Module DNA 1 - rshbiologie

DNAlab1: Solanum
Module DNA1
•
•
•
•
•
Waar gaat het om?
Apparatuur
Techniek en practicum
Resultaten
Verslag
Module: DNAlab1 Solanum
1
DNAlab1: Solanum
Waar gaat het om?
1. Vaststellen of enkele genen die
betrokken zijn bij de resistentie
tegen phythophtera in de
betreffende plant(en) aanwezig zijn.
2. Komen de uitkomsten overeen met
hetgeen kwekers van deze rassen
ook claimen?
Module: DNAlab1 Solanum
2
DNAlab1: Solanum
De techniek
1.
Monstername van 5 aardappelrassen.
In de vriezer zitten van 5 rassen
bladmateriaal:
1. Doré
2. Mona Lisa
3. Mozart
4. Texla
5. Irene
6. Biologische soort.
2.
We testen op de aanwezigheid van het R1
gen en het gen R3a.
Beide genen zijn gedocumenteerd als
betrokken zijnde bij de resistentie tegen
phythophtera; er zijn er meer!
3.
Eventuele controle of deze genen ook
aanwezig zijn in tomaat, erwt etc.
Verder..
Module: DNAlab1 Solanum
3
DNAlab1: Solanum
De techniek
Module: DNAlab1 Solanum
1.
DNA-isolatie
Het DNA moet uit het blad worden
gehaald. De fabrikant kent twee
methoden: directe procedure en de
verdunde procedure. Wij nemen de
verdunde procedure wegens de hogere
betrouwbaarheid.
2.
PCR
De PCR zal geprogrammeerd worden:
fase 1:
5 min 98 graden
fase 2:
10 sec 98 graden
(40x)
10 sec 52 graden
30 sec 72 graden
fase 3:
5 min 72 graden
3.
Gel-electroforese in 2% gel.
4
DNAlab1: Solanum
De Apparatuur
Module: DNAlab1 Solanum
1.
Pipetten.
Dit zijn dure dingen, vanwege de
preciezie waarmee ze werken.
Mogelijk zijn er al fixed-volume
pipetten aangeschaft.
2.
Finn-tips. Deze verbruiken we veel.
Een DNA-practicum moet brandschoon
zijn. Elke vervuiling met vreemd DNA
kan de proef verstoren; erger nog:
onbedoeld toevoegen van DNAse kan
DNA in no-time afbreken…
3.
Pipetpunten kosten een paar cent. Ga
ze niet sparen… je andere
ingredienten zijn 100-1000 x duurder!
5
DNAlab1: Solanum
De Apparatuur
Module: DNAlab1 Solanum
1.
2.
PCR: Techne CycloGene
3.
De cycler kan een programma aflopen
waarbij gedurende vooraf ingestelde
tijden een temperatuur wordt
ingesteld. De meeste wachttijd gaat
verloren met de overgang van de ene
temp naar de andere.
4.
5.
Deze cycler kan 96 epjes bevatten.
Dit is een apparaat van dik 3000 euro
welke de school tijdelijk in bruikleen
heeft. Voorzichtig graag.
De cycler heeft ook een heated lid;
epjes worden aan de bovenzijde
verwarmd.
6
DNAlab1: Solanum
De Apparatuur
Module: DNAlab1 Solanum
1.
Vortex.
Dit ding is hier gemaakt van een
omgekeerde schuurmachine zonder
schuurpapier. Hij schudt als een malle
en dat is het enige wat ie moet
kunnen.
2.
3.
Niet bang zijn; hij maakt veel herrie
4.
O ja…
Hou wel de epjes vast… anders
worden ze gelanceerd!
Je schudt vaak maar voor 10
seconden..
7
DNAlab1: Solanum
De Apparatuur
Module: DNAlab1 Solanum
1.
Centrifuge.
Deze machine draait (helaas) maar op
één snelheid: 15000 rpm. Eigenlijk is
dat te snel; 10000 zou beter zijn. Na
testen blijkt het plastic er tegen te
kunnen. Glazen buizen knallen stuk.
2.
Zorg bij het laden, dat er evenveel
massa links als rechts is..
8
DNAlab1: Solanum
De Apparatuur
Module: DNAlab1 Solanum
1.
De gel-chamber.
In deze chamber wordt de agarose-gel
gegoten (als ie nog warm is) en het
kammetje geplaatst.
2.
Als de gel hard is, wordt de kam
verwijderd.
3.
De chamber wordt op 50-100 Volt
aangesloten en de electrische stroom
neemt het DNA mee naar de pluspool.
4.
Voor het bekijken van het resultaat,
zit in de gel de (giftige) stof
EthidiumBromide. Dat kruipt in het
DNA en licht op na bestraling met UV.
9
DNAlab1: Solanum
De techniek
1. DNA isolatie
2. PCR
3. Gel gieten
4. Gel runnen
5. Resultaat bekijken.
Module: DNAlab1 Solanum
10
DNAlab1: Solanum
De techniek
DNA ISOLATIE 1
Module: DNAlab1 Solanum
•
Gebruik (latex) handschoenen
en vermijdt contact met de
binnenzijde van de epjes.
•
•
Neem een leeg epje van 0.2 ml.
•
Neem een schoon objectglaasje , een
(nieuw) mesje, groen tissue
•
Snijdt óp het glas een stukje
bladweefsel uit van 1,5 x 1,5 mm
groot. Laat dit in de buffer vallen
•
Neem je pipet punt en crush het blad.
Neem een 10-100 Pipet + schone
tipjes en piptetteer 20 uL Dilution
Buffer (staat klaar) in deze ep.
(Dit heb ik al voor je gedaan.)
11
DNAlab1: Solanum
De techniek
DNA ISOLATIE 2
Module: DNAlab1 Solanum
•
Als het goed is, toont de oplossing nu
een beetje groenig (chlorophyll)
•
Centrifugeer het epje bij 15000 rpm
gedurende 1 minuut. Zorg voor een
epje aan de overzijde van de
centrifuge dat nét zo vol is. (tarreren)
•
•
Neem nu een tweede epje van 0.2 ml
•
Pipetteer nu 0.6-0.8 uL van het
supernatant (1e epje) in het tweede
epje.
Pipetteer hierin eerst 10 uL PCR
buffer-mix. (hierin zitten de dNTP’s,
zouten en buffers)
12
DNAlab1: Solanum
De techniek
DNA ISOLATIE 3
•
Pipetteer nu 0.5 uL primer A erbij.
Druk je pipetpunt tegen de ep-wand
zodat de druppel dáár blijft zitten.
•
•
Doe hetzelfde voor primer B
•
Vortex heel kort en centrifugeer 20
sec.
•
Voeg nu 0.5 uL taq-DNApolymerase toe
en zet deze kleine hoeveelheid ook
tegen de epwand. Gezien de hoge prijs van
Voeg nu toe 8.5 uL dNase-vrij water
toe
dit spul: ik doe dat wel.
•
Module: DNAlab1 Solanum
Vortex kort en centrifugeer 20 sec.
13
DNAlab1: Solanum
De techniek
DNA PCR 1
Onderstaande procedure zet ik klassikaal
in. Het proces neemt 4-5 uur in beslag.
Module: DNAlab1 Solanum
•
1.
2.
3.
Stel de PCR in op programma 20
4.
5.
Selecteer rechts bovenin nummer 20
6.
7.
Start door op [run] te drukken.
aanzetten
Heated lid aanzetten (achterin!)
Druk op [mode] en wacht tot de
melding over het gebruik verdwijnt..
Laadt de epjes ergens in de 96
welletje.
Controleer even of de temp oploopt
naar 98 graden.
Je kan nu wat anders gaan doen….
14
DNAlab1: Solanum
De techniek
DNA Gel voorbereiden
Module: DNAlab1 Solanum
•
Je PCR loopt nu dik 4 uur. Die tijd
wachten we niet af. De docent zal de
verdere verwerking doen.
•
•
•
Neem een schone erlenmeyer 250 ml.
•
Gebruik de microwave om kort te
verwarmen. Kan ook met
bunsenbander.
•
Alle agarose moet gesmolten zijn; een
heldere oplossing.
•
Dit is nu HEEEL heet. Laat afkoelen
tot 50-60 graden
Pipetteer 80 ml TBE buffer erin (1X)
Weeg af op de balans 1,6 gram
agarose en voeg die toe.
15
DNAlab1: Solanum
De techniek
DNA Gel gieten
Module: DNAlab1 Solanum
•
Pipetteer 4 uL Ethidium Bromide in de
erlenmeyer met afgekoelde agarose-opl.
•
Giet zonder luchtbellen de agarose in de
chamber.
•
Plaats het kammetje bij de markering
links en zorg dat dit rechtop staat en ca 8
mm van de linker ‘dam’wand. Zet de bak
HORIZONTAAL.
•
Als de gel hard is (na 40 min) kan je
damwandjes weghalen.
•
Vul de chamber met dezelfde TBE
bufferoplossing (ca 400 ml nodig) als
waarmee de gel gemaakt is. Er staat ca 3
mm vloeistof boven de gel, die dus geheel
ondergedompeld is.
16
DNAlab1: Solanum
De techniek
DNA Gel laden
• Als het klopt, zou na 4-5 uur de PCR wel klaar
moeten zijn. Zet de epjes weer in de goede
volgorde in het rekje.
Module: DNAlab1 Solanum
•
Voeg aan elk epje 5 uL loading dye toe. Dit
bestaat grotendeels uit glycerine en maakt het
laden makkelijker doordat dit zwaarder is dan
de TBE-buffer in de gel.
•
Vortex all epjes met loading dye. Centrifuge
mag, maar is nu niet zo nodig.
•
Neem 3 uL DNAladder in een schone ep en vul
aan met 5 uL loading dye en 10 uL water. Vortex
even.
•
Pipetteer steeds met schone nieuwe punt 18-20
uL van elk epje in een welletje.
Kies welletje 5 voor de DNA ladder. (centrale
positie). Noteer goed waar welke ep-inhoud in
gedaan is. Je kan het nergens meer aan zien!
17
DNAlab1: Solanum
De techniek
DNA Gel runnen
• De gel is nu geladen met 9 welletjes.
Noteer goed wat waar in zit. En verwerk dat
ook zo in je verslag.
Module: DNAlab1 Solanum
•
Steek de stekkers erin MIN = LINKS, PLUS =
RECHTS. DNA loopt van MIN naar PLUS!!!
•
•
•
Stel in op 50 Volt.
•
Giet de TBE buffer in een afsluitbare bak ( deze
kan hergebruikt worden).
•
Neem de gel niet uit de bak; deze bekijken we
in het donker met een UV lamp.
Maak (als het lukt een foto van het resultaat).
Na 10-15 min plug je de stekkers in op 100 Volt.
Na 6 kwartier kan je de run stoppen. (foto
hiernaast was na 4 kwartier..
18
DNAlab1: Solanum
De techniek
DNA Gel bekijken
Module: DNAlab1 Solanum
19
DNAlab1: Solanum
De resultaten
Module: DNAlab1 Solanum
•
Probeer een foto te hebben van de
gel.
•
Op de foto zijn hier en daar bandjes
te zien. Met behulp van de DNAladder
kan je schatten hoe groot de DNA
fragmenten moeten zijn.
•
Sommige bandjes zijn helder, ander
soms erg vaag. Een kwestie van
hoeveelheid.
•
Noteer goed welke bandjes je
waarneemt bij welke wel.
•
Mogelijk zie je twee bandjes in een
laantje.
20
DNAlab1: Solanum
Het verslag.
Je verslag bevat deze onderdelen:
Module: DNAlab1 Solanum
1.
2.
3.
Inleiding
4.
Resultaten met digitale foto van de
gels.
5.
Discussie.
Hier bespreek je de resultaten en trek
je conclusies. Doe ook voorstellen
voor verbetering of alternatieve
uitvoeringen van het practicum.
6.
Einde.
Doelstelling, verwachting,
Materiaal en werkwijze met uitvoerig
hoé alles wordt uitgevoerd.
21