Tentamen Protein Engineering (8S080)

9:00 – 12:00 16/1/2008
Tentamen Protein Engineering (8S080)
Het tentamen bestaat uit 4 vragen en 3 pagina’s. Veel succes!
Vraag 1
15 punten
Professor Frank B. heeft vorig jaar een origineel verjaardagscadeau gekregen, en wil nu
zijn collega Klaas N. met eenzelfde cadeau verrassen: een peptide met de sequentie
KLAAS. Omdat Klaas van oorspong een chemicus is wil hij er graag een
structuurformule bijgeven. Kun jij deze werktuigbouwkundige helpen?
Bonusvraag voor 5 punten: teken welke groepen in het peptide onder fysiologische
omstandigheden (pH 7.0) geladen zijn?
A = Ala
L = Leu
K = Lys
S = Ser
Vraag 2
50 punten
Het vogelgriepvirus H5N1 is een dodelijk griepvariant voor zowel vogels als mensen. De
naam H5N1 refereert aan de subtypen van oppervlakte eiwitten bij het virus:
hemagglutinine type 5 en neuraminidase type 1. Het is bekend dat hemagglutinine 5
betrokken is bij de binding van het virus aan humane cellen, maar onbekend is aan welk
humaan eiwit dit virale eiwit bindt.
a. Leg uit hoe je het yeast two-hybrid systeem zou kunnen gebruiken om erachter te
komen om welk eiwit het gaat. Leg daarbij ook het principe van deze techniek uit.
Zowel voor de detectie van het virus als voor een eventuele behandeling wil je graag een
antilichaam of een antilichaamfragment hebben dat specifiek aan het virale eiwit bindt.
b. Bediscussieer de voor- en nadelen (3) van het gebruik van monoclonale
antilichamen en single-chain antilichaamfragmenten (scFv) voor deze toepassing.
c. Welke technieken (2) zou je kunnen gebruiken om een scFv fragment te vinden
dat specifiek bindt aan het virale eiwit?
Hieronder zie je een schematische weergave van een ScFv genaamd Tue1 dat aan
hemagglutinine 5 bindt. De beide zwavelbruggen zijn essentieel voor de stabiliteit en de
juiste vouwing van het eiwit.
1
Tue1 (171 amino acids)
Cys8
Cys42 Cys47
Cys167
C
N
S
S
S
S
d. Welke zwavelbrug zal theoretisch de grootste invloed hebben op de stabiliteit van
dit eiwit. Leg uit.
e. Recombinante expressie van het eiwit Tue1 in E. coli resulteert in de vorming van
zogenaamde inclusion bodies. Leg uit hoe de aanwezigheid van zwavelbruggen
kan leiden tot de vorming van inclusion bodies en geef 2 mogelijkheden om toch
dit eiwit in E.coli tot expressie te brengen.
f. Om de expressie problemen te voorkomen besluiten de onderzoekers de 4
cysteines te vervangen door een ander aminozuur. Welk aminozuur kunnen ze
daarvoor het beste gebruiken (leg uit).
g. Het eiwit zonder zwavelbrug blijkt veel minder stabiel te zijn. Noem 3 technieken
die gebruikt kunnen worden om eiwitvouwing te volgen en leg van alle 3 uit hoe
ze werken.
h. Noem 3 rationele manieren om de stabiliteit van het eiwit te vergroten, er van
uitgaande dat je de 3-dimensionale struktuur van het eiwit kent.
i. Uit de kristalstruktuur van het eiwit blijkt dat de N- and C-terminus van het eiwit
zich vlak bij elkaar bevinden. Een slimme student suggereert om te proberen de
C- en N-terminus van het eiwit met elkaar te verbinden via een normale peptide
binding, zodat een cyclisch eiwit wordt gevormd. Leg uit hoe je een dergelijke
cyclische variant van Tue1 zou kunnen maken.
j. Beschrijf een combinatoriele benadering die je zou kunnen gebruiken om scFv
varianten te ontwikkelen die temperatuur stabieler zijn.
Vraag 3
25 punten
Keratines zijn fiber-vormende eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de structurele
eigenschappen van de huid, haren, nagels, klauwen en dergelijke. Ze bestaan uit te lange
polypeptide ketens die samen een zogenaamde coiled-coil structuur vormen, twee helices die om elkaar heen zijn gewonden. De beide ketens worden o.a. door disulfide
bruggen met elkaar verbonden.
a. Keratines bestaan vaak uit een repeterende sequentie van 7 aminozuren. Geef een
voorbeeld van een sequentie van 7 aminozuren die een keratine structuur zou
kunnen vormen, o.a. door vorming van disulfide bruggen. Uit hoeveel repeats van
deze sequentie moet een peptide bestaan om een keratine fiber van 15 nm te
vormen. Leg je antwoord uit.
2
Omdat de betreffende sequentie niet goed tot expressie komt in E. coli, wordt
besloten het peptide m.b.v. Solid Phase Peptide Synthesis te produceren.
b. Leg het principe van SPPS uit. Welke verschillende stappen kun je
onderscheiden? Waarin verschillen de twee meest gebruikte varianten van deze
techniek?
c. Vergelijk de efficiëntie van de peptide koppelingstap in SPPS met recombinante
expressie van eiwitten?
d. Leg uit hoe je ondanks deze beperking toch via chemische synthese het gewenste
peptide kunt maken.
TOF MS ES+
4 .3 6 e 3
Vraag 4
56.68
9 5 6 .8 5
956.85
10 punten
IINS_2 416 (7.820) Cm (416:443)
TOF MS ES+
Hieronder
vindt je een klein gedeelte van een ESI-MS massaspectrum
van een klein
5.04e3
100
eiwit. Door een koffievlek is een groot gedeelte van het spectrum onleesbaar geworden.
Kun je desondanks toch de massa van het betreffende eiwit bepalen?
1147.6
9 5 7 .0 1
1147.4
957.01
1147.8
9 5 7 .1 9
1148.0
9 5 7 .3 6
1147.2
9 5 7 .5 2
9 5 7 .6 9
956.35
956.52
1148.2
m /z
9 5 6 .3 5
957
TOF MS ES+
4 .3 6 e 3
9 5 6 .5 2
9 5 6 .6 8
956.68
%
1148.4
9 5 6 .8 5
956.85
956.19
1147.4
100
9 5 6 .1 9
9 5 7 .0 1
1147.6
IINS_2 416 (7.820) Cm (416:443)
1147.4
957.01
TOF MS ES+
5.04e3
1147.6
1147.8
1147.8
9 5 7 .1 9
1148.0
56.02
1147.2
1147.2
9 5 7 .3 6
0
9 5 6 .0 2
1147
9 5 7 .5 2
1148.0
m/z
1148
1149
9 5 7 .6 9
1148.2
1148.2
m /z
956
957
%
1148.4
1148.4
1433.5
0
m/z
1147
1148
1147
1149
1148
1149
1433.5
1000
1200
1400
1600
1800
1200
1400
3
1600
Mass (M/z)
800
1000
Mass (M/z)
1800