Stroomlijnen van mutatie-detectie binnen de tumordiagnostiek

Stroomlijnen van mutatie-detectie binnen de
tumordiagnostiek:
melanoma als voorbeeld
Bastiaan Tops
Klinisch moleculair bioloog i.o.
UMC St Radboud
Laboratorium Tumorgenetica
(LTG)
Monster ontvangst / invoer
moleculaireDNA isolatie
pathologie
DNA
diagnostiek
(normalisatie)
erfelijke
mutaties
verworven
mutaties
Pre PCR
Post PCR
Sequencing
structurele
veranderingen
cytogenetica
Analyse
Verslag
- Aanvragen via het LMS
- Registratie, tracking, uitslagen, etc. via aparte database,
werkformulieren (CCKL), standaard uitslagen
- Momenteel bezig met de implementatie van HELIX
- HE-voor en –na laten aftekenen door patholoog (+ % tumorcellen)
- Manueel (micro-dissectie)
- HE-voor en –na laten aftekenen door patholoog (+ % tumorcellen)
- Manueel (micro-dissectie)
- DNA isolatie m.b.v. proteïnase-K en chelex (2 dagen)
- Geen additionele zuivering
- Geen normalisatie, “blind” 1 ul in de PCR-reactie
- Eventueel BSA aan de PCR mix toevoegen (melanine)
- Alle PCR reacties zijn universeel:
- 360 GOLD mix (buffer, Mg2+, dNTPs en taq)
- alle primers geoptimaliseerd (+universele tails)
- alle PCR reacties met hetzelfde PCR programma
Pre-robotstraat (via HELIX):
- minder foutgevoelig
- 24 h/dag
DNA diagnostiek:
- >400 genen
- 13.500 aanvragen/jaar
- Agarose gel
- Kolom zuivering (Multiscreen)
- Normalisatie voor sequencen
- Samples aanleveren aan sequence faciliteit (digitaal)
(binnenkort vanuit HELIX)
Post-robotstraat (via HELIX):
- Opzuiveren via beads
- Concentratie bepaling
- Normalisatie
- Sequence faciliteit (Antropogenetica)
- 2x/week aanleveren, samples volgende dag gesequenced
Gekozen voor een mutatie-detectie techniek (pijplijn),
dus geen HRM, real-time PCR, etc.
Voordelen
- Infrastructuur aanwezig
- Universele assay
- Makkelijk nieuwe genen te implementeren
Nadelen
- Snelheid
- Gevoeligheid (30-40% tumorcellen)
- COLD-PCR
- pyro-sequencen
“Normale” PCR
KRAS
c.34G>T (p.G12C)
25% tumorcellen
COLD-PCR
CAAAGGTCAG GNAQ wt (codon 209)
CAAAGGTCAG GNAQ wt (codon 209)
CTAAGGTCAG GNAQ c.626A>T (p.Q209L)
Commercieel software pakket (Sequence pilot):
- automatisch benoemen van mutaties/SNP’s
- opbouw statistiek van signaalhoogtes
- loggen van technische en medische validatie
- archiveren van analyses
Automatisch
“callen”
van mutaties
Statistiek voor
individuele
pieken
Statistiek, archivering, etc.
Loggen van validaties
HELIX
- Alle gegevens digitaal ingevoerd en “gelogd”
HELIX
- Alle gegevens digitaal ingevoerd en “gelogd”
- Mogelijkheid tot barcodering (scannen) van samples
- Alle testen digitaal aanvragen en doorvoeren m.b.v. robots
HELIX
- Alle gegevens digitaal ingevoerd en “gelogd”
- Mogelijkheid tot barcodering (scannen) van samples
- Alle testen digitaal aanvragen en doorvoeren m.b.v. robots
- Alle uitslagteksten zijn digitaal beheerd
- Alle uitslagen worden digitaal gevalideerd (digitale handtekening)
HELIX
- Alle gegevens digitaal ingevoerd en “gelogd”
- Mogelijkheid tot barcodering (scannen) van samples
- Alle testen digitaal aanvragen en doorvoeren m.b.v. robots
- Alle uitslagteksten zijn digitaal beheerd
- Alle uitslagen worden digitaal gevalideerd (digitale handtekening)
- Archivering (doorlooptijden, aantal verrichtingen, etc.)
HELIX
- Alle gegevens digitaal ingevoerd en “gelogd”
- Mogelijkheid tot barcodering (scannen) van samples
- Alle testen digitaal aanvragen en doorvoeren m.b.v. robots
- Alle uitslagteksten zijn digitaal beheerd
- Alle uitslagen worden digitaal gevalideerd (digitale handtekening)
- Archivering (doorlooptijden, aantal verrichtingen, etc.)
NB. Alle uitslagen komen nog steeds in PALGA (UDPS)
BRAF/NRAS/HRAS/GNAQ
35
30
25
20
%
15
KRAS/EGFR
10
5
70
0
60
<7
7-9
10-12
13-15
>14
50
Aantal dagen
40
%
30
20
10
0
<4
4-6
7-9
Aantal dagen
>9
www.umcn.nl/LTG