DNA/RNA extracties uit FFPE weefsel

H.-Hartziekenhuis Roeselare - Menen vzw
Wilgenstraat 2 - 8800 Roeselare
DNA/RNA extracties uit FFPE weefsel
Dr. Sc. Elke Boone, H.-Hartziekenhuis Roeselare-Menen
Belang van intacte DNA/RNA moleculen voor
moleculaire diagnostiek
  Diagnostiek gebaseerd op de analyse van moleculen.
Moleculaire Diagnostiek: PCR analyses
Intact DNA!
Zuiver DNA!
Geen contaminatie!
Moleculaire Diagnostiek: RT-PCR analyses
Intact RNA!
Inactivering van de endogene RNasen!
Moleculaire Diagnostiek: FISH analyses
Intacte morphologie!
Pre-analytische fase?
  Periode voorafgaand aan de eigenlijke analyse
van het staal in het laboratorium.
  Belangrijke component in de
laboratoriumgeneeskunde, en dus ook in de
moleculaire diagnostiek.
  Belangrijke bron van foute resultaten.
Staaltransport
  Gouden regel voor de afname:
onmiddellijk na afname doorsturen op
kamertemperatuur naar laboratorium!
  Stabilisering van het staal gebeurt in het
laboratorium!
  Doel: morfologie, DNA en RNA moleculen intact
houden!
  Verzendingen: labo weet hoe, wat en wanneer
  Interne staalverwerking om batch analyse toe te
laten
Staaltransport
  Gouden regel voor de afname:
onmiddellijk na afname doorsturen op kamertemperatuur naar
laboratorium!
  “Intern labotransport” verlengt tijd tot stabilisering
  Primaire aanvraag: onmiddellijk stabilisering
  MAAR! moleculaire analyses worden vaak pas in 2de lijn
aangevraagd:
  door klinisch bioloog na het vaststellen van een
hematologische maligniteit in bloed, beenmerg, klieren,
etc…
  door patholoog na het vaststellen van de aanwezigheid
of sterk vermoeden van een tumor in de genomen
biopsie
Staalvoorbereiding
  Afhankelijk van type staal, type analyse (FISH, DNA of RNA)
en/of nucleïnezuur extractiemethode
  Perifeer bloed of BM
  FISH-analyse:
  onmiddellijk uitstrijkjes maken! (CLL, fragiele cellen)
  Fixeren in EtOH
  DNA-analyse:
  invriezen < -17°C (Qiagen extractie)
  Lyseren en dan invriezen (EasyMAG extractie)
  RNA-analyse:
  verwijdering van RBC (niet-relevant RNA)
  Lyseren en invriezen van WBC om RNasen te
inactiveren
Staalvoorbereiding: biopten en/of FFPE weefsel
 
 
 
 
 
 
Staal type
Staal verwerving
Fixatie
Paraffine inbedding
Kleuring (niet goed)
Opslag (voor RNA best bij 4°C)
  Deparaffiniseren
  Opzuiveren van DNA/RNA
  PCR analyse
Staalvoorbereiding: biopten en/of FFPE weefsel
  Elk weefsel heeft een specifieke fysiologische
functie, een unieke structuur en opbouw van
celtypes
  Degradatiesnelheid, eventuele inductie en
modificatie van biomoleculen is weefsel
specifiek
  Tengevolge van anesthesie, ligatie van
bloedvaten en het uitsnijden van het weefsel
kunnen biomoleculen veranderen.
  Zo vlug mogelijk verwijderen en fixeren/
stabiliseren!!!!
Staalvoorbereiding: biopten en/of FFPE weefsel
Staalvoorbereiding: FFPE weefsel
  Type buffer
  Neutrale, gebufferde, formaline (minder degradatie van
formaline, beter voor de DNA kwaliteit)
  Geen Bouin of picric acid
  Dikte van het weefsel
  Hoeveelheid buffer
  Fixatieduur
  Onderfixatie: DNA/RNA of eiwit afbraak of verandering
  Overfixatie: teveel crosslinking, slechte DNA kwaliteit
Staalvoorbereiding: paraffine embedding
  Dehydratatie: water wordt vervangen door alcohol, meestal ethanol
  Moet volledig zijn want restwater kan tot degradatie leiden van bv. eiwitten
  “Clearing”: alcohol wordt vervangen door xyleen of equivalent
  “Impregnation”: xyleen wordt vervangen door paraffine
  “Embedding” : staal wordt volledig omgeven door paraffine
  Daarom:
  Niet verdunde reagentia moeten gebruikt worden (geen water
verdunningen)
  Verse reagentia (alcohol en xyleen) om wateroverdracht te vermijden
  Tijdsduur en temperatuur moeten optimaal zijn
  Samenstelling en smelttemperatuur van paraffines kan verschillen: geen
“beeswax” additiven en paraffine met hoge smelttemperaturen gebruiken
(meer degradatie)
Qiagen DNA-extractie uit FFPE weefsel
Kwaliteitscontrole
  DNA-kwaliteit
  Concentratie van de
bekomen DNA-oplossing
  OD260/280 ratio
(1.8-2.0)
  Amplificeerbaarheid van
het DNA:
  Mate van
irreversibele
crosslinking
  Fragmentatie van
DNA
BM
FFPE
Tonsil
Kwaliteitscontrole
Darmbiopten - FFPE
KRAS exon 2 - 234bp
KRAS exon 3 - 261bp
Kwaliteitscontrole
Longbiopsies - FFPE
Kwaliteitscontrole
96bp, 206bp, 400bp,
613bp, en 785bp
  Penetratiesnelheid formaline: 1 mm per uur
  Snelheid omgekeerd evenredig met de dikte van het weefsel
  Dikte moet optimaal zijn om overfixatie aan de rand, en
onderfixatie in het centrum te vermijden
Kwaliteitscontrole
  RNA-kwaliteit
  Concentratie van de bekomen RNA-oplossing
  OD260/280 ratio (1.8-2.0)
  Amplificeerbaarheid van het RNA:
 Mate van irreversibele crosslinking
 Mate van afbraak door RNasen
Kwaliteitscontrole
  Ratio buffer/weefsel best 10:1
  Niet langer dan 24h fixeren om verhoogde crosslinking te
vermijden