingen blijkt dat de Exoquick-TC kit geen ideale methode is voor exosoomisolatie, wat in sterk contrast staat met de bevindingen van Taylor et al (26). Zij isoleerden exosomen uit ascites en duiden de Exoquick-TC kit aan als de isolatiemethode voor exosomen die de hoogste zuiverheid en opbrengst oplevert. Khan et al. beschrijven ook een geslaagde exosoomisolatie uit serum via de Exoquick-TC kit (27). Echter, Xiao et al. halen aan dat exosoomisolatie door middel van Exoquick-TC precipitatie, van exosomen uit celcultuur, resulteert in onvoldoende aanrijking van exosomen, wat overeenstemt met de resultaten van ons experiment (8). Uit deze sterke contradictie kunnen we afleiden dat de Exoquick-TC isolatiemethode geschikt is voor exosoomisolatie uit patiëntstalen (ascites, serum, urine e.a.) maar geen ideale methode is voor exosoomisolatie uit 43 cultuurmedia. De Exoquick-TC kit werd tevens reeds aangehaald als een snelle methode voor exosoomisolatie (28). Echter door de essentiële incubatiestap van minimum 12 h, loopt de tijdsduur al gauw op en is het sneller om gebruik te maken van differentiële centrifugatie. Wel is exosoomisolatie via de Exoquick-TC kit minder arbeidsintensief. Een ander voordeel is ook dat veel minder startmateriaal noodzakelijk is, wat zeker voordelig is wanneer men uitgaat van patiëntenmateriaal. De exosoominhoud van de verschillende, geselecteerde cellijnen kan vergeleken worden op eiwitniveau op basis van de verscheidene geïdentificeerde exosomale eiwitten per cellijn. Deze geïdentificeerde exosomale eiwitten vertonen veel gelijkenissen voor de verscheidene isolatiemethoden, waarbij vaak dezelfde eiwitten naar voor kwamen. De differentiële centrifugatiemethode levert duidelijk de meeste resultaten op. Deze exosomale eiwitten werden bekomen door een vergelijking te maken tussen de eiwitten weergevonden in de exosoomstalen en deze in de totale cellysaten. Ook werd een vergelijking gemaakt met het cellulair secretoom voor de HeLa cellijn. Zo werden enkel de eiwitten die duidelijk meer aanwezig waren in de exosoomstalen en afwezig of duidelijk minder aanwezig in de totale cellysaten en het cellulair secretoom benoemd als exosomale eiwitten. Eiwitten die even sterk naar voor kwamen in de totale cellysaten (clathrine heavy chain 1, annexine A2, e.a.) en celluaire secretomen (filamine A, clusterine, e.a.) werden niet aangeduid als exosomale eiwitten. De exosomale eiwitten die steeds terugkomen in alle cellijnen zijn de glucocorticoïd receptor, 4F2 cell-surface antigen heavy chain, histoneiwitten (histon H2A type 1-B/E, histon H2B type 1-K), ribosomale eiwitten (40 S ribosomaal eiwit S16, 40 S ribosomaal eiwit S2) en transporters (large neutral amino acid transporter small subunit 1, neutral amino acid transporter B(0), solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 1). Aangezien deze eiwitten steeds voorkomen in alle cellijnen, kan men spreken van gemeenschappelijke exosomale eiwitten die bijdragen tot algemene exosomale structuren en/of functies. Alsook worden eiwitten weergevonden in alle cellijnen of 3 van de 4 cellijnen die bijdragen tot het kankerfenotype van de cellijnen zoals 4F2 cell-surface antigen heavy chain en CD44 antigen. Ze dragen bij tot het kankerproces door neoplastische celgroei, proliferatie en invasie. Hiernaast werden, in enkele cellijnen, eiwitten weergevonden die specifiek instaan voor de vesikelformatie en vesiculair transport; de Ras-related eiwitten Rab-5C (vesiculair transport), 44 Rab-35 (vesikel formatie, transport, aanhechting en fusie) en Rab-7a (vesiculair transport) en flottiline-1 (vesikel formatie). Al deze eiwitten zijn reeds gekend als exosomale eiwitten in de ExoCarta databank. Naast deze geconserveerde, gemeenschappelijke set van eiwitten, beschikken de exosomen van elke cellijn ook over unieke eiwitten afkomstig van hun producerende (kanker)cel. Enerzijds kunnen deze eiwitten een functie vervullen gerelateerd aan de oorspronkelijke functie van de cel. Dit wordt vooral duidelijk voor de exosomen afkomstig van de HepG2 cellijn; ze beschikken over eiwitten die specifiek instaan voor functies die, in normale omstandigheden, uitgeoefend worden door levercellen zoals cholesteroltransport (apolipoproteïne A-I), katabolisme van lipoproteïne partikels (apolipoproteïne E), internalisatie van LDL partikels (apolipoproteïne B-100) en formatie van lange vetzuurketens (vetzuursynthase). Anderzijds kunnen deze unieke eiwitten ook bijdragen tot het kankerfenotype van de cel. Enkele voorbeelden hiervan zijn galectine-3-bindend eiwit (HepG2), basigine en podocalyxine (HeLa) en CD63 antigen (MCF7). Ten slotte kan, voor elke cellijn, op basis van deze geconserveerde set van eiwitten en de unieke eiwitten een exosoomsignatuur opgesteld worden, bestaande uit alle eiwitten die specifiek voorkomen in de exosomen van deze cellijn. Hieruit blijkt dat elke cellijn gelijkenissen heeft met de andere drie cellijnen, maar dat er ook veel onderlinge verschillen waarneembaar zijn. Dit laatste is duidelijk waarneembaar voor de MDA en MCF7 cellijn. Deze cellijnen zijn beide afkomstig van een borstcarcinoom, maar vertonen een verschillende graad van agressie. Naast de geconserveerde set van eiwitten hebben de exosomen van deze cellijnen slechts één exosomaal eiwit gemeenschappelijk; het MARCKS gerelateerd eiwit. Dit eiwit speelt een rol in de migratie van kankercellen. Hieruit blijkt dat de eiwitinhoud van exosomen, gesecreteerd door cellen met een zelfde biologische afkomst, sterk kan verschillen. Dit roept het vermoeden op dat de exosomale eiwitinhoud gecorreleerd is met een andere factor, zoals de agressiegraad van de cel van herkomst. Verdere vergelijking van de cellijnen op basis van de volledige set van geïdentificeerde eiwitten in de exosoomstalen bevestigt deze eerdere stelling. De MDA en MCF7 cellijnen vertonen nog steeds een geringe overeenkomst. Echter, de MCF7 cellijn toont meer gelijkenissen met de HeLa en HepG2 cellijn, in tegenstelling tot de MDA cellijn die steeds weinig gelijkenissen vertoont met de andere cellijnen. Dit spreekt de eerdere stelling omtrent de correlatie tussen exosoominhoud en agressiegraad deels tegen. 45 Indien uit de opgestelde exosoomsignaturen van deze verscheidene kankercellijnen specifieke diagnostische biomerkers willen geïdentificeerd worden, is het noodzakelijk om eerst elk van deze signaturen te vergelijken met de exosoomsignatuur van een passende controle cellijn. Hierbij kan bijvoorbeeld voor de MDA en MCF7 cellijnen gebruik gemaakt worden van humane borst epitheliale cellen (HMEC). Op deze wijze kan nagegaan worden welke exosomale eiwitten specifiek voorkomen in de exosomen afkomstig van de maligne cel en afwezig zijn in de exosomen van de normale cel en zo mogelijks aangewend kunnen worden als biomerker. Validatie van de exosoomisolatie aan de hand van Western blotting van gekende exosomale eiwitten (CD63, CD81) met het Odyssey systeem gaf slechts weinig resultaat. Enkel voor één cellijn (MCF7) werd verrijking aangetoond van CD63 na exosoomisolatie met de ExoquickTC kit. Het materiaal bekomen na differentiële centrifugatie was te beperkt om aanwezigheid van CD63 aan te tonen. Hiervoor werd geopteerd om een meer gevoelige techniek te gebruiken; de ECL methode. Hierbij werd een zwak signaal voor CD63 aangetoond voor enkele cellijnen (MDA, MCF7) na exosoomisolatie door differentiële centrifugatie, maar was geen signaal waarneembaar voor de Exoquick-TC stalen. Ook was een signaal voor CD81 afwezig in alle stalen. De MS resultaten ondersteunen deels deze uitkomst; enkel CD63 wordt geïdentificeerd in de MCF7 cellijn na isolatie door differentiële centrifugatie. De exosomale merker CD81 werd in geen van de exosoomstalen geïdentificeerd. Deze bevindingen worden gesteund door twee andere papers, die ook geen CD63 of CD81 identificeerden via MS (13, 18). Dit kan dus twijfels oproepen bij de benoeming van deze eiwitten als algemene exosomale merkers. 46 ALGEMEEN BESLUIT Exosomen van de vier geselecteerde kankercellijnen (MDA, MCF7, HeLa en HepG2 cellijn) werden succesvol geïsoleerd. Hieruit bleek dat het aangewezen is om gebruik te maken van differentiële centrifugatie voor exosoomisolatie uit celcultuurmedia. Deze methode leidde tot een betere reproduceerbaarheid, opbrengst en zuiverheid in vergelijking met de Exoquick-TC kit. Er is echter nog sprake van contaminatie met serumeiwitten, ondanks de aangewende maatregelen, wat de identificatie van exosomale eiwitten bemoeilijkt. Ook wordt, indien mogelijk, beter gebruik gemaakt van detergent removal kolommen, in tegenstelling tot in gel trypsinisatie, als staalvoorbereiding voor massaspectrometrie. Exosoomstalen werden vergeleken met hun totale cellysaten en cellulaire secretomen op basis van de resultaten bekomen door massaspectrometrische technieken, zodat exosomale eiwitten geïdentificeerd werden. Hierbij kan een onderscheid gemaakt worden tussen gemeenschappelijke, geconserveerde exosomale eiwitten en unieke exosomale eiwitten. Deze eiwitten vervullen een functie binnen de exosoombiogenese en transport of een specifieke functie van hun afgeleide cel. Op basis van deze geïdentificeerde exosomale eiwitten kon voor elke cellijn een exosoomsignatuur opgesteld worden. Aan de hand van deze verschillende exosoomsignaturen werd duidelijk dat de eiwitinhoud van exosomen afkomstig van cellen met eenzelfde biologische herkomst niet noodzakelijk gelijk is. Cellen met eenzelfde herkomst maar met een verschillende graad van agressie (MDA en MCF7) vertoonden zo slechts geringe gelijkenissen met elkaar. Samenvattend kunnen we stellen dat het mogelijk is om exosomen succesvol te isoleren uit celcultuurmedia van verschillende cellijnen en hun eiwitinhoud te achterhalen met massaspectrometrische technieken. Indien een vergelijking wordt gemaakt van de bekomen data met exosomale eiwitten afkomstig van de corresponderende normale cellen, zou dit kunnen leiden tot identificatie van nieuwe diagnostische biomerkers. 47 REFERENTIELIJST 1. World Health Organisation. (2007). The World Health's Organisation fight against cancer: Strategies that prevent, cure and care. www.who.int. 2. Hanahan D, Weinberg RA. (2000). The hallmarks of cancer. Cell. 100(1):57-70. 3. Sandvig K, Llorente A. (2012). Proteomic analysis of microvesicles released by the human prostate cancer cell line PC-3. Molecular & cellular proteomics. 11(7):M111 012914. 4. Velonas VM, Woo HH, Remedios CG, Assinder SJ. (2013). Current status of biomarkers for prostate cancer. International journal of molecular sciences. 14(6):11034-11060. 5. Welton JL, Khanna S, Giles PJ, Brennan P, Brewis IA, Staffurth J, et al. (2010). Proteomics analysis of bladder cancer exosomes. Molecular & cellular proteomics. 9(6):1324-1338. 6. Chen CL, Lai YF, Tang P, Chien KY, Yu JS, Tsai CH, et al. (2012). Comparative and targeted proteomic analyses of urinary microparticles from bladder cancer and hernia patients. Journal of proteome research. 11(12):5611-5629. 7. Rappa G, Mercapide J, Anzanello F, Pope RM, Lorico A. (2013). Biochemical and biological characterization of exosomes containing prominin-1/CD133. Molecular cancer. 12:62. 8. Xiao D, Ohlendorf J, Chen Y, Taylor DD, Rai SN, Waigel S, et al. (2012). Identifying mRNA, microRNA and protein profiles of melanoma exosomes. PloS one. 7(10):e46874. 9. Mathivanan S, Lim JW, Tauro BJ, Ji H, Moritz RL, Simpson RJ. (2010). Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Molecular & cellular proteomics. 9(2):197-208. 10. Garnier D, Jabado N, Rak J. (2013). Extracellular vesicles as prospective carriers of oncogenic protein signatures in adult and paediatric brain tumours. Proteomics. 13(1011):1595-1607. 11. Palmisano G, Jensen SS, Le Bihan MC, Laine J, McGuire JN, Pociot F, et al. (2012). Characterization of membrane-shed microvesicles from cytokine-stimulated beta-cells using proteomics strategies. Molecular & cellular proteomics. 11(8):230-243. 12. Yang C, Robbins PD. (2011). The roles of tumor-derived exosomes in cancer pathogenesis. Clinical & developmental immunology. 2011:842849. 13. Hosseini-Beheshti E, Pham S, Adomat H, Li N, Guns EST. (2012). Exosomes as Biomarker Enriched Microvesicles: Characterization of Exosomal Proteins Derived from a Panel of Prostate Cell Lines with Distinct AR Phenotypes. Molecular & cellular proteomics. 11(10):863-885. 14. Henderson MC, Azorsa DO. (2012). The genomic and proteomic content of cancer cellderived exosomes. Frontiers in oncology. 2:38. 15. Lasser C, Eldh M, Lotvall J. (2012). Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of visualized experiments. 2012(59):e3037. 16. Choi DS, Kim DK, Kim YK, Gho YS. (2013). Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes. Proteomics. 13:1554-1571. 17. Skog J, Wurdinger T, van Rijn S, Meijer DH, Gainche L, Sena-Esteves M, et al. (2008). Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature cell biology. 10(12):1470-1476. 18. Simona F, Laura S, Simona T, Riccardo A. (2013). Contribution of proteomics to understanding the role of tumor-derived exosomes in cancer progression: state of the art and new perspectives. Proteomics. 13:1581-1594. 19. Koga K, Matsumoto K, Akiyoshi T, Kubo M, Yamanaka N, Tasaki A, et al. (2005). Purification, characterization and biological significance of tumor-derived exosomes. 48 Anticancer research. 25(6A):3703-3707. 20. Théry C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. (2006). Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3(Unit 3.22):1-29. 21. Mathivanan S, Fahner CJ, Reid GE, Simpson RJ. (2012). ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40:D1241-1244. 22. Zhuang X, Xiang X, Grizzle W, Sun D, Zhang S, Axtell RC, et al. (2011). Treatment of brain inflammatory diseases by delivering exosome encapsulated anti-inflammatory drugs from the nasal region to the brain. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 19(10):1769-1779. 23. Bereman MS, Egertson JD, MacCoss MJ. (2011). Comparison between procedures using SDS for shotgun proteomic analyses of complex samples. Proteomics. 11(14):2931-2935. 24. Helsens K, Colaert N, Barsnes H, Muth T, Flikka K, Staes A, et al. (2010). ms_lims, a simple yet powerful open source laboratory information management system for MS-driven proteomics. Proteomics. 10(6):1261-1264. 25. Chiasserini D, van Weering JR, Piersma SR, Pham TV, Malekzadeh A, Teunissen CE, et al. (2014). Proteomic analysis of cerebrospinal fluid extracellular vesicles: A comprehensive dataset. Journal of proteomics. http://dx.doi.org/10.1016/j.jprot.2014.04.028 26. Taylor DD, Zacharias W, Gercel-Taylor C. (2011). Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in molecular biology. 728:235-246. 27. Khan S, Bennit HF, Turay D, Perez M, Mirshahidi S, Yuan Y, et al. (2014). Early diagnostic value of survivin and its alternative splice variants in breast cancer. BMC cancer. 14:176. 28. Yamada T, Inoshima Y, Matsuda T, Ishiguro N. (2012). Comparison of methods for isolating exosomes from bovine milk. The Journal of veterinary medical science/the Japanese Society of Veterinary Science. 74(11):1523-1525. 49 BIJLAGE Tabel 1. Exosomale eiwitten geïdentificeerd na exosoomisolatie via Exoquick TC. Tabel 2. Exosomale eiwitten geïdentificeerd na exosoomisolatie via differentiële centrifugatie in combinatie met detergent removal kolommen. Tabel 3. Exosomale eiwitten geïdentificeerd na exosoomisolatie via differentiële centrifugatie in combinatie met in gel trypsinisatie. Tabel 4. Exosoomsignatuur van de MDA cellijn. Tabel 5. Exosoomsignatuur van de MCF7 cellijn. Tabel 6. Exosoomsignatuur van de HeLa cellijn. Tabel 7. Exosoomsignatuur van de HepG2 cellijn. Tabel 8. Exosoomeiwitten gemeenschappelijk met de databank Exocarta. Figuur 1. Distributiecurves van de exosoomstalen na SILAC labeling. Figuur 2. Distributiecurves van de secretoomstalen na SILAC labeling. Figuur 3. Validatie exosoomisolatie via differentiële centrifugatie – ECL systeem. Figuur 4. Validatie exosoomisolatie via Exoquick TC – ECL systeem. Tabel 1. Exosomale eiwitten geïdentificeerd na exosoomisolatie via Exoquick TC. Aanwezig in 2 van de 3 cellijnen P04114 Q00610 P01024 P02751 P07996 P07437 P04004 Apolipoproteine B100 Clathrine heavy chain 1 Complement 3 Fibronectine Thrombospondine-1 Tubuline beta keten Vitronectine MDA en HepG2 MCF7 en HepG2 MDA en HepG2 MDA en HepG2 MDA en HepG2 MCF7 en HepG2 MDA en HepG2 Tabel 1: Eiwitten die voorkomen in de exosoomstalen van 2 van de 4 cellijnen na isolatie door Exoquick TC. De eiwitten zijn steeds duidelijk meer aanwezig in de exosoomstalen dan in de totale cellysaten voor de HepG2 cellijn, dit in tegenstelling voor de MCF7 en MDA cellijn. In de tabel wordt links het accessienummer weergegeven, in het midden de eiwitnaam en rechts in welke cellijnen deze eiwitten voorkomen. Tabel 2. Exosomale eiwitten geïdentificeerd na exosoomisolatie via differentiële centrifugatie in combinatie met detergent removal kolommen. Aanwezig in 3 van de 4 cellijnen Q07020 P18124 P62424 P09525 P16070 P10909 O43854 P02751 Q03113 P62805 P05556 O15427 A5A3E0 P59190 P51148 Q8NFJ5 P05026 60S ribosomaal eiwit L18 60S ribosomaal eiwit L7 60S ribosomaal eiwit L7a Annexine A4 CD 44 antigen Clusterine EGF like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3 Fibronectine Guanine nucleotide binding protein alfa 2 Histon H4 Integrine beta 1 Monocarboxylaat transporter 4 POTE ankyrine domein familielid F Ras related protein Rab-15 Ras related protein Rab-5c Retinoic acid induced protein 3 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit 1 P62847 P62851 P61247 P23396 P30050 P60709 P50995 P07355 P12429 P08758 P48960 40S ribosomaal eiwit S24 40S ribosomaal eiwit S25 40S ribosomaal eiwit S3a 40S ribosomaal S3 60 S ribosomaal L12 Actine cytoplasmatisch 1 Annexine A11 Annexine A2 Annexine A3 Annexine A5 CD 97 antigen niet in HepG2 niet in HepG2 niet in MDA niet in MDA niet in HepG2 niet in MDA niet in HepG2 niet in MCF7 niet in HepG2 niet in HepG2 niet in HepG2 niet in MCF7 niet in HepG2 niet in HepG2 niet in HepG2 niet in HepG2 niet in HepG2 Aanwezig in 2 van de 4 cellijnen MCF7 en HeLa HeLa en HepG2 MCF7 en HeLa MCF7 en HeLa Hela en MCF7 Hela en MCF7 HeLa en MCF7 MCF7 en HeLa Hela en MCF7 HeLa en HepG2 HeLa en MDA P27105 O95757 P10412 P01891 P01889 P49006 P0CG47 P31949 Q15286 P02786 P04004 Erythrocyte band 7 integraal membraan proteïne Heat shock protein 70 kDa, 4L Histon 1,4 HLA class I histocompatibility antigen, A-2 alpha chain HLA class I histocompatibility antigen, B-7 alpha chain MARCKS related protein Polyubiquitine B Protein S100-A11 Rab related protein Rab-35 Transferrine receptor protein 1 Vitronectine Hela en MCF7 MCF7 en HeLa MCF7 en MDA HeLa en MDA HeLa en MDA MCF7 en MDA HeLa en HepG2 HeLa en MDA MCF7 en HeLa HepG2 en HeLa HepG2 en HeLa Tabel 2: Eiwitten die voorkomen in de exosoomstalen van 2 of 3 van de 4 cellijnen na isolatie door differentiële centrifugatie in combinatie met detergent removal kolommen. De eiwitten zijn steeds duidelijk meer aanwezig in de exosoomstalen dan in de totale cellysaten. In de tabel wordt links het accessienummer weergegeven, in het midden de eiwitnaam en rechts in welke cellijn deze eiwitten voorkomen. Tabel 3. Exosomale eiwitten geïdentificeerd na exosoomisolatie via differentiële centrifugatie in combinatie met in gel trypsinisatie. Aanwezig in 3 van de 4 cellijnen P81605 Dermcidine niet in HepG2 P02751 P04908 P14923 P61626 P0CG47 Fibronectine Histon H2A type 1-B/E Junction plakoglobine Lysozyme C Polyubiquitine B Aanwezig in 2 van de 4 cellijnen HepG2 en HeLa HeLa en MDA HeLa en MDA HepG2 en MDA HepG2 en MDA Tabel 3: Eiwitten die voorkomen in de exosoomstalen van 2 of 3 van de 4 cellijnen na isolatie door differentiële centrifugatie in combinatie met in gel trypsinisatie. De eiwitten zijn steeds duidelijk meer aanwezig in de exosoomstalen dan in de totale cellysaten. In de tabel wordt links het accessienummer weergegeven, in het midden de eiwitnaam en rechts in welke cellijnen deze eiwitten voorkomen. Tabel 4. Exosoomsignatuur van de MDA cellijn. P62249 40 S ribosomaal eiwit S16 P15880 P08195 Q07020 P18124 P16070 P48960 P81605 O43854 P02751 P04150 Q03113 P11142 P10412 P04908 O60814 P62805 P01892 P01891 P01889 Q86YZ3 P26006 P05556 P14923 Q08431 Q01650 P61626 P49006 O15427 Q15758 P0CG47 A5A3E0 P31949 Q04941 P59190 P51148 Q8NFJ5 P02768 P05026 P11166 40 S ribosomaal eiwit S2 4F2 cell-surface antigen heavy chain 60S ribosomaal eiwit L18 60S ribosomaal eiwit L7 CD 44 antigen CD 97 antigen Dermcidine EGF like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3 Fibronectine Glucocorticoïd receptor Guanine nucleotide binding protein alfa 2 Heat shock cognate 71 kDa Histon 1,4 Histon H2A type 1-B/E Histon H2B type 1-K Histon H4 HLA class I histocompatibility antigen, A-2 alpha chain HLA class I histocompatibility antigen, A-68 alpha chain HLA class I histocompatibility antigen, B-7 alpha chain Hornerine Integrine alfa-3 Integrine beta 1 Junction plakoglobine Lactadherine Large neutral amino acid transporter small subunit 1 Lysozyme C MARCKS related protein Monocarboxylaat transporter 4 Neutral amino acid transporter B(0) Polyubiquitine B POTE ankyrine domein familielid F Protein S100-A11 Proteolipide protein 2 Ras related protein Rab-15 Ras related protein Rab-5c Retinoic acid induced protein 3 Serum albumine Sodium/potassium-transporting ATPase subunit 1 Solute carrier family 2 Tabel 4: Exosomale eiwitten van de MDA cellijn met links het accessienummer en rechts de eiwitnaam. Tabel 5. Exosoomsignatuur van de MCF7 cellijn. P62249 40 S ribosomaal eiwit S16 P15880 P62847 P61247 P62244 P23396 P08195 P30050 Q07020 P18124 P62424 P60709 P50995 P07355 P12429 P09525 P02647 P35221 P16070 P08962 P10909 O43854 P27105 P04150 Q03113 O95757 P10412 P04908 O60814 P62805 P05556 Q01650 P49006 Q15758 P19338 A5A3E0 Q15286 Q13283 P59190 P51148 Q8NFJ5 Q99985 P02768 P05026 P11166 40 S ribosomaal eiwit S2 40S ribosomaal eiwit S24 40S ribosomaal eiwit S3a 40S ribosomaal S15a 40S ribosomaal S3 4F2 cell-surface antigen heavy chain 60 S ribosomaal L12 60S ribosomaal eiwit L18 60S ribosomaal eiwit L7 60S ribosomaal eiwit L7a Actine cytoplasmatisch 1 Annexine A11 Annexine A2 Annexine A3 Annexine A4 Apolipoproteine A1 Catenine alfa-1 CD 44 antigen CD63 antigen Clusterine EGF like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3 Erythrocyte band 7 integraal membraan proteïne Glucocorticoïd receptor Guanine nucleotide binding protein alfa 2 Heat shock protein 70 kDa, 4L Histon 1,4 Histon H2A type 1-B/E Histon H2B type 1-K Histon H4 Integrine beta 1 Large neutral amino acid transporter small subunit 1 MARCKS related protein Neutral amino acid transporter B(0) Nucleoline POTE ankyrine domein familielid F Rab related protein Rab-35 Ras GTPase activating like protein Ras related protein Rab-15 Ras related protein Rab-5c Retinoic acid induced protein 3 Semaphorine-3C Serum albumine Sodium/potassium-transporting ATPase subunit 1 Solute carrier family 2 Tabel 5: Exosomale eiwitten van de MCF7 cellijn met links het accessienummer en rechts de eiwitnaam. Tabel 6. Exosoomsignatuur van de HeLa cellijn. P62249 P15880 P62847 P62851 P61247 P23396 P08195 P30050 Q07020 P18124 P62424 P60709 P05186 P50995 P07355 P12429 P09525 P08758 P08133 P35613 Q6YHK3 P16070 P48960 P14209 P10909 O43854 P27105 P02751 Q5D862 O75955 P04150 Q03113 O95757 P04908 P16104 P06899 O60814 P62805 P01891 P01889 P05556 P14923 Q01650 O15427 Q15758 O00592 P0CG47 A5A3E0 P31949 Q15286 40 S ribosomaal eiwit S16 40 S ribosomaal eiwit S2 40S ribosomaal eiwit S24 40S ribosomaal eiwit S25 40S ribosomaal eiwit S3a 40S ribosomaal S3 4F2 cell-surface antigen heavy chain 60 S ribosomaal L12 60S ribosomaal eiwit L18 60S ribosomaal eiwit L7 60S ribosomaal eiwit L7a Actine cytoplasmatisch 1 Alkaline fosfatase Annexine A11 Annexine A2 Annexine A3 Annexine A4 Annexine A5 Annexine A6 Basigine CD 109 antigen CD 44 antigen CD 97 antigen CD 99 antigen Clusterine EGF like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3 Erythrocyte band 7 integraal membraan proteïne Fibronectine Filaggrine-2 Flotilline-1 Glucocorticoïd receptor Guanine nucleotide binding protein alfa 2 Heat shock protein 70 kDa, 4L Histon H2A type 1-B/E Histon H2AX Histon H2B type 1-J Histon H2B type 1-K Histon H4 HLA class I histocompatibility antigen, A-68 alpha chain HLA class I histocompatibility antigen, B-7 alpha chain Integrine beta 1 Junction plakoglobine Large neutral amino acid transporter small subunit 1 Monocarboxylaat transporter 4 Neutral amino acid transporter B(0) Podocalyxine Polyubiquitine B POTE ankyrine domein familielid F Protein S100-A11 Rab related protein Rab-35 P59190 P51148 P62820 P51149 P11233 Q8NFJ5 P02768 P05026 P11166 P02786 P04350 P04004 Ras related protein Rab-15 Ras related protein Rab-5c Ras-related protein Rab-1A Ras-related protein Rab-7a Ras-related protein Ral-A Retinoic acid induced protein 3 Serum albumine Sodium/potassium-transporting ATPase subunit 1 Solute carrier family 2 Transferrine receptor protein 1 Tubuline beta 4A keten Vitronectine Tabel 6: Exosomale eiwitten van de HeLa cellijn met links het accessienummer en rechts de eiwitnaam. Tabel 7. Exosoomsignatuur van de HepG2 cellijn. P62249 P15880 P62851 P08195 P62424 P01023 P09525 P08758 P02647 P04114 P02649 P10909 P01024 P49327 P02671 P02675 P02679 P02751 Q08380 P04150 P51654 P04908 O60814 Q01650 P61626 O15427 Q15758 P19338 P0CG47 A5A3E0 P78509 P02768 P11166 P07996 P02786 P07437 P04004 40 S ribosomaal eiwit S16 40 S ribosomaal eiwit S2 40S ribosomaal eiwit S25 4F2 cell-surface antigen heavy chain 60S ribosomaal eiwit L7a Alfa-2-macroglobuline Annexine A4 Annexine A5 Apolipoproteïne A1 Apolipoproteïne B100 Apolipoproteïne E Clusterine Complement 3 Fatty acid synthase Fibrinogeen alfa keten Fibrinogeen beta keten Fibrinogeen gamma keten Fibronectine Galectine-3 bindend eiwit Glucocorticoïd receptor Glypican-3 Histon H2A type 1-B/E Histon H2B type 1-K Large neutral amino acid transporter small subunit 1 Lysozyme C Monocarboxylaat transporter 4 Neutral amino acid transporter B Nucleoline Polyubiquitine B POTE ankyrine domein familielid F Reeline Serum albumine Solute carrier family 2 Thrombospondine-1 Transferrine receptor proteïne 1 Tubuline beta keten Vitronectine Tabel 7: Exosomale eiwitten van de HepG2 cellijn met links het accessienummer en rechts de eiwitnaam. Tabel 8. Exosoomeiwitten gemeenschappelijk met de databank Exocarta. P61247 P08195 P62424 P08133 P02649 Q6YHK3 P16070 P48960 P14209 O43854 P27105 P49327 P02671 P02675 P02679 P02751 P23142 Q5D862 O75955 Q08380 P07305 P04908 P16104 P06899 O60814 P62805 P01892 P01891 P01889 P17301 P14923 Q08431 Q01650 P61626 P49006 Q15758 P19338 Q15063 O00592 O75340 Q15286 P51148 P51149 P11233 Q8NFJ5 P11166 P07437 40S ribosomal protein S3a 4F2 cell-surface antigen heavy chain 60S ribosomal protein L7a Annexin A6 Apolipoprotein E CD109 antigen CD44 antigen CD97 antigen CD99 antigen EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3 Erythrocyte band 7 integral membrane protein Fatty acid synthase Fibrinogen alpha chain Fibrinogen beta chain Fibrinogen gamma chain Fibronectin Fibulin-1 Filaggrin-2 Flotillin-1 Galectin-3-binding protein Histone H1.0 Histone H2A type 1-B/E Histone H2AX Histone H2B type 1-J Histone H2B type 1-K Histone H4 HLA class I histocompatibility antigen, A-2 alpha chain HLA class I histocompatibility antigen, A-68 alpha chain HLA class I histocompatibility antigen, B-7 alpha chain Integrin alpha-2 Junction plakoglobin Lactadherin Large neutral amino acids transporter small subunit 1 Lysozyme C MARCKS-related protein Neutral amino acid transporter B(0) Nucleolin Periostin Podocalyxin Programmed cell death protein 6 Ras-related protein Rab-35 Ras-related protein Rab-5C Ras-related protein Rab-7a Ras-related protein Ral-A Retinoic acid-induced protein 3 Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 1 Tubulin beta chain Tabel 8: Exosomale eiwitten gemeenschappelijk met de databank Exocarta met links het accessienummer en rechts de eiwitnaam. Figuur 1: Distributie van de eiwitten in de exosoomstalen na SILAC labeling. De distributiecurves van de eiwitten van de exosoomstalen, na SILAC labeling, worden getoond voor de berekende limieten (rood) en de zelf opgestelde limieten (blauw). Figuur 2: Distributie van de eiwitten in de secretoomstalen na SILAC labeling. De distributiecurves van de eiwitten van de secretoomstalen, na SILAC labeling, worden getoond voor de berekende limieten (rood) en de zelf opgestelde limieten (blauw). De grafieken boven en onder behoren toe aan twee verschillende herhalingen van hetzelfde experiment. Figuur 3: Validatie exosoomisolatie via differentiële centrifugatie – ECL systeem. Western blot met CD63 en CD81 als primair antilichaam met 1) exosomen - MDA cellen, 2) exosomen – MCF7 cellen, 3) exosomen – HeLa cellen, 4) exosomen – HepG2 cellen, 5) cellysaat – MDA cellen, 6) cellysaat – MCF7 cellen, 7) cellysaat – HeLa cellen, 8) cellysaat – HepG2 cellen. Figuur 4: Validatie exosoomisolatie via Exoquick TC – ECL systeem. Western blot met CD63 als primair antilichaam 1) exosomen - MDA cellen, 2) exosomen – MCF7 cellen, 3) exosomen – HepG2 cellen, 4) cellysaat – MDA cellen, 5) cellysaat – MCF7 cellen, 6) cellysaat – HepG2 cellen.
