University of Groningen Regulation of polarity development in

University of Groningen
Regulation of polarity development in hepatocytes
van der Wouden, Johanna
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2004
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Wouden, J. M. V. D. (2004). Regulation of polarity development in hepatocytes: a novel role for oncostatin
M Groningen: s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
SAMENVATTING
Nederlande samenvatting
Samenvatting
Epitheelcellen vormen een belangrijk deel van onze lichaamscellen. Zij
verzorgen de bekleding van holle organen en kanalen, zoals bijvoorbeeld
in het maag-darmstelsel, de nieren en de lever. De algemene opbouw van
epitheel hangt nauw samen met zijn functie om de holte van een orgaan
of kanaal en de onderliggende weefsels en/of bloedvaten van elkaar te
scheiden. Het epitheel vormt dus een cellaag tussen het lumen en het
onderliggende weefsel waarbij de epitheelcellen aan elkaar gekoppeld zijn
met verbindingscomplexen of “tight junctions” (TJ). De tight junctions
zorgen niet alleen voor de koppeling tussen cellen maar gaan door tot in
de plasmamembraan van de cel waardoor deze in twee afzonderlijke delen
wordt opgedeeld: de cel is polair. Het membraandomein dat in contact
staat met het lumen wordt de apicale plasmamembraan genoemd, het
deel dat in contact staat met het onderliggende weefsel en/of de
bloedvaten wordt de basolaterale plasmamembraan genoemd (zie figuur
1). In de lever wordt de apicale membraan ook wel galcanaliculaire
membraan (BC) genoemd. De in de lever geproduceerde galzouten worden
over de galcanaliculaire membraan getransporteerd, alsmede specifieke
vetten, en afgevoerd naar de galblaas. Gal helpt bij de vertering van
vetten in de darm.
De plasmamembraan bestaat uit lipiden en eiwitten. Grofweg kunnen we
drie klassen van lipiden onderscheiden: de fosfolipiden, cholesterol en de
(glyco)sfingolipiden. In de plasmamembraan van epitheelcellen zijn deze
laatste
niet
gelijk
verdeeld
over
de
beide
membraandomeinen.
Glycosfingolipiden zijn verrijkt in de apicale membraan waar zij o.a. een
rol zouden kunnen spelen bij de bescherming van de plasmamembraan.
In de cel worden, vanuit het basismolecuul (precursor) ceramide, de
(glyco)sfingolipiden in het Golgi apparaat gesynthetiseerd. Om een
specifieke
verdeling
van
sfingolipiden
en
eiwitten
over
de
membraandomeinen te bewerkstelligen, is een epitheelcel gespecialiseerd
in het sorteren en transporteren van membraancomponenten. Voor de
sortering van membraancomponenten heeft de cel enkele
166
Nederlandse samenvatting
Figuur 1: Schematische voorstelling van gepolariseerde HepG2 cellen.
Links: Het transport van SM en GlcCer van uit de SAC in controle (CTRL)
situaties. Rechts: Het transport van SM en GlcCer na stimulatie met Oncostatin
M (OSM) of activatie van protein kinase A (PKA). PM, plasma membraan; BC, gal
kanaal; TJ, tight junction; SAC, sub-apicaal compartiment; SM, sfingomyeline;
GlcCer, glucosylceramide.
sorteringsstations.
Simpel
gezegd
zijn
dit
intracellulaire
membraanstructuren die verschillende soorten blaasjes (vesikels) kunnen
afsnoeren die dan met de transportmachinerie naar de juiste locatie
vervoerd worden. Een van de belangrijke sorteringscentra in de hepatocyt
(de epitheelcel van de lever) is het sub-apicale compartiment (SAC) dat,
zoals de naam al aangeeft, vlak onder de apicale plasmamembraan ligt. In
dit proefschrift wordt gebruik gemaakt van fluorescerende lipiden zodat
hun intracellulaire locatie, sortering en transport kunnen worden gevolgd
bij de ontwikkeling van plasmamembraan polariteit.
Tijdens de ontwikkeling van de lever is het van belang dat de
plasmamembraan polariteit op de juiste manier wordt gevormd en dat die
gehandhaafd blijft zodat de functie van de lever niet in gevaar komt. Om
de biogenese van de apicale membraan te kunnen bestuderen, is er
gebruik gemaakt van een lever cellijn (HepG2), die gekweekt kan worden
in het laboratorium en die zich na enige tijd ontwikkelt tot een
gepolariseerde cel met een apicaal en basolateraal plasmamembraan
167
Nederlande samenvatting
domein. Gedurende de ontwikkeling van deze epitheliale morfologie is de
sortering van sfingomyeline of galactosylceramide (sfingolipiden) vanuit
SAC richting de apicale plasmamembraan (PM) bestudeerd. In een
“volwassen” volledig gepolariseerde HepG2 cel worden sfingomyeline en
galactosylceramide vanuit het SAC naar de basolaterale membraan
getransporteerd. Een ander sfingolipide, glucosylceramide, wordt in beide
situaties vanuit het SAC naar de apicale, canaliculaire membraan
getransporteerd. In hoofdstuk 2 wordt de ontwikkeling of biogenese van
de apicale plasmamembraan beschreven onder invloed van de cytokine
Oncostatin M (OSM) en wordt het effect daarvan op de sortering van het
sfingolipide sfingomyeline onderzocht. Een cytokine is een bio-actief
eiwitmolecuul dat door cellen wordt afgegeven, en dat specifieke functies
heeft op het gebied van cel-communicatie en het gedrag van andere cellen
kan beinvloeden. OSM is een cytokine dat behoort tot de familie van de
IL-6 cytokines. Deze cytokines, die binden aan specifieke receptoren op
het cel oppervlak, hebben naast een eigen, d.w.z. cytokine-specifiek,
receptordeel, een gemeenschappelijk receptordeel, het gp130, dat zorgt
voor de overdracht van het cytokinesignaal in de cel (signaal transductie).
Als HepG2 cellen worden gekweekt in de aanwezigheid van OSM wordt de
biogenese van de apicale PM gestimuleerd. Dat wil zeggen dat er meer
cellen zijn die een apicale PM vormen en dat de gevormde apicale
domeinen groter zijn van omvang dan in cellen die niet behandeld zijn.
Dit noemen we hyperpolariteit.
Het gp130 receptordeel, dat aanwezig is in de basolaterale PM, is nodig
voor het verkrijgen van deze hyperpolariteit. Door binding van OSM aan
de receptor vindt er een clustering van gp130 plaats in zogenaamde
“rafts”
in
de
PM
waardoor
er
een
platform
voor
efficiënte
signaaltransductie ontstaat. “Rafts” zijn kleine “zwevende” plasma
membraandomeinen die bestaan uit sfingolipiden en cholesterol. Door
cholesterol uit de PM te verwijderen en daarmee de raft-structuur te
elimineren, kon worden aangetoond dat raft-associatie van gp130 een
vereiste is om hyperpolariteit door OSM te krijgen.
168
Nederlandse samenvatting
Zoals al eerder is opgemerkt, is de sortering en het transport van
sfingolipiden belangrijk voor de gepolariseerde bouw van de PM. Onder
standaardcondities
(in
een
optimaal
gepolariseerde
cel)
wordt
sfingomyeline naar de basolaterale PM getransporteerd terwijl tijdens de
ontwikkeling,
dus
in
jonge
sub-optimaal
gepolariseerde
cellen,
sfingomyeline naar de apicale PM wordt gesorteerd. Ook na behandeling
met OSM is deze “switch” in sfingomyeline transport vanuit SAC naar de
apicale (i.p.v. naar de basolaterale PM zoals in controle cellen) gevonden.
Concluderend kan worden vastgesteld dat OSM de biogenese van de
apicale
PM
stimuleert
door
signaaltransductie
via
gp130
op
de
basolaterale PM en dat OSM een apicaal gerichte transport route activeert
die gemarkeerd wordt door sfingomyeline, en dat die transport route
specifiek betrokken is bij PM polariteit ontwikkeling.
Sfingolipiden spelen niet alleen een rol in de ontwikkeling van de apicale
membraan maar zijn ook betrokken bij de celgroei. Vaak zijn beiden
verstoord in kanker. In hoofdstuk 3 wordt het effect van sfinganine op
zowel celpolariteit als de celdeling beschreven en hoe deze twee effecten
met elkaar samen kunnen hangen. Sfinganine is een precursor van
sfingolipiden maar is zelf ook een bio-actief molecuul. Bij een remming
van de omzetting van sfinganine door Fumonisine B1 (waardoor er dus
een
hoge
concentratie
sfinganine
in
de
cel
ontstaat)
wordt
de
ontwikkeling van de apicale membraan ernstig geremd, terwijl het aantal
celdelingen toeneemt. De celdeling verloopt meestal volgens een strikt
plan waarbij verschillende eiwitten interacties met elkaar aangaan. Zo’n
eiwit is p27kip1, waarbij een hoge concentratie van dit eiwit zorgt voor
blokkade in de fase (G1) vlak voordat het genetisch materiaal (DNA)
gesynthetiseerd wordt (S). Er treedt een zogenaamd G1/S blokkade op en
de celdelingsnelheid zal afnemen. Cellen in de G1 fase van de celdeling
kunnen rijpen (differentiëren). Hieronder valt ook de ontwikkeling van
plasmamembraan polariteit. In hoofdstuk 3 wordt beschreven dat cellen
behandeld met Fumonisine B1 juist een lage concentratie van het p27kip1
bezitten, hetgeen een verklaring kan geven voor hun snelle groei. Om de
afwezigheid van plasmamembraan polariteit in cellen met een lage
169
Nederlande samenvatting
sfinganine omzetting te kunnen verklaren, is het transport en de apicale
sortering van sfingolipiden onderzocht onder condities waarbij een lage
sfinganine omzetting plaatsvindt (en er dus ook een lage expressie is van
p27kip1). Uit de experimenten blijkt dat als in Fumonisine B1 behandelde
cellen PKA werd geactiveerd, er geen “switch” plaats vindt van
galactosylceramide transport vanuit de SAC naar de BC maar dat
galactosylceramide, net als in onbehandelde controle cellen, naar de
basolaterale plasmamembraan wordt getransporteerd. Om te kunnen
aantonen dat het effect van een lage sfinganine omzetting op het
transport van galactosylceramide vanuit SAC naar de BC afhankelijk is
van de lage p27kip1 concentraties in de Fumonisine B1 behandelde cellen,
wordt in hoofdstuk 3 nog een experiment beschreven. In dit experiment
zijn de cellen weer behandeld met Fumonisine B1 maar daarnaast ook
nog met een stof die een hoge p27kip1 waarde simuleert. Ook in deze
cellen is het transport van galactosylceramide bestudeerd na activatie van
PKA. De resultaten tonen aan dat hoge p27kip1 concentraties nodig zijn
om galactosylceramide, onder polariteit stimulerende condities (activatie
van PKA), vanuit SAC naar de apicale plasmamembraan te transporteren.
Om meer inzicht te krijgen in de effecten van een hoge cellulaire p27kip1
concentratie op de ontwikkeling van plasmamembraan polariteit zijn in
hoofdstuk
4
experimenten
beschreven
waarbij
met
behulp
van
gentransfectie de expressie van p27kip1 verhoogd is. Uit de resultaten kan
worden afgeleid dat p27kip1 HepG2 cellen inderdaad in een G1/S
blokkade houdt en dat de levensduur van de cellen toeneemt. Naast het
effect op de celdeling heeft p27kip1 ook een stimulerend effect op de
ontwikkeling van plasmamembraan polariteit, vooral tijdens de beginfase
van de polariteitontwikkeling. Dat effect kan gelegen zijn in het
beïnvloeden van het transport van galactosylceramide (hoofdstuk 3) maar
daarnaast kan ook de intracellulaire locatie van p27kip1 een verklaring
geven voor het gevonden effect op de polariteitontwikkeling. Tijdens de
beginfase van de ontwikkeling bevindt p27kip1 zich namelijk op een deel
van de plasmamembraan van de cel waar uiteindelijk de apicale
membraan zich gaat vormen. In oudere cellen is dit niet meer
170
Nederlandse samenvatting
waarneembaar. Een aantal verklaringen is mogelijk. Ten eerste kan deze
lokalisatie erop wijzen dat p27kip1 de plaats markeert waar apicaal gericht
transport naar toe gedirigeerd moet worden. Een soortgelijk proces vindt
plaats in gistcellen. Een andere mogelijkheid kan zijn dat cellen met een
asymmetrische verdeling van p27kip1 migreren en proberen dichter naar
elkaar toe te komen. Als derde mogelijkheid kan niet uitgesloten worden
dat de cellen op deze manier betere cel-celcontacten kunnen maken die
nodig zijn om goede polariteit te vormen. Welke hypothese de juiste is, is
op dit moment nog niet duidelijk en verder onderzoek zal dit moeten
uitwijzen.
In de hoofdstukken 2, 3 en 4 is naar de ontwikkeling van de apicale
membraan gekeken waarbij als maat voor polariteit het aantal BC per
100 cellen is genomen. In hoofdstuk 5 is echter gekeken naar het aantal
cellen per BC, dat onder geschikte experimentele omstandigheden kan
variëren van 2 tot plusminus 5. In de lever vormen hepatocyten samen
een kanaal (het galkanaal) doordat alle apicale membraan domeinen in
zo’n kanaal aan elkaar gekoppeld zijn door middel van tight junctions.
Hier kan men dus spreken van een complexe architectuur van het
epitheel. In de gebruikte HepG2 kweken is in de meeste gevallen deze
complexe architectuur afwezig en delen gemiddeld twee cellen één BC,
ook als polariteitontwikkeling gestimuleerd wordt met behulp van OSM.
Wanneer HepG2 cellen echter worden behandeld met de stof Y-27632,
dan blijken er veel meer dan twee cellen één BC te kunnen delen. Er
onstaat dus een meer complexe epitheliale structuur. Y-27632 is een stof
die de effecten van het enzym Rho kinase remt. Rho kinase is onder
andere betrokken bij celmigratie, adhesie en bij de flexibiliteit van het
actine skelet in de cel. Om het ontstaan van een complexere epitheliale
structuur te kunnen verklaren is naar de vorm van de cellen en naar de
lokalisatie van het actine skelet in de cel gekeken. Opvallend was dat
cellen behandeld met Y-27632 weinig laterale cel-cel contacten vormen en
het daardoor voor andere cellen, ruimtelijk gesproken, minder moeilijk is
om “binnen te dringen” en samen te gaan met de cellen die al een BC
hebben. Het resultaat is drie cellen die samen één BC delen. Op deze
171
Nederlande samenvatting
manier kan een vierde en wellicht een vijfde cel volgen waardoor er een
heus kanaaltje kan ontstaan. Hoe de remming van Rho kinase bijdraagt
aan het ontstaan van deze complexe architectuur van levercellen is op dit
moment nog niet geheel duidelijk en verder onderzoek zal moeten
uitwijzen wat het achterliggende mechanisme is.
Samenvattend: in dit proefschrift worden verschillende aspecten van de
ontwikkeling van plasmamembraan polariteit beschreven. Onderzoek
naar het ontstaan en de handhaving van polariteit is belangrijk omdat in
veel
pathologische
condities
deze
ernstig
verstoord
is.
Een
veel
voorkomende ernstige pathologie is leverkanker waarin zowel de celdeling
als plasmamembraan polariteit ontregeld zijn. In dit proefschrift wordt
beschreven dat de ontwikkeling van polariteit en de celdeling aan elkaar
gekoppeld zijn. Dit soort inzicht in de regulatie van polariteitontwikkeling
en celdeling zal wellicht op termijn kunnen bijdragen tot de ontwikkeling
van een succesvolle therapie in het gevecht tegen kanker.
172