University of Groningen Reconstituted viral envelopes as delivery

University of Groningen
Reconstituted viral envelopes as delivery vehicles for nucleic acids
de Jonge, Jørgen Martin
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2007
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
de Jonge, J. M. (2007). Reconstituted viral envelopes as delivery vehicles for nucleic acids s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 19-07-2017
CHAPTER
7
SAMENVATTING VOOR
NIETINGEWIJDEN
CHAPTER 7
INLEIDING
Achtergrond
Sinds zijn bestaan wordt de mens geteisterd door diverse ziekten en heeft hij getracht
deze te bestrijden. Veelal ging dit door middel van het toedienen van medicijnen die
symptomen bestreden, maar vaak de oorzaak van de ziekte niet aanpakten. Recente
ontwikkelingen op het gebied van de celbiologie en van de recombinant-DNA
technologie en de ontrafeling van het humane genoom hebben geleid tot de vorming
van therapieconcepten die hier veranderingen in zouden kunnen brengen. Deze
therapieën werken op genetisch niveau en kunnen daarom in principe de ziekte bij de
bron aanpakken.
Van DNA via RNA tot Eiwit
De therapieën grijpen in een cellulair proces in dat verantwoordelijk is voor de bouw
(synthese) van eiwitten. Eiwitten fungeren als bouwblokken van het lichaam of als
machientjes die o.a. transport of communicatie verzorgen. Daarnaast zijn eiwitten
betrokken bij de bouw van lichaamseigen stoffen of vertering van voeding. Hoe
eiwitten er uit moeten zien staat beschreven in de genen die op het DNA liggen.
Voor de synthese van een eiwit wordt een gen eerst in RNA vertaald wat een soort
alternatief DNA is. Dit RNA wordt vervolgens gebruikt als een soort mal om eiwitten
mee te synthetiseren.
Gentherapie
Een van de therapieën die op genetisch niveau werken, in dit geval op DNA niveau,
is die van de gentherapie. Gentherapie is gebaseerd op het toedienen van een stukje
DNA met daarop een gen dat een specifiek eiwit beschrijft. Deze therapie kan
bijvoorbeeld gebruikt worden voor erfelijke ziekten (o.a. taaislijmziekte en hemofilie).
Deze worden veroorzaakt door een defect in een gen (het DNA bevat dan een
verkeerde code) wat kan leiden tot de synthese van een eiwit dat niet goed
functioneert. Door simpelweg een stukje DNA te introduceren dat een correcte
versie van het gen bevat zou het goede eiwit geproduceerd kunnen worden. Ook
kunnen genen ingebracht worden waarvan de eiwitten een therapeutische werking
hebben om ziekten zoals kanker, de ziekte van Parkinson, cardiovasculaireziekten of
auto-immuunziekten tegen te gaan. Daarnaast kan gentherapie gebruikt worden voor
- 192 -
SAMENVATTING VOOR NIETINGEWIJDEN
vaccinatiedoeleinden. Door één of meerdere genen toe te dienen die coderen voor
lichaamsvreemde eiwitten van bv. bacteriën of virussen wordt een infectie nagebootst
wat vervolgens een immuunrespons op kan wekken.
RNA interferentie
Een andere therapie die op genetisch niveau ingrijpt is gebaseerd op RNA
interferentie (RNAi). RNAi is een mechanisme dat heel specifiek de synthese van
een eiwit verhindert. Dit mechanisme is bijna in iedere cel van meercellige
organismen aanwezig en wordt gestuurd door zogenaamde “small interfering RNAs”
(siRNA), ofwel kleine interfererende RNA-molekulen. Deze siRNAs kunnen heel
specifiek aan een bepaald RNA segment binden. Na binding wordt een
enzymcomplex aangeschakeld dat het RNA in stukken knipt. Wanneer het RNAsegment informatie bevat voor de synthese van een bepaald eiwit kan dit eiwit niet
meer geproduceerd worden. RNAi-gebaseerde therapieën maken gebruik van dit
mechanisme. Zo zou mbv siRNA bv de synthese van eiwitten verhinderd kunnen
worden die bij kanker betrokken zijn. Ook zouden infectieziekten kunnen worden
bestreden door de synthese van de eiwitten van bacteriën of virussen met siRNA te
remmen.
Conceptueel gezien lijken DNA- en siRNA-gebaseerde therapieën vrij simpel. Er is
echter één groot obstakel dat tot nu toe de toepassing bij de mens in de weg staat en
dat is het transport van DNA of siRNA de cel in. Cellen zijn ingepakt in een soort
hulsje ook wel het celmembraan genoemd. Dit membraan voorkomt dat allerlei
molekulen de cel in en uit kunnen gaan. Ook therapeutisch DNA of siRNA moet dus
door dit membraan heen dringen om zijn werking in de cel te kunnen doen en dat
gaat niet vanzelf. Om het transport door het membraan voor elkaar te krijgen zijn tot
op heden twee verschillende transportsystemen toegepast, de zogenaamde virale en
non-virale systemen. Gezien het feit dat deze respectievelijk nog onveilig of
inefficiënt zijn, wordt in dit proefschrift als alternatief het gebruik van virosomen als
transportsysteem voor DNA of siRNA geïntroduceerd.
Andere obstakels zijn onder andere het sturen van de transportsystemen naar
het weefsel of orgaan waar de ziekte zich bevindt en ervoor te zorgen dat eiwitten
lang genoeg en in de juiste hoeveelheid worden gesynthetiseerd.
- 193 -
Chapter 7
Transport van DNA en siRNA de cel in
CHAPTER 7
Virussen als transportsysteem
Virosomen zijn afgeleid van membraanvirussen. Membraanvirussen zijn opgebouwd
uit stukjes genetisch materiaal (DNA of RNA) samengevouwen m.b.v. eiwitten tot
een complex dat als geheel in een membraanhulsje ingepakt is. Virussen kunnen zich
niet zelf voortplanten en hebben de hulp van gastheercellen nodig om zich te kunnen
vermenigvuldigen. Om dit te bereiken moeten ook virussen de cel binnenkomen en
dus door het celmembraan heen dringen. Membraanvirussen hebben zeer efficiënte
mechanismen ontwikkeld om dit voor elkaar te krijgen. Zo zitten er op de buitenkant
van het virusmembraan zogenaamde fusie-eiwitten die aan cellen kunnen binden.
Door een bepaald signaal schieten deze fusie-eiwitten een soort harpoen het
celmembraan in en trekken daarmee vervolgens het celmembraan zo dicht naar het
membraan van het virus toe dat de beide membranen samensmelten. Dit heeft als
gevolg dat het genetische materiaal dat in het virus zit nu toegang tot de cel heeft.
Het virosomale concept
Virosomen zijn als het ware lege membraanvirussen (Figuur 1). Het genetische
materiaal is verwijderd waardoor alleen het virusmembraan met de fusie-eiwitten
overblijft. Virosomen behouden hierdoor dezelfde fusie-eigenschappen als het virus
zelf. Omdat het binnenste van het virosoom leeg is kan hierin bijvoorbeeld DNA of
siRNA worden ingesloten. Op soortgelijke wijze als membraanvirussen hun genetisch
materiaal aan cellen afleveren, kunnen virosomen het ingesloten DNA of siRNA aan
cellen afleveren.
Figuur 1. Een doorsnede van een virusdeeltje en een virosoom. Te zien zijn membraanbolletjes
met daarop onder andere de fusie-eiwitten. Alleen in het virus zit het genetische materiaal
terwijl het virosoom leeg is.
- 194 -
SAMENVATTING VOOR NIETINGEWIJDEN
Figuur 2. Virosomen transporteren DNA of siRNA de cel in. Virosomen binden aan het
celoppervlak en waarna ze door de cel opgenomen worden. Vervolgens belanden ze in het
endosoom waar een zuur milieu heerst (H+). Door dit zure milieu worden de fusie-eiwitten op
het virosoom geactiveerd en fuseert het virosoom met het endosoom. Als gevolg hiervan komt
het DNA of siRNA in de cel terecht.
- 195 -
Chapter 7
De virosomen die in dit proefschrift zijn beschreven worden van het influenzavirus (griepvirus) gemaakt. Figuur 2 beeldt het transport van DNA of siRNA door
influenza-virosomen af. Virosomen binden met behulp van het fusie-eiwit aan het
celoppervlak en worden vervolgens door de cel opgenomen door een proces dat
endocytose heet. Dit is een proces dat normaal door de cel uitgevoerd wordt om
voedselcomponenten van buiten de cel op te nemen. Door dit proces belanden de
virosomen in een soort membraancompartiment wat in de cel zit, het zogenaamde
endosoom. In het endosoom is de omgeving zuur. Dit is een signaal voor de fusieeiwitten die op het membraan van het virosoom zitten om hun harpoenen uit te
schieten en ervoor te zorgen dat het virusmembraan samensmelt met het membraan
van het endosoom. Als gevolg hiervan kan het DNA of siRNA het cytoplasma in
ontsnappen om daar de therapeutische werking te uit te oefenen.
CHAPTER 7
DIT PROEFSCHRIFT
Doel van het onderzoek
Het doel van het onderzoek beschreven in dit proefschrift was de ontwikkeling van
een methode waarmee DNA en siRNA in virosomen kunnen worden ingesloten.
Vervolgens moest dit resulteren in een transportsysteem dat efficiënt DNA en siRNA
aan cellen af kan leveren. Daarnaast was het doel een methode te ontwikkelen om de
stabiliteit van virosomen te verbeteren.
Reconstitutie van influenza-virusmembranen
In Hoofdstuk 2 wordt een nieuwe methode beschreven om influenzavirusmembranen te reconstitueren om zodoende virosomen te verkrijgen. Membraan
reconstitutie is als het ware het uit elkaar halen en weer in elkaar zetten van een
membraan. Om het membraan van het influenza-virus uit elkaar te halen wordt bij
deze nieuwe methode gebruik gemaakt van een soort detergens (zeep). Deze
detergensachtige stof lost alleen het virusmembraan met de eiwitten die in dit
membraan ingebouwd zijn op (onder andere de fusie-eiwitten). Het genetische
materiaal, dat door middel van inpak eiwitten samengevouwen is, blijft intact en kan
door ultracentrifugatie (centrifugeren met 100.000 keer de zwaartekracht) uit de
oplossing gedraaid en vervolgens verwijderd worden. Zo blijven alleen de
membraancomponenten van het influenza-virus in de oplossing over. Met behulp van
een soort zeefmethode, ook wel dialyse genoemd, kan het kleine zeepachtige stofje
verwijderd worden, waardoor de opgeloste componenten van de virusmembranen
zich opnieuw gaan rangschikken (reconstitueren). Met behulp van
elektronenmicroscopie wordt in Hoofdstuk 2 aangetoond dat op deze manier een
membraanbolletje gevormd wordt met op het oppervlak onder andere de fusieeiwitten van het originele virus. Op deze wijze is dus een leeg virusdeeltje ontstaan,
een zogenaamd virosoom. Met een aantal experimenten wordt aangetoond dat de
fusie-eiwitten die in het membraan van het virosoom ingebouwd zijn hun fusogene
eigenschappen behouden. Dit is essentieel wanneer de virosomen gebruikt worden
voor het afleveren van ingesloten materiaal zoals DNA en siRNA.
Virosomen als transportsysteem voor DNA en siRNA
In Hoofdstuk 3 en 4 wordt een methode beschreven die het insluiten van DNA en
siRNA in virosomen mogelijk maakt. Hierbij wordt gebruik gemaakt van cationische
- 196 -
SAMENVATTING VOOR NIETINGEWIJDEN
lipiden. Dit zijn membraancomponenten met een positieve lading die aan het negatief
geladen DNA en siRNA kunnen binden. Op deze manier kan DNA of siRNA aan
het membraan van het virosoom gekoppeld worden. Door DNA of siRNA en deze
cationische lipiden voor de dialysestap in het bereidingsproces van de virosomen toe
te voegen, wordt het DNA of siRNA in het virosoom ingesloten. De verkregen
virosomen behouden hun fusogene eigenschappen en geven daarnaast een goede
bescherming tegen enzymen die DNA en siRNA afbreken. Dit zijn enzymen die op
grote schaal in het lichaam aanwezig zijn en een probleem kunnen vormen bij het
transport van het DNA of siRNA de cel in. In Hoofdstuk 3 en 4 wordt in een serie
experimenten aangetoond dat deze virosomen zeer efficiënt DNA en siRNA aan
verschillende soorten gekweekte cellen kunnen afleveren.
Drogen en inpakken van virosomen in suikerglazen
Doordat virosomen in een waterige oplossing worden geproduceerd is hun stabiliteit
beperkt, omdat allerlei chemische reacties en fysische processen kunnen plaatsvinden
die de virosomen kunnen inactiveren. Een methode om de stabiliteit te verhogen is
door het water te onttrekken, net zoals bij voedsel ook wel gedaan wordt
(bijvoorbeeld poedermelk). Hoofdstuk 5 beschrijft een methode waarmee het water
uit een virosoomoplossing wordt verwijderd en de virosomen tegelijkertijd in een
soort matrix of netwerk van suikers worden ingepakt. Dit netwerk wordt ook wel een
suikerglas genoemd omdat het vergelijkbare eigenschappen als gewoon glas vertoont.
Het inpakken in zo’n suikerglas zorgt er voor dat er een beschermingslaagje om de
virosomen heen komt waardoor ze langer stabiel blijven. In dit hoofdstuk wordt
aangetoond dat virosomen hun structurele en functionele eigenschappen behouden
als ze in een suikerglas worden ingepakt en later weer in water worden gedispergeerd.
Dus virosomen kunnen met behulp van de suikerglastechniek stabieler gemaakt
worden wat hun toepassingsmogelijkheden vergroot.
Om de efficiëntie van de virosomen in levende organismen (in vivo) aan te tonen
werd een aantal experimenten gedaan, zoals kort beschreven in Hoofdstuk 6. Dit
leverde wat betreft de siRNA virosomen zeer hoopvolle resultaten op, maar de DNAvirosomen leken niet werkzaam te zijn. In dit hoofdstuk worden vervolgens een
aantal suggesties gedaan om de problemen omtrent de DNA-virosomen op te lossen.
- 197 -
Chapter 7
Virosomen in levende organismen
CHAPTER 7
In perspectief
Elke ziekte die bestreden zou kunnen worden met behulp van gentherapie of met een
RNAi gebaseerde therapie vereist een transportsysteem voor de introductie van DNA
of siRNA in cellen dat specifiek is aangepast voor het weefsel of orgaan dat betrokken
is bij de desbetreffende ziekte. Aangezien ziekten in vele verschillende organen en
weefsels voorkomen is er een spectrum aan transportsystemen nodig.
De virosomen beschreven in dit proefschrift zijn zeer goed in staat DNA en siRNA
aan gekweekte cellen af te leveren en bieden bovendien een goede bescherming tegen
enzymen die het DNA en siRNA afbreken. In eerder gepubliceerd werk is ook
aangetoond dat het mogelijk is virosomen naar een bepaald celtype (bv cellen die
betrokken zijn bij een ziekte) te sturen door een adapter die specifiek aan een bepaald
celtype kan binden aan de virosomen te koppelen. In vivo zijn met de siRNAvirosomen hoopvolle resultaten geboekt, terwijl er voor de DNA-virosomen ruimte
voor verbetering is. Vooropgesteld dat het probleem omtrent de DNA-virosomen
opgelost kan worden, zouden virosomen een belangrijke bijdrage kunnen leveren aan
de collectie van de andere veel onderzochte virale en non-virale transportsystemen,
zodat er een grote keuze uit transportsystemen is voor de vele verschillende ziekten
die in potentie te behandelen zijn met gentherapie of met een op siRNA gebaseerde
therapie.
- 198 -
Chapter 7
SAMENVATTING VOOR NIETINGEWIJDEN
- 199 -