Specifieke monitoringstechnieken

Tabel 2. Toepassingsgeschiktheid van verschillende moleculaire detectietechnieken
Microbial groups
Detection
Target gene
Total Bacteria
Bacterial 16S rRNA
Remark
Total Archaea
Archeal 16S rRNA
Denitrifying bacteria
Nitrate reductase (NarG)
Denitrifying bacteria
Nitrite reductase (NirS or NirK) NO2 → NO
Denitrifying bacteria
Nitrous oxide reductase (NosZ) N2O → N2
Iron-reducing bacteria
Geobacteriales 16S rRNA
Sulphate-reducing
bacteria
Sulfite-reductase (dsrA or dsrB)
Microbial corrosion
Fe-hydrogenase (hydA)
NiFeSe-hydrogenase (hysA)
NO3 → NO2
Methanogenic Archaea Methyl-CoM reductase
Pathogenic bacteria
Detection
Target gene
Cyanobacteria
Cyanobacteria 16S rRNA
Microcystis 16S rRNA
McyD toxine
Remark
Legionella sp.
5s rRNA
mipA
Legionella group
Legionella pneumophila
Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae 16S rRNA
Indicator of faecal contamination
Eschericha coli
Glucuronidase
Indicator of pathogenic faecal
contamination
Biological transformation of pollutants
Detection
Target gene
Mineral oil*
Alkane mono-oxygenase (alkA) Alkane hydroxylation
BTEX*
Catechol-1,2-dioxygenase
Catechol-2,3-dioxygenase
Aerobic ring-cleavage
TEX
Benzylsuccinyl-CoA synthase
(BssA)
Anaerobic ring-cleavage
MTBE
MTBE mono-oxygenase (MM)
MTBE → TBA
Isobutyryl-CoA mutase (ICMA) Degradation of 2-HIBA
1,2-dichloroethane
Alkane dehalogenase (dhlA)
Aerobic dechlorination
16S rRNA specific for Dehalococcoides, Desulfitobacterium
and/or Dehalobacter
Anaerobic dechlorinating
bacteria
in principe volledige afbraak van PER en TRI (via CIS
en VC) naar etheen plaatsvinden. De aanwezigheid
van het enzym VC-reductase, de laatste stap in het
afbraakproces dat zorgt voor omzetting van VC naar
etheen, geeft hier uitsluitsel over.
Waarvoor wordt een DNA-analyse ingezet?
De resultaten van een DNA-analyse leveren belangrijke informatie bij:
• Het vaststellen van de potentie voor natuurlijke
afbraak. De aanwezigheid van afbraakproducten
op een specifieke plaats kan verschillende oorzaken hebben (aanvoer van elders of afbraak in het
verleden of heden). Het aantonen van een levende
populatie specifieke bacteriën duidt op afbraak op
het moment van onderzoek, op de onderzoekslocatie;
• Bepalen of stagnerende afbraak van de verontreiniging ver­oorzaakt wordt door een gebrek aan
(actieve) bacteriën. Indien de leefomstandigheden
voor deze bacteriën wel geschikt zijn kan in dat
geval water met een geschikte bacteriepopulatie
worden toegevoegd aan het grondwater.
16S rRNA specific for Dehalo- Anaerobic dechlorinating
coccoides, Desulfitobacterium, bacteria
Sulfurospirillum, Dehalobacter,
Desulfuromonas and/or Desulfomonile
TCE
Trichloroethene reductase
(TceA)
Methode, voorwaarden en kosten
Uit een grond- of grondwatermonster wordt DNA
geïsoleerd en vervolgens kwalitatief of kwantitatief
geanalyseerd met resp. een PCR of real-time PCR
techniek. Voor het verifiëren van de aanwezigheid van
(voldoende) bacteriën en/of enzymen is een beperkt
aantal monsters nodig. Momenteel kunnen de bacteriën en enzymen die in tabel 2 worden genoemd,
bepaald worden. De kosten voor kwantitatieve DNAanalyses zijn € 375 per stuk. Kwalitatieve analyses
kosten circa € 90- € 130 per monster.
Contact
Afdeling Geo milieu onderzoekslaboratorium
Unit Bodem- en Grondwatersystemen
TCE → cis-DCE
Cis-DCE & VC
Dehalococcoides spp. 16S rRNA Anaerobic dechlorinating
bacteria
VC
Vinylchloride reductase (vcrA
and/or bvcA)
Anaerobic, VC → ethene
VC
Expoxyalkane coenzyme M
transferase (EaCoMT)
Aerobic VC degradation
Fredericke Hannes
[email protected]
T 088 335 78 32
* In development
uBGS 009 A3NL juli2010 Langenhoff
Dr.ir. Alette Langenhoff
[email protected]
T 088 335 78 66
Postbus 85467
3508 AL Utrecht
T 088 335 77 75
F 088 335 78 56
[email protected]
www.deltares.nl
Aanvulling bij complexe bodemsanering
Specifieke monitoringstechnieken bieden bij bodemonderzoek, saneringsonderzoek en -uit­
voering een belangrijke of zelfs noodzakelijke aanvulling op technieken die zijn gericht op het
bepalen van standaard parameters. Deze specifieke technieken hebben vooral een meerwaarde
Remarks
PCE & TCE
Specifieke monitoringstechnieken
Deltares is een onafhankelijk kennisinstituut en specialistisch adviseur voor deltatechnologie. We werken wereldwijd aan innovatieve oplossingen voor water, ondergrond- en deltavraagstukken, die het leven in delta’s, kusten riviergebieden veilig, schoon en duurzaam maken.
in complexe situaties of wanneer standaard monitoringsparameters (oa redoxparameters,
concentratie verontreiniging) onvoldoende inzicht geven in de processen die plaatsvinden. Ook
kunnen ze worden ingezet om na te gaan waarom de gewenste processen juist stagneren.
Specifieke monitoringstechnieken bieden bij bodemonderzoek, saneringsonderzoek en -uitvoering een
belangrijke of zelfs noodzakelijke aanvulling op technieken die zijn gericht op het bepalen van standaard
parameters. Deze specifieke technieken hebben vooral een meerwaarde in complexe situaties of wanneer
standaard monitoringsparameters (oa redoxparameters, concentratie verontreiniging) onvoldoende inzicht
geven in de processen die plaatsvinden. Ook kunnen ze
worden ingezet om na te gaan waarom de gewenste
processen juist stagneren.
meest voorkomende biologische omzettingsproces.
Ook de lager gechloreerde verbindingen die hierbij als
afbraakproduct ontstaan zoals cis-1,2-dichlooretheen
(CIS) en vinylchloride (VC) kunnen via dit proces verder
worden afgebroken tot onschadelijke producten.
PER
TRI
CIS
VC
etheen
Cl
Cl
Cl
H
H
H
H
H
H
H
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
H
H
H
H2 HCl
H2 HCl
H2 HCl
H2 HCl
Figuur 1Volledige reductieve dechlorering van tetrachlooretheen (PER).
Specifieke monitoringstechnieken geven inzicht in:
• Aanwezigheid van potentie voor natuurlijke afbraak
van verontreinigingen;
• Bewijs voor chemische of biologische afbraak;
• Oorzaak van tegenvallende afbraak of niet plaatsvinden van afbraak;
• Processturing tijdens chemische of gestimuleerde
biologische afbraak;
• Afbraaksnelheid;
• Moment van afbraak: nu of in het verleden.
In bovenstaande figuur wordt als voorbeeld de
volledige reductieve dechlorering van PER beschreven.
Hierbij wordt een chlooratoom vervangen door
een waterstofatoom en ontstaan uiteindelijk de
onschadelijke producten etheen en ethaan. De
benodigde waterstof wordt geproduceerd doordat de
bacteriën organische stof afbreken door middel van
een oxidatieproces waarbij de organische stof fungeert
als electronendonor.
1. Waterstof (H2)
Voor hoog gechloreerde componenten zoals tetrachlooretheen (PER), hexachloorbenzeen (HCB) en polychloorbifenylen (PCB’s) is reductieve dechlorering het
Welke informatie kan worden afgeleid uit
de waterstofconcentratie?
De concentratie waterstof in het grondwater geeft
informatie over:
• De condities voor reductieve dechlorering (tabel 1);
• De geschiktheid van natuurlijke organische stof of
toegevoegd substraat als electronendonor;
• De noodzaak om een electronendonor (substraat) toe
te voegen;
• De zone waar electronendonor (substraat) toegevoegd moet worden;
• De verspreiding van toegevoegd substraat uit het
grondwater.
Tabel 1 Relatie reductieproces en waterstofconcentratie
Waterstofconcentratie (nM)
< 0,1
0,2 - 0,8
1-4
>1
5 - 20
→
→
→
→
→
Proces
Nitraat reductie
Fe(III)-reductie
Sulfaat reductie
Reductieve dechlorering
Methanogenese
Vaak wordt opgelost organisch koolstof (Dissolved Organic Carbon, DOC) voorafgaand aan en tijdens de sanering
gebruikt als indicatie voor de hoeveelheid substraat die
aanwezig is. Omdat niet alle organische stof geschikt is
als electronendonor, geeft DOC een minder betrouwbaar
beeld dan de waterstofconcentratie.
Waarvoor worden waterstofmetingen gebruikt?
Samenvattend kunnen waterstofmetingen als aanvulling
op standaard monitoringstechnieken worden ingezet
voor de volgende situaties:
• Bepalen van de potentie voor natuurlijke afbraak
(reductieve dechlorering);
• Processturing tijdens gestimuleerde biologische
afbraak van VOCl:
• Hoeveelheid en zone van toe te voegen substraat;
• Effectiviteit van het substraat.
Methode, voorwaarden en kosten
Waterstof wordt in het veld bepaald door grondwater uit
een peil­buis op te pompen via een doorstroomcel met
hierin een kleine gasfase. Een monster uit deze gasfase
wordt vervolgens in het veld direct op een mobiele gaschromatograaf (GC) ge­ana­lyseerd. De bepaling kan niet
worden uitgevoerd in recent ge­plaatste peilbuizen. Indien
grondwater via een lang leidingenwerk wordt bemonsterd, is de waterstofmeting minder betrouwbaar.
Figuur 2Waterstofmeting in het veld
Momenteel worden in Nederland alleen door ons lab waterstofmetingen verricht, door een team van twee personen. Wanneer de meetpunten op korte afstand van elkaar
liggen, kunnen circa 15 metingen (meetpunten) per dag
worden uitgevoerd. De kosten voor 15 waterstofmetingen bedragen circa € 2.500,- tot € 3.000,-. De metingen
kunnen tijdens deze dag in combinatie met monsterneming ten behoeve van standaardanalyses worden uitgevoerd. De veldmeting resulteert direct in bruikbare resultaten voor het bepalen van de potentie voor natuurlijke
afbraak, de geschiktheid van een substraat en de ruimtelijke verdeling ervan.
2. Verbindingsspecifieke stabiele isotopen
Organische componenten bestaan van nature uit verschillende stabiele isotopen. Zo bestaat natuurlijk koolstof uit een mengsel van koolstof-12 (12C, 98,89%) en
koolstof-13 (13C, 1,11%) en een klein beetje koolstof-14
(14C, minder dan 0,001%). Het is bekend dat bacteriën
verbindingen met lichte isotopen preferentieel afbreken,
waardoor in het geval van koolstof de verhouding 13C:12C
(de “δ13C-ratio” of isotopenratio) van de resterende verbinding (de uitgangsstof) verandert als het gevolg van
afbraak (Fig 3).
12 C
12 C
12 C 12
C 13 C
13 C 12
12 C
C 12 C
12 C
13 C 12 C12 C
12 C
13 C 1213
C C 12 C
12 C
12 C
1313
CC
12 C
12 C
12 C13 C
12 C
13 C
Figuur 3Principe van fractionering; verandering van de koolstof-isotopenratio van de uitgangsstof bij afbraak
Ook bij chemische omzetting of vervluchtiging treedt dit
proces op en neemt de verhouding 13C:12C toe. Dit proces
wordt fractionering genoemd. Deze analyses zijn onafhankelijk van de concentratie. Naast isotopenanaly­ses
op koolstof kunnen ook isotopenanalyses op waterstof
(1H en 2H) en chloride (35Cl en 37Cl) worden uitgevoerd.
Informatie afleiden
De ratio van stabiele isotopen in een verontreiniging en
de verandering van deze ratio in de tijd (fractionering)
bieden de volgende informatie:
• Een toename van de isotopenratio in de tijd duidt op
afbraak van de verontreiniging (hierbij is een traject
van bron naar pluim ook equivalent met tijd). Deze
ratio is geschikt voor het aantonen van Natuurlijke
Afbraak op een locatie;
• Voor verontreinigingen waarbij tijdens afbraak geen
specifiek aantoonbare of meetbare afbraakproducten worden gevormd, is een isotopenanalyse een
zeer waardevolle aanvulling voor het aantonen van
natuurlijke afbraak;
• Op basis van fractionering kan de afbraaksnelheid
van uitgangsproducten berekend worden;
• Op basis van verschillen in de isotopenratio kunnen
bronnen van verontreiniging worden onderscheiden. Op
basis van overeenkomsten kan de herkomst van een
verontreiniging worden bepaald (bronnen/pluimen);
• De isotopenratio is onafhankelijk van de concentratie.
Wanneer worden isotopen analyses toegepast?
Verschillen en overeenkomsten in isotopenratio’s zijn een
duidelijke meerwaarde en aanvulling op standaard monitorings- en onderzoeksprogramma’s voor de volgende
situaties:
• Aantonen of afbraak heeft plaatsgevonden;
• Een onderscheid maken of concentratieverlaging het
gevolg is van afbraak of als gevolg van verdunning,
adsorptie of transport. Bij deze laatste (fysische)
processen treedt geen fractionering op;
• Het achterhalen van bronnen van verontreiniging;
• Op basis van isotopenfractionering en literatuurgegevens over het omzettingsproces kan de afbraaksnelheid van uitgangsproducten berekend worden en is de
saneringsduur te voorspellen.
Een afnemende concentratie van een verontreiniging in
een monitoringspeilbuis kan het gevolg zijn van afbraak
van de verontreiniging maar ook van verdunning, adsorptie of ve­rspreiding. Vooral wanneer geen specifieke
afbraakproducten worden gevormd is het van belang om
met behulp van de isotopen­fractionering aan te tonen
dat afbraak plaatsvindt.
De isotopenratio is kenmerkend voor een specifieke verontreiniging. Door de isotopenratio van de verontreiniging op verschillende plaatsen te vergelijken, kunnen afzonderlijke bronnen van verontreiniging geïdentificeerd
worden en kunnen primaire en secundaire bronnen en
pluimen aan elkaar gerelateerd worden.
Wanneer de tijdsduur bekend is waarin fractionering
heeft plaatsgevonden, kan ook de afbraaksnelheid worden berekend.
Methode, voorwaarden en kosten
Tijdens analyse van verbindingsspecifieke stabiele isotopen wordt de isotopenratio van een element in een specifieke verbinding bepaald, zoals koolstof of waterstof in
bijvoorbeeld benzeen.
Voor isotopen met een hoge molecuul massa, zoals PAK
of PCB, is de toepasbaarheid van de methode beperkt
omdat fractionering gelimiteerd is. De methode is in ieder geval geschikt voor het aantonen van afbraak van
BTEX, naftaleen, MTBE, gechloreerde koolwaterstoffen en
cyanide.
Afhankelijk van de te onderzoeken verontreiniging
wordt bepaald welk element het meest geschikt is voor
de isotopen­analyse. Zo leidt afbraak van benzeen bijvoorbeeld tot geringe fractionering van koolstof maar
tot significante fractionering van waterstof. Wanneer de analyse gebruikt wordt om afbraak aan te tonen is een beperkt aantal analyses voldoende. Indien
isotopenratio’s worden beschouwd in verband met het
vaststellen van afbraaksnelheden is het benodigde aan-
tal analyses groter, afhankelijk van de ruimtelijke verspreiding op de onderzoekslocatie.
Zowel voor het vaststellen van afbraak als voor het bepalen van de afbraaksnelheid is een tijdserie van isotopenratio’s nodig. Monitoring kan worden uitgevoerd door op
een punt een aantal keer in de tijd monsters te nemen
en te analyseren; het is ook mogelijk om plaats-voor-tijd
substitutie toe te passen. Hierbij worden op één moment
monsters genomen op verschillende plaatsen in een
stroombaan. Wanneer de stroomsnelheid van het grondwater bekend is, kan worden uitgerekend hoe lang het
heeft geduurd voordat grondwater van stroomopwaarts
naar stroomafwaarts is verplaatst.
Voor de isotopenanalyse worden grondwatermonsters
genomen. De kosten voor een analyse van de isotopenratio variëren van circa € 250,- tot € 450,- per monster;
afhankelijk van de isotoop, het aantal specifieke componenten in een monster en het aantal analyses per meetronde.
3. Bacteriën en enzymen: DNA analyse
In de bodem en het grondwater zijn micro-organismen
(met name bacteriën en schimmels) verantwoordelijk
voor de afbraak van verontreinigingen. Hiervoor gebruiken micro-organismen enzymen. Een snelle, specifieke,
gevoelige en kwantitatieve detectie van verschillende
soorten micro-organismen en hun enzymen is belangrijk
voor het aantonen en monitoren van natuurlijke afbraakprocessen (NA) en het sturen van gestimuleerde bodemsaneringen.
Klassieke detectiemethoden zijn vaak gebaseerd op het
kweken van bacteriën in het laboratorium. Van de bacteriën die in water, bodem en sediment voorkomen is
echter minder dan één procent kweekbaar. Daarom ontwikkelt en gebruikt Deltares moleculaire detectiemethoden die gericht zijn op het aantonen van genetische
informatie (DNA en RNA) van specifieke micro-organismen en hun enzymen. Deze technieken zijn bij uitstek
geschikt om de diversiteit van complexe microbiële ecosystemen te helpen ontrafelen en specifieke processen
aan te tonen. In combinatie met klassieke methoden
- zoals microscopie, kweken, vloeistof- en gaschromatografie en chemische analyse - vormen moleculaire
technieken een krachtig middel voor een efficiënte diagnose. Moleculaire detectie kan daarbij aantonen
welke bacteriën aanwezig zijn en in welke mate. Ook is
het op deze wijze mogelijk om te bepalen welke microorga­nismen actief zijn en welke afbraakmechanismen
optreden.
Momenteel worden in Nederland in de saneringspraktijk
voornamelijk DNA-analyses uitgevoerd naar de bacteriën
die zorgen voor reductieve dechlorering van VOCl. Indien
de bacterie Dehalococcoides spp. wordt aangetoond kan