NEDERLANDSE SAMENVATTING Astrocyten zijn de meest

Nederlandse samenvatting
NEDERLANDSE SAMENVATTING
Proteomische karakterisatie van perisynaptische astrocyten in synaptische plasticiteit
Astrocyten zijn de meest voorkomende cellen in de hersenen en hebben een veelvoud aan
functies, waaronder een rol in neurogenese, synaptogenese, ion homeostase, metabole
ondersteuning, vorming van de bloed-hersen barrière, opruimen van toxische stoffen en de
reactie op hersenbeschadigingen. De astrocyt heeft contact met de synaps via kleine cellulaire
uitlopers, genaamd perisynaptische astrocyt projecties (PAPs), met daarop receptor- en
transport-eiwitten die synaptische activiteit kunnen detecteren. Tevens bevatten de PAPs
gespecialiseerde eiwitten die het mogelijk maken om op synaptische activiteit te reageren
met de afgifte van signaalstoffen, genaamd gliotransmitters. Dit vermogen van astrocyten om
de synaptische functie te reguleren heeft geleid tot het formeel erkennen van de astrocyt als
actief element van de synaps, en daarmee tot de term ‘tripartite synaps’, het concept dat de
synaps bestaat uit een neuronale pre- and post-synaptische terminal en de PAP.
Astrocyten kunnen reageren op verschillende neurotransmitters, waaronder glutamaat,
acetylcholine, GABA, en ATP, wat aangeeft dat astrocyten een rol kunnen spelen in meerdere
synaptische processen. Daarnaast is gevonden dat de functie van tripartite synapsen
veranderd is in verschillende neurologische afwijkingen, zoals epilepsie, depressie, dementie,
amyotrofe laterale sclerosis, en schizofrenie, wat het klinische en maatschappelijke belang
aangeeft van onderzoek aan de rol van astrocyten bij de synaps. Echter, de vooruitgang in dit
onderzoeksveld wordt ernstig vertraagd door het gebrek aan geschikte onderzoeksmethodes
om de functie en samenstelling van PAPs te kunnen bestuderen, dit omdat PAPs extreem klein
1
Nederlandse samenvatting
zijn (<1 µm in doorsnede). Het is daarom van groot belang dat nieuwe technieken worden
ontwikkeld voor de analyse van PAP functies in verschillende experimentele modellen. In dit
proefschrift heb ik verschillende isolatie-methoden onderzocht op hun geschiktheid voor de
analyse van PAPs, en heb vervolgens de meest geschikte methode gebruikt voor de analyse
van PAP eiwitten in modellen van synaptische plasticiteit.
In hoofdstuk 2 hebben we een in vitro methode ontwikkeld, genaamd ‘cold jet’, voor de
analyse van genen die in astrocyten worden geïnduceerd door de aanwezigheid van
neuronen. Deze methode bestaat uit het pipeteren van ijskoude PBS op neuron-astrocyt
cokweken, wat resulteert in het loslaten van de neuronen omdat deze andere
adhesievermogens hebben dan astrocyten. Met deze methode is het mogelijk om astrocyten
te isoleren uit deze co-kweek met 90% zuiverheid.
Vervolgens zijn met behulp van
microarray-analyse de transcriptionele veranderingen in astrocyten geinduceerd door
neuronen bepaalt. Gevonden werd dat met name genen met een metabole functie werden
gereguleerd, waaronder de afname van mRNAs voor Insig1, Hmgcs, en Dhcr7, die een rol
spelen in lipidenmetabolisme.
Omdat transcriptionele veranderingen niet strikt correleren met veranderingen op
eiwitniveau, en dus biologische functie, heb ik tevens biochemische isolatie-methodes
geëvalueerd op hun geschiktheid voor analyse van astrocyt-eiwitten. Gliosomen, geïsoleerd
met behulp van een Percoll°-gradiënt, zijn verrijkt voor astrocyt-eiwitten, waaronder
PAPeiwitten, en daarmee mogelijk een geschikt preparaat voor de identificatie van nieuwe
PAPeiwitten en meten van veranderingen in PAP-eiwitniveaus gedurende experimentele
veranderingen in synaptische plasticiteit. In hoofdstuk 3 heb ik met behulp van label-vrije
TripleTOF massa spectrometrie een meer gedetailleerde analyse gedaan van de eiwitten in
2
Nederlandse samenvatting
gliosomen, en dit vergeleken met Percoll°-geïsoleerde synaptosomen. Gevonden werd dat
gliosomen verrijkt zijn voor G-eiwit gemedieerde signaaleiwitten, terwijl synaptosomen
verrijkt zijn voor vesicle-gemedieerd transporteiwitten. Verrassend was verder de observatie
dat niet alleen gliosomen verrijkt zijn in PAP-eiwitten, maar dat synaptosomen zelfs nog meer
verrijkt zijn voor PAP-eiwitten.
Na een geschikte methode voor analyse van PAP eiwitten te hebben gevonden, ben ik verder
gegaan met het bepalen van de bijdrage van astrocyten in synaptische plasticiteit in vivo. Het
is bekend dat de supra-optische nucleus (SON) functionele en structurele neuron-glia
plasticiteitsveranderingen ondergaat als gevolg van lactatie en hyperosmose. Tijdens deze
fysiologische stimuli ondergaat de astrocyt morfologische veranderingen; het trekt zijn
uitlopers (PAPs) terug van synapsen op oxytocin magnocellulaire neuronen, waarbij de
diffusie en beschikbaarheid van gliotransmitters in de synaps-spleet veranderd. Deze
structurele plasticiteit resulteert in een verandering in synaptische plasticiteit die van belang
is bij the fysiologische reactie op hyperosmose en lactatie.
In hoofdstuk 4 heb ik vervolgens Orbitrap label-vrij massa spectrometrie gebruikt voor
kwantitatieve analyse van eiwitexpressie in maagdelijke, lacterende, en hyperosmotische
ratten om de eiwitten te identificeren die betrokken zijn bij het moleculaire mechanisme
achter deze plasticiteitsveranderingen. Ik heb 985 eiwitten gevonden die gereguleerd werden
door plasticiteit, en door het vervolgens filteren van de resultaten heb ik dit aantal
teruggebracht tot 86 eiwitten die vermoedelijk in astrocyten een rol spelen bij de
plasticiteitsveranderingen. Helaas hebben we deze resultaten met Western blotting voor de
meeste eiwitten niet kunnen valideren, al werd voor N-myc down-stream regulated gene 2
(Ndrg2) wel een significante verhoging in eiwitniveaus gevonden bij hyperosmose en lactatie.
3
Nederlandse samenvatting
Ik concludeer dat er waarschijnlijk te veel bronnen van zowel biologische als technische
variatie in onze experimentele opzet aanwezig was om de massa spectometrie-data te kunnen
valideren, en bediscussieer in hoofdstuk 4 enkele verbeteringen in de methodiek die bij
vervolgexperimenten een succesvollere analyse mogelijk maken.
Daarnaast hebben we contextuele angst conditionering gebruikt als model voor synaptische
plasticiteit, waarbij muizen eerst een conditioneringskamer kunnen onderzoeken voordat ze
een voetschok krijgen en daardoor een associatie maken tussen de voetschok en de context
(vertraagde schok). Interessant hierbij is dat muizen die een voetschok krijgen voordat ze de
conditioneringskamer kunnen onderzoeken (onmiddellijke schok), geen associatie maken
tussen de schok en de context, deze muizen kunnen daarmee fungeren als controle voor de
stressvolle ervaring van een voetschok, waarmee het effect van synaptische plasticiteit
specifiek betrokken bij opslaan van een angstherinnering kan worden bepaald. Daarmee
hebben we in hoofdstuk 5 bepaald dat 4 uur na training van de muizen er in de hippocampus
423 eiwitten significant worden gereguleerd, waarvan 164 door een vertraagde schok en 273
door een onmiddellijke schok. Regulatie van meerdere astrocyt-eiwitten werd gevonden,
waaronder een verlaging van de glutamaat transport-eiwitten GLAST en GLT-1, en GABA
transport-eiwit Scl6a11/GAT3 op 4 uur na een vertraagde schok. Als geheel laat deze analyse
zien dat een onmiddellijke schok in staat is om grote veranderingen in eiwitniveaus te
veroorzaken, en tevens dat astrocyt-eiwitten gereguleerd worden door zowel een
onmiddellijke schok als ook door specifiek het opslaan van angstherinneringen.
In hoofdstuk 6 zijn we vervolgens verder gegaan met het onderzoeken van de expressie van
een selectie van astrocyt-eiwitten op verschillende momenten in het opslagproces van
angstherinneringen. Voor de meeste astrocyt-eiwitten werd een afname in niveaus gevonden
4
Nederlandse samenvatting
na 4 uur. Tezamen laten deze data zien dat astrocyt-eiwitten dynamisch gereguleerd worden
tijdens het opslaan van angstherinneringen, en tevens dat astrocyteiwitten vermoedelijk een
regulerende rol hebben in het opslaan van herinneringen in het geheugen.
Samenvattend, in dit proefschrift heb ik verschillende biochemische preparaten onderzocht
op hun geschiktheid voor het bepalen van de rol van astrocyt-eiwitten in synaptische
plasticiteit, ik heb een groot aantal astrocyt-eiwitten gevonden die gereguleerd worden door
synaptische plasticiteit en die geschikte kandidaat-eiwitten zijn om in vervolgstudies te
manipuleren en daarmee moleculaire mechanisme te onderzoeken die ten grondslag liggen
aan het functioneren van de tripartite synaps in zowel fysiologische als pathologische
omstandigheden.
5
Nederlandse samenvatting
Nederlandse samenvatting
6