Nederlandse samenvatting

Nederlandse samenvatting
nl
Nederlandse samenvatting
Nicotinerge acetylcholine receptor subunits in het centrale
zenuwstelsel van de zoetwater slak Lymnaea stagnalis
de moleculaire en functionele diversiteit van nicotinerge acetylcholine
receptoren in een weekdier
Het zenuwstelsel is een orgaan dat zintuiglijke informatie ontvangt, verwerkt en vertaalt
in een aanpassing van het gedrag of van de fysiologische processen in het lichaam. Het
zenuwstelsel bevat gespecialiseerde cellen (zenuwcellen of neuronen) die elektrische
signalen ontvangen en doorgeven aan andere cellen. De doorgifte van signalen tussen
neuronen vindt plaats op speciale contactpunten (synapsen) waar elektrische activiteit
(actiepotentialen) door het ene (presynaptisch) neuron de afgifte van boodschapperstoffen
(neurotransmitters) veroorzaakt die vervolgens binden aan ontvangsteiwitcomplexen
(receptoren) in het celmembraan van een ander (postsynaptisch) neuron. De binding
van neurotransmitter aan de receptor kan leiden tot activatie van de receptor waarna
de receptor de electrische activiteit van het postsynaptisch neuron kan beïnvloeden.
Er bestaan verschillende klassen van neurotransmitter receptoren. Eén klasse, de
ligandgestuurde ionkanalen (LGIKs), bestaan uit een ionkanaal dat zich opent als gevolg
van receptoractivatie. De opening van het ionkanaal maakt het mogelijk dat geladen
deeltjes (ionen) het celmembraan kunnen passeren om zo de elektrische activiteit van het
postsynaptisch neuron te beïnvloeden. Positief geladen (kationen) en negatief geladen
(anionen) ionen hebben een verschillende invloed op de neuronale activiteit; kationen
stimuleren activiteit (bevorderen het ontstaan van actiepotentialen) terwijl anionen de
activiteit verminderen (remmen het ontstaan van actiepotentialen). LGIKs zijn selectief
doorlatend voor een beperkte set van ionensoorten met een specifieke polariteit en
valentie. Mede door verschillen in de ionenselectiviteit kunnen verschillende LGIK typen
uiteenlopende effecten op de neuronale activiteit hebben.
De nicotinerge acetylcholine receptor (nAChR) behoort samen met de serotonine
receptor (5HTR), γ-aminobutyricacid receptor (GABAR) en de glycine receptor (GlycR) tot
de gelijkvormige (homologe) subklasse van LGIKs, de “Cys-loop” receptoren. De nAChR
wordt geactiveerd door de neurotransmitter acetylcholine. Daarnaast ontleent de nAChR
zijn naam aan zijn gevoeligheid voor nicotine, een verslavende alkaloïde die voorkomt in
tabak. De nAChR is opgebouwd uit vijf homologe eiwitmoleculen (subunits) die circulair in
het celmembraan zijn gerangschikt, een structuur die een pentameer wordt genoemd. In
het zenuwstelsel komt een verscheidenheid aan nAChR subunit typen voor. Deze nAChR
diversiteit is het beste onderzocht in gewervelde dieren. In het zenuwstelsel gewervelde
dieren zijn acht α-type subunits (α2, α3, α4, α5, α6, α7, α9, α10) en drie β-type subunits (β2,
β3, β4) bekend. Deze nAChR subunittypen combineren selectief tot receptorpentameren.
Hierin worden twee klassen van pentameren onderscheiden. De eerste klasse bestaat uit
101
Nederlandse samenvatting
receptoren die uit één α-type subunittype is opgebouwd (homopentamere receptoren).
De andere klasse van receptoren bestaat uit een combinatie van α- en β-type subunits
(heteropentamere receptoren). Door deze moleculaire diversiteit aan nAChR subunit
typen komen er in het zenuwstelsel nAChRs met verschillende receptor eigenschappen
zoals bijvoorbeeld ligandbinding en ionenselectiviteit voor. Het is bekend dat een
dergelijke diversiteit aan nAChR subunits niet alleen in het zenuwstelsel van gewervelde
dieren, maar ook in dat van nematodes (C.elegans) en insecten (bijv. de fruitvlieg D.
melanogaster en de malariamug A. gambiae) bestaat. Hoewel het bestaan van nAChRs
in het zenuwstelsel van weekdieren zoals de poelslak Lymnaea stagnalis functioneel
is aangetoond, was er in weekdieren geen informatie over de diversiteit van de nAChR
subunit familie. Het onderzoek beschreven in dit proefschrift had als eerste doel om voor
het eerst de moleculaire diversiteit van nAChR subunits in het centrale zenuwstelsel van
een weekdier, de zoetwaterslak Lymnaea stagnalis, in kaart te brengen en deze functioneel
te onderzoeken.
De nAChR pentameer bestaat uit een extracellulair neurotransmitterbindend
deel (ligandbindend deel, LBD) en een transmembraan ionkanaal (TM). Deze functionele
delen vinden we terug in de afzonderlijke subunits van de pentameer. Iedere subunit
bestaat uit een aminoterminaal LBD en een carboxyterminaal TM dat weer bestaat uit vier
transmembraan domeinen (TM1, TM2, TM3, TM4). In de nAChR pentameer vormen de TM2
domeinen de binnenwanden van het ionkanaal. In een nAChR pentameer is de moleculaire
samenstelling (aminozuurvolgorde) van de TM2 domeinen van de nAChR subunits
bepalend voor de ionenselectiviteit van het kanaal. In gewervelde dieren bestaat er een
strikt onderscheid in ionenselectiviteit tussen de leden van de Cys-loop familie; nAChR’s en
5HTR’s zijn kationselectief/activerend en GABAR’s en GlycR’s anionselectief/inactiverend
zijn. In het zenuwstelsel van Lymnaea stagnalis bestaan echter naast kationselectieve ook
anionselectieve nAChRs. Het tweede doel van het onderzoek beschreven in dit proefschrift
is subunittypen te identificeren die onderdeel uitmaken van kationselectieve, dan wel
anionselectieve nAChRs.
Hoofdstuk 2 beschrijft de identificatie van nAChR subunits die voorkomen in het
centrale zenuwstelsel van Lymnaea stagnalis. Partiële cDNA fragmenten die coderen voor
nAChR subunits werden met behulp van PCR met gedegenereerde oligonucleotiden
geamplificeerd vanuit cDNA preparaten van het Lymnaea zenuwstelsel. Volledige
sequenties werden verkregen met behulp van PCR reacties met geneste oligocombinaties
op een λ-faag cDNA bibliotheek van het Lymnaea zenuwstelsel. In totaal werden er met
deze aanpak twaalf verschillende sequenties geïdentificeerd die gelijkenis vertonen met
bekende nAChR subunits. De nieuw geïdentificeerde Lymnaea nAChR subunits kregen de
naam LnAChR A-L. Het is niet gelukt om van LnAChR L alle sequentieinformatie te verkrijgen.
Op basis van de afgeleide eiwitsequentie van de Lymnaea nAChR subunits worden LnAChR
102
Nederlandse samenvatting
A-I en LnAChR K geclassificeerd als α-type nAChR subunits en LnAChR J als β-type subunit.
Fylogenetische analyse laat zien dat een aantal Lymnaea subunits verwantschap vertonen
met heteropentamere dan wel homopentamere nAChR subunittypen van gewervelde
dieren. Daarnaast suggereert fylogenetische analyse dat een groep van vier Lymnaea
subunits, LnAChR B, -F, -I en -K, geen verwanten kent in gewervelde dieren en insecten.
In hoofdstuk 3 wordt de expressie van de geïdentificeerde nAChR subunits in het
zenuwstelsel beschreven. Wanneer gemeten met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR)
in cDNA preparaten van verschillende weefsels van Lymnaea stagnalis blijkt de expressie
van de geïdentificeerde LnAChR subunits hoofdzakelijk voor te komen in het centrale
zenuwstelsel. In situ hybridisatie (ISH) op coupes van het Lymnaea centrale zenuwstelsel
laat zien dat de expressie van de nAChR subunits uitsluitend plaats vindt in neuronen.
nAChR subunitexpressie kan worden waargenomen in elk van de ganglia die het centrale
zenuwstelsel vormen. Tussen de verschillende ganglia bestaan aanzienlijke verschillen in
relatieve expressieniveaus van de meeste nAChR subunits.Ten minste 10% van alle neuronen
in het centrale zenuwstelsel vertonen expressie van nAChR subunits. Als indicator voor het
aantal en de lokalisatie van neuronen die acetylcholine als neurotransmitter uitscheiden
werd de expressie van de Lymnaea vesiculaire acetylcholine transporter (LVAChT) met
behulp van ISH in kaart gebracht. Net als nAChR subunits komt expressie van LVAChT
ook voor in alle ganglia van het centrale zenuwstelsel en betreft ongeveer 10% van alle
neuronen. De relatief hoge niveaus van expressie van zowel nAChR subunits als LVAChT in
de pedale ganglia suggereert dat de pedale ganglia een prominente plaats innemen in de
cholinerge synaptische transmissie.Tot slot werd de expressie van nAChR subunits bekeken
in verschillende neuro-endocriene cellen in het zenuwstelsel, te weten caudodorsal cellen,
light green cellen, light yellow cellen, pedale cluster IB cellen of anterior lobe neuronen.
QPCR laat zien dat deze celpopulaties verschillende sets van nAChR subunits tot expressie
brengen. Daarnaast laat ISH zien dat er binnen celpopulaties heterogeniteit bestaat in
nAChR subunitexpressie. Deze resultaten suggereren dat de afgifte van neuropeptiden
door deze celpopulaties onder een invloed staat van cholinerge innervatie.
In hoofdstuk 4 wordt de ionenselectiviteit van de geïdentificeerde Lymnaea nAChRs
nader bestudeerd. Op basis van resultaten van eerder gepubliceerde mutagenesestudies
voorspellen we de betrokkenheid van nAChR subunits bij anionselective (LnAChR B, -F, -I
and -K) and kationselectieve (LnAChR A, -C, -D, -E, -G, -H and -J) nAChR typen. Om de invloed
van nAChR subunits op de ionenselectiviteit van functionele receptoren te bestuderen,
werden de subunits individueel of in combinaties tot expressie gebracht in Xenopus
oöcyten. Uitsluitend individuele expressie van LnAChR A, -B en -I resulteerde in de expressie
van functionele receptoren. De functionele eigenschappen van receptoren bestaande uit
LnAChR A of LnAChR B subunits werden nader bestudeerd. Beide receptortypen bleken
103
Nederlandse samenvatting
gevoelig voor nAChR-specifieke agonisten en antagonisten. Een erg belangrijke observatie
was dat de receptor bestaande uit de LnAChR A subunit meer permeabel was voor het
kation Na+ en dat de receptor bestaande uit de LnAChR B subunit meer permeabel was
voor het anion Cl-. Fylogenetische analyse suggereert dat de LnAChR B, -F, -I en -K subunits
alle onderdeel uitmaken van anionselectieve nAChRs en dat deze subunits zijn ontstaan
uit een kationselectieve vooroudersubunit. Omdat de ionenselectiviteit van de Lymnaea
nAChR subunits correct was voorspeld, concluderen wij dat anionselectieve Lymnaea
nAChR subunits geëvolueerd zijn via mutaties analoog aan mutaties die anionselectiviteit
induceren van nAChRs in in vitro-mutageneseexperimenten.
De resultaten in dit proefschrift vormen het moleculaire bewijs voor het voorkomen van
nAChRs in het centrale zenuwstelsel van Lymnaea stagnalis. Het blijkt dat het zenuwstelsel
van Lymnaea een verscheidenheid aan nAChR subunittypen kent die vergelijkbaar is met
die van gewervelde dieren en insecten. Een belangrijke observatie is dat anionselectieve
acetylcholinegevoelige receptoren, die alleen voorkomen in het zenuwstelsel van
weekdieren, hun evolutionaire oorsprong lijken te hebben in een kationselectieve nAChR
vooroudersubunit. Omdat receptoren analoog aan de Lymnaea anionselectieve nAChRs
en aan andere LGICs van ongewervelde dieren met een ongebruikelijke combinatie
van neurotransmittergevoeligheid en ionenselectiviteit niet voorkomen in gewervelde
dieren concluderen wij dat de zenuwstelsels van ongewervelde dieren een belangrijk
andere fysiologie moeten bezitten zodat dit het ontstaan van dergelijke kanalen mogelijk
en gewenst heeft gemaakt. Omdat het een enkel cholinerg neuron in staat stelt zowel
excitatoire als inhibitoire postsynaptische effecten te bewerkstelligen, vermoeden wij
dat de evolutionaire druk om de omvang en daarmee het aantal neuronen van het
zenuwstelsel zo beperkt mogelijk te houden een belangrijke drijfveer is geweest voor het
koppelen van de afgifte van één neurotranmitter aan zowel kation- als anionstromen.
104