Verdere optimalisatie van het Ford-project voor het

Verdere optimalisatie van
het Ford-project voor het
gebruik van Next-generation
sequencing in de
moleculaire diagnostiek.
Bachelorproef - Liselotte Vergote
Centrum Medische Genetica Gent
Stagementor: Mevrouw Kathleen Claes
Promotor: Mevrouw Griet Vanbillemont
Inhoudsopgave
 Ford-project
 CFTR, HFE en MTHFR
 Validatie van Ford-assays
 Next-generation Sequencing
 Resultaten CFTR, HFE en MTHFR
 SNP’s in Ford-primers
 Besluit
Ford-project
Staal
DNA
extractie
NGS
 Geautomatiseerde
workflow
PCR
 Standaard procedure
Stock
primers
Primer
werkoplossing
Assay
validatie
Sanger
 Reductie van de prijs
 Uitvoerbaar door
iedereen
PrimerXL
Ford
Ford-project
Werkwijze ‘voor’ Ford
Werkwijze met Ford
 Buffer, dNTP’s, MgCl2, Taqpolymerase, DNA en primers 
primermix
 Kapa Robust mastermix, DNA en
primers  primermix
 Verschillende PCR-programma’s
 1 PCR programma
 Voor mutatiescreening van elk
gen is een apart protocol en
specifieke detectiemethoden
 De mutaties in genen kunnen via
de Ford-workflow geanalyseerd
worden
CFTR, HFE en MTHFR
 Nog niet geïntegreerd in de Ford-workflow
 Ford-assays moeten ontwikkeld en gevalideerd worden
CFTR, HFE en MTHFR
 Opgespoorde mutaties in het HFE-gen (hemochromatose):
 c.845G>A (assay 1)
 c.187C>G (assay 2)
 c.193A>T (assay 2)
 Opgespoorde mutaties in het MTHFR-gen (trombofilie):
 c.677C>T (assay 1)
 Opgespoorde mutaties in het CFTR-gen (mucoviscidose):
 Top 50 mutatielijst (21 assays)
Ford-project
 MTHFR assay 1: c.677C>T in exon 4
 AAGAACTCAGCGAACTCAGCACTCCACCCAGAGCCCCCAGCCTGTGC
GAGGACGGTGCGGTGAGAGTGGGGTGGAGGGAGCTTATGGGCTCTCCT
GGGCCCCTCACCTGGATGGGAAAGATCCCGGGGACGATGGGGCAAGTG
ATGCCCATGTCGGTGCATGCCTTCACAAAGCGGAAGAATGTGTCAGCCTCA
AAGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCGRCTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCA
AGTGCTTCAGGTCAGCCTCAAAGCTCCCTGCTTCGGGGTGGCCTTTGGGGTA
ACCTGCCAATAGGGATGACAGTCAGGAGAGG
CFTR, HFE en MTHFR
 32 DNA controlestalen voor CFTR, 10 DNA controlestalen voor HFE en MTHFR
 PCR uitvoeren volgens de Ford-condities en laten sequeneren via Nextgeneration sequencing met MiSeq
Next-generation Sequencing
 Library Preparation
 Cluster generation
 Sequencing by synthesis
Next-generation Sequencing
Next-generation Sequencing
Next-generation Sequencing
Next-generation Sequencing
Next-generation Sequencing
Next-generation Sequencing
Next-generation Sequencing
Next-generation Sequencing
Resultaten CFTR, HFE en MTHFR
 Gevonden mutaties via screening in de gewone diagnostiek vergelijken
met mutaties gevonden met MiSeq
Komen mutaties gevonden in diagnostiek en
met MiSeq overeen?
CFTR
HFE
MTHFR



Ford-project
Staal
DNA
extractie
NGS
PCR
Stock
primers
PrimerXL
Primer
werkoplossing
Ford
Assay
validatie
Sanger
SNP’s in Ford-primers
 Theoretisch geen SNP’s in de laatste 5 nucleotiden
AAGAACTCAGCGAACTCAGC
 Afspraak in het CMGG: geen SNP’s in de laatste 12 nucleotiden
AAGAACTCAGCGAACTCAGC
 Primer bevat SNP  risico op allele drop-out
 Primers met gedegenereerde base
SNP’s in Ford-primers
 Ford-condities  nog altijd allele drop-out
 Annealingstemperatuur: 60°C  optimale temperatuur bepaald per Fordassay
 Annealingstijd: 10 seconden  35 seconden
BRCA1---17 en BRCA1---35
 SNP c.3119G>A in reverse primer
BRCA1---17 en BRCA1---35
 Mutatie c.3481_3491del homozygoot zichtbaar
BRCA1---17 en BRCA1---35
 Bij optimale annealingstemperatuur 54,3°C
BRCA1---17 en BRCA1---35
 Resultaten bij 54°C
BRCA1---17 en BRCA1---35
 Bij verlengde annealingstijd (35 seconden)
Resultaten aangepaste condities
Gewone Ford-assay
Ford-assay met
gedegenereerde base
SERPINF1---5
SERPINF1---9
Optimale temperatuur (55,3°C
en 59,2°C)
Heterozygoot
Heterozygoot
Verlengde annealingstijd
Licht heterozygoot
Heterozygoot
BRCA1---17
BRCA1---35
Optimale temperatuur (54,3°C)
Heterozygoot
Heterozygoot
Verlengde annealingstijd
Licht heterozygoot
Licht heterozygoot
BRCA1---20
BRCA1---52
Optimale temperatuur (57,4°C)
Licht heterozygoot
Heterozygoot
Verlengde annealingstijd
Homozygoot
Heterozygoot
Besluit
Validatie CFTR, HFE en MTHFR voor Ford-workflow
 Verkregen mutaties CFTR, HFE en MTHFR komen overeen
 Installeren softwarefilters + cut-off waarde bepalen
Besluit
SNP’s in primers
 Verlagen annealingstemperatuur  positieve invloed, niet toepasbaar in
Ford-workflow
 Verlengen annealingstijd + gedegenereerde base minder risico op allele
drop-out  aanpassen in Ford-workflow
Verdere optimalisatie van
het Ford-project voor het
gebruik van Next-generation
sequencing in de
moleculaire diagnostiek.
Bachelorproef - Liselotte Vergote