Inhoudstafel

1. Inleiding
1.1. Belang van methoden
1.2. Doestelling van de cursus
1.3. Inpassing in de leerlijnen Ba BMW
1.4. Organisatie van de cursus
1.5. Inhoud
1.6. Examens
2. Biomedische vraagstelling en Onderzoeksmethodiek
2.1. open exploratied hypothese-gedreven
2.2. fundamenteel/translationeel/klinisch
2.3. analyse in vivo, ex vivo, in vitro, in silica
2.4. vereisten/eigenschappen v methoden
2.5. ontwerp v biomedische experiment
2.6. selectie methoden
2.7. methoden voor analyse en voor modulatie
2.8. statische bepalingen vs kwantitatieve , dynamische en vergelijkende analyse
2.9. experimentel variatie
3. Sudiemateriaal
3.1. humaan organisme
3.2. modelsystemen
3.2.1.Xenograft
3.2.2.Weefsel (explant)- cultuur (humaan en andere)
3.2.3.celculturen
- primair
- cellijnen
- stamcellen
3.2.4.modelorganismen
- muis
- gist
- worm
- fruitvlieg
- kikker( leavis en tropicalis)
- zebravis
3.3. Staalbereiding
3.3.1.Staalname
3.3.2.(micro)dissectie en fractionatie
3.3.3.cell sorting (FACS: fluorescence activated cell sorting)
3.3.4.bewaring en biobanking
- invriezen
- bewaarmiddelen
- fixeren
- toepassing weefsel microarrays
4. Basistechnieken
4.1. Pipetteren
4.2. Centrifugatie
4.2.1.Klassiek centrifugatie
4.2.2.Differentiële centrifugatie
4.2.3. Densiteit centrifugatie
4.2.4.Gradient vormers
4.2.5.Types centrifuges
4.2.6.Types van rotoren
4.3. Spectrometrie
4.3.1. Spectrofotometer
4.3.2.Spectrofluorimeter
4.4. Radiometrie (radioisotoop technieken)
4.4.1.Autoradiografie
4.4.2.Scintillation proximity assay (SPA)
4.5. Chromatografie
4.5.1.Liquid chromatografie
4.5.2.Gas chromatografie
4.5.3.Toepassingen
4.6. Elektroforese: scheiding v geladen deeltje in gel oiv elektisch veld
4.6.1.Agarose gel
4.6.2.Polyacrylamide gel
4.6.3.bioanalyzer
5. Analyse van DNA
5.1. Isoleren en concentreren van DNA
5.1.1.Isoleren/ zuiveren
5.1.1.1.
Fenol-Chloroform extractie
5.1.1.2.
Ionuitwisselingskolommetjes
5.1.1.3.
Cesium chloride densiteitscentrifugatie
5.1.2.Concentreren
5.1.2.1.
Alcohol percipitatie
5.1.2.2.
Concentrators
5.1.2.3.
Speed vac
5.2. in vitro synthese van DNA
5.2.1.Chemische synthese (oligonucleotiden)
5.2.2.Enzymatische synthese (PCR)
5.3. kwantificeren van DNA
5.3.1.OD metign
5.3.2.Dipsticks
5.3.3.Gel kwantificering
5.3.4.Enzymatische assay
5.3.5.Bio-analyzer
5.4. manipuleren en cloneren van DNA
5.4.1.Restrictiedigestie
5.4.2.Aspecifieke fragmentatie van DNA
5.4.3.Uiteinden invullen
5.4.4.Uiteinde afknabbelen
5.4.5.Merken van DNA fragmenten
5.4.6.Scheiden op gel
5.4.7.Vecotoren
5.4.8.Ligeren
5.4.9.TA cloneren
5.4.10. Cloneren met recombinatiesystemen
5.4.11. Transformeren, elektroporeren en infecteren van bacteriën
5.4.12. Screening van banken
5.5. DNA sequentiebepaling
5.5.1.Methoden voor DNA sequentiebepaling
5.5.1.1.
Chemisch (Maxam en Gilbert)
5.5.1.2.
Dideoxy-methode (Chain termination, Sanger
5.5.1.3.
Pyrosequencing
5.5.1.4.
Ion semiconductor sequencing (“proton sequencing)
5.5.1.5.
Sequencing by ligation
5.5.2. Hybridization sequencing
5.5.3.Next generation sequencing(545, Illumina, SOLiD, Ion Torrent)
5.5.4.Next next generation sequencing
5.6. andere methoden vr genidentificatie, genmapping, genkwantificatie, mutatie- en
genoomanalyse
5.6.1.Southern blotting
5.6.2.RFLP (restriction fragment length polymorphism)
5.6.3.ARMS (amplification refractory mutation system)
5.6.4.SSCP (single strans conformation polymorphisme)
5.6.5.DGGE (denaturation gradient gel electrophoresis)
5.6.6.HRMA (high resolution melting analysis)
5.6.7.CGH (comparative genomic hybridization)
5.6.8.Array comparative hybridization
5.6.9.Oligonucleotide array analyse van mataties en SNP’s
5.6.10. MassArray analyse van mutaties, SNP’s en methylatie(Sequenom)
5.6.11. Q-PCR (quantitatieve en Real timer PCR)
5.6.12. Digital PCR
6. Analyse van RNA
6.1. Isoleren en concentreren van RNA
weefsel collectie, RNA bereiding, ionenuitwisselingschromatografie/spinkollometjes, mRNA
bereiding, miRNA bereiding, bewaren
6.2. in vitro aanmaak van RNA
6.2.1.chemisch: (from scratch) zie DNA synthese  korte RNAs bvb siRNAs
6.2.2.enzymatisch: in vitro transcriptoe (bv voor in vitro/in vivo translatie)
6.3. concentratiebepaling van RNA + kwaliteitscontrole
6.4. cDNA synthese en cDNA banken
6.5. transcriptidentificatie en kwantificatie
6.5.1.Northern blotting
6.5.2.Ribonuclease protectie(RNP) en nuclease protectie assay (NPA)
6.5.3.Q-RT-PCR
6.5.4.In situ hybridisatie
6.6. Transcriptoomanalyse
6.6.1.Differential Display
6.6.2.Microarrays
6.6.3.RNAseq
7. Analyse van eiwitten
7.1. Aanmaak van eiwitten
7.1.1.Chemisch aanmaken in vitro
7.1.2.Enzymatisch aanmaken in votro
7.1.3.In vivo expressie-systemen:
7.1.3.1.
Bacteriële expressiesystemen
7.1.3.2.
Gist expressiesystemen
7.1.3.3.
Baculovirus expressiesystemen
7.1.3.4.
Xenopys oöcyten
7.1.3.5.
Zoogdiiercellijnen
7.2. Isoleren van eiwitten
7.3. Scheiding van eiwiten
7.3.1. Uitzouten
7.3.2.Chromatografie
7.3.2.1.
Gelfiltratie
7.3.2.2.
Affiniteitschromatografie
7.3.2.3.
Ionenuitwisselingschromatografie
7.3.2.4.
hydrofobiciteitschromatografie
7.3.3.Gel-elektroforese
7.3.3.1.
Volgens massa en lading
7.3.3.2.
Volgens massa
7.3.3.3.
Volgens lading
7.3.3.4.
2D-gel elektroforese
7.4. Concentratiebepaling
7.4.1.Verschillende methoden
7.4.1.1.
UV absorptie
7.4.1.2.
Colorimetrische methoden

Biuret assay

Lowry assay

BCA assay

Bradford assay

Colloidal goud assay

Nihydrine assay
7.4.1.3.
Fluorimetrische methoden
7.4.2.Keuze is afhankelijk van
7.4.2.1.
Onzuiverheden in het staal
7.4.2.2.
Hoeveelheid eiwit
7.4.2.3.
Vereiste nauwkeurigheid
7.4.2.4.
Gebruiksvriendelijkheid
7.5. eiwitidentificatie en kwantificatie
7.5.1. Eiwitkleuring in gel
7.5.1.1.
Coomassie
7.5.1.2.
Zilverkleuring
7.5.1.3.
Vooral fluorescent maken
7.5.2. Western blorring
7.5.3.ELISA
PNPP, OPD, TMB, ABTS
7.5.4.RIA
7.5.5.Immunohistochemie
7.5.6.Eiwitsequentiebepaling
7.5.6.1.
Edman
7.5.6.2.
MS
7.6. proteoomanalyse:
7.6.1.exploratieve proteoomanalyse
7.6.1.1.
Bottom-up
7.6.1.2.
Top-down
7.6.2. Targeted proteomics
7.6.3.Differentiële proteoomanalyse
7.6.3.1.
2D-DIGE (difference gel electrophoresis)
7.6.3.2.
SILAC (stable isotope labeling in cell culture)
7.6.3.3.
ICAT (isotope-coded affinity tag)
7.6.3.4.
iTRAQ (isobaric tag for relative and absolute quantitation)
7.7. eiwit-eiwit en eiwit-ligand interacties
7.7.1.methoden om eiwit-eiwit interacties op te sporen :
7.7.1.1.
Y2H
7.7.1.2.
Affinity pull-down
7.7.1.3.
Co-IP
7.7.1.4.
FRET
7.7.1.5.
Array-base protein interaction detection
7.7.1.6.
Surface plasmon resonance
7.7.1.7.
Phage display
7.7.1.8.
Proximity ligation assay
7.7.2.Ligand- receptor bindingsstudies
dosis respons curve: niet-specigiek, specigieke binding , totale binding.
7.7.2.1.
Evenwichtsdialysis
7.7.2.2.
Ultrafiltratie
7.7.2.3.
Surfca plasmon resonance
7.8. 3D-structuurbepaling
7.8.1.X-straaldiffractie and kristallografie
7.8.2.NMR voor 3D structuurbepaling van eiwitten
7.8.3.Cryo-EM
8. Analyse van metabolieten /lipiden
8.1. Specifieke testen van individuele metabolieten
8.2. Metabolomics
8.2.1.NMR
8.2.2.MS
8.3. Fluxomics/ stable isotope-resolved metabolomics (SIRM)
8.3.1.NMR: 2D-TOCSY
8.3.2.Isotopomeer analyse via MS
8.4. Analyse van lipiden
8.4.1.Extractive van lipiden
8.4.2.Analyse van lipiden
8.4.2.1.
TLC (dunne lag chromatografie)
8.4.2.2.
High performance TLC
8.4.2.3.
2D-TLC
8.4.2.4.
HPLC (high performance liquid chromatography)
8.4.2.5.
GC (gaschromatografie)
8.4.2.6.
GC-MS
8.4.2.7.
Direct infusion ESI-MS/MS = shotgun lipidomics
8.4.2.8.
Online-separation MS: LC-MS/MS
8.4.2.9.
Ion mobility lipidomics
8.4.2.10. MALDI imaging van lipiden
9. Analyse van gentranscriptie
9.1. run-on assays
9.2. promotor-reporter studies
9.3. DNase footprinting
9.4. DNase-seq
9.5. FAIRE en FAIRE-seq
9.6. EMSA
9.7. sequence-specific DNA affinity chromatography
9.8. ChIP / ChIP-chip / ChIP-seq
10. Data-analyse en databanken
10.1.
Hoe vind ik genexpressie data ?Hoe vind ik eiwit expressie data ?
10.2.
Hoe vind/maak ik interactie netwerken ?
10.3.
Help, ik heb een lijst van genen/eiwitten
10.4.
Wat doet mijn (favoriete) gen ?
10.5.
Hoe literatuur zoeken ?
10.6.
Hoe de juiste persoon vinden/ de competitie analyseren
10.7.
Zoeken: other cool stuff
10.8.
Verborgen voor pubmed: patenten
10.9.
Protocols zoeken
10.10.
Databases en webservers zoeken
11. Modulatie van genexpressie
11.1.
11.1.1.
11.1.2.
11.1.3.
11.1.4.
-
onderdrukking van genexpressie
Antisens DNA
RNA interference
Synthetische siRNAs
In vitro transcriptie
Genereren van siRNAs/shRNAs in vivo
Gendisruptie
Random
Targeted (knockout)
Mutagenes
Random
In vitro targeted
In vivo targeted (Zn-finger, TALEN, crispr/cas9)
11.2.
11.2.1.
11.2.2.
11.2.3.
ectopische expressie / overexpressie
constitutief
induceerbaar
TALE-TF
11.3.
Methode voor gentransfer
11.3.1. Transfectie
- Calciumfosfaat
- DEAE dextraan
- Lipofectie
- cationische polymeren
- targeted transfection
- elektroporatie
- laser poratie
- microinjectie
- particle bombardement
- ultrasound
11.3.2. Infectie : virale methoden
11.4.
11.4.1.
11.4.2.
11.4.3.
mutagenese
random
site directed
Zinc-finger nuclease method
12. Microscopie
12.1.
Conventionele lichtmicroscopie
12.2.
Fluoriscentie microscopie
12.2.1. Epi-fluorisctiemicroscopie
12.2.2. Confocale (laser scanning) fluoriscente microscopie
12.2.3. Two-photon fluorescentie microscopie
12.2.4. Total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM)
12.3.
Superresolutie microscopie
12.3.1. Near-field scanning optical microscopy (NSOM)
12.3.2. Structured illumination microscopy (SIM) en
spatially modulated illumination microscopy (SMI)
12.3.3. Stimulated emission depletion (STED)
12.3.4. Photoactivated localization microscopy (PALM) en
Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM)
12.4.
Elektronenmicroscopie
12.4.1. Transmissie elektronen microscopie (TEM)
12.4.2. Scanning elektronen microscopie (SEM)
12.5.
12.6.
Atoomkrachtmicroscopie
Beeldverwerking
13. Celcultuur en celbiologische methoden:
celproliferatie, celdood, migratie, invasiviteit, tissue engineering,...
13.1.
celtelling en viabiliteitstest met trypaanblauw
13.2.
celtelling via Coulter counting
13.3.
MTT viabiliteitestest
13.4.
BrdU proliferatie test
13.5.
Tunel apoptosetest
13.6.
Viabiliteitstest via Propidium Iodide (PI) en flow cytometrie
13.7.
Viabiliteit / apoptose / necrosetest via flow cytometrie
13.8.
Celcyclusanalyse via flow cytometrie
13.9.
Merkeranalyse via flow cytometrie
13.10.
Senescentietest
13.11.
Celadhesietest
13.12.
Wound Healing migratietest
13.13.
Boyden chamber migratietest
13.14.
Boyden chamber invasietest
13.15.
Celmonitoring via impedantiemeting
13.16.
Celmonitoring via high definition imaging
14. Elektrofysiologie:
basisprincipes van bio-elektriciteit, stroom- en spanningsmetingen, Patch-clamp-analyse voor de
studie van ionenkanalen en membraantransportprocessen,...
14.1.
Elektrische eigenschappen van het membraan
- Membraancapaciteit
- Membraanweerstand
14.2.
Elektrofysiologische metingen van cellen
14.2.1. Indirecte methodes
- Electro-encephalo/cardio/myograms –EX VIVO
- Multiëlectrode arrays (MEA) – IN VIVO
o Passieve systemem
o Actieve systemen (CMOS): met geïntegreerde schakeling
14.2.2. Directe methodes (intracellulaire electrodes)
- Micropipet (patch clamp)
- Planar patch clamp
14.2.3. Alternatieve (optische) en recent ontwikkelde methodes
14.3.
Klassieke technieken
14.3.1. Micropipet
- Membraan wordt doorprikt
- Grote cellen
14.3.2. Patchclamp techniek
- Gigaseal vorming
- Voltage and current clamping
- Kleine cellen, in vitro
- Ex vivo and in vivo
14.4.
Nieuwe technieken
14.4.1. Planaire elektrodes
- Multi-electrode arrays (MEA)
o Passieve systemen
o Actieve systemen (CMOS): met geïntegreerd schakelingen
14.4.2. Planaire patch clamp
14.4.3. In vivo elektrofysiologie
- EEG: electro-encephalogram
o Niet-invasief
o invasief
- Invasieve elektrofysiologie met extracellulaire elektrodes
o ‘wire’-electrodes
o ‘silicon’electrodes
- Deppbraan stimulatie
14.5.
14.5.1.
14.5.2.
14.5.3.
Optische technieken
Calciumindicators
Chemische calcium indicators
Genetisch-gecodeerde calcium indicators
Spanningsgevoelige indicators
Optogenetica
15. Inleiding tot systeembiologie en synthetische biologie
15.1.
Systeembiologie
15.2.
Synthetische biologie