Inductie van geheugen in het aangeboren immuunsysteem van Sus
advertisement
Inductie van geheugen in het aangeboren immuunsysteem van Sus scrofa Hans VAN DER WEKEN Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de Biochemie en de Biotechnologie Major Biomedische biotechnologie Academiejaar 2013-2014 Promotoren: prof. dr. Eric Cox en dr. Bert Devriendt Wetenschappelijk begeleider: dr. Bert Devriendt Vakgroep Virologie, Parasitologie en Immunologie Laboratorium voor Immunologie Dankwoord Als eerste wil ik prof. Dr. Eric Cox bedanken om mij de kans te geven mijn masterthesis te volbrengen op het laboratorium voor Immunologie op de faculteit van Diergeneeskunde, waardoor ik de kans heb gekregen om mijn diploma als master in de biochemie en biotechnologie te behalen. Vervolgens wil ik Dr. Bert Devriendt bedanken voor de uitstekende begeleiding en hulp bij het maken van deze masterthesis. Hoewel hij het soms zeer druk had, vond hij toch steeds de tijd om mij te helpen. Ik kon steeds terecht bij hem met mogelijke vragen. Ook wil ik iedereen op het labo bedanken voor de toffe sfeer en hulp. Bedankt Ann, Céline, Charlotte, Christophe, Cliff, Delphine, Elisa, Evelien, Hanne, Joanna, Jochen, Karen, Kim, Korneel, Manon, Maria, Rudi, Sarah, Simon en Ut. Ook mijn professoren wil ik bedanken omdat ze hun kennis met mij hebben willen delen en mij zo de kans hebben gegeven om mijn doelen te bereiken. Als laatste wil ik mijn ouders bedanken voor hun steun tijdens deze masterthesis en de voorbije jaren. Zonder hen was ik hier niet geraakt. 1 Inhoudstafel Lijst met tabellen/figuren …………………………………………………………………………………....... p.4 Lijst met afkortingen ………………………………………………………………………………………………. p.5 Nederlandse samenvatting …………….………………………………………………………………………. p.8 English summary ……………………………………………………………………………………………………. p.9 Deel 1: Inleiding ……………………………………………………………………………… p.10 1.1 Het aangeboren immuunsysteem ……………………………………………….….……. p.10 1.1.1 Cellen van het aangeboren immuunsysteem ………………………. p.11 1.2 Pathogeen herkenning ………………………………………………………………………….. p.12 1.2.1 β-glucanen …………………………………………………………………………… p.16 1.3 Getrainde immuniteit …………………………………………………………………………… p.17 1.3.1 Systemic Aquired Resistance (SAR) in planten ……………….……. p.18 1.3.2 Invertebrata …………………………………………………………………………. p.19 1.3.3 Vertebraten ………………………………………………………………………….. p.20 1.3.4 Training, priming en immuun tolerantie ……………………………….. p.22 1.3.5 Moleculaire mechanismen voor getrainde immuniteit …..……. p.22 Deel 2: Doelstelling ………………………………………………………………………... p.26 Deel 3: Resultaten …………………………………………………………………………... p.27 3.1 Getrainde immuniteit in neutrofielen ……………………………………………………. p.27 3.1.1 GM-CSF verlengt de levensduur van neutrofielen …………………. p.28 3.1.2 ROS-productie door neutrofielen ………………………………………….. p.29 3.2 Getrainde immuniteit in monocyten ……………………………………………………… p.31 3.2.1 Aangeboren immuuntraining van monocyten met β-glucanen p.35 3.2.2 Het belang van epigenetische modificaties bij immuuntraining p.36 3.2.3 Immuuntraining van CD14+ monocyten met Euglenia gracilis β-glucanen p.38 Deel 4: Discussie …………………………………………………………………………….... p.40 Deel 5: Materialen en methoden …………………………………………………..…. p.44 5.1 Bloedstalen ……………………………………………………………………………………………. p.44 5.2 Cultuurmedia …………………………………………………………………………………………. p.44 5.3 Isolatie van PBMC’s en neutrofielen ……………………………………………………….. p.44 5.3.1 Aanrijking van monocyten uit de PBMC fractie ……………………… p.45 5.3.2 Productie van monocyt-afkomstige macrofagen ………….…….… p.45 2 5.4 Flow cytometrie ……………………………………………………………………………………. p.45 5.5 Monocyt stimulatie ………………………………………………………………………………. p.46 5.5.1 Histon methylatie assay ………………………………………………………. p.46 5.5.2 Cytokine ELISA’s ………………………………………………………………….. p.47 5.6 Viabiliteitsassay ……………………………………………………………………………………. p.47 5.7 Productie van reactieve zuurstof species door neutrofielen ………….……. p.47 5.8 Statistische analyse ………………………………………………………………………….…… p.48 Referenties ……………………………………………………………………………………………………….…… p.49 Bijlagen …………………………………………………………………………………………………………….…… p.58 3 Lijst met tabellen/figuren Tabel 1: Overzicht van verschillende membraangebonden PRRs met hun ……….. cellulaire lokalisatie, liganden, immuunrespons en doelwit pathogenen p.14 Figuur 1: Herkenning van H. pylori door aangeboren immuunsysteem …………….. p.16 Figuur 2: Aangeboren immuunrespons na priming van immuuncellen …………….. p.22 Figuur 3: Epigenetische histon modificaties ………………………………………………………. p.24 Figuur 4: Zuiverheid van de neutrofiel populatie na isolatie ……………………………… p.27 Figuur 5: Invloed van GM-CSF op de viabiliteit van neutrofielen ……………………….. p.28 Figuur 6: ROS-productie door neutrofielen na stimulatie met verschillende …….. reagentia p.29 Figuur 7: ROS-productie door neutrofielen 5 dagen na stimulatie …………………….. p.31 Figuur 8: Expressie van de merker CD14 in de verschillende cel populaties na …. isolatie door middel van Percoll densiteitgradiënt centrifugatie p.32 Figuur 9: Zuiverheid van de PBMC populatie na Percoll densiteitgradiënt …………. centrifugatie en CD14 MACS p.32 Figuur 10: Zuiverheid van CD14+ celpopulatie na lymphoprep densiteitgradiënt ... en CD14 MACS p.33 Figuur 11: TNFα secretie bij monocyten na stimulatie met MacroGard ……………….. p.33 Figuur 12: Experimentele methode voor immuuntraining bij monocyten ……………. p.34 Figuur 13: TNFα secretie door β-glucaan gestimuleerde monocyten tijdens de ….. washout fase p.34 Figuur 14: MacroGard blijft aanwezig in het cultuurmedium tijdens de washout .. fase p.35 Figuur 15: β-glucanen induceren immuuntraining in monocyten ………………………… p.36 Figuur 16: Invloed van MTA op viabiliteit van monocyten ……………………………………. p.36 Figuur 17: Effect van MTA op de immuuntraining van monocyten door MacroGard p.37 Figuur 18: Effect van MTA op H3K4 histon trimethylaties …………………………………….. p.38 Figuur 19: Immuuntraining van monocyten door β-glucanen afkomstig van ……….. Euglenia gracilis p.39 4 Lijst met afkortingen AF647: Alexa Fluor 647 BCA: Bicinchoninic acid BCG: Baccile Calmette-Guérin BSA: Bovine serum albumine CD: Cluster of Differentiation CIITA: Class II major histocompatibility complex transactivator CLEC4G: C-type lectin domain family 4 member G CLR: C-type lectin receptors CpG: Cytosine-phosphate-guanine CR3: Complement receptor 3 CXCR6: C-X-C chemokine receptor type 6 DAP: Diaminopimelic acid DC: Dendritische cel DC-SIGN: Dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin DMEM: Dulbecco’s minimal essential medium DPT: Diptheria-pertussis-tetanus Dscam: Down syndrome cell adhesion molecule EDTA: Ethyleendiaminetetraazijnzuur ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay ETI: Effector-triggered immunity FACS: Fluorescence-activated cell sorting FCM: Flow cytometer FCS: Forward scatter FITC: Fluorescein isothiocyanate FREP: Fibrinogen-related proteins GM-CSF: Granulocyte macrophage colony-stimulating factor H3K4Me3: Histon 3 lysine 4 trimethylatie HBSS: Hank's Balanced Salt Solution HEPES: 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HRP: Horseradish peroxidase HSV: Herpes simplex virus IFN: Interferon 5 Ig: Immunoglobuline IL: Interleukine IRF: Interferon regulatory factor JNK: c-Jun N-terminal kinases LGP2: Laboratory of Genetics and Physiology 2 LPS: Lipopolysacharide LRR: Leucine rich repeats mAB: monoclonal Antibody MACS: Magnetic-activated cell sorting MAMP: Microbe-associated molecular pattern MAPK: Mitogen-activated protein kinases MCMV: Muis cytomegalovirus M-CSF: Macrophage colony-stimulating factor MD2: Myeloid differentiation factor-2 MDA-5: Melanoma differentiation-associated protein 5 MDM: monocyte-derived macrophage MDP: Muramyl dipeptide MEM-NEAA: Minimal essential médium – non-essential amino acids MHC: Major histocompatibility complex MR: Mannose receptor MTA: 5’-deoxy-5’-methylthioadenosine MTI: MAMP-triggered immunity MyD88: Myeloid differentiation primary response gene 88 NADPH: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase NAIP: Neuronal apoptosis inhibitory protein NFκB: Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NK: Natural killer NKp46: Natural killer cell p46-related protein NLR: NOD-like receptors NLRC: NOD-like receptor family CARD domain NLRP: NACHT, LRR and PYD domains-containing protein NLRX1: NLR family member X1 NOD: Nucleotide-binding oligomerization domain 6 NP40: nonyl phenoxypolyethoxylethanol P/S: Peniciline/streptamycine PBMC: Perifeer bloed mononucleaire cel PBS: Phosphate buffered saline PI: Propidium iodide PMA: Phorbol 12-myristate 13-acetate PRR: Pattern recognition receptor Raf1: Rapidly accelerated fibrosarcoma 1 RAG: Recombination-associated genes RIG-I: Retinoic acid-inducible gene 1 RLR: RIG-I-like receptors RLU: Relative light units ROS: Reactive oxygen species RPMI: Roswell Park Memorial Institute medium SA: Salicylic acid SAR: Systemic acquired resistance SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulphate - Polyacrylamide gel electrophoresis SSC: Side scatter Th: T-helper TIR: Toll/interleukin-1 receptor TLR: Toll-like receptors TNE buffer: Tris-NaCl-EDTA buffer TNF: Tumor necrosis factor TRIF: TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β TSB: Tryptic soy broth VLR: Variable lymphocyte receptor WB: Western blot 7 Nederlandse samenvatting Het immuunsysteem bij vertebraten bestaat uit een aangeboren en een adaptieve component. Het adaptieve immuunsysteem is in staat om specifieke pathogenen te herkennen en hiertegen een immunologisch geheugen op te bouwen. Het aangeboren immuunsysteem daarentegen herkent pathogenen op een aspecifieke manier en kan geen geheugen opbouwen tegen toekomstige infecties. Recent onderzoek bij de mens en muis heeft echter aangetoond dat dit huidig model van het immuunsysteem niet volledig correct is. Blijkbaar kunnen ook cellen van het aangeboren immuunsysteem, zoals monocyten, een geheugenfunctie opbouwen. De term “trained immunity” of getrainde immuniteit werd hiervoor geïntroduceerd. We kunnen deze getrainde immuniteit omschrijven als een verhoogde weerstand van het aangeboren immuunsysteem tegen secundaire infecties na inductie door een primaire infectie. Hierdoor kunnen aangeboren immuuncellen op een aspecifieke manier sneller en sterker reageren op een tweede infectie. Zo vertonen monocyten een verhoogde cytokine secretie na inductie van getrainde immuniteit, waarbij epigenetische modificaties en meer specifiek trimethylaties op H3K4 aan de basis liggen van dit mechanisme. In deze masterthesis werd deze getrainde immuniteit voor de eerste keer aangetoond in monocyten van het varken. Monocyten, geïsoleerd uit perifeer bloed, vertoonden een verhoogde TNFα secretie na stimulatie met een partikelvormig β-glucaan afkomstig van de gist Saccharomyces cerevisiae (MacroGard). Ook de rol van H3K4 histon trimethylaties in het induceren van getrainde immuniteit in monocyten van het varken werd aangetoond. Behalve MacroGard induceerde een ander partikelvormig β-glucaan afkomstig van de alg Euglenia gracilis ook een verhoogde TNFα secretie door monocyten. Deze respons lag zelfs hoger dan de respons van MacroGard-getrainde monocyten. Dit doet vermoeden dat kleine structuurverschillen aanleiding kunnen geven tot een verschillend trainingseffect. Verder onderzoek is echter nodig om deze structuur-functie relatie in de inductie van getrainde immuniteit door β-glucanen op te helderen. De aanwezigheid van getrainde immuniteit werd ook onderzocht bij andere aangeboren immuuncellen, namelijk neutrofielen. In tegenstelling tot monocyten kon echter geen getrainde immuniteit aangetoond worden, aangezien geen verhoogde ROS productie werd waargenomen na stimulatie met β-glucanen of andere PRR liganden. Er werd eerder een verlaagde ROS productie gedetecteerd in vergelijking met de controle cellen, wat kan wijzen op een uitputting van de neutrofielen. Niettegenstaande het aantonen van getrainde immuniteit in monocyten bij het varken is verder onderzoek nog vereist om meer reagentia, zoals andere β -glucanen, te screenen op hun mogelijkheid om getrainde immuniteit op te wekken, hun optimale concentratie voor de inductie van getrainde immuniteit en de duur van het trainingseffect te bepalen. Bovendien zou het interessant zijn om de aanwezigheid van getrainde immuniteit in andere aangeboren immuuncellen, zoals macrofagen te bevestigen. De resultaten behaald in deze masterthesis kunnen belangrijke implicaties hebben voor de ontwikkeling van nieuwe vaccins. Zo zouden β-glucanen kunnen worden toegevoegd aan vaccins om hun beschermende werking te versterken door de inductie van getrainde immuniteit. De ontwikkeling van nieuwe vaccins, die gebruik maken van het beschermende effect van getrainde immuniteit, bovenop hun activatie van het adaptief immuunsysteem, bieden interessante vooruitzichten in de bestrijding van tal van infectieziekten bij zowel mens als dier. 8 English summary The immune system in vertebrates consists of an innate and adaptive component. The adaptive immune system is able to recognize and build up an immunological memory against specific pathogens. The innate immune system on the other hand recognizes pathogens in a nonspecific manner and is unable to build up memory against future infections. Recent research in humans and mice however has shown that the current model of the immune system is incomplete. Indeed, innate immune cells, such as monocytes, are also capable of building up an immunological memory. The term “trained immunity” was therefore introduced. Trained immunity has been defined as a heightened resistance of the innate immune system against secondary infections after induction by a primary infection. This results in a faster and increased response to a second infection, albeit in a nonspecific manner. Monocytes for instance display an increased secretion of pro-inflammatory ctyokines upon induction of this trained immunity in which epigenetic modifications, more specific trimethylations on H3K4, regulate this mechanism. In this master dissertation, we demonstrated for the first time the presence of trained immunity in porcine monocytes. These monocytes, isolated from peripheral blood, showed an increased secretion of TNFα upon stimulation with particulate β-glucans, isolated from the yeast Saccharomyces cerevisiae (MacroGard). In addition, the role of H3K4 trimethylations in the induction of trained immunity in porcine monocytes was demonstrated. Besides MacroGard, another particulate β-glucan, obtained from the alga Euglenia gracilis, also elicited an increased TNFα secretion in monocytes. This response was even higher as compared to training of the monocytes with MacroGard. This suggests that small structural differences could give rise to different training effects. Further research is however necessary to elucidate the structure-function relationship in the induction of trained immunity by β-glucans. The presence of trained immunity was also examined in other innate immune cells, such as neutrophils. In contrast to monocytes, no trained immunity could be shown for neutrophils, since no heightened ROS-production could be observed after stimulation with β-glucans or other PRR ligands. Rather, a decreased ROSproduction was detected in comparison with control cells, which could be an indication of exhaustion of the neutrophils. Although trained immunity was demonstrated in porcine monocytes, further research is required to screen more reagents, like other β-glucans, for their capacity to induce trained immunity, to determine their optimal concentrations to induce trained immunity and to pinpoint the duration of this training effect. Furthermore, it would be interesting to confirm the presence of trained immunity in other innate immune cells, such as macrophages. The results obtained in this master dissertation could have important implications in the development of new vaccines. Β-glucans could be added to vaccines to increase their protective effect by the induction of trained immunity. The development of new vaccines, which make use of this trained immunity, in addition to their activation of the adaptive immune system, could offer interesting prospects in fighting numerous infectious diseases in both animals as humans. 9 Deel 1: Inleiding Het immuunsysteem wordt sinds lang beschouwd als een tweedelig verdedigingsmechanisme tegen pathogenen en ziekteverwekkers. Enerzijds is er het aangeboren of aspecifieke immuunsysteem, dat een belangrijke rol speelt als eerste verdedigingslinie tegen indringers (Mair et al, 2014). Anderzijds is er het adaptieve of specifieke immuunsysteem, dat gebruik maakt van gespecialiseerde immuuncellen, zoals Ben T-cellen. Dit deel van het immuunsysteem is uniek voor vertebraten. Het heeft een tragere respons tegen infecties dan het aangeboren immuunsysteem, maar is wel in staat om specifieke pathogenen te herkennen en hiertegen een immunologisch geheugen op te bouwen. Deze geheugenfunctie wordt ondersteund door speciale geheugencellen, die bij een secundaire infectie van dezelfde pathogeen een klonale expansie kunnen ondergaan. Hierdoor ontstaat een pathogeen-specifieke immuunrespons, die veel vlugger opkomt en sterker is dan bij de eerste infectie (Danilova, 2012). Het aangeboren immuunsysteem daarentegen heeft een veel vluggere immuunrespons wanneer het een pathogeen herkent, maar kan hiertegen geen immunologisch geheugen opbouwen. Hierdoor kan er geen versterkte immuunrespons ontwikkeld worden bij opeenvolgende infecties door dezelfde pathogeen. In de laatste jaren is dit simplistische dogma, waarbij het aangeboren immuunsysteem aspecifiek reageert en het adaptieve immuunsysteem een specifieke respons opbouwt tegen pathogenen echter sterk veranderd. Er blijken complexere mechanismen van kracht te zijn, waardoor de scheiding tussen de aangeboren en adaptieve immuunrespons tegen pathogenen vervaagd. Zo wordt de algemene overtuiging dat het aangeboren immuunsysteem zich niet kan aanpassen aan een voorgaande ontmoeting met een pathogeen en dus ook geen immunologisch geheugen hiertegen kan opbouwen sinds kort in twijfel getrokken (Netea et al, 2011). Om de mechanismen die later in deze literatuurstudie worden besproken beter te kunnen begrijpen, zullen de verschillende onderdelen van het aangeboren immuunsysteem kort besproken worden. 1.1. Het aangeboren immuunsysteem Het aangeboren of aspecifieke immuunsysteem vormt de eerste verdedigingslinie van het organisme en doet dienst als een fysische en chemische barrière tegen tal van infectueuze agentia (Cruvinel Wde et al, 2010). In tegenstelling tot het adaptief immuunsysteem, dat uniek is voor vertebraten, is het aangeboren immuunsysteem zowel aanwezig in vertebraten, planten, fungi en invertebrata, zoals insecten en weekdieren. Zelfs prokaryoten bezitten een primitief verdedigingsmechanisme tegen bacteriofagen (Bikard & Marraffini, 2012). Evolutionair gezien zijn er dus verschillende strategieën ontwikkeld om het organisme te beschermen tegen pathogenen. Men zou het aangeboren immuunsysteem dus kunnen beschouwen als een evolutionair oudere verdedigingsstrategie in vergelijking met het adaptief immuunsysteem (Rinkevich, 1999). Het aangeboren immuunsysteem bij vertebraten heeft in de loop van de geschiedenis enkele belangrijke functies ontwikkeld, zoals: 1) de rekrutering van immuuncellen naar de plaats van infectie met behulp van chemokines, 2) de identificatie en het verwijderen van lichaamsvreemde stoffen door gespecialiseerde witte bloedcellen, zoals neutrofielen, monocyten en macrofagen, 3) de activering van het adaptief immuunsysteem door middel van antigeen presentatie door antigeen presenterende cellen en 4) de activering van de complementcascade voor pathogeen herkenning, cel activatie en om het opruimen van antilichaam complexen en 10 dode cellen te bevorderen. Deze complement cascade bestaat uit een hele reeks eiwitten, aanwezig in het bloedplasma, die samenwerken om het celmembraan van vreemde cellen te vernietigen (Degn & Thiel, 2013). Drie verschillende routes kunnen het complement systeem activeren: de klassieke , de alternatieve en de mannose-bindende route. De klassieke route wordt gezien als een onderdeel van een specifieke immuunrespons, omdat deze antilichamen nodig heeft voor zijn functie. De alternatieve route is aspecifiek en de mannose-bindende route herkent bacteriën voornamelijk via glycoproteïnen aanwezig op hun oppervlakte (Brunner et al, 2012). Bij pathogeenherkenning worden aangeboren immuuncellen aangetrokken naar de plaats van infectie door inflammatoire mediatoren, zoals TNFα, IL-6 of IL-1β. Deze proinflammatoire cytokinen worden gesecreteerd door (immuun)cellen, zoals macrofagen of beschadigde/geïnfecteerde cellen en spelen een belangrijke rol in de ontstekingsreactie tegen de pathogeen (Le Bel et al, 2014). Andere cytokinen, zoals IFN-γ, kunnen belangrijke antivirale effecten hebben of staan in voor de communicatie tussen de witte bloedcellen onderling (Sheahan et al, 2014); (Mear et al, 2014). 1.1.1. Cellen van het aangeboren immuunsysteem Zoals net besproken wordt de verdediging door het aangeboren immuunsysteem gecontroleerd door witte bloedcellen of leukocyten. Deze leukocyten bevinden zich in de bloedsomloop en migreren bij detectie van cellulair afval, vreemde deeltjes of binnendringende micro-organismen naar de plaats van infectie, waar deze cellen instaan voor het vernietigen van de lichaamsvreemde moleculen of beschadigde cellen. Leukocyten ontstaan uit multipotente hematopoëtische stamcellen in het beenmerg en worden onderverdeeld in verschillende celtypes zoals monocyten, macrofagen, neutrofielen, naturalkiller (NK) cellen, mest cellen, eosinofielen, basofielen en dendritische cellen. Elk van deze cellen heeft een specifieke functie in het aangeboren immuunsysteem. Monocyten zijn de grootste leukocyten en omvatten ongeveer 2 tot 10% van alle leukocyten. Onder normale omstandigheden staan zij in voor het aanvullen van residente macrofagen en dendritische cellen in weefsels. Bij een infectie kunnen monocyten zeer vlug naar de plaats van infectie migreren, waar ze zullen delen en differentiëren tot macrofagen of dendritische cellen (Fairbairn et al, 2013). De belangrijkste merkers voor monocyten in het varken zijn CD14, CD163 en CD172a (Piriou-Guzylack & Salmon, 2008). Macrofagen zijn sterk gedifferentieerde fagocyten, afkomstig van monocyten. Ze zijn in staat om zich aan te passen aan hun micro-omgeving, waarbij ze verschillende fenotypes kunnen aannemen. Zo differentiëren ze tot Kupffer cellen in de lever, Langerhans cellen in de huid of alveolaire macrofagen in de longen (Geissmann et al, 2010). Hun differentiatie en toekomstig fenotype is afhankelijk van de concentraties aan M-CSF, GM-CSF, retoïnezuur en lipoproteïnen (Gordon & Martinez, 2010). Macrofagen hebben een relatief lange levensduur van enkele maanden en kunnen 10-15% van de totale cel populatie in weefsels uitmaken. Het zijn sterk gespecialiseerde cellen, die bacteriën en dode of geïnfecteerde cellen vernietigen door middel van fagocytose en daaropvolgend de productie van reactieve zuurstofradicalen (ROS), zoals waterstofperoxide (H2O2). Bij detectie van pathogenen produceren macrofagen ook verschillende cytokines en chemokines, die instaan voor de rekrutering en activering van andere cellen naar de plaats van infectie (Locati et al, 2013). In het varken kunnen ze 11 herkend worden via de macrofaag-specifieke merker CD169 (Martinez-Pomares & Gordon, 2012). Net als monocyten expresseren ze ook CD14, CD172a en CD163, met het onderscheid dat hun CD14 expressie veel lager is dan deze in monocyten. Dendritische cellen zijn professionele antigeen presenterende cellen die vooral aanwezig zijn in weefsels die contact maken met de externe omgeving, zoals de huid (Langerhans cellen) en het binnenste slijmvlies van de neus, longen, maag en ingewanden. Ze spelen een belangrijke rol in de herkenning van pathogenen en de presentatie van antigenen aan naïeve T-cellen (VegaRamos & Villadangos, 2013). In het varken worden ze gekenmerkt door de expressie van CD135 en het ontbreken van CD14 (Summerfield & McCullough, 2009). Een ander soort fagocyten zijn de neutrofielen. Het zijn de meest abundante witte bloedcellen in het varken (40-75%). Deze sterk gedifferentieerde cellen hebben een zeer korte levensduur van slechts enkele dagen, die bij infectie of inflammatie echter verlengd wordt (Kumar & Sharma, 2010). Bij een bacteriële of schimmel infectie zijn het meestal de eerste verdedigers. Neutrofielen bevatten granulen met toxische bestanddelen, zoals defensines of NADPH oxidases. Bij pathogeen herkenning worden deze bestanddelen vrijgegeven, wat leidt tot hun vernietiging (Jaillon et al, 2013). In het varken worden ze gekenmerkt door de expressie van SWC1 en SWC8 (Piriou-Guzylack & Salmon, 2008). Ze zijn ook kleiner dan humane neutrofielen, vertonen een lagere granuliteit en een hogere activatie grens (Brea et al, 2012). Andere granulocyten zijn onder andere basofielen en eosinofielen. Deze cellen zijn vooral belangrijk voor de verdediging tegen parasieten. Tijdens een parasitaire infectie zullen basofielen histamines vrijlaten, die een belangrijke rol spelen in allergische reacties, zoals astma (Hur et al, 2008). Net zoals basofielen secreteren ook eosinofielen toxische eiwitten en vrije radicalen die helpen bij het vernietigen van bacteriën en parasieten (Gauvreau et al, 2009). NK-cellen zijn cytotoxische lymfocyten van het aangeboren immuunsysteem, die niet rechtstreeks instaan voor de vernietiging van pathogenen. Ze gaan eerder aangetaste gastheercellen, zoals tumorcellen of virus-geïnfecteerde cellen, doden door herkenning van een zogenaamd “missing self” signaal (Souza-Fonseca-Guimaraes et al, 2012). Hierbij wordt gebruik gemaakt van de cel oppervlakte merker “Major Histocompatibility Complex I”(MHCI). Deze merker is aanwezig op alle gastheercellen. Tumor cellen of cellen geïnfecteerd met een virus zullen een verlaagde hoeveelheid van dit MHCI eiwit expresseren op hun membraan, wat zal leiden tot hun vernietiging door NK-cellen (Borrego et al, 2002). In vergelijking met humane NK-cellen zijn deze bij het varken kleiner. Ze worden gekenmerkt door CD3-CD8hi en in tegenstelling tot de mens en andere species expresseren niet alle NK cellen NKp46 (Mair et al, 2012). Een ander type van immuuncellen zijn de aangeboren lymfoïde cellen. Zij spelen een belangrijke rol in de regulatie van immuniteit, inflammatie en herstel van weefsels. Het is een zeer heterogene groep, die veel eigenschappen gemeen heeft met de adaptieve T-helper(Th) cellen. Hierdoor wordt er voorgesteld dat ze de evolutionaire voorgangers van Th-cellen zijn (Tait Wojno & Artis, 2012). 1.2. Pathogeen herkenning Een zeer belangrijk aspect in de initiatie van een immuunrespons tegen een pathogeen is de herkenning van deze pathogeen door cellen van het aangeboren immuunsysteem. Herkenning van pathogenen gebeurt door middel van zogenaamde patroon herkenningsreceptoren (pattern recognition receptors; PRRs), geëxpresseerd op cellen van het aangeboren immuunsysteem. Deze PRRs herkennen micro-organisme geassocieerde 12 moleculaire patronen (Microbe-associated molecular patterns; MAMPs). MAMPs zijn evolutionair geconserveerde moleculen afkomstig van bacteriën, virussen, fungi of parasieten en zijn vaak essentieel voor hun overleving en pathogeniciteit (Kumar et al, 2011). Er bestaan zowel membraangebonden als intracellulaire PRRs. Onder de membraangebonden PRRs behoren de Toll-Like Receptoren (TLR), de C-Type Lectin Receptoren (CLR) en de receptor kinasen. Bij de intracellulaire PRRs horen de NOD-Like Receptoren (NLR), de RIG-I-Like Receptoren (RLR) en de plant PRRs (Tabel 1). TLRs zijn zowel in vertebraten als bij invertebrata aanwezig en blijken één van de oudste en meest geconserveerde componenten van het aangeboren immuunsysteem te zijn. In zoogdieren zijn, afhankelijk van de soort, 10 tot 15 verschillende TLRs aanwezig. Bij het varken vindt men net zoals bij de mens 10 verschillende TLRs (TLR1-10) (Sang et al, 2008). Deze kunnen zowel homodimeren (TLR3-5,7,9) als heterodimeren (TLR1 en 6 met TLR2) vormen. Er kunnen ook complexen met andere moleculen gevormd worden, zoals TLR4 met MD2 en CD14 (Kumar et al, 2011). Elke TLR is in staat om een andere MAMP te herkennen. Zo staat TLR2 in voor de herkenning van β-glucanen, zoals zymosan, die aanwezig zijn op de celwand van fungi en lipoteichoïnezuur, een belangrijk onderdeel van de celwand van grampositieve bacteriën. TLR4 herkent lipopolysacharide (LPS), een component van de buitenste membraan van gramnegatieve bacteriën. TLR9 daarentegen herkent ongemethyleerde CpG motieven, aanwezig in het DNA van bacteriën en virussen. Een andere groep van membraangebonden PRRs zijn de CLRs. Zij zijn in staat om suikergroepen, zoals β-glucanen en mannose te binden. Deze carbohydraten zijn voornamelijk aanwezig in de celwand van bacteriën en fungi. In het varken zijn dectin-1, DC-SIGN en CLEC4G reeds geïdentificeerd. (Huang & Meng, 2009; Sonck et al, 2009). Dectin-1 wordt geëxpresseerd door macrofagen, neutrofielen en dendritische cellen en is belangrijk voor de immuniteit tegen schimmels, zoals S.cerevisiae en C.albicans. DC-SIGN wordt geëxpresseerd op macrofagen en dendritische cellen en herkent voornamelijk hoge mannose-bevattende glycoproteïnen, aanwezig op de enveloppe van virussen of op de celwand van bacteriën en schimmels. NLRs zijn cytoplasmatische PRRs die bacteriële componenten detecteren. De NOD1 en NOD2 receptoren zijn reeds gekarakteriseerd in het varken (Tohno et al, 2008a; Tohno et al, 2008b). NOD1 herkent meso-DAP, een peptidoglucaan aanwezig op gram-negatieve bacteriën. NOD2 herkent het intracellulaire muramyl dipeptide (MDP), een peptidoglucaan dat zowel aanwezig is op gram-negatieve als gram-positieve bacteriën. Net zoals NLRs zijn RLRs ook aanwezig in het cytoplasma. Deze PRRs herkennen dubbelstrengig RNA en kunnen bijgevolg infecties van RNA virussen detecteren. In het varken is de rol van RIG-1 en MDA-5 reeds beschreven (Husser et al, 2011). RIG-1 herkent korte, vrije 5’trifosfaat groepen op dsRNA of ssRNA. MDA-5 daarentegen herkent eerder lang dsRNA, zoals poly(I:C). In tabel 1 wordt een uitgebreid overzicht gegeven van de verschillende PRRs, hun cellulaire localisatie, liganden, de immuunrespons die ze initiëren en de soort pathogenen die ze kunnen herkennen. 13 Tabel 1: Overzicht van de verschillende membraangebonden PRRs met hun cellulaire lokalisatie, liganden, immuunrespons en doelwit pathogenen. PRRs Cellulaire lokalisatie Liganden Immuunrespons Pathogenen Referenties TLRs TLR1 Cel oppervlak Triacylglyceride Pro-inflammatoire cytokines G+-bacteriën, fungi (Kumar et al, 2013) TLR2 Cel oppervlak Peptidoglycanen, Pro-inflammatoire cytokines G+-bacteriën, fungi (Kumar et al, 2013) (Kuzemtseva et al, 2014) lypoteichoïnezuur TLR3 Endosoom ssRNA, dsRNA Type-1 IFN RNA virussen TLR4 Cel oppervlak LPS, mannaan Pro-inflammatoire cytokines, Type-1 IFN G -bacteriën (Kumar et al, 2013) TLR5 Cel oppervlak Flagelline Pro-inflammatoire cytokines Geflaggeleerde bacteriën (Kumar et al, 2013) TLR6 Cel oppervlak Diacylglyceride, lipoteichoïnezuur Pro-inflammatoire cytokines G+-bacteriën, fungi (Kumar et al, 2013) TLR7 Endolysosoom ssRNA Type-1 IFN Endosomale bacteriën, virussen (Kumar et al, 2013; - Kuzemtseva et al, 2014) TLR8 Endolysosoom ssRNA Pro-inflammatoire cytokines RNA virussen (Kuzemtseva et al, 2014) TLR9 Endolysosoom Ongemethyleerd CpG DNA Type-1 IFN Endosomale bacteriën, virussen (Kumar et al, 2013; Kuzemtseva et al, 2014) TLR10 Cel oppervlak Onbekend Pro-inflammatoire cytokines Influenza virus (Lee et al, 2014) Dectin-1 Cel oppervlak β-glucanen Pro-inflammatoire cytokines, Th1 + Th17 ondersteuning Fungi (Saijo & Iwakura, 2011) Dectin-2 Cel oppervlak Mannose Pro-inflammatoire cytokines, Th1 + Th17 ondersteuning Fungi (Saijo & Iwakura, 2011) Mincle Cel oppervlak Mannose, glycolipiden Pro-inflammatoire cytokines, Th1 + Th17 ondersteuning Fungi, mycobacterium (Wevers et al, 2014) MR Cel oppervlak Mannose Cytokine productie, T-cell costimulatie en differentiatie Fungi (Hardison & Brown, 2012) DC-SIGN Cel oppervlak Mannose, LPS Cytokine productie, T-cell costimulatie en differentiatie Fungi (Hardison & Brown, 2012) CLRs 14 Tabel 1: vervolg PRRs Cellulaire lokalisatie Liganden Immuunrespons Pathogenen Referenties NLRs CIITA Cytoplasma Onbekend Reguleert MHCII antigen presentatie Onbekend (Lupfer & Kanneganti, 2013) NAIPs Cytoplasma Flagelline Secretie IL-1β en IL-18, pyroptose bacteriën (Kumar et al, 2013; Lupfer & Kanneganti, 2013) NOD1 Cytoplasma (NLRC1) NOD2 Peptidoglycanen, muramyl Pro-inflammatoire cytokines, Type-1 IFN bacteriën (Kumar et al, 2013) Pro-inflammatoire cytokines, Type-1 IFN bacteriën (Kumar et al, 2013) dipeptide(MDP) Cytoplasma (NLRC2) Peptidoglycanen, muramyl dipeptide(MDP) NLRC3 Cytoplasma Onbekend Verzwakken van TLR signalisatie Onbekend (Zhang et al, 2014) NLRC4 Cytoplasma flagelline Secretie IL-1β en IL-18, pyroptose Bacteriën (Kumar et al, 2013) NLRC5 Cytoplasma Onbekend Reguleerd MHCI antigen presentatie Onbekend (Neerincx et al, 2013) NLRX1 Cytoplasma Viraal RNA Verzwakken van TLR signalisatie RNA virussen (Jaworska et al, 2014) NLRP1 Cytoplamsa “lethal factor” van B.anthracis Secretie IL-1β en IL-18, pyroptose B.anthracis, T.gondii (Ewald et al, 2014; Kumar et al, 2013) NLRP2- Cytoplasma Variable, vaak onbekend Secretie IL-1β en IL-18, pyroptose, Verzwakken Variabel, vaak onbekend (Kumar et al, 2013) 9,11-14 NLRP10 van TLR signalisatie Cytoplasma Onbekend Inflammasoom, IL-1β onafhankelijk C.albicans, fungi (Damm et al, 2013) RIG-1 Cytoplasma dsRNA Pro-inflammatoire cytokines, Type-1 IFN RNA virussen (Szabo & Rajnavolgyi, 2013) MDA5 Cytoplasma dsRNA Pro-inflammatoire cytokines, Type-1 IFN RNA virussen (Szabo & Rajnavolgyi, 2013) LGP2 Cytoplasma dsRNA Activeren/inhiberen van RIG-1 en MDA5 RNA virussen (Szabo & Rajnavolgyi, 2013) RLRs 15 Micro-organismen bevatten verschillende MAMPs, waardoor ook verschillende PRRs simultaan geactiveerd kunnen worden tijdens een infectie. Hierdoor is het aangeboren immuunsysteem in staat om op een gepaste manier te reageren op verschillende pathogenen (Figuur 1). Bij binding van een ligand op een PRR worden signaalcascades geactiveerd via signalisatie met TIR of TRIF. Deze signaalcascaden resulteren finaal in de nucleaire translocatie van pro-inflammatoire transcriptiefactoren zoals NFκB of IRF3/7, met productie van respectievelijk inflammatoire cytokines en type I interferonen tot gevolg (Kumar et al, 2011). Figuur 1: Herkenning van H. pylori door aangeboren immuunsysteem. (Salama et al, 2013) 1.2.1. β-glucanen Een belangrijke MAMP voor de herkenning van gisten, fungi en bacteriën door cellen van het aangeboren immuunsysteem zijn β-glucanen. β-glucanen zijn polysachariden van D-glucose monomeren, aan elkaar gelinkt via 1,3 β-glycoside bindingen. Het is een zeer heterogene groep, die sterk kan verschillen in oplosbaarheid, primaire structuur, moleculair gewicht, vertakkingen en lading (Soltanian et al, 2009). Het meest voorkomende β-glucaan is cellulose, een essentiële component van de celwand in planten. Ook de celwanden van gisten, zoals S. cerevisiae, fungi, algen en sommige bacteriën bevatten een substantiële hoeveelheid βglucanen (Zekovic et al, 2005). Bij gisten kan de celwand zelfs tot 90% uit polysachariden bestaan. De β-glucanen staan bekend om hun vermogen om het immuunsysteem te moduleren (Mahla et al, 2013). Kleine verschillen in β-glucaan verbindingen en chemische structuur, zoals de frequentie, locatie en lengte van de zijketens kunnen grote verschillen in oplosbaarheid, werkingsmechanisme en biologische activiteit teweegbrengen (Vetvicka et al, 2008). Afhankelijk van hun structuur, kunnen β-glucanen worden onderverdeeld in 3 verschillende groepen, met verschillende eigenschappen: De oplosbare, gelvormige en partikel-vormende β-glucanen. Hoe lager de polymerisatiegraad, hoe hoger de oplosbaarheid (Zekovic et al, 2005). Ook vertakkingen kunnen een gunstig effect hebben op 16 de oplosbaarheid (Ishibashi et al, 2002). Oplosbare β-glucanen blijken bovendien sterkere immuun-stimulatoren te zijn dan niet-oplosbare (Guo et al, 2009). Voor (1,3) β-glucanen is aangetoond dat ze een sterk immuun-stimulerend effect hebben in een groot aantal soorten, zoals aardwormen (Beschin et al, 1998), konijnen (Kennedy et al, 1995), varkens (Stuyven et al, 2009) en mensen (Kougias et al, 2001). Omdat dit immuun-stimulerend effect actief is over het gehele evolutionaire spectrum, wordt herkenning van β-glucanen door het aangeboren immuunsysteem gezien als een evolutionair geconserveerde respons tegen schimmels (Soltanian et al, 2009). Enkele β-glucanen zijn onder andere scleroglucan, afkomstig van de schimmel S. glucanicum, macrogard en zymosan, afkomstig van de gist S. cerevisiae, curdlan, afkomstig van de bacterie A. faecalis en paramylon, afkomstig van de alg E. gracilis. Beta-glucanen worden herkend door PRRs, zoals Dectin-1 en Complement Receptor 3 (CR3). Dectin-1 is een CLR, geëxpresseerd op macrofagen, neutrofielen en dendritische cellen. Bij macrofagen leidt herkenning van β-glucanen via de dectin-1 pathway tot de stimulatie van fagocytose en de productie van inflammatoire cytokines (Brown, 2006). Bij neutrofielen en monocyten resulteert β-glucaan herkenning in de productie van reactieve zuurstofradicalen (Rubin-Bejerano et al, 2007; Sonck et al, 2010). CR3 is opgebouwd uit CD18 en CD11R1 en is een onderdeel van het complement systeem. Expressie van deze receptoren is afhankelijk van de soort en het celtype. Zo is bij de muis dectin-1 belangrijk voor de herkenning van β-glucanen. Bij de mens is dan weer CR3 betrokken bij β-glucaan herkenning door neutrofielen, terwijl macrofagen zowel gebruik maken van dectin-1 als CR3 (van Bruggen et al, 2009). Bij het varken is dectin-1 reeds waargenomen (Sonck et al, 2009), terwijl voor CR3 beide oppervlakte merkers reeds aangetoond zijn op neutrofielen, macrofagen en andere immuuncellen (Nochi et al, 2006). Dectin-1 wordt momenteel beschouwd als de belangrijkste β-glucaan receptor. Ook voor TLR2 en TLR6 is reeds een belangrijke rol aangetoond in de herkenning van β-glucanen (Batbayar et al, 2011). Bovendien kunnen dectin-1 en TLR2/6 op een synergistische manier met elkaar samenwerken om de immuunrespons tegen een pathogeen te versterken (Mukhopadhyay et al, 2004). Het immuun-stimulerend effect van deze β-glucanen wordt veroorzaakt door een mechanisme dat men getrainde immuniteit noemt. 1.3. Getrainde immuniteit Het aangeboren immuunsysteem word conventioneel gezien als een relatief simpel systeem dat het organisme moet verdedigen tegen binnendringende pathogenen. Het maakt hierbij gebruik van zowel chemische, biochemische als mechanische barrières. Het aangeboren immuunsysteem beschermt niet specifiek tegen een bepaalde pathogeen, maar eerder tegen een volledige groep van pathogenen, zoals bacteriën, virussen of fungi. Er wordt geen immunologisch geheugen opgebouwd zoals bij de adaptieve immuunrespons en bijgevolg kan het ook geen specifieke bescherming geven tegen organismen die voordien reeds zijn gedetecteerd. In mensen en andere vertebraten wordt langdurige bescherming tegen herinfectie geleverd door het adaptieve immuunsysteem, waarbij klonaal geëxpandeerde populaties van antigeen-specifieke lymfocyten instaan voor het immunologisch geheugen (Amsen et al, 2013). De laatste jaren is echter gebleken dat de grens tussen het adaptief en het aangeboren immuunsysteem niet zo duidelijk is als eerst werd aangenomen. Studies in planten, invertebrata en vertebraten hebben de scheidingslijn tussen aangeboren en adaptief doen 17 vervagen door de ontdekking van een aantal immuun mechanismen die zowel aangeboren als adaptieve kenmerken bevatten (Netea, 2013). De term “trained immunity” of getrainde immuniteit werd hierbij geïntroduceerd. We kunnen getrainde immuniteit omschrijven als een verhoogde weerstand van het aangeboren immuunsysteem tegen secundaire infecties na inductie door een primaire infectie. Dit gebeurt op een T- en B-cel onafhankelijke manier. Hoewel deze verhoogde weerstand minder specifiek is dan het adaptief immuunsysteem, is deze wel in staat om kruisbescherming te geven tegen andere pathogenen (Netea et al, 2011). Het principe van getrainde immuniteit is reeds in vele soorten waargenomen. Zowel zoogdieren, planten, vissen, insecten, en zelfs micro-organismen hebben aspecifieke verdedigingsmechanismen ontwikkeld om zich beter te beschermen tegen pathogenen. Hieronder volgt een kort overzicht van de verschillende mechanismen die zijn gevonden op de verschillende evolutionaire niveaus. Samen kunnen ze ons een beter inzicht geven in de werking van getrainde immuniteit bij zoogdieren en meer specifiek in het varken. 1.3.1. Systemic Aquired Resistance (SAR) in planten Planten beschermen zichzelf tegen pathogenen via een combinatie van aangeboren en geïnduceerde weerstand mechanismen. Aangeboren weerstand baseert zich op mechanismen die reeds aanwezig zijn vooraleer de plant wordt geïnfecteerd door een pathogeen. Geïnduceerde of verkregen weerstand mechanismen worden pas zichtbaar na infectie door een pathogeen. Het plant immuunsysteem wordt onderverdeeld in twee grote groepen: MAMP-triggered immunity (MTI) en effector-triggered immunity (ETI). MTI staat in voor de basis weerstand, terwijl ETI eerder in een duurzamere weerstand resulteert. Planten bezitten ook nog een bijkomstig immuunsysteem, genaamd systemisch verkregen weerstand of SAR (Muthamilarasan & Prasad, 2013). SAR is een beschermingssysteem dat al lang gekend is bij planten. Het is analoog aan het aangeboren immuunsysteem in dieren en er zijn bewijzen dat deze twee systemen evolutionair geconserveerd zijn (Durrant & Dong, 2004). Detectie van microbiële infecties door plant PRRs activeren een immunologische respons, waarbij de weerstand tegen een specifieke pathogeen verspreid wordt doorheen de volledige plant, vertrekkend vanuit de plaats van infectie. De weerstand die door SAR wordt geïnduceerd kan bescherming bieden tegen een brede waaier aan pathogenen (Durrant & Dong, 2004). Zo zal het inenten van planten met een verzwakt micro-organisme bescherming bieden tegen zowel bacteriën, virussen en fungi. Enkele belangrijke mechanismen over de werking van SAR zijn in de laatste decennia geïdentificeerd. Zo wordt SAR onder andere geassocieerd met de activatie van een groot aantal pathogeengerelateerde genen. Deze genen staan in voor de productie van pathogeen-gerelateerde eiwitten, die zorgen voor de bescherming van de plant tegen de pathogeen. Endogeen salicylzuur (SA) speelt hierin een belangrijke rol. Het pathogeen geïnduceerde SA-signaal activeert een moleculaire signaaltransductieweg, die leidt tot de productie van deze pathogeen-gerelateerde eiwitten (Fu & Dong, 2013). Ook epigenetische veranderingen zouden aan de basis liggen van SAR. Zo wordt SAR in A.thaliana geassocieerd met H3K9 acetylatie van salicyl-responsieve promotors en een algemene DNA hypomethylatie, wat leidt tot een verhoogde transcriptie van pathogeen geassocieerde genen (van den Burg & Takken, 2009). Bovendien zou deze verhoogde immuniteit kunnen worden doorgegeven 18 over verschillende generaties, wat ook een epigenetische mechanisme suggereert (Slaughter et al, 2012). 1.3.2. Invertebrata Niet enkel in planten zijn mechanismen waargenomen die de aangeboren weerstand kunnen versterken. Omdat adaptieve immuniteit zoals wij die kennen, beperkt is tot de vertebraten, kunnen invertebrata enkel via aangeboren immuun mechanismen reageren op een infectie. Ze hebben geen functionele equivalenten van B- en T-cellen ontwikkeld tijdens hun evolutie. Dit betekent echter niet dat invertebrata geen immunologisch geheugen bezitten. Er zijn steeds meer studies die aantonen dat invertebrata een verhoogde weerstand kunnen vertonen tegen secundaire infecties indien er een eerdere ontmoeting is geweest met een pathogeen (Kurtz, 2005). Twee belangrijke mechanismen worden voorgesteld voor deze versterkte aangeboren immuunrespons. Als eerste zijn er meerdere mechanismen die een kwantitatieve versterking van de aangeboren immuunrespons kunnen veroorzaken tijdens een herinfectie. Zo worden de Toll en lmd-pathways bij Drosophila opgereguleerd na een infectie met Streptococcus pneumoniae. Bij een tweede infectie met een dodelijke dosis van S. pneumoniae wordt een versterkte immuunrespons waargenomen, resulterend in een betere bescherming tegen de pathogeen. Deze bescherming blijft gedurende het volledige leven van de fruitvlieg aanwezig (Pham et al, 2007). Ook kwantitatieve en fenotypische veranderingen in immuun cel populaties kunnen resulteren in een versterkte immuunrespons. Zo heeft onderzoek bij de mug A. gambiae aangetoond dat een eerdere infectie met Plasmodium kan resulteren in een verhoogde hoeveelheid aan granulocyten die circuleren in de hemocoel. Dit leidt tot een verlaagde overlevingskans van plasmodium tijdens een herinfectie (Rodrigues et al, 2010). Onderzoek bij de meeltor T. molitor heeft aangetoond dat ook een versterking van cellulaire mechanismen, zoals fagocytose, kan leiden tot een verhoogde immuunrespons. Hierbij vertoonden larven van de meeltor, die vooraf werden gestimuleerd met LPS, een verhoogde bescherming tegen de fungus M. Anisopliae (Moret & Siva-Jothy, 2003). Ook de expressie van specifieke receptoren, zoals peptidoglycaan herkenningsmoleculen en lectine receptoren kunnen worden opgereguleerd na een eerste infectie (Steiner, 2004). Deze mechanismen zijn duidelijk verschillend van de adaptieve immuunrespons bij vertebraten. Ze geven eerder een aspecifieke bescherming tegen herinfectie door een verhoogde respons te induceren van het aangeboren immuunsysteem. Als tweede mechanisme voor een versterkte immuunrespons bij invertebrata worden meer specifieke beschermingsmechanismen voorgesteld. Specifiek geheugen in het adaptieve immuunsysteem maakt gebruik van somatische diversificatie. Ook hiervan zijn meerdere mechanismen ontwikkeld gedurende de evolutie. Het klassieke voorbeeld bij de vertebraten zijn de recombinatie-geassocieerde genen (recombination-associated genes; RAGs). Deze staan in voor de somatische herschikking van immunoglobulines en T-cel receptoren tijdens V-D-J-recombinatie (Tsai & Lieber, 2010). Bij invertebrata treden RAG-onafhankelijke herschikkingen, zoals sterk diverse leucine-rijke herhalingen (LRR). Deze worden voorgesteld als een nieuw type van variabele lymfocyt receptor (VLR) bij kaakloze vertebraten, zoals de prik (hyperoartia) of slijmprik (Myxini) (Pancer et al, 2004). Somatische diversificatie hoeft echter niet samen te hangen met herschikkingen. Zo zijn er tal van diversiteit genererende 19 mechanismen aangetoond bij invertebrata die geen gebruik maken van herschikkingen. Eén van deze mechanismen die de aangeboren immuunrespons kan versterken is de hoge mate van diversificatie op genomisch niveau van fibrinogeen-gerelateerde eiwitten (FREPs) in weekdieren, zoals B. Glabrata (Zhang & Loker, 2004). Een ander mechanisme zijn de scavenger receptor cysteïne-rijke (SRCS) eiwitten in stekelhuidigen, zoals A. pectinifera (Du Pasquier, 2005; Furukawa et al, 2012). Ook in insecten, zoals D. melanogaster en A. gambiae kan alternatieve splicing van het immunoglobuline (Ig) domein-coderende gen, Down syndroom cel adhesie molecule (Dscam), een duizenden, sterk diverse potentiële splice varianten produceren. Deze leveren bijkomende mechanismen voor diversiteitsgeneratie, die kunnen leiden tot de specifieke herkenning van en bescherming tegen bacteriën en parasieten (Watson et al, 2005). Voorgaande mechanismen zijn belangrijk om de diversiteitsgeneratie bij invertebrata te kunnen begrijpen. Ze laten de inductie van een anticiperende immuunrespons toe. Deze observaties in organismen die geen adaptieve immuunrespons bezitten spreken de algemene zienswijze dat het aangeboren immuunsysteem zich niet kan aanpassen tegen. 1.3.3. Vertebraten Ook bij vertebraten zijn aanwijzingen gevonden voor een verhoogde weerstand van het aangeboren immuunsysteem na een initiële infectie. Zo is reeds lang bekend dat kinderen, gevaccineerd met het Bacille Calmette-Guérin (BCG) vaccin, een veel lagere sterftegraad vertonen in vergelijking met kinderen die niet werden gevaccineerd. BCG is een vaccin dat bescherming biedt tegen tuberculose. De meeste sterfgevallen worden hierbij vermeden in de eerste levensjaren van het kind, terwijl tuberculose net slachtoffers maakt op latere leeftijd (Garly et al, 2003). Dit doet vermoeden dat het BCG vaccin meer doet dan enkel tegen tuberculose beschermen. Het lijkt ook een niet-specifieke immuniteit te veroorzaken tegen andere ziekten. In verdere studies is gebleken dat BCG een verlaging in sterftegraad met meer dan 40% kan veroorzaken bij pasgeboren kinderen, door ademhalingsinfecties en bloedvergiftigingen te voorkomen (Aaby et al, 2011). Ook bij eerdere studies met muizen, gevaccineerd met BCG, werd een versterkte immuniteit waargenomen nadat deze werden geïnfecteerd met C. albicans (van 't Wout et al, 1992). Een ander voorbeeld van getrainde immuniteit bij vertebraten werd verkregen bij infectie van muizen met een verzwakte C. albicans stam. Bij herinfectie met een meer virulente stam vertoonden de muizen bescherming tegen deze stam, maar ook tegen de bacterie S. aureus. Dit toonde de aanwezigheid van een aspecifieke bescherming aan (Bistoni et al, 1986). Belangrijker in dit onderzoek was het feit dat deze bescherming ook kon worden geïnduceerd bij athymische muizen, wat aantoonde dat de bescherming op een T-cel onafhankelijke manier verliep (Bistoni et al, 1986). Bijkomend onderzoek toonde bovendien aan dat de bescherming tegen herinfectie afhankelijk was van macrofagen en proinflammatoire cytokine productie, zoals TNFα en IL-1 (Vecchiarelli et al, 1989). Deze experimenten toonden duidelijk aan dat het aangeboren immuunsysteem een rol speelt in deze bescherming en daarenboven dat er ook adaptieve kenmerken van kracht zijn. 20 Bij studies van mazelen (Aaby et al, 1995) en pokken (vaccinia)(Mayr, 2004) vaccinatie zag men ook een voordelig effect dat niet gerelateerd kon zijn aan een specifieke bescherming tegen de ziekte zelf. Ook hier werd een verlaagde sterftegraad waargenomen bij gevaccineerde kinderen tegenover ongevaccineerde kinderen. Dit kan enkel verklaard worden indien het vaccin een niet-specifieke bescherming geeft tegen ziekten die voornamelijk in de eerste jaren na geboorte voorkomen. In tegenstelling tot de voordelige effecten van voorgaande vaccins waren er bij vaccinaties met het kroep-kinkhoest-tetanus (Diphtheria-Pertussis-tetanus; DPT) vaccin net meer sterftegevallen bij gevaccineerde kinderen in vergelijking met ongevaccineerde kinderen (Aaby et al, 2012). Dit nadelig effect kan mogelijk verklaard worden door heterologe immuniteit, gemedieerd door kruisreactiviteit van T-cellen. Hierbij kan een bepaald antigeen, afkomstig van het vaccin, op een T-cel afhankelijke manier een kruisreactie induceren met andere pathogenen. Dit effect kan, afhankelijk van de T-cel receptor specificiteit, zowel een voordelig als een nadelig effect hebben (Welsh & Selin, 2002). Getrainde immuniteit kan ook een belangrijke rol vervullen bij pasgeborenen. De eerste dagen na geboorte vormen een periode van extreme stimulatie voor het relatief naïeve immuunsysteem door blootstelling en kolonisatie met tal van bacteriën. Omdat het adaptieve immuunsysteem nog niet op punt staat in de eerste dagen tot weken na geboorte, zijn pasgeborenen erg afhankelijk van het aangeboren immuunsysteem. De immuuncellen van het aangeboren immuunsysteem vormen tijdens deze periode de belangrijkste verdediging. De reactie van het aangeboren immuunsysteem stimuleert bovendien het adaptieve immuunsysteem en draagt bij aan de ontwikkeling van de klassieke immuun geheugen respons (Levy & Wynn, 2014). Uit onderzoek is gebleken dat het aangeboren immuunsysteem bij pasgeborenen kan onderscheiden worden van dit op latere leeftijd (Strunk et al, 2011). Zo zijn er belangrijke leeftijdsafhankelijke verschillen waargenomen in de TLR-gemedieerde cytokine productie (Kollmann et al, 2012). Hoewel de expressie en distributie van TLRs in monocyten van pasgeborenen gelijkaardig zijn aan volwassen monocyten, zijn de functionele gevolgen van deze TLR activering wel verschillend. Zo vertonen pasgeborenen een verhoogde productie van IL-6 en IL-23, verantwoordelijk voor Th-17 differentiatie. De productie van pro-inflammatoire cytokines zoals TNF-α, IFN-γ, IL-1β en IL-12 zijn dan weer lager. Dit draagt waarschijnlijk bij aan de verhoogde vatbaarheid voor onder andere het herpes simplex virus (HSV), L. monocytogenes en groep B streptococcen in de eerste weken na geboorte (Kollmann et al, 2012). Deze verlaagde pro-inflammatoire cytokine productie is deels te wijten aan een verlaagde productie van intracellulaire mediatoren betrokken in TLR signalisatie, zoals MyD88, IRF5 en p38 (Sadeghi et al, 2007). Dit kan belangrijk zijn om het risico op een overmatige pro-inflammatoire immuunrespons te vermijden tijdens de eerste kolonisatie van de huid en het darmkanaal. Deze immuun tolerantie kan ook belangrijk zijn om de kans op foetale afstoting van de moeder te verminderen (Kollmann et al, 2012). Bij onderzoek met pasgeboren muizen, blootgesteld aan lage dosissen van TLR liganden, zoals LPS (TLR4) of imidazoquinoline R-848 (TLR7/8) werd ook een versterkte aangeboren immuunrespons waargenomen. Hier zag men een significant overlevingsvoordeel van de voorbehandelde muizen ten opzichte van muizen die een zoutoplossing toegediend kregen na stimulatie met poly microbiële sepsis (Wynn et al, 2008). TLR-gemedieerde immuun priming induceerde hierbij verschillende versterkingen in immuun 21 functie, zoals een verhoogde cytokine productie, ROS productie, neutrofiel fagocytose en een verbeterde verwijdering van bacteriën. 1.3.4. Training, priming en immuun tolerantie Om training van het aangeboren immuunsysteem goed te kunnen begrijpen is het belangrijk om een onderscheid te maken tussen training en priming van immuuncellen. Priming is een bekend fenomeen, waarbij aangeboren immuuncellen worden gestimuleerd, leidend tot een verhoogde immuunrespons. Wanneer de infectie overwonnen is zal deze verhoogde immuunrespons terug dalen naar zijn basis niveau (Heremans et al, 1990; Steele et al, 2011). Bij training krijgen we echter een functionele herprogrammering van de aangeboren immuuncellen, waarbij deze op een hoger responsniveau blijven staan. Bij een volgende infectie zullen deze getrainde immuuncellen hierdoor een sterkere immuunrespons vertonen in verhouding met niet-getrainde immuuncellen (Netea et al, 2011). Immuun tolerantie daarentegen is het tegenovergestelde van priming. Hierbij wordt tijdens een infectie het immuunsysteem net onderdrukt in plaats van versterkt (Figuur 2). Zo kan de binding van LPS aan TLR4 in monocyten de immuunrespons inhiberen. Hierbij is de dosis van LPS, waaraan de monocyten worden blootgesteld, bepalend of de cellen tolerant dan wel geprimed worden (Nahid et al, 2011). Epigenetische mechanismen zouden hierbij centraal staan (Foster et al, 2007). Ook bij macrofagen is de inductie van training of tolerantie afhankelijk van de concentratie van het ligand (Baker et al, 2014). In het volgende hoofdstuk zullen deze mechanismen uitgebreid worden besproken. Figuur 2: Aangeboren immuunrespons na priming van immuun cellen (Netea, 2013) 1.3.5. Moleculaire mechanismen voor getrainde immuniteit Er zijn reeds tal van mechanismen gevonden die verantwoordelijk zijn voor de aspecifieke bescherming van het aangeboren immuunsysteem bij vertebraten. Uit onderzoek is gebleken dat monocyten, die worden gestimuleerd met een MAMP, een functionele herprogrammering kunnen ondergaan. Hierbij kan zowel een verhoogde als verlaagde cytokine respons worden waargenomen, afhankelijk van het type ligand en de gebruikte concentratie. De functionele herprogrammering van de monocyten gaat ook gepaard met een grotere celvorm, verhoogde granulariteit en opregulatie van cel oppervlakte merkers, zoals CD14, CD68 en DC-SIGN (Ifrim et al, 2014). Microbiële liganden 22 zoals β(1,3)-glucanen en muramyl dipeptide (MDP) induceren getrainde immuniteit via respectievelijk dectin-1 en NOD-2 (Kleinnijenhuis et al, 2012; Quintin et al, 2012). LPS induceert dan weer tolerantie via TLR4 (Fan & Cook, 2004). Niet enkel het ligand zelf, maar ook de concentratie speelt een belangrijke rol in de inductie van getrainde immuniteit. Lagere concentraties vertonen vaak een sterkere capaciteit om monocyten te trainen, terwijl hogere concentraties dan weer vlugger tot tolerantie leiden. Bijkomend onderzoek heeft ook aangetoond dat getrainde immuniteit afhankelijk is van zowel de MAP kinase-afhankelijke signaalcascades als van histon methylaties en acetylaties. Inductie van getrainde immuniteit door β-glucanen, MDP en flagelline is bovendien afhankelijk van de niet-canonieke Raf1, p38 en JNK signaalcascades (Ifrim et al, 2014). Een verhoogde of verzwakte immuunrespons kan dus afhankelijk zijn van een verschillende activatie van PRRs. In muizen, deficiënt voor zowel T als B cellen, werd aangetoond dat bescherming tegen herinfectie met C. albicans op een monocyt-afhankelijke manier gebeurt en dat β-glucanen in de celwand van C. albicans verantwoordelijk zijn voor de functionele herprogrammering van deze monocyten na de initiële infectie (Quintin et al, 2012). Tijdens herinfectie werd een verhoogde secretie aan de inflammatoire cytokines TNFα, IL-1β en IL-6 waargenomen in vergelijking met controle cellen. De β-glucaan receptor dectin-1 en de niet-canonieke raf-1 signaal transductieweg spelen een belangrijke rol in de inductie van getrainde immuniteit (Ifrim et al, 2013). Bovendien zijn er sterke correlaties gevonden tussen de β-glucaan afhankelijke functionele herprogrammering van monocyten en histon trimethylaties op H3K4, wat alweer een link met epigenetische mechanismen voorstelt (Quintin et al, 2012). Om deze epigenetische mechanismen beter te kunnen begrijpen, zal eerst een korte inleiding in de epigenetica worden gegeven. Epigenetische mechanismen kunnen omkeerbare erfelijke veranderingen introduceren in de activiteit van genen zonder hierbij de DNA sequentie zelf te veranderen. Er zijn tal van mechanismen die hiervoor kunnen instaan, maar de meest voorkomende zijn DNA methylaties en histon modificaties, zoals acetylaties, methylaties, fosforylaties, ubiquitinaties of sumoylaties bevatten. Heel wat enzymen spelen een rol in deze epigenetische modificaties, zoals DNA methyltransferasen, histon acetyl transferasen, histon deacetylases, histon methyltransferasen en fosfatasen (Suarez-Alvarez et al, 2013). DNA methylaties gebeuren voornamelijk op CpG motieven, waarbij cytosine geconverteerd wordt naar 5-methylcytosine. Hypergemethyleerde regio’s in het genoom zijn transcriptioneel minder actief, terwijl hypogemethyleerde regio’s net meer actief zijn. Histonen zijn eiwitten, die het DNA samenpakken en groeperen in nucleosomen. Deze nucleosomen vormen herhalingseenheden, die samen het chromatine vormen. Afhankelijk van de structuur van het chromatine spreken we over hetero- of euchromatine. Heterochromatine is dichter opeengepakt en wordt geassocieerd met geïnactiveerde genen omdat het DNA moeilijk toegankelijk is voor de transcriptie machinerie. Bij euchromatine zit het histon-DNA complex daarentegen losser verpakt, waardoor het beter toegankelijk is voor transcriptiefactoren. Histon modificaties kunnen, afhankelijk van de plaats en het type van de modificatie, zowel een activerend als inhiberend effect hebben op de transcriptionele activiteit van genen. Bovendien kunnen verschillende histon modificaties ook een synergistisch effect hebben op elkaar. Histonen ondergaan deze modificatie meestal op lysine-residuen in de N-terminale histon staarten. De meest voorkomende activerende modificaties zijn methylaties op H3K4, H3K9 en H3K27 en acetylaties op H3K9 en H3K27. Trimethylaties op H3K9 en H3K27 zijn dan weer inactiverend (Figuur 3). 23 Figuur 3: Epigenetische histon modificaties (© Oryzon Genomics) Zoals eerder vermeld staan epigenetische mechanismen onder andere centraal bij de ontwikkeling van LPS geïnduceerde tolerantie in monocyten (Foster et al, 2007). LPS kan hierbij epigenetische modificaties induceren op een cel-type en stimulus-specifieke wijze. Zogenaamde verborgen enhancers spelen hierin een belangrijke rol (Ostuni et al, 2013). Enhancers zijn regio’s op het DNA waarop transcriptiefactoren kunnen binden voor inductie van de transcriptie machinerie. Verborgen enhancers zijn aanwezig bij terminaal gedifferentieerde cellen, zoals macrofagen of neutrofielen. Ze blijven ongebonden door transcriptiefactoren, omdat ze de histon merkers ontbreken die normaal aanwezig zijn op gewone enhancers. Ze verkrijgen deze merkers echter wel in respons op stimulatie, waarna de transcriptiefactoren kunnen binden. Vele van deze verborgen enhancers zullen na stimulatie niet terugkeren naar hun oorspronkelijke staat, waardoor ze bij een volgende stimulatie veel vlugger en sterker kunnen reageren. Dit epigenetische mechanisme geeft het organisme dus een geheugen van de blootstelling aan de omgeving (Ostuni et al, 2013). Bij niet-gestimuleerde monocyten zien we een verlaagde cytokine productie, waarbij zowel histon acetylatie als methylatie merkers afwezig zijn bij immuunrespons genen. Wanneer deze cellen geactiveerd worden door contact met een ligand, vindt er zowel histon acetylatie als methylatie plaats, resulterend in een verhoogde transcriptie van de immuunrespons genen. Een getrainde cel zal na stimulatie zijn acetylatie merkers terug verliezen, waardoor het zijn actieve transcriptie verliest. De histon methylatie merkers zullen echter behouden blijven. Hierdoor blijven de promotors van inflammatoire genen gemerkt met histon methylaties (H3K4Me3) op deze verborgen enhancers (Ostuni et al, 2013). Dit laat een vluggere en sterkere respons toe bij een volgende stimulatie. Dit concept kan instaan voor het aspecifieke geheugen van getrainde immuun cellen. Zo kunnen monocyten getraind met β-(1,3)glucanen afkomstig van C. albicans niet enkel een versterkte respons vertonen bij herstimulatie met C. albicans, maar ook bij herstimulatie met andere pathogenen zoals S. aureus (Bistoni et al, 1986). Uit recent onderzoek is gebleken dat humane monocyten blootgesteld aan BCG een verhoogde productie van IFN-γ en een verhoogde vrijgave van TNFα en IL-1β vertoonden. Deze versterkte functie van circulerende monocyten blijft minstens 3 maanden na vaccinatie 24 aanwezig. Bovendien werd een verhoogde expressie van activatiemerkers, zoals CD11b en TLR4, waargenomen. Dit zou de monocyten beter in staat moeten stellen om infecties te detecteren. Er werd ook aangetoond dat de monocyten functioneel werden herprogrammeerd na inductie met BCG. Zowel het toevoegen van TLR2 en TLR4 specifieke inhibitoren als het gebruik van monocyten van dectin-1 deficiënte individuen had geen invloed op het trainingseffect van BCG op de monocyten. Bij gebruik van monocyten afkomstig van NOD2-deficiente individuen werd daarentegen wel een verschil waargenomen ten opzichte van niet-deficiënte monocyten. Dit geeft een sterk argument dat NOD2 en niet de TLRs (TLR2/4) of CLRs (dectin-1) verantwoordelijk zijn voor de training van monocyten door BCG. Verder bewijs voor deze conclusie kon gevonden worden door experimenten, waarbij het NOD2-specifieke ligand MDP en niet het TLR4 ligand LPS of TLR2 ligand Pam3Cys in staat was om de effecten van BCG vaccinatie na te bootsen. Bovendien konden verhoogde H3K4 trimethylaties worden waargenomen na training met BCG op het niveau van cytokine en TLR4 promotors. Dit toont aan dat histon modificaties, zoals acetylaties en methylaties een belangrijke rol vervullen in de transcriptionele regulatie tijdens inflammatie. Zo was de histon methyltransferase inhibitor MTA in staat om het trainingseffect van BCG te niet te doen (Kleinnijenhuis et al, 2012). Voorgaande studies geven duidelijk de link weer tussen getrainde immuniteit en epigenetica. Epigenetische mechanismen geven het aangeboren immuunsysteem de mogelijkheid om voorgaande infecties te onthouden. Dit is uiteraard verschillend van de geheugenfunctie in het adaptieve immuunsysteem. Terwijl adaptieve immuuncellen een specifiek antigeen kunnen herkennen, is dit bij aangeboren immuun cellen duidelijk niet het geval. Dit aspecifieke geheugen heeft echter wel voordelen tegenover het adaptieve immuun geheugen. Zo kan er een verhoogde weerstand worden opgebouwd tegen pathogenen waaraan het organisme nog niet is blootgesteld. Epigenetische veranderingen kunnen ook worden doorgegeven aan volgende generaties, indien deze plaatsvinden in de kiemcellen. Het zou dus interessant kunnen zijn om uit te zoeken of deze epigenetische veranderingen ook plaatsvinden in andere cellen van het organisme, zoals de voortplantingscellen. Ook bij NK-cellen werden adaptieve immuun kenmerken waargenomen. NK-cellen expresseren een groot repertoire aan activerende en inhiberende receptoren, die de controle tussen zelf-tolerantie en het aanvallen van viraal-geïnfecteerde cellen reguleren. Bij infectie met muis cytomegalovirus (MCMV) wordt het virale eiwit m157, aanwezig op het oppervlak van geïnfecteerde cellen, herkend door de activerende Ly49H receptor op NKcellen. Bij detectie van m157 ondergaan deze NK-cellen een sterke activatie en vermenigvuldiging met verwijdering van de geïnfecteerde cellen tot gevolg. Na infectie zullen een beperkt aantal NK-cellen aanwezig blijven in lymfoïde en niet-lymfoïde organen, zoals de lever, waar ze enkele maanden kunnen overleven. Bij herinfectie met MCMV zullen deze zogenaamde “geheugen” NK-cellen zich klonaal uitbreiden op een antigeen-specifieke wijze. Dit resulteert in degranulatie en vrijlating van cytokines, waarmee een vlugge en beschermende immuunrespons geïnduceerd wordt (Sun et al, 2009). Dit systeem vertoont sterke gelijkenissen met de geheugen T-cellen van het adaptieve immuunsysteem. Deze geheugen NK-cellen blijken zelfs de capaciteit te hebben tot zelf vernieuwing en kunnen tot enkele maanden na infectie nog een secundaire immuunrespons induceren (Sun et al, 2010). De chemokine receptor CXCR6 blijkt ook een belangrijke rol te spelen in de opbouw van deze geheugen NK-cellen in de lever (Paust et al, 2010). 25 Deel 2: Doelstelling Recent onderzoek heeft het huidige model van het immuunsysteem, waarbij het aangeboren immuunsysteem vlug reageert op pathogenen, maar geen geheugen opbouwt, in twijfel getrokken. Bij zowel mens als muizen werd een geheugenfunctie of training aangetoond bij cellen van het aangeboren immuunsysteem, meer specifiek monocyten. Hierbij werd aangetoond dat monocyten na stimulatie met β-glucanen een verhoogde respons vertoonden na een tweede stimulatie. Epigenetische modificaties, meer bepaald trimethylaties van H3K4, liggen aan de basis van deze training van het aangeboren immuunsysteem. Niet enkel β-glucanen maar ook andere PRR liganden zijn in staat om getrainde immuniteit op een concentratie-afhankelijke manier in humane monocyten te induceren. Of training van het aangeboren immuunsysteem ook aanwezig is bij andere diersoorten is voorlopig een raadsel. Bovendien is het nog onduidelijk of training ook aanwezig is bij andere aangeboren immuuncellen, zoals macrofagen en neutrofielen. In deze masterthesis willen we dan ook de aanwezigheid van getrainde immuniteit bij aangeboren immuuncellen, zoals monocyten, macrofagen en neutrofielen van het varken aantonen. Dit doel past perfect in de onderzoeksactiviteiten van het Laboratorium voor Immunologie, dat zich voornamelijk toespitst op de ontwikkeling van nieuwe veterinaire vaccins om enteropathogenen bij varkens, schapen en runderen te bestrijden. Een belangrijk aspect hierbij is de optimalisatie van de experimentele methoden en voornamelijk de isolatie van de verschillende aangeboren immuuncellen uit hetzelfde perifeer bloedstaal. Daarnaast wordt het onderzoek bij neutrofielen belemmerd door hun beperkte levensduur, waardoor deze cellen niet lang in cultuur kunnen worden gehouden. In dit project willen we dit probleem omzeilen door hun levensduur te verlengen door het toevoegen van GM-CSF aan het cultuurmedium. Indien de levensduur van neutrofielen voldoende kan verlengd worden, dan zal de invloed van verschillende reagentia, zoals β-glucanen, MacroGard, LPS, CpG en PMA op de aangeboren immuunrespons van neutrofielen onderzocht worden. Zowel de initiële respons als een potentieel trainingseffect zal worden onderzocht door de productie van reactieve zuurstofradicalen, een handelsmerk van neutrofielen, te bestuderen. Onderzoek heeft aangetoond dat behalve β-glucanen ook andere PRR liganden aangeboren immuuntraining kunnen induceren. Tijdens deze masterthesis zullen verschillende βglucanen gescreend worden op hun capaciteit om getrainde immuniteit bij monocyten van het varken te induceren. Vorig onderzoek heeft aangetoond dat partikelvormige β-glucanen, afkomstig van de gist Saccharomyces cerevisiae en de alg Euglena gracilis, een sterk immuun-stimulerend effect vertonen (Sonck et al, 2010). Optimalisatie van de experimentele methoden, zoals de β-glucaan concentratie en het bepalen van de optimale periode tussen de eerste en tweede stimulatie, zal noodzakelijk zijn. Om de training van de aangeboren immuunrespons bij monocyten na te gaan, zal de secretie van een aantal proinflammatoire cytokines, zoals TNFα, IL-1β en IL-6, geanalyseerd worden. Aangezien histon methylaties cruciaal zijn in de inductie van getrainde immuniteit bij humane monocyten, zal het belang van deze epigenetische modificatie in de inductie van aangeboren immuuntraining door β-glucanen in monocyten van het varken onderzocht worden. De resultaten bekomen in deze masterthesis zouden later gebruikt kunnen worden bij de ontwikkeling van nieuwe veterinaire vaccins. Het toevoegen van moleculen, die een training van het aangeboren immuunsysteem bij het varken opwekken, zou de efficiëntie van klassieke vaccins kunnen versterken. 26 Deel 3: 3.1. Resultaten Getrainde immuniteit in neutrofielen Aangezien tijdens een infectie neutrofielen één van de eerste immuuncellen zijn die gerekruteerd worden naar de plaats van infectie, werd de inductie van getrainde immuniteit eerst onderzocht in neutrofielen. Deze neutrofielen werden uit perifere bloedstalen geïsoleerd met behulp van een Percoll densiteitgradiënt centrifugatie. De zuiverheid van de geïsoleerde neutrofielen werd geanalyseerd met behulp van flow cytometrie (Figuur 4). Hiermee kunnen neutrofielen, perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC’s) en afval op basis van de celgrootte (FSC, forward scatter) en granulariteit (SSC, side scatter) van elkaar onderscheiden worden. Neutrofielen bevatten veel granulen en vertonen bijgevolg een hogere SSC-waarde dan PBMC’s. Een gemiddelde zuiverheid van 94,9% ± 5,6% (n = 4) werd bekomen. De overige cellen waren voornamelijk lymfocyten. Deze zuiverheid was voldoende hoog om verdere experimenten te kunnen uitvoeren. Figuur 4: Zuiverheid van de neutrofiel populatie na isolatie. Flow cytometrie (FACSCanto) werd gebruikt om de verschillende celpopulaties van elkaar te onderscheiden. (A+B) Doublets werden gediscrimineerd op basis van FSC-H/FSC-A en SSC-H/SSC-A dotplots. (C) De side scatter-area (SSC-A) werd uitgezet tegenover de forward scatter-area (FSC-A) om de verschillende cel populaties van elkaar te onderscheiden. Minstens 20000 singlets werden geanalyseerd. De figuren zijn representatief voor 4 onafhankelijke experimenten. Neutrofielen werden geïsoleerd uit bloed van 4 verschillende dieren. 27 3.1.1. GM-CSF verlengt de levensduur van neutrofielen Om het trainingseffect bij neutrofielen te bestuderen, is een relatief lange cultuurperiode nodig. Dit is noodzakelijk om de respons van de cellen na de eerste stimulatie terug te laten dalen naar het basale niveau van de controle cellen. Omdat neutrofielen echter sterk gedifferentieerde cellen zijn met een beperkte levensduur, is het noodzakelijk om hun levensduur te verlengen. Een mogelijke manier bestaat uit de stimulatie van neutrofielen met groeifactoren, zoals granulocyt-macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) (Geering et al, 2013; von Gunten et al, 2009). Vooraleer we het trainingseffect bij neutrofielen zullen nagaan, zal eerst het effect van GM-CSF op de levensduur of viabiliteit van de geïsoleerde neutrofielen bepaald worden. In afwezigheid van GM-CSF werd na een cultuurperiode van 48 h een overlevingspercentage waargenomen van 45,0 ± 1 % en slechts 20,0 % na 4 cultuurdagen (Figuur 5A). Na 5 dagen waren nagenoeg alle neutrofielen gestorven. In aanwezigheid van GM-CSF (200 ng/ml) daarentegen kon het overlevingspercentage van de neutrofielen verhoogd worden tot 61,3 ± 3,5 % na 2 cultuurdagen en tot 37,2 % na 4 cultuurdagen (Figuur 5A). Niettegenstaande het positief effect van GM-CSF op de viabiliteit van de neutrofielen, werd nog steeds een celsterfte van 62,8% waargenomen na een cultuur periode van 4 dagen. Als gevolg hiervan werd in een tweede experiment een tweede dosis GM-CSF (200 ng/ml) toegevoegd 2 dagen na isolatie van de neutrofielen (Figuur 5B). Hierbij werd op dag 5 en 6 na isolatie nog een overlevingspercentage van respectievelijk 50,4 % en 40,5 % waargenomen tegenover een cel sterfte van 96,0 % bij de controle cellen. Deze resultaten geven duidelijk weer dat GM-CSF een gunstig effect heeft op de celviabiliteit van neutrofielen na isolatie uit perifeer bloed. Deze verlenging in levensduur geeft ons de mogelijkheid om het trainingseffect bij neutrofielen te onderzoeken binnen een tijdsspanne van 5 dagen. A B Ctrl 100 Ctrl 100 GM-CSF % levende cellen GM-CSF 80 80 60 60 40 40 20 20 0 0 1 2 3 Dagen na isolatie 4 1 2 3 4 Dagen na isolatie 5 6 Figuur 5: Invloed van GM-CSF op de viabiliteit van neutrofielen. GM-CSF (200 ng/ml) werd toegevoegd op (A) dag 0 of op (B) dag 0 en 2 na isolatie. Bij de controle cellen (Ctrl) werd geen GM-CSF toegevoegd. De celviabiliteit werd bepaald door een kleuring van de dode cellen met propidiumiodide (PI; 0,3 μg/ml). Elke meting werd uitgevoerd in duplicaat. (dag 1 en 2, n ≥ 3; dag 3-6, n ≥ 1, ). 28 3.1.2. ROS-productie door neutrofielen Tijdens een infectie zijn neutrofielen één van de eerste immuuncellen die migreren naar de plaats van infectie om pathogenen te bestrijden. Wanneer neutrofielen aankomen op de plaats van infectie, stellen ze na pathogeen herkenning de inhoud van hun granulen vrij aan de omgeving. Hiertoe behoort onder andere het NADPH oxidase, dat instaat voor de productie van reactieve zuurstofradicalen (reactive oxygen radicals; ROS). Aangezien de productie van deze reactieve zuurstofradicalen gezien wordt als één van de kenmerkende eigenschappen van neutrofielen, zullen we training van neutrofielen via deze ROS-productie nagaan. Aangezien β-glucanen training van het aangeboren immuunsysteem opwekken en βglucanen neutrofielen aanzetten tot ROS productie (Sonck et al, 2010), werd ROS productie door neutrofielen na MacroGard stimulatie bestudeerd. Bovendien werden twee andere PRR liganden, het TLR4 ligand LPS en het TLR9 ligand CpG, geanalyseerd op hun capaciteit om ROS productie door neutrofielen te stimuleren. Als positieve controle werd phorbol 12myristate 13-acetate (PMA) toegevoegd aan de cellen. Zoals aangetoond op figuur 6A leidde stimulatie van neutrofielen met 5 en 50 µg/ml MacroGard, 1 µg/ml CpG en 20 µg/ml PMA tot een significant hogere ROS-productie ten opzichte van de controle cellen. Bij stimulatie met 10 µg/ml LPS en 200 ng/ml PMA kon geen significant verschil worden waargenomen in ROS-productie ten opzichte van de controle cellen (Figuur 6A). Het is mogelijk dat deze reagentia niet in staat zijn om ROS-productie te induceren bij neutrofielen (LPS) of dat ze aan een te hoge (LPS) of te lage (PMA) concentratie zijn toegevoegd. De stimulatie van neutrofielen met 20 µg/ml PMA gaf een relatieve stijging van 127,0 ± 75,5 in ROS-productie, terwijl voor CpG een stijging van 34,9 ± 29,5 waargenomen werd ten opzichte van de controle cellen (Figuur 6B). Bij stimulatie met 5 en 50 µg/ml MacroGard werd een stijging van respectievelijk 3,3 ± 0,5 en 35,5 ± 19,7 waargenomen ten opzichte van de controle cellen. A 20000 * RLU 16000 12000 * * 8000 4000 * 0 ctrl MG5 MG50 LPS CpG PMA0,2 PMA20 29 B 250 Relatieve stijging tov ctrl 200 * 150 100 * * 50 0 * MG5 MG50 LPS CpG PMA0,2 PMA20 Figuur 6: ROS-productie door neutrofielen na stimulatie met verschillende reagentia. Neutrofielen (2,0 x 105) werden gestimuleerd met MacroGard (MG; 5 of 50 µg/ml), LPS (10 µg/ml), CpG (1 µg/ml) of PMA (0,2 of 20 µg/ml). HBSS werd toegevoegd als negatieve controle (Ctrl), terwijl PMA (20 µg/ml) gebruikt werd als positieve controle. De ROS-productie werd bepaald met een luminometer (Luminoskan, Labsystems) en weergegeven als (A) Relative Light Units (RLU) of (B) als verhouding van de RLU-waarden van de gestimuleerde cellen ten opzichte van de controle cellen (n = 3). *, p<0.05. In een tweede experiment werd vervolgens onderzocht als deze reagentia getrainde immuniteit of immuuntraining kunnen induceren. Hiervoor werden de neutrofielen gedurende 24 u een eerste keer gestimuleerd (training), gevolgd door een tweede stimulatie 5 dagen na isolatie. Er werd geen significant verschil in RLU-waarden waargenomen ten opzichte van de controle cellen na een tweede stimulatie met 50 µg/ml MacroGard, 10 µg/ml LPS en 1 µg/ml CpG (Figuur 7A). Enkel een tweede stimulatie van de neutrofielen met 20 µg/ml PMA leidde tot ROS productie (Figuur 7A). Hierbij moet echter opgemerkt worden dat deze RLU-waarden ongeveer 10 keer lager zijn bij de PMA stimulatie van controle neutrofielen op dag 5 in vergelijking met de eerste stimulatie (Figuur 6A; PMA20). Een tweede stimulatie met PMA van controle, LPS- en CpG-gestimuleerde neutrofielen resulteerde in ROS productie, maar er werden geen verschillen waargenomen tussen de verschillende condities (Figuur 7). In tegenstelling met deze resultaten werd er een significante daling in ROS-productie waargenomen bij de PMA-gestimuleerde neutrofielen na een eerste stimulatie met 5 µg/ml MacroGard en 200 ng/ml PMA ten opzichte van de controle cellen (Figuur 7). Deze daling kan verschillende oorzaken hebben. Het is mogelijk dat er een inductie van anergie is opgetreden na de eerste stimulatie met MacroGard of PMA. Hierdoor zijn de neutrofielen mogelijk tolerant geworden tegen deze reagentia. Het is wel verwonderlijk dat we dit effect niet waarnemen na een eerste stimulatie met CpG, omdat hierbij een sterk verhoogde ROS-productie werd waargenomen na de eerste stimulatie. Een andere mogelijke verklaring is een verhoogde celdood na de eerste stimulatie van de neutrofielen met 5 µg/ml MacroGard of 200 ng/ml PMA. 30 RLU 3000 2000 A Training: ctrl MG5 LPS CpG PMA 1000 * 0 Ctrl MG50 LPS CpG * PMA Relatieve stijging van RLU tov ctrl 4000 3,0 2,5 2,0 B Training: MG5 LPS CpG PMA 1,5 1,0 0,5 * * 0,0 PMA 5 Figuur 7: ROS-productie door neutrofielen 5 dagen na stimulatie. Neutrofielen (2,0 x 10 ) werden een eerste keer gestimuleerd (training) met MacroGard (MG5, 5 µg/ml), LPS (10 µg/ml), CpG (1 µg/ml) of PMA (200 ng/ml) opgelost in HBSS. HBSS werd toegevoegd als negatieve controle (Ctrl). Voor de tweede stimulatie werd gebruik gemaakt van MacroGard (MG50, 50 µg/ml), LPS (10 µg/ml), CpG (1 µg/ml) of PMA (20 µg/ml). HBSS werd toegevoegd als negatieve controle (ctrl). ROS-productie werd bepaald met een luminometer en weergegeven als (A) Relative Light Units (RLU) of (B) als de verhouding van de RLU-waarden van de gestimuleerde neutrofielen ten opzichte van de controle cellen. *, p<0.05; n = 3 (PMA training: n = 2; CpG training: n = 1; CpG stimulatie: n = 2). 3.2. Getrainde immuniteit in monocyten De rol van monocyten in training van het aangeboren immuunsysteem is reeds aangetoond bij de mens en de muis (Kleinnijenhuis et al, 2012; Quintin et al, 2012). Om dit effect ook aan te tonen bij het varken, werd eerst de isolatie van monocyten uit perifeer bloed verder op punt gesteld. PMBCs werden tegelijk met neutrofielen geïsoleerd met behulp van Percoll densiteitgradiënt centrifugatie. Na isolatie werd de zuiverheid bepaald met behulp van flow cytometrie op basis van hun granulariteit (SSC) en celgrootte (FSC)(Figuur 8A). Een gemiddelde zuiverheid van 93,3 ± 4,1% werd behaald over verschillende experimenten (n = 4), waarbij eveneens een kleine neutrofiel populatie (< 5%) waargenomen werd. Monocyten werden vervolgens via immunomagnetische selectie aangereikt uit deze celpopulatie. In het varken kunnen monocyten gefenotypeerd worden als CD172a hiCD14hiCD163+ of CD172ahiCD14hiCD163-, terwijl conventionele en plasmacytoïde DCs CD172aloCD14- zijn (Summerfield & McCullough, 2009). Alhoewel neutrofielen in de literatuur als CD14- worden omschreven bij mens en muis, zijn neutrofielen bij het varken CD14 lo (Figuur 8C)(PiriouGuzylack & Salmon, 2008). Niettemin werd beslist om monocyten selectief aan te rijken via immunomagnetische selectie (MACS) op basis van hun CD14 merker expressie. Na opzuivering werd de lymfocyt fractie nagenoeg volledig verwijderd (< 5%), terwijl behalve monocyten eveneens een sterke aanrijking van de neutrofiel populatie werd waargenomen (>10%)(Figuur 9). Vermoedelijk is dit te wijten aan de overmaat α-CD14 monoklonale antilichamen die tijdens MACS aan de cellen toegevoegd werden om zoveel mogelijk monocyten te isoleren. Een verdere optimalisatie van de αCD14 mAb concentratie is aangewezen. 31 Figuur 8: Expressie van de merker CD14 in de verschillende cel populaties na isolatie door middel van Percoll densiteitgradiënt centrifugatie. Cellen werden geselecteerd en doublets werden uitgezonderd. (A) De side scatter-area (SSC-A) werd uitgezet tegenover de forward scatter-area (FSC-A). Monocyten (CD14+ PBMC fractie) zijn weergegeven in rood, CD14lo neutrofielen in donker blauw. (B en C) CD14+ celpopulaties werden geselecteerd op basis van een kleuring met α-CD14 mAb (mIgG2b) en geit α-IgG2b-AF647. Een IgG2b isotype controle werd gebruikt om de aspecifieke binding te controleren. Minstens 20000 singlets werden geanalyseerd. De figuur is representatief voor 4 onafhankelijke experimenten. PBMC’s werden geïsoleerd uit bloed van 4 verschillende dieren. Figuur 9: Zuiverheid van de PBMC populatie na Percoll densiteitgradiënt centrifugatie en CD14 MACS. Cellen werden geselecteerd en doublets werden uitgezonderd zoals hierboven aangegeven. De side scatter-area (SSC-A) werd uitgezet tegenover de forward scatter-area (FSC-A). De populaties werden bekeken na Percoll densiteitgradiënt centrifugatie en CD14 MACS. Minstens 20000 singlets werden geanalyseerd. De figuur is representatief voor 4 onafhankelijke experimenten. PBMC’s werden geïsoleerd uit bloed van 4 verschillende dieren. 32 Om de aanrijking van neutrofielen zo veel mogelijk te beperken, werd een andere densiteitgradiënt op basis van lymphoprep gebruikt om PBMC’s te isoleren uit perifeer bloed. Dit resulteerde in een veel kleinere neutrofiel populatie (<1 %) en dus werden veel minder neutrofielen aangerijkt na immunomagnetische selectie op basis van CD14 expressie. De gemiddelde zuiverheid van de CD14+ monocyt populatie bedroeg 87,1 ± 4,0 % over de verschillende experimenten (n = 9). De neutrofiel contaminatie was hierbij steeds lager dan 10% (Figuur 10). Dit was voldoende om verdere experimenten uit te voeren. De aanrijking van neutrofielen zou vermeden kunnen worden door een lagere concentratie aan α-CD14 antilichamen te gebruiken. De geïsoleerde monocyten werden na aanrijking eerst 24 u in cultuur gehouden om de cellen te laten rusten. Figuur 10: Zuiverheid van de CD14+ celpopulatie na lymphoprep densiteit gradiënt en CD14 MACS. Cellen werden geselecteerd en doublets werden uitgezonderd. De side scatter-area (SSC-A) werd uitgezet tegenover de forward scatter-area (FSC-A). Minstens 20.000 singlets werden geanalyseerd. De figuur is representatief voor 9 onafhankelijke experimenten. PBMC’s werden geïsoleerd uit bloed van 5 verschillende dieren. Om aan te tonen dat β-glucanen getrainde immuniteit kunnen induceren bij monocyten, werd eerst gekeken naar de secretie van het pro-inflammatoire cytokine TNFα na stimulatie met het partikelvormig β-glucaan MacroGard. Dit β-glucaan werd gekozen, omdat zijn immuun-stimulerend effect reeds aangetoond is (Sonck et al, 2010). Monocyten secreteerden significant meer TNFα in het supernatans na stimulatie met 5 of 50 µg/ml MacroGard in vergelijking met de controle cellen (Figuur 11). 5000 * TNFa (pg/ml) 4000 * 3000 2000 1000 0 Ctrl MG5 MG50 Figuur 11: TNFα secretie bij monocyten na stimulatie met MacroGard. Monocyten (5,0 x 105) werden 24 u na isolatie gestimuleerd met cultuurmedium (Ctrl), 5 of 50 µg/ml MacroGard. TNFα concentraties werden 24 u na stimulatie bepaald door middel van ELISA (R&D Systems). *, p < 0,05. (Ctrl, n = 8; MG5, n = 6; MG50, n = 3) 33 Indien we de immuun training bij monocyten willen onderzoeken, is het belangrijk dat de reagentia na 24 uur voldoende verwijderd worden uit de celcultuur om bijkomende stimulatie te vermijden. Hiervoor werden de cellen 1, 4 en 6 dagen na de eerste stimulatie gewassen (Figuur 12). Figuur 12: Experimenteel methode voor immuun training bij monocyten. De geïsoleerde monocyten werden gedurende 24 u gestimuleerd met de verschillende reagentia. Vervolgens werd het cultuurmedium 1, 4 en 6 dagen na de eerste stimulatie vervangen. Een tweede stimulatie met de verschillende reagentia volgde 7 dagen na de oorspronkelijke stimulatie en na 24 u werd het supernatans gecollecteerd . Vervolgens werd de TNFα concentratie bepaald in het cultuurmedium 1, 4 en 6 dagen na stimulatie. Bij een goede washout verwachten we dat de TNFα secretie ten gevolge van de eerste stimulatie afneemt en terug daalt naar een basis niveau. Na de eerste stimulatie daalde de TNFα secretie in het cultuurmedium gedurende de washout fase (Figuur 13). Na stimulatie met 5 µg/ml MacroGard werd een sterke daling van de TNFα secretie waargenomen, die na 4 dagen 50 % en na 8 dagen slechts 5% bedroeg van de TNFα concentratie op dag 1. Indien de monocyten daarentegen gestimuleerd werden met een 10x hogere MacroGard concentratie (50 µg/ml), daalde de TNFα concentratie minder sterk tijdens de washout fase. Na 4 dagen werd er geen daling gedetecteerd ten opzichte van dag 1, terwijl 8 dagen na de oorspronkelijke stimulatie de TNFα concentratie nog steeds de helft bedroeg van die op dag 1 (Figuur 13B). Als partikelvormig β-glucaan is MacroGard blijkbaar moeilijk weg te wassen bij hoge concentratie, aangezien na 4 dagen nog steeds β-glucaan partikels werden waargenomen in het cultuurmedium na stimulatie met 50 µg/ml MacroGard (Figuur 14). Dit was niet het geval na stimulatie met 5 µg/ml MacroGard. Na stimulatie werd hierbij ook een duidelijke verandering in morfologie waargenomen. Uit deze resultaten blijkt dat 50 µg/ml MacroGard een te hoge concentratie is om een goede washout te verkrijgen. De ontwikkeling van een betere was stap is noodzakelijk. hierdoor werd beslist om monocyten te stimuleren met 5 µg/ml MacroGard om immuun training te induceren. TNFa (pg/ml) 6000 5000 Reagentia: Ctrl MG5 MG50 B 4000 3000 2000 1000 0 1 4 6 Dagen na stimulatie 8 Relatieve TNFa expressie tov dag 1 7000 A Reagentia: MG5 MG50 2 1,5 1 0,5 0 4 6 Dagen na stimulatie 8 Figuur 13: TNFα secretie door β-glucaan gestimuleerde monocyten tijdens de washout fase. Monocyten (5,0 5 x 10 ) werden gestimuleerd met MacroGard (MG; 5 of 50µg/ml). Op dag 1, 4, 6 en 8 na stimulatie werd het cultuurmedium gecollecteerd en vervangen. (A) TNFα concentraties werden bepaald door middel van ELISA (R&D Systems) en (B) uitgezet ten opzichte van de stimulatie op dag 1. (Ctrl, n = 8; MG5, n = 6; MG50, n = 3) 34 Figuur 14: MacroGard blijft aanwezig in het cultuurmedium tijdens de washout fase. Monocyten (5,0 x 105) werden gestimuleerd met 50 µg/ml MacroGard. De MacroGard partikels zijn duidelijk zichtbaar zowel 1 dag (A) als 4 dagen (B) na stimulatie. De afbeeldingen werden bewerkt met ImageJ. 3.2.1. Aangeboren immuun training van monocyten met β-glucanen Om enerzijds aangeboren immuun training bij monocyten en anderzijds het trainingseffect van partikelvormige β-glucanen aan te tonen, werden de geïsoleerde CD14+ monocyten gedurende 24 u gestimuleerd met 5 µg/ml MacroGard. Het cultuurmedium werd vervolgens vervangen na 1, 4 en 6 dagen stimulatie om MacroGard te verwijderen. Vervolgens werden de monocyten een tweede keer gestimuleerd met 5 of 50 µg/ml MacroGard gedurende 24 u. Om de immuun training van de monocyten na te gaan, werd de concentratie van het proinflammatoire cytokine TNFα bepaald. Een eerste stimulatie met 5 µg/ml MacroGard (= training) resulteerde in een verhoogde TNFα secretie door monocyten na een tweede stimulatie met 5 of 50 µg/ml MacroGard in vergelijking met niet-gestimuleerde cellen (= geen training) (Figuur 15A en B). Een significante relatieve stijging in TNFα concentratie van 1,90 ± 0,57 werd waargenomen na stimulatie met 5 µg/ml MacroGard in vergelijking met de niet-gestimuleerde cellen (p = 0.0097). Bovendien werd na een tweede stimulatie met 50 µg/ml MacroGard een relatieve stijging in de TNFα concentratie van 3,1 ± 0,8 ten opzichte van de niet-gestimuleerde cellen waargenomen (p = 0.0061) (Figuur 15C). Er werd dus een duidelijk verschil in cytokine secretie waargenomen na β-glucaan stimulatie tussen de controle cellen en de monocyten die vooraf met β-glucanen gestimuleerd werden. Deze data suggereren dat er inderdaad een trainingseffect optreedt in monocyten van het varken na βglucaan herkenning, waardoor deze getrainde monocyten sterker reageren op een tweede stimulatie. 35 A 600 B Gemiddelde TNFa (pg/ml) TNFa (pg/ml) 500 400 300 200 Relatieve stijging TNFa tov ctrl Gemiddelde 4000 3000 2000 100 1000 0 0 Ctrl C 5000 MG5 Ctrl MG5 5 * 4 3 * 2 1 0 MG5 MG50 5 Figuur 15: β-glucanen induceren immuuntraining in monocyten. Monocyten (5,0 x 10 ) werden gestimuleerd met cultuurmedium (Ctrl) of 5 µg/ml MacroGard (MG5) gedurende 24 u. Na de washout fase werden deze cellen opnieuw gestimuleerd met 5 (A) of 50 µg/ml (B) MacroGard. De experimenten werden uitgevoerd op monocyten afkomstig van 3 tot 4 verschillende varkens. *, p < 0.5 ten opzichte van controle. (MG5, n = 4; MG50, n = 3) 3.2.2. Het belang van epigenetische modificaties bij immuun training Recent onderzoek heeft aangetoond dat H3K4 histon trimethylaties een belangrijke rol spelen bij immuun training (Ifrim et al, 2014). Om het belang van deze histon methylaties bij immuun training in monocyten van het varken te bestuderen, werd de histon methylase inhibitor MTA aan de monocyten toegevoegd tijdens de eerste stimulatie. In een eerste stap werd nagegaan als MTA de viabiliteit van de monocyten beïnvloedde. Na 24 u incubatie met MTA daalde het aantal levende monocyten van 94,8% bij de controle groep naar 71,4% in de MTA groep (Figuur 16). Deze daling in celviabiliteit is mogelijk niet het gevolg van MTA zelf, maar eerder van het oplosmiddel, dimethylformamide. Dit experiment werd bovendien slechts eenmaal uitgevoerd en moet zeker nog herhaald worden. % overlevende neutrofielen 100 80 60 40 20 0 Ctrl MTA Figuur 16: Invloed van MTA op de viabiliteit van monocyten. De monocyten werden behandeld met cultuurmedium (Ctrl) of met 1 mM MTA, opgelost in dimethylformamide. Dode cellen werden gekleurd met 0,3 µg/ml PI en geanalyseerd met flow cytometrie (n = 1). 36 Vanwege bovenstaande resultaten werd dimethylformamide toegevoegd aan de controle cellen, indien de cellen behandeld werden met MTA. Inhibitie van histon methylatie met MTA had duidelijk een invloed op het trainingseffect van MacroGard. In afwezigheid van MTA werd opnieuw een trainingseffect van MacroGard waargenomen na stimulatie van de monocyten met 50 µg/ml MacroGard, indien deze vooraf met 5 µg/ml MacroGard gestimuleerd werden (Figuur 17). In aanwezigheid van MTA verdween deze immuun training volledig, aangezien de TNFα secretie van de monocyten na stimulatie met 50 µg/ml MacroGard sterk daalde. Dit resultaat doet vermoeden dat gelijkaardig aan de aangeboren immuun training bij humane monocyten, trimethylaties van H3K4 ook bij het varken een belangrijke rol spelen in de inductie van immuun training door β-glucanen. 1200 Training: Ctrl MG5 TNFa (pg/ml) 1000 800 600 400 200 0 MTA- MTA+ Figuur 17: Effect van MTA op de immuun training van monocyten door MacroGard. De monocyten (5,0 x 105) werden 1 u voor stimulatie behandeld met 1 mM MTA (MTA+) of eenzelfde volume dimethylformamide (MTA-). Vervolgens werden de monocyten een eerste keer gestimuleerd (training) met cultuurmedium (Ctrl) of 5 µg/ml MacroGard (MG5) gedurende 24 u. Na de wash out fase werden deze getrainde monocyten een tweede keer gestimuleerd met 50 µg/ml MacroGard (n = 1). Om de rol van histon methylatie bij immuun training verder aan te tonen, werd vervolgens aanwezigheid van H3K4 histon trimethylaties aangetoond via Western blotting op cellysaten van gestimuleerde monocyten Na stimulatie van de monocyten met 5 µg/ml MacroGard werd een verhoogde H3K4 histon trimethylatie (17 kDa) waargenomen in vergelijking met niet gestimuleerde monocyten. Zoals verwacht werd deze verhoogde H3K4 trimethylatie niet meer waargenomen indien MTA toegevoegd werd 1 u voor stimulatie van de cellen met MacroGard (Figuur 18). Hierbij moet echter wel opgemerkt dat de geladen eiwitconcentratie niet gelijk was voor alle condities, aangezien de intensiteit van de actine detectie (42 kDa) grote verschillen vertoonde. Verder onderzoek is vereist om deze resultaten te bevestigen. Desalniettemin geven deze resultaten opnieuw aan dat H3K4 trimethylaties belangrijk zijn in het induceren van getrainde immuniteit bij monocyten in het varken. 37 5 Figuur 18: Effect van MTA op H3K4 histon trimethylaties. Monocyten (2,0 x 10 ) werden 1 u voor stimulatie behandeld met 1 mM MTA (+MTA) of eenzelfde volume dimethylformamide (-MTA). Vervolgens werden de monocyten gestimuleerd met cultuurmedium (Ctrl) of 5 µg/ml MacroGard (MG5). De cellen werden 24 u na stimulatie gecollecteerd en gelyseerd. Deze cellysaten werden geladen op SDS-PAGE (12%) en getransfereerd op een PVDF membraan met Western blotting. Trimethylaties op H3K4 en actine werden gedetecteerd met respectievelijk α-H3K4 (Abcam) en α-actine antilichamen, gevolgd door α-konijn IgG HRP (Dako). Banden werden gevisualiseerd met ECL prime detectie kit (GE Healthcare) en een Chemidoc MP (Biorad). Magic Marker XP (Life technologies) werd geladen als eiwitladder. De afbeelding werd bewerkt met ImageJ en Paint. 3.2.3. Immuun training van CD14+ monocyten met Euglena gracilis β-glucanen Uit de bovenstaande resultaten blijkt dat β-glucanen afkomstig van de gist S. cerevisiae immuun training induceren in monocyten van het varken. In humane monocyten werd deze immuuntraining aangetoond met β-glucanen afkomstig van C. albicans. Aangezien βglucanen afhankelijk van de bron een verschillende structuur hebben en deze structurele verschillen de biologische effecten van β-glucanen kunnen beïnvloeden, werd het effect van β-glucanen afkomstig van de alg Euglena gracilis op immuun training van de monocyten eveneens onderzocht. Aangezien E. gracilis (EG) β-glucanen slechts minimale structurele verschillen vertonen met MacroGard, werd een gelijkaardig trainingseffect verwacht. Om het effect van EG β-glucanen op de immuun training van monocyten aan te tonen werden de cellen eerst gestimuleerd met 5 µg/ml EG β-glucanen. Na de washout fase werden deze cellen vervolgens gestimuleerd met 50 µg/ml EG β-glucanen of MacroGard. In vergelijking met de controle cellen wekte de priming met 5 µg/ml EG β-glucanen eveneens een hogere TNFα secretie op na stimulatie van de monocyten met 50 µg/ml EG β-glucanen (Figuur 19A). Alhoewel de respons lager was, werd dit trainingseffect ook waargenomen na stimulatie met MacroGard. In een vervolg experiment werden de monocyten eerst getraind met MacroGard, waarna de TNFα secretie gedetecteerd werd na stimulatie van deze getrainde cellen met MacroGard (5 en 50 µg/ml) of EG β-glucanen (50 µg/ml). Opnieuw werd een dosis-afhankelijk effect waargenomen na stimulatie van MacroGard-getrainde monocyten (Figuur 19B). Bovendien werd deze verhoogde TNFα en dus immuun training ook 38 zichtbaar na stimulatie van de MacroGard-getrainde monocyten met EG β-glucanen. Beide β-glucanen blijken dus in staat te zijn om immuuntraining in monocyten te induceren, alhoewel verder onderzoek vereist is om het verschil in de sterkte van het trainingseffect door beide β-glucanen te bevestigen. TNFa (pg/ml) 2500 B EG50 MG50 2000 1500 1000 500 0 Ctrl 5 Relatieve stijging TNFa tov ctrl A 3000 EG5 * 4 3 * 2 1 0 MG5 MG50 EG50 Figuur 19: Immuuntraining van monocyten door β-glucanen afkomstig van E. gracilis. Monocyten (5,0 x 105) werden een eerste keer gestimuleerd (training) met cultuurmedium (Ctrl) of 5 µg/ml E. gracilis (EG5), waarna deze getrainde cellen na de washout fase gestimuleerd werden met 50 µg/ml E. gracilis (EG50) of 50 µg/ml MacroGard (MG50) (A). Monocyten werden getraind met 5 µg/ml MacroGard (MG5) en vervolgens gestimuleerd met de condities weergegeven op de x-as (B). De experimenten werden uitgevoerd op afzonderlijke varkens. *p < 0,05; MG5, n = 4; MG50, n = 3; EG50, n = 1 39 Deel 4: Discussie Training van het aangeboren immuunsysteem is, zoals eerder beschreven, reeds aangetoond bij de mens en muis (Quintin et al, 2012). Hierbij werd aangetoond dat zowel monocyten, macrofagen als NK-cellen op een aspecifieke manier een verhoogde immuunrespons kunnen vertonen na een tweede stimulatie. Bij humane monocyten werd na priming met β-glucanen, afkomstig van C. albicans, een verhoogde productie van pro-inflammatoire cytokines, zoals TNFα en IL-6, waargenomen na herstimulatie (Quintin et al, 2012). In deze masterthesis werd voor de eerste keer aangetoond dat getrainde immuniteit van het aangeboren immuunsysteem ook aanwezig is bij het varken. De bekomen resultaten tonen duidelijk aan dat partikelvormige β-glucanen, afkomstig van de gist S. cerevisiae (MacroGard) en de alg E. gracilis (EG), getrainde immuniteit kunnen induceren bij monocyten van het varken, aangezien een verhoogde TNFα secretie werd gedetecteerd door β-glucaangestimuleerde cellen in vergelijking met controle cellen na een tweede β-glucaan stimulatie. Aangezien het cytokine secretie patroon van monocyten na activatie niet beperkt is tot één pro-inflammatoir cytokine, zou het in vervolgonderzoek interessant zijn om de invloed van getrainde immuniteit op de secretie van andere pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-6 en IL-1β, door aangeboren immuuncellen te bestuderen. Het is opmerkelijk dat beide partikelvormige β-glucanen een gelijkaardige immuuntraining in monocyten kunnen opwekken. Ondanks hun sterke structurele gelijkenissen, vertonen deze twee β-glucanen toch enkele belangrijke verschillen. Zo is MacroGard opgebouwd uit β-1,3-verbonden glucose eenheden met β-1,6 zijvertakkingen, terwijl EG β-glucanen opgebouwd zijn uit onvertakte β-1,3-verbonden glucose eenheden (Sonck et al, 2010). Deze structuurverschillen kunnen dus aanleiding geven tot een verschillende immuunrespons en bijgevolg een verschillende training van het aangeboren immuunsysteem. EG β-glucanen blijken inderdaad een sterkere immuuntraining te induceren dan MacroGard. Deze resultaten moeten echter bevestigd worden in herhaal experimenten. Bovendien is verder onderzoek noodzakelijk indien we het effect van deze structurele verschillen, zoals het ontbreken van β-1,6 zijvertakkingen, op de inductie van getrainde immuniteit willen ontrafelen. Hiervoor zou de capaciteit van andere β-glucanen met een verschillende structuur, zoals Zymosan of Curdlan, om immuuntraining te induceren kunnen onderzocht worden. Vermoedelijk resulteren deze structurele verschillen tot een andere interactie met β-glucaan receptoren. Eerdere studies hebben reeds aangetoond dat β-glucanen bij de mens herkend worden door dectin-1 en complement receptor 3 (CR3) (Netea et al, 2008). De expressie van deze receptoren is echter afhankelijk van het celtype en het organisme. Bij de mens maken neutrofielen voornamelijk gebruik van CR3, terwijl macrofagen en monocyten zowel CR3 als dectine-1 gebruiken (verbruggen et al, 2009). Recent onderzoek bij monocyten toonde aan dat partikelvormige βglucanen herkend worden door middel van dectin-1 en dat oplosbare β-glucanen eerder door CR3 worden herkend (Bose et al, 2014). Dit geeft duidelijk het belang aan van de βglucaan structuur en de interactie met de β-glucaan receptoren in het induceren van een immuunrespons. Naast dectine-1 en CR3 herkennen ook TLR2 en TLR6 β-glucanen (Batbayar et al, 2011). Verder onderzoek naar de specifieke receptoren die instaan voor herkenning van deze β-glucanen en de biochemische pathways die geactiveerd worden kunnen duidelijkheid scheppen over het exacte moleculaire mechanisme, verantwoordelijk voor de inductie van getrainde immuniteit door β-glucanen bij het varken. 40 Ook de rol van andere PRR liganden, zoals CpG-motieven of LPS, in het induceren van getrainde immuniteit bij het varken kan nog verder worden onderzocht. Bij de mens werd recent aangetoond dat bepaalde PRR liganden afhankelijk van hun concentratie tolerantie of getrainde immuniteit kunnen induceren in monocyten (Ifrim et al 2014). Daarom zou het interessant zijn om in de toekomst de minimale concentratie te bepalen van β-glucanen of andere PRR liganden noodzakelijk voor inductie van getrainde immuniteit. Daarnaast is het ook nog niet geweten hoelang deze getrainde immuniteit kan behouden worden en als de duur van deze periode afhankelijk is van de aard van de stimulus. Ook de rol van epigenetische modificaties, zoals H3K4 methylaties, in het induceren van getrainde immuniteit is reeds aangetoond bij de mens (Quintin et al, 2012). Tijdens inductie van aangeboren immuuncellen zijn zowel histon methylaties als histon acetylaties aanwezig op de promotoren en enhancers van inflammatoire genen, resulterend in hun actieve transcriptie. Een getrainde immuun cel verliest zijn acetylatie merkers bij het wegvallen van de stimulus, wat leidt tot het verlies van zijn actieve transcriptie. De promotoren van bepaalde inflammatoire genen blijven echter wel gemerkt met histon methylaties, die de cel in staat stellen om vlugger en sterker te reageren op een volgende stimulus. De term “latent enhancers” werd voorgesteld voor de eenheden die betrokken zijn in deze getrainde immuniteit (Ostuni et al, 2013). Data uit onze experimenten suggereren dat ook bij het varken een belangrijke rol is weggelegd voor deze histon methylaties in het induceren van getrainde immuniteit bij monocyten. Verder onderzoek en optimalisatie van de experimentele methode zal nog nodig zijn om de rol van H3K4 trimethylaties in de inductie van getrainde immuniteit in monocyten van het varken definitief te bevestigen.. Bovendien zou het zeer interessant zijn om de duur van deze epigenetische modificaties en bijgevolg de getrainde immuniteit na te gaan. Ook immuun tolerantie wordt geassocieerd met epigenetische veranderingen op het niveau van inflammatoire genen (El Gazzar et al, 2010). Verder onderzoek zou de rol hiervan bij het varken nog verder kunnen toelichten. De rol van monocyten en macrofagen in getrainde immuniteit is reeds uitvoerig besproken (Netea, 2013). Over de rol van getrainde immuniteit bij neutrofielen is daarentegen nog niet veel geweten. Neutrofielen zijn sterk gedifferentieerde cellen en onderzoek naar hun functies wordt sterk bemoeilijkt door hun korte levensduur onder homeostatische omstandigheden. Tijdens infectie of inflammatie kan hun levensduur echter sterk verlengd worden (Geering et al, 2013). Zoals verwacht tonen onze data aan dat de levensduur van neutrofielen in vitro verlengd wordt door het toevoegen van de groeifactor GM-CSF. In tegenstelling tot monocyten, macrofagen en NK-cellen zijn er voor neutrofielen voorlopig nog geen aanwijzingen gevonden, waarin een bijdrage wordt gesuggereerd in de geheugenfunctie van het aangeboren immuunsysteem. Neutrofielen zijn één van de eerste immuuncellen die reageren op een infectie. Wanneer ze de plaats van infectie bereiken, dragen ze bij tot de rekrutering en activering van andere immuuncellen. Bovendien produceren ze ook reactieve zuurstofradicalen, resulterend in het afsterven van de pathogeen. Onze data tonen aan dat MacroGard en CpG-motieven in staat zijn om ROSproductie te induceren bij neutrofielen. Bovendien werd voor MacroGard een dosisafhankelijk effect waargenomen, waarbij hogere concentraties een sterkere ROS-productie induceerden. Dit effect van MacroGard op de ROS-productie was reeds aangetoond bij varken neutrofielen (Sonck et al, 2010). Alhoewel TLR9 in het varken reeds beschreven is als de receptor voor CpG-motieven bij PBMC’s (Dar et al, 2008), is er nog niks geweten over de 41 rol van TLR9 in de herkenning van CpG-motieven door neutrofielen. Voor LPS werd geen significante immuunrespons waargenomen. Het is mogelijk dat neutrofielen op zichzelf niet in staat zijn om LPS te herkennen. Bij de mens speelt het TLR4/CD14/MD2 receptor complex een belangrijke rol bij de herkenning van LPS. Neutrofielen worden omschreven als CD14lo, waarbij hun expressie van CD14 tot 10 keer lager kan liggen dan die bij monocyten. Daarnaast bestaan er twee LPS varianten: de S- (Smooth) en R- (Rough) vorm, op verschillende manieren een immuunrespons induceren (Kapp et al, 1987). De R-vorm interageert met TLR4 op een CD14-onafhankelijke manier, terwijl voor de herkenning van het S-LPS CD14 echt noodzakelijk is (Gomes et al, 2010). Dit S-LPS zou hierdoor niet voldoende herkend door geïsoleerde neutrofielen en zou kunnen verklaren waarom LPS geen ROS-productie induceerde bij neutrofielen van het varken. Uit onze resultaten kunnen we echter niet besluiten dat neutrofielen in staat zijn tot immuun training. Ondanks het toevoegen van GM-CSF werd nog steeds een sterke celdood waargenomen van de neutrofielen na 5 cultuur dagen. Verdere optimalisatie van de experimentele methode zal dus nog vereist zijn. We kunnen eventueel de washout periode inkorten of een kortere eerste stimulatie gebruiken. De data gaven ook een opmerkelijk resultaat, waarbij neutrofielen vooraf gestimuleerd met MacroGard of PMA een veel lagere immuunrespons vertoonden na een tweede stimulatie in vergelijking met de andere reagentia. De exacte reden hiervoor is nog niet geweten. Het is mogelijk dat de neutrofielen een verhoogde cel sterfte vertoonden door blootstelling aan deze reagentia. Een andere mogelijkheid is dat er bij deze neutrofielen een inductie van anergie is opgetreden na de eerste stimulatie. Hierdoor zijn de neutrofielen mogelijk tolerant geworden tegen deze reagentia, resulterend in de lagere immuunrespons. Het is wel opmerkelijk dat we dit effect niet waarnamen na stimulatie met CpG, aangezien CpG net als MacroGard en PMA in staat was een verhoogde ROS-productie te induceren na de eerste stimulatie. Verder onderzoek zal nog nodig zijn om dit mechanisme verder te ontrafelen. Hoewel de principes van getrainde immuniteit al een tijdje gekend zijn bij de mens, zijn deze ogenschijnlijk zeer belangrijke ontdekkingen tot dusver grotendeels genegeerd in de ontwikkeling van vaccins. Dit komt omdat ze biologisch onwaarschijnlijk leken als men rekening hield met het oudere model van immuniteit en vaccinaties. Oorspronkelijk lag de focus van vaccins op het adaptieve immuunsysteem, maar door de recente ontdekkingen omtrent immuun training van het aangeboren immuunsysteem, is gebleken dat men ook naar het aangeboren immuunsysteem moeten kijken voor vaccin ontwikkeling. Bevindingen in de laatste jaren hebben aangetoond dat het huidige begrip van vaccins verder genuanceerd moet worden. Vaccins geven veel meer dan enkel een specifieke bescherming tegen de pathogeen van interesse. Een beter inzicht in de rol van aangeboren immuniteit kan belangrijke consequenties hebben voor de ontwikkeling van nieuwe vaccins. Zo kunnen bepaalde reagentia, waarvan geweten is dat ze getrainde immuniteit kunnen induceren, worden toegevoegd aan bestaande vaccins. Dit principe wordt reeds toegepast door het toevoegen van adjuvanten aan vaccins voor de inductie van het adaptieve immuunsysteem (Baldwin et al, 2012). De ontwikkeling van nieuwe vaccins, die gebruik maken van het beschermende effect van getrainde immuniteit bovenop de activatie van het adaptief immuusysteem, biedt interessante vooruitzichten in de bestrijding van tal van infectieziekten. Een bijkomstig voordeel van getrainde immuniteit bestaat uit de mogelijkheid om bescherming te bieden in situaties waar nog geen specifieke vaccins ontwikkeld zijn door de aangeboren immuunrespons te versterken. Het kan ook zeer 42 interessant zijn om na te gaan in hoeverre de huidige vaccins reeds gebruik maken van deze getrainde immuniteit. Onderzoek heeft immers aangetoond dat tal van vaccins, zoals BCG, vaccinia en vaccins tegen mazelen en polio, de niet-specifieke immuunrespons tegen infecties kunnen verhogen (Aaby et al, 2010; Sorup et al, 2011). Deze mechanismen en de betrokken componenten zouden nog verder moeten ontrafeld worden. Het is belangrijk dat de effecten van vaccins op een systematische manier onderzocht worden. Zo hebben epidemiologische studies reeds aangetoond dat de trainingseffecten sterker zijn bij jongere individuen (Levy & Wynn, 2014). Getrainde immuniteit kan noodzakelijk zijn voor de immuun bescherming vlak na geboorte, wanneer het adaptieve immuunsysteem nog niet op punt staat. Het zou dus interessant zijn om getrainde immuniteit uitvoerig te bestuderen bij pasgeborenen. Zo worden bepaalde TLRs opgereguleerd bij monocyten en neutrofielen na de bevalling en is de migratie van neutrofielen verhoogd na blootstelling aan TLR4 liganden (Molloy et al, 2004; Shen et al, 2009). We zouden kunnen onderzoeken of het immuunstimulerende effect van getrainde immuniteit sterker is bij jongere varkens en of dit mechanisme gelijkaardig is aan de mens. Andere zaken die we verder kunnen onderzoeken zijn onder andere de snelheid waarmee het trainingseffect wordt waargenomen en of er ook negatieve effecten zijn verbonden aan getrainde immuniteit, zoals reeds aangetoond in onderzoek naar DPT vaccinatie (Aaby et al, 2012). Momenteel zijn er ook nog geen kinetiek experimenten gedaan, waarbij de beschermingsduur van getrainde immuniteit wordt nagegaan. Indien getrainde immuniteit gedurende een lange periode aanwezig blijft, kan dit belangrijke implicaties hebben op het gebruik van immuun training bij vaccins. Het aantonen van getrainde immuniteit in het varken kan ook belangrijke consequenties hebben voor het varken als modelorganisme. Het varken is niet enkel anatomisch en fysiologisch sterk gelijkaardig aan de mens (Bendixen et al, 2010; Groenen et al, 2012; Mair et al, 2014), ook op immunologisch vlak zijn er sterke gelijkenissen (Dawson et al, 2013). Hierdoor biedt onderzoek naar getrainde immuniteit in het varken de kans om vaccins te onderzoeken die aangeboren immuun training kunnen induceren. Niettegenstaande het belang van knaagdiermodellen in fundamenteel immunologisch onderzoek, kunnen de resultaten bekomen in deze diermodellen vaak niet worden omgezet in klinische applicaties voor de mens wegens te sterke verschillen. 43 Deel 5: 5.1. Materialen en methoden Bloedstalen Bloed werd afgenomen uit de halsader van gezonde varkens (10 tot 30 weken oud, Belgisch Landras, vrouwelijk) op heparine. De dieren werden gehuisvest onder standaard omstandigheden in de isolatie eenheden van het laboratorium voor veterinaire immunologie met water en voedsel ad libitum. Alle proefdier experimenten werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Faculteit Diergeneeskunde. 5.2. Cultuur media Monocyten werden in cultuur gehouden in monocyt medium, bestaande uit Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) met HEPES (25 mM) en hoge glucose (25 mM), zonder natrium pyruvaat en phenolrood (Life Technologies), aangevuld met 100 U/ml penicilline (Life Technologies), 100 µg/ml streptomycine (Life Technologies) en 10% Foetaal Kalf Serum (FCS; Integro). Neutrofielen werden in cultuur gehouden in leukocyt medium, bestaande uit DMEM met HEPES (25 mM), hoge glucose (25 mM) en zonder phenolrood, aangevuld met 1 mM natriumpyruvaat, 1% niet-essentiele amino zuren in minimaal essentieel medium (MEM-NEAA; Life Technologies), 100 U/ml penicilline, 100 µg/ml streptomycine, 100 µg/ml kanamycine , 10 µg/ml gentamycine (Life Technologies) en 10 % FCS. 5.3. Isolatie van PBMC’s en neutrofielen. Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) werden geïsoleerd uit perifeer bloed door middel van densiteitgradiënt centrifugatie (800 g, 18°C, 25’) met lymphoprepTM (1,077 g/ml; Axis-Shield). De interfase werd gecollecteerd en rode bloedcellen werden gedurende 10 minuten gelyseerd op kamertemperatuur door middel van osmotische shock in een ammonium chloride buffer. De PBMC’s werden gewassen in koude PBS-EDTA (1 mM EDTA) en gefiltreerd door een 70 µm celfilter (Falcon®, Corning). Na centrifugatie (350g, 4°C, 10’) werden de PBMC’s geteld met een hemocytometer (Neubauer) en geresuspendeerd in PBSEDTA. Om neutrofielen te isoleren werd perifeer bloed verdund (1:1) met koude Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium met L-glutamine (Life Technologies) en HEPES (Life Technologies) en op ijs gezet. Vervolgens werd het bloed op een discontinue 75% en 68% percoll (GE healthcare Life sciences) gradiënt gebracht. Na centrifugatie (500 g, 4°C, 30’) werden de PBMC’s en neutrofielen apart gecollecteerd en respectievelijk gewassen met koude PBS-EDTA en Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) zonder Ca 2+, Mg2+ en phenolrood (Life Technologies). Rode bloedcellen werden gedurende 10 minuten gelyseerd op kamertemperatuur. De PBMC’s en neutrofielen werden respectievelijk geresuspendeerd in monocyt en leukocyt medium. Om de zuiverheid van de PBMC’s en neutrofielen na te gaan werden 3,0 x 105 cellen geresuspendeerd in koude PBS-EDTA en geanalyseerd met behulp van flow cytometrie (FACSCanto, BD Biosciences). Analyse van de FACS data gebeurde met BD FACSDiva software. 44 5.3.1. Aanrijking van monocyten uit de PBMC fractie Monocyten werden geïsoleerd uit de PBMC’s (Percoll) door middel van plastiek adhesie. Hiervoor werden 5,0 x 106 PBMC’s in 2 ml RPMI + 10% FCS + 1% P/S geplant in een 6-well plaat (Greiner Bio-one). Na 2 u incubatie bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid werd het medium voorzichtig afgenomen en vervangen door 2 ml monocyt medium (37°C) om enkel de adherente cellen te behouden. De adherente cellen werden vervolgens na 24u incubatie gecollecteerd. De zuiverheid van de adherente celfractie werd nagegaan met behulp van flow cytometrie. Monocyten (lymphoprep) werden aangereikt met behulp van immunomagnetische selectie zoals beschreven in Devriendt et al (2010). Maximaal 5,0 x 108 PBMC werden gemerkt met CD14-specifieke monoklonale antilichamen (mIgG1;Mil2) en geit α-muis IgG microparels (MACS® Microbeads; ). De gemerkte PBMC fractie werd vervolgens op een LS kolom (Miltenyi biotec) gebracht en in een Quadro MACS separator geplaatst (Miltenyi biotec). De CD14+ cellen werden vervolgens gecollecteerd en geresuspendeerd in monocyt medium in een concentratie van 5,0 x 105 cellen/ml. 5.3.2. Productie van monocyt-afkomstige macrofagen Om monocyt-afkomstige macrofagen (MDM) te genereren werden 5,0 x 105 CD14+ monocyten in 1 ml monocyte medium in 24-well platen gebracht (Greiner Bio-one). Om monocyten te differentiëren tot macrofagen werd 3 ng/ml M-CSF (R&D systems) toegevoegd aan de cellen. De cellen werden 1 week in cultuur gehouden bij 37C°, 5% CO 2 en 95% luchtvochtigheid, waarbij na 3 dagen nogmaals 3 ng/ml M-CSF werd toegevoegd aan de cellen. 5.4. Flow cytometrie Flow cytometrie (FACSCanto, BD Biosciences) werd gebruikt om de zuiverheid van de geïsoleerde cellen te bepalen. Er werd gebruik gemaakt van de FACSCanto (BD Biosciences). Cellen werden geselecteerd uit alle gedetecteerde events door de hoogte van de forward scatter (FSC) uit te zetten tegenover de FSC oppervlakte. Vervolgens werden de singlets geselecteerd door de hoogte van de side scatter (SSC) uit te zetten tegenover de SSC oppervlakte. Uit deze singlets werden de geïsoleerde cel populaties geselecteerd door de oppervlakte van FSC-A uit te zetten tegenover de SSC-A. Data van minstens 20000 singlets werden opgemeten en geanalyseerd met FACSDiva software. Om levende cellen van dode cellen te onderscheiden, werden de gecollecteerde cellen geresuspendeerd in PBS-EDTA + propidium iodide (PI; 0,3 µg/ml kleuring; Sigma) en overgebracht in een FCM-tube (BD Falcon). De PI-negatieve en PI-positieve cellen werden van elkaar onderscheiden door de fluorescentie te meten van de singlets bij 565 nm. De oppervlakte expressie van CD14 op de geïsoleerde cellen werd bepaald door 1,0 x 106 cellen in 150 µl kleuringsmedium (DMEM met phenolrood + 1% FCS) over te brengen naar een 96-well microplaat (V-bodem, Sigma-aldrich). De cellen werden afgedraaid (400g, 4°C, 3’) en het supernatans werd verwijderd. Vervolgens werden de cellen gemerkt met α-CD14 antilichamen (mIgG2b) in een finaal volume van 50 µl kleuringsmedium en geïncubeerd op 45 ijs gedurende 20 minuten. Een muis IgG2b antilichaam werd toegevoegd als isotype controle om de aspecifieke binding uit te sluiten. Na 2 wasstappen met 200 µl kleuringsmedium werden de cellen gemerkt met geit α-IgG2b-AF647 (Life Technologies) secundaire antilichamen in 50 µl kleuringsmedium en geïncubeerd op ijs gedurende 20 minuten. De gemerkte cellen werden vervolgens gecollecteerd (400g, 4°C, 3’), geresuspendeerd in PBSEDTA + PI en overgebracht in een FCM-tube. De merkerexpressie werd bepaald bij minstens 20000 singlets door de fluorescentiewaarden van PI-negatieve cellen te meten bij 652 nm (APC-A). De FACS data werd geanalyseerd met BD FACSDiva software. 5.5. Monocyt stimulatie Om het effect van verschillende reagentia op de cytokine expressie bij varken monocyten te bestuderen, werden 5,0 x 105 monocyten in monocytmedium (1 ml) in een 24-well plaat (Greiner Bio-one) gebracht. De platen werden 24 u geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid, zodat de monocyten voldoende kunnen adhereren aan de platen. Vervolgens werden de cellen gestimuleerd met 50 µl MacroGard (5-50 µg/ml; Saccharomyces serevisiae, Biotech Pharmacon ASA, Noorwegen), Euglenia gracilis (5 µg/ml; Sigma-Aldrich) of LPS (10 µg/ml; Sigma, E. coli O26:B6). Warm monocytmedium werd toegevoegd als negatieve controle. Na 24 u incubatie bij 37°C, 5% CO 2 en 90% luchtvochtigheid werd het medium gecollecteerd en vervangen met warm monocytmedium. Om de washout van de toegevoegde stimulatoren te controleren, werd het medium na 4 en 6 dagen nogmaals gecollecteerd en vervangen door warm monocytmedium. Na 7 dagen werden de cellen een tweede keer gestimuleerd met 50 µl MacroGard (5-50 µg/ml), E. gracilis (50 µg/ml) of LPS (10µg/ml). Warm monocytmedium werd toegevoegd als negatieve controle. Na 24 u incubatie bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid werd het medium een laatste maal gecollecteerd. De reagentia werden steeds in duplicaat toegevoegd. Het gecollecteerde medium werd telkens gecentrifugeerd (350g, 4°C, 10’), waarna het celvrije supernatans werd overgebracht en bewaard bij -21°C tot de TNFα concentratie bepaald werd met behulp van ELISA. 5.5.1. Histon methylatie assay Om na te gaan of epigenetische veranderingen een rol spelen bij de training van varken monocyten, werd aan 5,0 x 105 CD14+ monocyten de histon methyltransferase inhibitor MTA (1 mM; 5’deoxy-5’methylthio adenosine, Sigma-Aldrich) toegevoegd. De invloed van verschillende concentraties MTA op de celviabiliteit van de monocyten werd 24 u na stimulatie onderzocht met behulp van flow cytometrie. Vervolgens werden de cellen gedurende 24 u geïncubeerd met MacroGard (5 µg/ml) zoals hierboven beschreven in aanwezigheid van 1 mM MTA. De cellen werden na deze incubatie periode gecollecteerd met behulp van trypsine, gewassen in PBS en gelyseerd met lysebuffer (10 % protease inhibitor en 1,43 % NP40 in TNE buffer). Cellysaten (20 μl) werden geladen op een SDS-PAGE (12%) en de eiwitten getransfereerd naar een PVDF membraan met Western blot. Trimethylaties op H3K4 en actine werden respectievelijk gedetecteerd met anti-H3K4 (abcam) en anti-actine antilichamen, gevolgd door anti-konijn IgG HRP (Dako). Banden werden gevisualiseerd met een ECL prime detectie kit (GE Healthcare) en een Chemidoc MP (Biorad). Magic Marker XP (Life technologies) werd geladen als eiwitladder. 46 5.5.2. Cytokine ELISA De concentratie van het pro-inflammatoir cytokine TNFα in het gecollecteerde celvrije supernatans werd bepaald met behulp van een commerciële ELISA kit (R&D Systems, DuoSet Sandwich ELISA) volgens de instructies van de producent (zie bijlagen). De optische densiteit werd gemeten bij 450 nm met behulp van een microplaat lezer (Spectrafluor, Tecan). De data werden geanalyseerd met Deltasoft software (Biometallics). 5.6. Viabiliteitsassay Om na te gaan of GM-CSF de viabiliteit van varken neutrofielen kan verhogen, zoals beschreven door von Gunten et al (2009), werden 2,0 x 105 neutrofielen in leukocyt medium met 200 ng/ml GM-CSF (200 µl; R&D systems) in een 96-well microtiter plaat (Greiner Bioone) gebracht. De neutrofielen werden gedurende 7 dagen in cultuur gehouden bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid. De neutrofielen werden dagelijks gecollecteerd en hun viabiliteit onderzocht door middel van een propidium iodide (PI; 0,3 µg/ml kleuring, Sigma). PI positieve neutrofielen werden geanalyseerd met flow cytometrie zoals hierboven beschreven. 5.7. Productie van reactieve zuurstof species door neutrofielen Om het effect van verschillende reagentia op de ROS productie van neutrofielen te bestuderen, werden 2,0 x 105 neutrofielen in leukocyt medium (200 µl) in een 96-well plaat (Wit; Greiner Bio-One) gebracht. De platen werden gedurende 2 u geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid, zodat de neutrofielen kunnen adhereren aan de plaat. Het supernatans werd verwijderd en 175 µl luminol (Fluca) werd toegevoegd tot een finale concentratie van 0,5 mM. De achtergrond luminescentiewaarden werden gedurende 10 minuten gemeten met een luminometer (Luminoskan, Labsystems). De cellen werden vervolgens gestimuleerd met 25 µl MacroGard (5-50 µg/ml), LPS (10 µg/ml), CpG (1 µg/ml) of PMA (0,2-20 µg/ml; phorbol 12-myristate 13-acetate, Enzo life sciences). HBSS werd toegevoegd als negatieve controle. De kinetiek van de ROS productie werd gemeten gedurende 2 u in de integratiemodus. De reagentia werden steeds in duplicaat toegevoegd. De ROS-productie werd weergegeven als relatieve licht eenheden (RLU). Om het trainingseffect van de verschillende reagentia op neutrofielen te onderzoeken, werden 2,0 x 105 neutrofielen in leukocyt medium + GM-CSF (100 µl) in een 96-well plaat gebracht. Vervolgens werden deze cellen gestimuleerd met 100 µl MacroGard (5 µg/ml), LPS (10 µg/ml), CpG (1 µg/ml), PMA (200 ng/ml) of HBSS (negatieve controle). Na 24 u incubatie bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid werd het medium afgenomen en vervangen door warm leukocyt medium + GM-CSF (200 µl). Na 24 u werd 50 µl leukocyt medium + GM-CSF toegevoegd. Na 72 u werden de neutrofielen opnieuw gestimuleerd met MacroGard (50 µg/ml), LPS (10 µg/ml), CpG (1 µg/ml) en PMA (20 µg/ml). HBSS diende als negatieve controle. De ROS productie werd bepaald zoals hierboven beschreven. 47 5.8. Statistische analyse Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van MS Excell 2010. De experimenten werden minstens 3 keer herhaald op cellen van verschillende varkens. Om het trainingseffect van de verschillende reagentia te bepalen, werden de niet-getrainde cellen vergeleken met getrainde cellen na een tweede stimulatie. Het verschil tussen de verschillende groepen werd geanalyseerd met behulp van een eenzijdige of tweezijdige ttest, uitgaande van gelijke varianties. Resultaten werden als significant gezien, indien pwaarde < 0,05. 48 Referenties Aaby P, Benn C, Nielsen J, Lisse IM, Rodrigues A, Ravn H (2012) Testing the hypothesis that diphtheria-tetanus-pertussis vaccine has negative non-specific and sex-differential effects on child survival in high-mortality countries. BMJ open 2 Aaby P, Martins CL, Garly ML, Bale C, Andersen A, Rodrigues A, Ravn H, Lisse IM, Benn CS, Whittle HC (2010) Non-specific effects of standard measles vaccine at 4.5 and 9 months of age on childhood mortality: randomised controlled trial. Bmj 341: c6495 Aaby P, Roth A, Ravn H, Napirna BM, Rodrigues A, Lisse IM, Stensballe L, Diness BR, Lausch KR, Lund N, Biering-Sorensen S, Whittle H, Benn CS (2011) Randomized trial of BCG vaccination at birth to lowbirth-weight children: beneficial nonspecific effects in the neonatal period? The Journal of infectious diseases 204: 245-252 Aaby P, Samb B, Simondon F, Seck AM, Knudsen K, Whittle H (1995) Non-specific beneficial effect of measles immunisation: analysis of mortality studies from developing countries. Bmj 311: 481-485 Amsen D, Backer RA, Helbig C (2013) Decisions on the road to memory. Advances in experimental medicine and biology 785: 107-120 Baker B, Maitra U, Geng S, Li L (2014) Molecular and cellular mechanisms responsible for cellular stress and low-grade inflammation induced by super-low dose endotoxin. The Journal of biological chemistry Baldwin SL, Bertholet S, Reese VA, Ching LK, Reed SG, Coler RN (2012) The importance of adjuvant formulation in the development of a tuberculosis vaccine. Journal of immunology 188: 2189-2197 Batbayar S, Kim MJ, Kim HW (2011) Medicinal mushroom Lingzhi or Reishi, Ganoderma lucidum (W.Curt.:Fr.) P. Karst., beta-glucan induces Toll-like receptors and fails to induce inflammatory cytokines in NF-kappaB inhibitor-treated macrophages. International journal of medicinal mushrooms 13: 213-225 Bendixen E, Danielsen M, Larsen K, Bendixen C (2010) Advances in porcine genomics and proteomics-a toolbox for developing the pig as a model organism for molecular biomedical research. Briefings in functional genomics 9: 208-219 Beschin A, Bilej M, Hanssens F, Raymakers J, Van Dyck E, Revets H, Brys L, Gomez J, De Baetselier P, Timmermans M (1998) Identification and cloning of a glucan- and lipopolysaccharide-binding protein from Eisenia foetida earthworm involved in the activation of prophenoloxidase cascade. The Journal of biological chemistry 273: 24948-24954 Bikard D, Marraffini LA (2012) Innate and adaptive immunity in bacteria: mechanisms of programmed genetic variation to fight bacteriophages. Current opinion in immunology 24: 15-20 Bistoni F, Vecchiarelli A, Cenci E, Puccetti P, Marconi P, Cassone A (1986) Evidence for macrophagemediated protection against lethal Candida albicans infection. Infection and immunity 51: 668-674 Borrego F, Kabat J, Kim DK, Lieto L, Maasho K, Pena J, Solana R, Coligan JE (2002) Structure and function of major histocompatibility complex (MHC) class I specific receptors expressed on human natural killer (NK) cells. Molecular immunology 38: 637-660 Bose N, Wurst LR, Chan AS, Dudney CM, LeRoux ML, Danielson ME, Will PM, Nodland SE, Patchen ML, Dalle Lucca JJ, Lebeda FJ, Vasilakos JP (2014) Differential regulation of oxidative burst by distinct 49 beta-glucan-binding receptors and signaling pathways in human peripheral blood mononuclear cells. Glycobiology 24: 379-391 Brea D, Meurens F, Dubois AV, Gaillard J, Chevaleyre C, Jourdan ML, Winter N, Arbeille B, Si-Tahar M, Gauthier F, Attucci S (2012) The pig as a model for investigating the role of neutrophil serine proteases in human inflammatory lung diseases. The Biochemical journal 447: 363-370 Brown GD (2006) Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nature reviews Immunology 6: 33-43 Brunner J, Prelog M, Riedl M, Giner T, Hofer J, Wurzner R, Zimmerhackl LB (2012) Analysis of the classical, alternative, and mannose binding lectin pathway of the complement system in the pathogenesis of oligoarticular juvenile idiopathic arthritis. Rheumatology international 32: 1815-1818 Cruvinel Wde M, Mesquita D, Jr., Araujo JA, Catelan TT, de Souza AW, da Silva NP, Andrade LE (2010) Immune system - part I. Fundamentals of innate immunity with emphasis on molecular and cellular mechanisms of inflammatory response. Revista brasileira de reumatologia 50: 434-461 Damm A, Lautz K, Kufer TA (2013) Roles of NLRP10 in innate and adaptive immunity. Microbes and infection / Institut Pasteur 15: 516-523 Danilova N (2012) The evolution of adaptive immunity. Advances in experimental medicine and biology 738: 218-235 Dar A, Nichani AK, Benjamin P, Lai K, Soita H, Krieg AM, Potter A, Babiuk LA, Mutwiri GK (2008) Attenuated cytokine responses in porcine lymph node cells stimulated with CpG DNA are associated with low frequency of IFNalpha-producing cells and TLR9 mRNA expression. Veterinary immunology and immunopathology 123: 324-336 Dawson HD, Loveland JE, Pascal G, Gilbert JG, Uenishi H, Mann KM, Sang Y, Zhang J, Carvalho-Silva D, Hunt T, Hardy M, Hu Z, Zhao SH, Anselmo A, Shinkai H, Chen C, Badaoui B, Berman D, Amid C, Kay M, Lloyd D, Snow C, Morozumi T, Cheng RP, Bystrom M, Kapetanovic R, Schwartz JC, Kataria R, Astley M, Fritz E, Steward C, Thomas M, Wilming L, Toki D, Archibald AL, Bed'Hom B, Beraldi D, Huang TH, AitAli T, Blecha F, Botti S, Freeman TC, Giuffra E, Hume DA, Lunney JK, Murtaugh MP, Reecy JM, Harrow JL, Rogel-Gaillard C, Tuggle CK (2013) Structural and functional annotation of the porcine immunome. BMC genomics 14: 332 Degn SE, Thiel S (2013) Humoral pattern recognition and the complement system. Scandinavian journal of immunology 78: 181-193 Devriendt B, Verdonck F, Summerfield A, Goddeeris BM, Cox E (2010) Targeting of Escherichia coli F4 fimbriae to Fcgamma receptors enhances the maturation of porcine dendritic cells. Veterinary immunology and immunopathology 135: 188-198 Du Pasquier L (2005) Meeting the demand for innate and adaptive immunities during evolution. Scandinavian journal of immunology 62 Suppl 1: 39-48 Durrant WE, Dong X (2004) Systemic acquired resistance. Annual review of phytopathology 42: 185209 El Gazzar M, Liu T, Yoza BK, McCall CE (2010) Dynamic and selective nucleosome repositioning during endotoxin tolerance. The Journal of biological chemistry 285: 1259-1271 Ewald SE, Chavarria-Smith J, Boothroyd JC (2014) NLRP1 is an inflammasome sensor for Toxoplasma gondii. Infection and immunity 82: 460-468 50 Fairbairn L, Kapetanovic R, Beraldi D, Sester DP, Tuggle CK, Archibald AL, Hume DA (2013) Comparative analysis of monocyte subsets in the pig. Journal of immunology 190: 6389-6396 Fan H, Cook JA (2004) Molecular mechanisms of endotoxin tolerance. Journal of endotoxin research 10: 71-84 Foster SL, Hargreaves DC, Medzhitov R (2007) Gene-specific control of inflammation by TLR-induced chromatin modifications. Nature 447: 972-978 Fu ZQ, Dong X (2013) Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annual review of plant biology 64: 839-863 Furukawa R, Matsumoto M, Kaneko H (2012) Characterization of a scavenger receptor cysteine-richdomain-containing protein of the starfish, Asterina pectinifera: ApSRCR1 acts as an opsonin in the larval and adult innate immune systems. Developmental and comparative immunology 36: 51-61 Garly ML, Martins CL, Bale C, Balde MA, Hedegaard KL, Gustafson P, Lisse IM, Whittle HC, Aaby P (2003) BCG scar and positive tuberculin reaction associated with reduced child mortality in West Africa. A non-specific beneficial effect of BCG? Vaccine 21: 2782-2790 Gauvreau GM, Ellis AK, Denburg JA (2009) Haemopoietic processes in allergic disease: eosinophil/basophil development. Clinical and experimental allergy : journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology 39: 1297-1306 Geering B, Stoeckle C, Conus S, Simon HU (2013) Living and dying for inflammation: neutrophils, eosinophils, basophils. Trends in immunology 34: 398-409 Geissmann F, Gordon S, Hume DA, Mowat AM, Randolph GJ (2010) Unravelling mononuclear phagocyte heterogeneity. Nature reviews Immunology 10: 453-460 Gomes NE, Brunialti MK, Mendes ME, Freudenberg M, Galanos C, Salomao R (2010) Lipopolysaccharide-induced expression of cell surface receptors and cell activation of neutrophils and monocytes in whole human blood. Brazilian journal of medical and biological research = Revista brasileira de pesquisas medicas e biologicas / Sociedade Brasileira de Biofisica [et al] 43: 853-858 Gordon S, Martinez FO (2010) Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity 32: 593-604 Groenen MA, Archibald AL, Uenishi H, Tuggle CK, Takeuchi Y, Rothschild MF, Rogel-Gaillard C, Park C, Milan D, Megens HJ, Li S, Larkin DM, Kim H, Frantz LA, Caccamo M, Ahn H, Aken BL, Anselmo A, Anthon C, Auvil L, Badaoui B, Beattie CW, Bendixen C, Berman D, Blecha F, Blomberg J, Bolund L, Bosse M, Botti S, Bujie Z, Bystrom M, Capitanu B, Carvalho-Silva D, Chardon P, Chen C, Cheng R, Choi SH, Chow W, Clark RC, Clee C, Crooijmans RP, Dawson HD, Dehais P, De Sapio F, Dibbits B, Drou N, Du ZQ, Eversole K, Fadista J, Fairley S, Faraut T, Faulkner GJ, Fowler KE, Fredholm M, Fritz E, Gilbert JG, Giuffra E, Gorodkin J, Griffin DK, Harrow JL, Hayward A, Howe K, Hu ZL, Humphray SJ, Hunt T, Hornshoj H, Jeon JT, Jern P, Jones M, Jurka J, Kanamori H, Kapetanovic R, Kim J, Kim JH, Kim KW, Kim TH, Larson G, Lee K, Lee KT, Leggett R, Lewin HA, Li Y, Liu W, Loveland JE, Lu Y, Lunney JK, Ma J, Madsen O, Mann K, Matthews L, McLaren S, Morozumi T, Murtaugh MP, Narayan J, Nguyen DT, Ni P, Oh SJ, Onteru S, Panitz F, Park EW, Park HS, Pascal G, Paudel Y, Perez-Enciso M, Ramirez-Gonzalez R, Reecy JM, Rodriguez-Zas S, Rohrer GA, Rund L, Sang Y, Schachtschneider K, Schraiber JG, Schwartz J, Scobie L, Scott C, Searle S, Servin B, Southey BR, Sperber G, Stadler P, Sweedler JV, Tafer H, Thomsen B, Wali R, Wang J, Wang J, White S, Xu X, Yerle M, Zhang G, Zhang J, Zhang J, Zhao S, Rogers J, 51 Churcher C, Schook LB (2012) Analyses of pig genomes provide insight into porcine demography and evolution. Nature 491: 393-398 Guo Z, Hu Y, Wang D, Ma X, Zhao X, Zhao B, Wang J, Liu P (2009) Sulfated modification can enhance the adjuvanticity of lentinan and improve the immune effect of ND vaccine. Vaccine 27: 660-665 Hardison SE, Brown GD (2012) C-type lectin receptors orchestrate antifungal immunity. Nature immunology 13: 817-822 Heremans H, Van Damme J, Dillen C, Dijkmans R, Billiau A (1990) Interferon gamma, a mediator of lethal lipopolysaccharide-induced Shwartzman-like shock reactions in mice. The Journal of experimental medicine 171: 1853-1869 Huang YW, Meng XJ (2009) Identification of a porcine DC-SIGN-related C-type lectin, porcine CLEC4G (LSECtin), and its order of intron removal during splicing: comparative genomic analyses of the cluster of genes CD23/CLEC4G/DC-SIGN among mammalian species. Developmental and comparative immunology 33: 747-760 Hur GY, Sheen SS, Kang YM, Koh DH, Park HJ, Ye YM, Yim HE, Kim KS, Park HS (2008) Histamine release and inflammatory cell infiltration in airway Mucosa in methylene diphenyl diisocyanate (MDI)-induced occupational asthma. Journal of clinical immunology 28: 571-580 Husser L, Alves MP, Ruggli N, Summerfield A (2011) Identification of the role of RIG-I, MDA-5 and TLR3 in sensing RNA viruses in porcine epithelial cells using lentivirus-driven RNA interference. Virus research 159: 9-16 Ifrim DC, Joosten LA, Kullberg BJ, Jacobs L, Jansen T, Williams DL, Gow NA, van der Meer JW, Netea MG, Quintin J (2013) Candida albicans primes TLR cytokine responses through a Dectin-1/Raf-1mediated pathway. Journal of immunology 190: 4129-4135 Ifrim DC, Quintin J, Joosten LA, Jacobs C, Jansen T, Jacobs L, Gow NA, Williams DL, van der Meer JW, Netea MG (2014) Trained immunity or tolerance: opposing functional programs induced in human monocytes after engagement of various pattern recognition receptors. Clinical and vaccine immunology : CVI 21: 534-545 Ishibashi K, Miura NN, Adachi Y, Ogura N, Tamura H, Tanaka S, Ohno N (2002) Relationship between the physical properties of Candida albicans cell well beta-glucan and activation of leukocytes in vitro. International immunopharmacology 2: 1109-1122 Jaillon S, Galdiero MR, Del Prete D, Cassatella MA, Garlanda C, Mantovani A (2013) Neutrophils in innate and adaptive immunity. Seminars in immunopathology 35: 377-394 Jaworska J, Coulombe F, Downey J, Tzelepis F, Shalaby K, Tattoli I, Berube J, Rousseau S, Martin JG, Girardin SE, McCullers JA, Divangahi M (2014) NLRX1 prevents mitochondrial induced apoptosis and enhances macrophage antiviral immunity by interacting with influenza virus PB1-F2 protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Kapp A, Freudenberg M, Galanos C (1987) Induction of human granulocyte chemiluminescence by bacterial lipopolysaccharides. Infection and immunity 55: 758-761 Kennedy MT, Bates PJ, Wheatley CL, Rohrbach MS (1995) Discrete pathways for arachidonic acid release from tannin versus beta-glucan-stimulated rabbit alveolar macrophages. Journal of leukocyte biology 58: 241-248 52 Kleinnijenhuis J, Quintin J, Preijers F, Joosten LA, Ifrim DC, Saeed S, Jacobs C, van Loenhout J, de Jong D, Stunnenberg HG, Xavier RJ, van der Meer JW, van Crevel R, Netea MG (2012) Bacille CalmetteGuerin induces NOD2-dependent nonspecific protection from reinfection via epigenetic reprogramming of monocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109: 17537-17542 Kollmann TR, Levy O, Montgomery RR, Goriely S (2012) Innate immune function by Toll-like receptors: distinct responses in newborns and the elderly. Immunity 37: 771-783 Kougias P, Wei D, Rice PJ, Ensley HE, Kalbfleisch J, Williams DL, Browder IW (2001) Normal human fibroblasts express pattern recognition receptors for fungal (1-->3)-beta-D-glucans. Infection and immunity 69: 3933-3938 Kumar H, Kawai T, Akira S (2011) Pathogen recognition by the innate immune system. International reviews of immunology 30: 16-34 Kumar S, Ingle H, Prasad DV, Kumar H (2013) Recognition of bacterial infection by innate immune sensors. Critical reviews in microbiology 39: 229-246 Kumar V, Sharma A (2010) Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International immunopharmacology 10: 1325-1334 Kurtz J (2005) Specific memory within innate immune systems. Trends in immunology 26: 186-192 Kuzemtseva L, de la Torre E, Martin G, Soldevila F, Ait-Ali T, Mateu E, Darwich L (2014) Regulation of toll-like receptors 3, 7 and 9 in porcine alveolar macrophages by different genotype 1 strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Veterinary immunology and immunopathology 158: 189-198 Le Bel M, Brunet A, Gosselin J (2014) Leukotriene B4, an endogenous stimulator of the innate immune response against pathogens. Journal of innate immunity 6: 159-168 Lee SM, Kok KH, Jaume M, Cheung TK, Yip TF, Lai JC, Guan Y, Webster RG, Jin DY, Peiris JS (2014) Tolllike receptor 10 is involved in induction of innate immune responses to influenza virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111: 3793-3798 Levy O, Wynn JL (2014) A prime time for trained immunity: innate immune memory in newborns and infants. Neonatology 105: 136-141 Locati M, Mantovani A, Sica A (2013) Macrophage activation and polarization as an adaptive component of innate immunity. Advances in immunology 120: 163-184 Lupfer C, Kanneganti TD (2013) Unsolved Mysteries in NLR Biology. Frontiers in immunology 4: 285 Mahla RS, Reddy MC, Prasad DV, Kumar H (2013) Sweeten PAMPs: Role of Sugar Complexed PAMPs in Innate Immunity and Vaccine Biology. Frontiers in immunology 4: 248 Mair KH, Essler SE, Patzl M, Storset AK, Saalmuller A, Gerner W (2012) NKp46 expression discriminates porcine NK cells with different functional properties. European journal of immunology 42: 1261-1271 Mair KH, Sedlak C, Kaser T, Pasternak A, Levast B, Gerner W, Saalmuller A, Summerfield A, Gerdts V, Wilson HL, Meurens F (2014) The porcine innate immune system: An update. Developmental and comparative immunology 45: 321-343 53 Martinez-Pomares L, Gordon S (2012) CD169+ macrophages at the crossroads of antigen presentation. Trends in immunology 33: 66-70 Mayr A (2004) Taking advantage of the positive side-effects of smallpox vaccination. Journal of veterinary medicine B, Infectious diseases and veterinary public health 51: 199-201 Mear JB, Gosset P, Kipnis E, Faure E, Dessein R, Jawhara S, Fradin C, Faure K, Poulain D, Sendid B, Guery B (2014) Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and interleukin-22associated mucosal response. Infection and immunity 82: 306-315 Molloy EJ, O'Neill AJ, Grantham JJ, Sheridan-Pereira M, Fitzpatrick JM, Webb DW, Watson RW (2004) Labor promotes neonatal neutrophil survival and lipopolysaccharide responsiveness. Pediatric research 56: 99-103 Moret Y, Siva-Jothy MT (2003) Adaptive innate immunity? Responsive-mode prophylaxis in the mealworm beetle, Tenebrio molitor. Proceedings Biological sciences / The Royal Society 270: 24752480 Mukhopadhyay S, Herre J, Brown GD, Gordon S (2004) The potential for Toll-like receptors to collaborate with other innate immune receptors. Immunology 112: 521-530 Muthamilarasan M, Prasad M (2013) Plant innate immunity: an updated insight into defense mechanism. Journal of biosciences 38: 433-449 Nahid MA, Satoh M, Chan EK (2011) MicroRNA in TLR signaling and endotoxin tolerance. Cellular & molecular immunology 8: 388-403 Neerincx A, Castro W, Guarda G, Kufer TA (2013) NLRC5, at the Heart of Antigen Presentation. Frontiers in immunology 4: 397 Netea MG (2013) Training innate immunity: the changing concept of immunological memory in innate host defence. European journal of clinical investigation 43: 881-884 Netea MG, Brown GD, Kullberg BJ, Gow NA (2008) An integrated model of the recognition of Candida albicans by the innate immune system. Nature reviews Microbiology 6: 67-78 Netea MG, Quintin J, van der Meer JW (2011) Trained immunity: a memory for innate host defense. Cell host & microbe 9: 355-361 Nochi H, Shinomiya T, Tamoto K (2006) Characterization of hyaluronan-binding proteins on guinea pig polymorphonuclear leukocytes: possible involvement of complement receptor type 3 (CR3, CD11b/CD18) in the hyaluronan-leukocyte interaction. Journal of biochemistry 139: 59-70 Ostuni R, Piccolo V, Barozzi I, Polletti S, Termanini A, Bonifacio S, Curina A, Prosperini E, Ghisletti S, Natoli G (2013) Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells. Cell 152: 157-171 Pancer Z, Amemiya CT, Ehrhardt GR, Ceitlin J, Gartland GL, Cooper MD (2004) Somatic diversification of variable lymphocyte receptors in the agnathan sea lamprey. Nature 430: 174-180 Paust S, Gill HS, Wang BZ, Flynn MP, Moseman EA, Senman B, Szczepanik M, Telenti A, Askenase PW, Compans RW, von Andrian UH (2010) Critical role for the chemokine receptor CXCR6 in NK cellmediated antigen-specific memory of haptens and viruses. Nature immunology 11: 1127-1135 Pham LN, Dionne MS, Shirasu-Hiza M, Schneider DS (2007) A specific primed immune response in Drosophila is dependent on phagocytes. PLoS pathogens 3: e26 54 Piriou-Guzylack L, Salmon H (2008) Membrane markers of the immune cells in swine: an update. Veterinary research 39: 54 Quintin J, Saeed S, Martens JH, Giamarellos-Bourboulis EJ, Ifrim DC, Logie C, Jacobs L, Jansen T, Kullberg BJ, Wijmenga C, Joosten LA, Xavier RJ, van der Meer JW, Stunnenberg HG, Netea MG (2012) Candida albicans infection affords protection against reinfection via functional reprogramming of monocytes. Cell host & microbe 12: 223-232 Rinkevich B (1999) Invertebrates versus vertebrates innate immunity: In the light of evolution. Scandinavian journal of immunology 50: 456-460 Rodrigues J, Brayner FA, Alves LC, Dixit R, Barillas-Mury C (2010) Hemocyte differentiation mediates innate immune memory in Anopheles gambiae mosquitoes. Science 329: 1353-1355 Rubin-Bejerano I, Abeijon C, Magnelli P, Grisafi P, Fink GR (2007) Phagocytosis by human neutrophils is stimulated by a unique fungal cell wall component. Cell host & microbe 2: 55-67 Sadeghi K, Berger A, Langgartner M, Prusa AR, Hayde M, Herkner K, Pollak A, Spittler A, Forster-Waldl E (2007) Immaturity of infection control in preterm and term newborns is associated with impaired toll-like receptor signaling. The Journal of infectious diseases 195: 296-302 Saijo S, Iwakura Y (2011) Dectin-1 and Dectin-2 in innate immunity against fungi. International immunology 23: 467-472 Salama NR, Hartung ML, Muller A (2013) Life in the human stomach: persistence strategies of the bacterial pathogen Helicobacter pylori. Nature reviews Microbiology 11: 385-399 Sang Y, Yang J, Ross CR, Rowland RR, Blecha F (2008) Molecular identification and functional expression of porcine Toll-like receptor (TLR) 3 and TLR7. Veterinary immunology and immunopathology 125: 162-167 Sheahan T, Imanaka N, Marukian S, Dorner M, Liu P, Ploss A, Rice CM (2014) Interferon lambda alleles predict innate antiviral immune responses and hepatitis C virus permissiveness. Cell host & microbe 15: 190-202 Shen CM, Lin SC, Niu DM, Kou YR (2009) Labour increases the surface expression of two Toll-like receptors in the cord blood monocytes of healthy term newborns. Acta paediatrica 98: 959-962 Slaughter A, Daniel X, Flors V, Luna E, Hohn B, Mauch-Mani B (2012) Descendants of primed Arabidopsis plants exhibit resistance to biotic stress. Plant physiology 158: 835-843 Soltanian S, Stuyven E, Cox E, Sorgeloos P, Bossier P (2009) Beta-glucans as immunostimulant in vertebrates and invertebrates. Critical reviews in microbiology 35: 109-138 Sonck E, Stuyven E, Goddeeris B, Cox E (2009) Identification of the porcine C-type lectin dectin-1. Veterinary immunology and immunopathology 130: 131-134 Sonck E, Stuyven E, Goddeeris B, Cox E (2010) The effect of beta-glucans on porcine leukocytes. Veterinary immunology and immunopathology 135: 199-207 Sorup S, Villumsen M, Ravn H, Benn CS, Sorensen TI, Aaby P, Jess T, Roth A (2011) Smallpox vaccination and all-cause infectious disease hospitalization: a Danish register-based cohort study. International journal of epidemiology 40: 955-963 Souza-Fonseca-Guimaraes F, Adib-Conquy M, Cavaillon JM (2012) Natural killer (NK) cells in antibacterial innate immunity: angels or devils? Molecular medicine 18: 270-285 55 Steele L, Errington F, Prestwich R, Ilett E, Harrington K, Pandha H, Coffey M, Selby P, Vile R, Melcher A (2011) Pro-inflammatory cytokine/chemokine production by reovirus treated melanoma cells is PKR/NF-kappaB mediated and supports innate and adaptive anti-tumour immune priming. Molecular cancer 10: 20 Steiner H (2004) Peptidoglycan recognition proteins: on and off switches for innate immunity. Immunological reviews 198: 83-96 Strunk T, Currie A, Richmond P, Simmer K, Burgner D (2011) Innate immunity in human newborn infants: prematurity means more than immaturity. The journal of maternal-fetal & neonatal medicine : the official journal of the European Association of Perinatal Medicine, the Federation of Asia and Oceania Perinatal Societies, the International Society of Perinatal Obstet 24: 25-31 Stuyven E, Cox E, Vancaeneghem S, Arnouts S, Deprez P, Goddeeris BM (2009) Effect of beta-glucans on an ETEC infection in piglets. Veterinary immunology and immunopathology 128: 60-66 Suarez-Alvarez B, Baragano Raneros A, Ortega F, Lopez-Larrea C (2013) Epigenetic modulation of the immune function: a potential target for tolerance. Epigenetics : official journal of the DNA Methylation Society 8: 694-702 Summerfield A, McCullough KC (2009) The porcine dendritic cell family. Developmental and comparative immunology 33: 299-309 Sun JC, Beilke JN, Lanier LL (2009) Adaptive immune features of natural killer cells. Nature 457: 557561 Sun JC, Beilke JN, Lanier LL (2010) Immune memory redefined: characterizing the longevity of natural killer cells. Immunological reviews 236: 83-94 Szabo A, Rajnavolgyi E (2013) Collaboration of Toll-like and RIG-I-like receptors in human dendritic cells: tRIGgering antiviral innate immune responses. American journal of clinical and experimental immunology 2: 195-207 Tait Wojno ED, Artis D (2012) Innate lymphoid cells: balancing immunity, inflammation, and tissue repair in the intestine. Cell host & microbe 12: 445-457 Tohno M, Shimazu T, Aso H, Uehara A, Takada H, Kawasaki A, Fujimoto Y, Fukase K, Saito T, Kitazawa H (2008a) Molecular cloning and functional characterization of porcine nucleotide-binding oligomerization domain-1 (NOD1) recognizing minimum agonists, meso-diaminopimelic acid and meso-lanthionine. Molecular immunology 45: 1807-1817 Tohno M, Ueda W, Azuma Y, Shimazu T, Katoh S, Wang JM, Aso H, Takada H, Kawai Y, Saito T, Kitazawa H (2008b) Molecular cloning and functional characterization of porcine nucleotide-binding oligomerization domain-2 (NOD2). Molecular immunology 45: 194-203 Tsai AG, Lieber MR (2010) Mechanisms of chromosomal rearrangement in the human genome. BMC genomics 11 Suppl 1: S1 van 't Wout JW, Poell R, van Furth R (1992) The role of BCG/PPD-activated macrophages in resistance against systemic candidiasis in mice. Scandinavian journal of immunology 36: 713-719 van Bruggen R, Drewniak A, Jansen M, van Houdt M, Roos D, Chapel H, Verhoeven AJ, Kuijpers TW (2009) Complement receptor 3, not Dectin-1, is the major receptor on human neutrophils for betaglucan-bearing particles. Molecular immunology 47: 575-581 56 van den Burg HA, Takken FL (2009) Does chromatin remodeling mark systemic acquired resistance? Trends in plant science 14: 286-294 Vecchiarelli A, Cenci E, Puliti M, Blasi E, Puccetti P, Cassone A, Bistoni F (1989) Protective immunity induced by low-virulence Candida albicans: cytokine production in the development of the antiinfectious state. Cellular immunology 124: 334-344 Vega-Ramos J, Villadangos JA (2013) Consequences of direct and indirect activation of dendritic cells on antigen presentation: functional implications and clinical considerations. Molecular immunology 55: 175-178 Vetvicka V, Vetvickova J, Frank J, Yvin JC (2008) Enhancing effects of new biological response modifier beta-1,3 glucan sulfate PS3 on immune reactions. Biomedicine & pharmacotherapy = Biomedecine & pharmacotherapie 62: 283-288 von Gunten S, Jakob SM, Geering B, Takala J, Simon HU (2009) Different patterns of Siglec-9mediated neutrophil death responses in septic shock. Shock 32: 386-392 Watson FL, Puttmann-Holgado R, Thomas F, Lamar DL, Hughes M, Kondo M, Rebel VI, Schmucker D (2005) Extensive diversity of Ig-superfamily proteins in the immune system of insects. Science 309: 1874-1878 Welsh RM, Selin LK (2002) No one is naive: the significance of heterologous T-cell immunity. Nature reviews Immunology 2: 417-426 Wevers BA, Kaptein TM, Zijlstra-Willems EM, Theelen B, Boekhout T, Geijtenbeek TB, Gringhuis SI (2014) Fungal engagement of the C-type lectin mincle suppresses dectin-1-induced antifungal immunity. Cell host & microbe 15: 494-505 Wynn JL, Scumpia PO, Winfield RD, Delano MJ, Kelly-Scumpia K, Barker T, Ungaro R, Levy O, Moldawer LL (2008) Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists. Blood 112: 1750-1758 Zekovic DB, Kwiatkowski S, Vrvic MM, Jakovljevic D, Moran CA (2005) Natural and modified (1-->3)beta-D-glucans in health promotion and disease alleviation. Critical reviews in biotechnology 25: 205230 Zhang L, Mo J, Swanson KV, Wen H, Petrucelli A, Gregory SM, Zhang Z, Schneider M, Jiang Y, Fitzgerald KA, Ouyang S, Liu ZJ, Damania B, Shu HB, Duncan JA, Ting JP (2014) NLRC3, a member of the NLR family of proteins, is a negative regulator of innate immune signaling induced by the DNA sensor STING. Immunity 40: 329-341 Zhang SM, Loker ES (2004) Representation of an immune responsive gene family encoding fibrinogen-related proteins in the freshwater mollusc Biomphalaria glabrata, an intermediate host for Schistosoma mansoni. Gene 341: 255-266 57 Bijlagen Protocols Tellen van cellen Voeg 10 μl celsuspensie toe aan 90 μl nigrosine (1/10 verdunning) Voeg 10 μl van deze 1/10 verdunning toe aan 90 μl nigrosine (1/100 verdunning) enzovoort tot de gewenste verdunning bereikt is. Neem 10 μl van de gewenste verdunning (afhankelijk van verwacht aantal cellen) en pipeteer deze in de telkamer (Neubauer). De telkamer bevat 4 kwadranten van telkens 4x4 vierkanten. Tel het totaal aantal cellen in de 4 kwadranten en bepaal hieruit het gemiddeld aantal cellen per kwadrant door dit aantal te delen door 4. Om de concentratie van de cellen te bepalen in 1 ml celsuspensie, gebruiken we volgende formule: a = b * c * d, waarbij: a= aantal cellen per ml celsuspensie; b=gemiddeld aantal cellen per kwadrant; c = verdunningsfactor (bv: bij 1/100 verdunning c = 102); d = 104 = correctiefactor van telkamer Isolatie PBMC’s mbv Lymphoprep Neem bloed af van een varken en voeg heparin (anti-coagulant) toe om bloedstolling te voorkomen. Breng dit bloed (20 ml) vervolgens druppelsgewijs op 15 ml lymphoprep (STEMCELL Technologies) Centrifugeer gedurende 25 minuten bij 800g en 18°C. Collecteer de interfase band in het midden en breng deze in een nieuwe tube. Leng vervolgens verder aan tot 40 ml met koude PBS + 1 mM EDTA (PBS-EDTA). Centrifugeer 10 minuten bij 400g en 4°C. Giet het SN af en resuspendeer de celpellet in 20 ml koude PBS-EDTA. Filtreer de celsuspensie door een 70 μm celfilter (Falcon®, Corning) en was de filter vervolgens met 20 ml koude PBS-EDTA. Centrifugeer 10 minuten bij 400g en 4°C. Giet het supernatans af en resuspendeer de celpellet in 1 ml koude PBS-EDTA. Tel de cellen. Immunomagnetische selectie (MACS) Neem 5,0 x 108 PBMC’s Label de cellen met 15 μl muis α-CD172a (mIgG1, 74-12-15) of 100 μl anti-CD14 hybridoma supernatans per 108 cellen Incubeer 20 minuten op ijs. Was de cellen vervolgens met 5 ml koude PBS-EDTA om de ongebonden primaire antilichamen te verwijderen. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 350g en 4°C. Neem het supernatans weg en hersuspendeer de cellen in de restbuffer. Voeg vervolgens 40 μl geit α-muis IgG microparels (Miltenyi) per 108 cellen toe. Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten op ijs. 58 Plaats ondertussen een voorgekoelde LS kolom (Miltenyi) in het magnetische veld en bereidt de kolom voor door deze te wassen met 3 ml koude MACSbuffer( PBS/EDTA/1%FCS). Voeg 5 ml van deze MACS-buffer toe aan de celsuspensie en breng deze celsuspensie ml per ml over de kolom. Probeer hierbij luchtbellen te voorkomen. Was de kolom 3 keer met 3 ml MACS-buffer. Verwijder de LS kolom van het magnetische veld en zet deze op een vooraf gekoelde opvangbuis. Voeg 5 ml MACS-buffer toe aan de kolom. Flush vervolgens de magnetisch gelabelde cellen, door de stamper op de kolom aan te sluiten en door te duwen. Tel het aantal CD172a+ of CD14+ cellen. Centrifugeer gedurende 10min bij 400g en 4°C. Breng de cellen aan een concentratie van 5,0 x 10 5 cellen /ml in monocyt medium Stimulatie van monocyten Breng 5,0 x 105 monocyten in 1 ml over naar een 24-well plaat. Incubeer de cellen bij 37°C, 5% CO2 e 90% luchtvochtighied gedurende 24 u. Stimuleer de monocyten vervolgens met 50 µl reagentia aan een gepaste concentratie. Incubeer de cellen vervolgens gedurende 24 u bij 37°C, 5% CO2. Collecteer het cultuurmedium en voeg 1 ml nieuw monocyt-medium (37°C) toe. Centrifugeer het afgenomen medium 10 min bij 400g, 4°C. Collecteer het SN en bewaar dit bij -21°C om later een ELISA op uit te voeren. Herhaal deze stappen op dag 4 en 6. Voeg op dag 7 opnieuw de reagentia toe. Incubeer de cellen 24 u bij 37°C, 5% CO2. Collecteer het SN, centrifigeer 10 min bij 400g en 4°C en bewaar bij -21°C voor latere ELISA. Isolatie van PBMCs en neutrofielen mbv percoll Neem bloed af van een varken en voeg heparin (anti-coagulant) toe om bloedstolling te voorkomen. Voeg 10 ml ijskoude RPMI-1640 toe aan 10 ml bloed Breng 10 ml 75% Percoll in een 50 ml buis op ijs. Voeg hier druppelsgewijs 10 ml 68% Percoll aan toe, zodat er 2 lagen ontstaan. Voeg vervolgens 20 ml van het verdunde bloed druppelsgewijs op de Percoll gradient. Centrifugeer 30’ bij 500g en 4°C. Collecteer de PBMC’s in de tussenlaag. Let hierbij op dat je niet onder de PBMC laag gaat met je pipet tip. Collecteer vervolgens voorzichtig de neutrofielen in de laag eronder. Leng de PBMC fractie en neutrofielen aan tot 40 ml met respectievelijk PBS-EDTA (4°C) en HBSS (4°C). Centrifugeer 10’, 350g, 4°C 59 Verwijder het SN en resuspendeer in 10 ml (PBMC) en 15 ml (neutrofielen) lysebuffer (op kamertemperatuur) Incubeer 10’ op KT Neutraliseer vervolgens de lysebuffer door 20 ml (PBMC) en 15 ml (neutrofielen) PBSEDTA (4°C) toe te voegen. Centrifugeer 10’, 350g, 4°C en verwijder het SN. Hersuspendeer de cellen in 1 ml koude PBS-EDTA (PBMC) of HBSS (neutrofielen). Tel de cellen en bewaar op ijs. Nagaan van de zuiverheid van PBMC’sen neutrofielen mbv flow cytometrie Breng 3,0 x 105 cellen in 300 µl PBS-EDTA in een FM-buis. Verdun hiervoor je celsuspensie met Analyseer de celpopulaties met de FACSCanto. Selecteer de singlets op FSC-H/FSC-A en vervolgens op SSC-H/SSC-A dotplots. Selecteer vervolgens de cellen op een FSC-A/SSC-A dotplot. Neem minimum 20000 events. Effect van GM-CSF op de viabiliteit van neutrofielen Breng 2,0 x 105 neutrofielen in een 96-well microtiter plaat in 200 µl leukocyt medium (1% Na-Pyruvaat, 1% Niet-Essentiele AminoZuren (MEM-NEAA), 1% P/S, 1% Kanamycine, 0,1% Gentamycine, 10% FCS, 25mM HEPES in DMEM). Voeg 200 ng/ml GM-CSF of medium. Incubeer bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid. Collecteer dagelijks neutrofielen (met/zonder GM-CSF) en breng deze over in een 1,5 ml epje. Centrifugeer (10’, 400G, 4°C), verwijder het SN en resuspendeer in 200 µl koude PBS. Voeg 100 µl PBS + 0,3 µg/ml propidium iodide (PI) toe om de dode cellen aan te kleuren. Analyseer het percentage dode neutrofielen mbv de FACSCanto. Flow cytometrie kleuring Transfereer 1,0 x 106 cellen naar een 96-well plaat met conische bodem (V-bodem) in 150 µl kleuringsmedium (DMEM + 1% FCS) Centrifugeer gedurende 3’ bij 400g en 4°C Verwijder het supernatans (SN) Voeg de primaire monoklonale antilichamen toe in een finaal volume van 50 µl kleuringsmedium Incubeer 20’ op ijs Voeg 100 µl kleuringsmedium toe Centrifugeer gedurende 3’ bij 400g en 4°C. Verwijder het SN Voeg 150 µl kleuringsmedium toe en resuspendeer goed Centrifugeer gedurende 3’ bij 400g en 4°C. Verwijder het SN 60 Voeg nu het correcte fluorescent-gemerkt muis IgG isotype-specific secundaire antilichaam toe in 50 µl kleuringsmedium (1/250 verdund) Incubeer 20’ op ijs afgeschermd van licht Voeg 100 µl kleuringsmedium toe Centrifugeer gedurende 3’ bij 400g en 4°C. Verwijder het SN Voeg 200 µl koude PBS toe Centrifugeer gedurende 3’ bij 400g en 4°C. Verwijder het SN Resuspendeer de cellen in 200 µl PBS Tranfereer de cellen naar een FCM-buis Voeg 100 µl PBS + PI toe Analyseer de merkerexpressie mbv flow cytometer (FACSCanto) TNFα ELISA (Duoset, R&D systems): Verdun het capture antilichaam naar een werkconcentratie in PBS zonder drager eiwitten. Coat een 96-well microplaatplaat (MaxiSorp, ThermoScientific) met 100 µl/well capture antilichaam. Dek de plaat af en incubeer overnacht bij kamertemperatuur. Verwijder de volgende dag de vloeistof uit de microplaat en was de wells 3x met wasbuffer (0,05% Tween20 in PBS; pH 7,2 - 7,4). Verwijder de wasbuffer na elke wasstap. Na de laatste wasstap verwijderen we de wasbuffer zeer goed door de plaat uit te kloppen tegen een papieren doekje. Blokkeer vervolgens de vrije bindingsplaatsen met 200 µl/well blokbuffer (1% BSA in PBS) Incubeer 1 u bij kamertemperatuur. Was de plaat opnieuw 3x met wasbuffer. Voeg 100 µl van het staal (1/2 verdunning in reagent oplossing) en van een standaard verdunningsreeks toe. o Reagent oplossing: 0,1% BSA, 0,05% Tween20 in Tris-gebufferde zoutoplossing (20 mM TrisBase, 150 mM NaCl), pH 7,2 – 7,4, 0,22 µm gefilterd. Dek de plaat af en incubeer 2 u bij kamertemperatuur Was de plaat 3x met wasbuffer Voeg 100 µl/well detectie antilichaamn toe verdund in reagent oplossing. Incubeer 2 u bij kamertemperatuur Was de plaat 3x met wasbuffer Voeg nu 100 µl/well streptavidine-HRP toe, 1/200 verdund in reagent oplossing. Dek de plaat af en incubeer 20’ bij kamertemperatuur en afgeschermd van licht. Was de plaat 3x met wasbuffer Voeg vervolgens 100 µl/well van de TMB substraatoplossing toe. o TMB substraat oplossing: los één TMB tablet op in 100 µl DMSO, voeg toe aan 10 ml TMB-buffer (0,2 M Na2HPO4, 0,1 M citroenzuur, pH 4,3). Voeg als laatste 1,3 µl H202 toe. 61 Incubeer 20’ in het donker bij kamertemperatuur. Voeg 50 µl/well stopoplossing(1M H2SO4) toe. Meng goed. Bepaal de optische densiteit bij 450 nm mbv een microplaat lezer (Spectrafluor, Tecan) Analyseer de data mbv DeltaSoft software (Biometallics). ROS productie door neutrofielenl Tel de neutrofielen Centrifugeer 10’ bij 350g en 4°C Verwijder het SN en resuspendeer de celpellet in leukocytmedium + 400 ng/ml GM-CSF zodat een concentratie van 2,0 x 106 cellen/ml bekomen wordt. Pipetteer 100 µl (= 2,0 x 105 cellen) van deze celsuspensie in een 96-well microtiter plaat (wit, open bodem; Greiner Bio one). Stimuleer de cellen vervolgens met 100 µl van de reagentia verdund in leukocyt medium. Incubeer 24 u bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid. Neem het medium voorzichtig af en ververs met warm leukocytmedium + 200 ng/ml GM-CSF. Incubeer 24 h bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid. Voeg nogmaals 50 µl warm leukocytmedium + 200ng/ml GM-CSF toe aan de cellen. Incubeer 48 u bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid. Neem het medium van de cellen en voeg 175 µl luminol (1 mg/ml) toe per well. Meet de achtergrondluminescentie met een luminometer (Luminoskan, Labsystems) Stimuleer de cellen vervolgens met 25 µl van de reagentia. We hebben hiervoor 20 minuten tijd na de meting van de basiswaarden. Meet vervolgens gedurende 2 u de kinetiek van de chemiluminescentierespons mbv de luminometer. Viabiliteitsassay MTA inhibitor Breng 5,0 x 105 monocyten in een 24-well plaat 1 ml monocytmedium/well. Incubeer 24 u bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid. Stimuleer de cellen met MTA (1 mM, opgelost in dimethylformamide) of monocytmedium. Incubeer 24 u bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid. Collecteer de cellen en kleur deze aan met propidium iodide in PBS-EDTA Analyseer de celviabiliteit mbv flow cytometrie Effect van histon methylatie op de inductie van immuuntraining in monocyten Breng 5,0 x 105 monocyten in een 24-well plaat in 1 ml monocytmedium/well. Incubeer 24 u bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid. Voeg 1 mM MTA of eenzelfde volume dimethylformamide toe aan de cellen. Incubeer 1 u bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid. Stimuleer de cellen met 5 µg/ml MacroGard. 62 Incubeer 24 u bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid. Collecteer het medium 1, 4 en 6 dagen na stimulatie en voeg nieuw monocytmedium toe. Bewaar het medium na centrifugatie (10’, 400g, 4°C) bij -21°C. Stimuleer een 2de keer met 50 µg/ml MacroGard na 7 dagen. Incubeer 24 u bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid. Collecteer het medium na 8 dagen en centrifugeer 10’, 400G, 4°C. Bepaal de cytokine concentratie in het celvrije cultuurmedium mbv ELISA Bereiden van cellysaten Breng 5,0 x 105 monocyten in een 24-well plaat in 1 ml monocytmedium/well. Incubeer 24 u bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid. Voeg 1 mM MTA of eenzelfde volume dimethylformamide toe aan de cellen. Incubeer 1 u bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid. Stimuleer de cellen met 5 µg/ml MacroGard. Incubeer 24 u bij 37°C, 5% CO2 en 90% luchtvochtigheid. Verwijder het SN. Voeg 250 µl trypsinebuffer (0,25% trypsine, 2% verseen, 1% P/S in steriele PBS) toe aan de cellen. Incubeer 10-15’ bij 37°C. Voeg 1 ml ijskoude PBS (0.22 µm gefilterd) toe aan de cellen. Collecteer de cellen in vooraf gekoelde 15 ml buizen Centrifugeer 7’ bij 500g en 4°C. Verwijder het SN en hersuspendeer de celpellet in 700 µl ijskoude PBS. Brengde celsuspensie over naar een vooraf gekoeld steriel epje. Was de buis met 700 µl PBS en breng over naar het epje. Centrifugeer 7’ bij 450g en 4°C. Verwijder het SN en resuspendeer de cellen in 50 µl lysebuffer (757 µl TNE buffer, 100 µl protease inhibitor, 143 µl 10% NP40) Lyseer de cellen met een naald (1 ml spuit met 21G 40 mm naald), door de cel suspensie 8 maal op en neer te zuigen. Incubeer 30’ op ijs Centrifugeer 5’ bij maximum snelheid en 4°C Transfereer het SN vervolgens naar een nieuw steriel epje Voeg ladingsbuffer (6x) toe en incubeer in een hitteblok (5’, 100°C) Laad de stalen op een 12% SDS-PAGE. SDS-PAGE Plaats 0,75 mm glaasjes in de houder en controleer op lekken met H2O. Maak de scheidingsgel (12%)(5 ml): o 1,7 ml H2O o 2,0 ml 30% acrylamide o 1,3 ml 1,5 M TrisHCl pH 8,8 o 50 µl 10% SDS o 50 µl 10% APS 63 o 2 µl TEMED Voeg deze vlug toe tussen de glaasjes, vooraleer hij stolt. Giet wat H 2O erover om een vlak oppervlak te krijgen. Maak de stackingsgel (4%)(5 ml) o 3,05 ml H2O o 1,25 ml 0,5 M TrisHCl pH 6,8 o 50 µl 10% SDS o 650 µl 30% acrylamide o 50 µl 10% APS o 10 µl TEMED Breng deze stacking buffer over op de scheidingsgel Breng een kammetje in de stackingsgel, voordat deze stolt Breng de gel en houder over in de buffertank en vul met 1x SDS PAGE running buffer (3 g TrisBase, 14,4 g glycine, 1,0 g SDS, opgelost in 1l aquadest) Laad de stalen in de slotjes Loop de SDS-PAGE op 100V gedurende 1-2 uur tot het front zich aan de onderzijde van de gel bevindt.. Western Blot en immunodetectie Activeer de PVDF membraan in MeOH. Haal de SDS-PAGE gel uit de houder en plaats deze in de blotting houder in de juiste volgorde (negatieve pool – vezeldoek - 2x whatmann papier – gel – PVDF membraan – 2x whatmann papier – vezeldoek – positieve pool). Week alle materialen vooraf in transferbuffer. Verwijder eventuele luchtbellen. Plaats dit geheel in de buffertank en vul met transferbuffer (28,8 g glycine, 6,06 g TrisBase, 400 ml MeOH, in 2l aquadest). Transfereer de eiwitten van de gel naar de PVDF membraan gedurende 2 uur aan 50 - 100V. Verwijder vervolgens het membraan voorzichtig uit de houder en breng deze over in blokbuffer (PBS + 5% magere melk poeder + 0,2% Tween80) Incubeer overnacht bij 4°C Was 3x met PBS-T (PBS + 0,2% Tween20) Incubeer 1 u met konijn α-actine IgG (1/5000) en konijn α-H3K4 IgG (1/1000) in blokbuffer Was 3x met PBS-T (PBS + 0,2% Tween20) Incubeer 1 u met varken α-konijn IgG-HRP (1/500) in blokbuffer Was 3x met PBS-T (PBS + 0,2% Tween20) Voeg 500 µl detectie reagent 1 (peroxide oplossing) en 500 µl reagent 2 (Luminol enhancer solution) toe en pipetteer gedurende 1 minuut over de blot. Meet de chemiluminescentie op de blot met het Chemidoc TM imaging system van Biorad 64
