Samenvatting moleculaire celbiologie Col 1: Packing van DNA in de

Samenvatting moleculaire celbiologie
Col 1: Packing van DNA in de cel / histon epigenetica (HS4;LB)
Prokaryoten: nauwelijks transcriptie controle
Eukaryoten:
organisatie van DNA bepaald controle voor genregulatie
gepaarde chromonsonen
hebben teleomeren en centromeren
een origin of replication
heterochromatine (sterk opgevouwen DNA -> kan niet
worden afgelezen)
euchromatine (zwakker opgevouwen DNA -> wel afleesbaar)
Nucleosomen: opgevouwen stukken DNA basen op Histon
eiwitten (8 verschillende)
Zijn heel dynamisch:
Opvouwen <-> ontvouwen
Constant reorganiseren (bestaan maar 250 miliseconde)
Histonen worden uitgewisseld
Histon H1: zit aan buitenkant nucleosomen en buigt de keten weg zodat het verder gaat naar
volgende nucleosoom.
Gemodificeerd Histon H3: cetromeer locatie wordt bepaald door gemodificeerd histon H3
Nucleosoom bestaan uit twee H2A-H2B complexen en twee H3-H4 complexen
Bij deling van DNA worden niet de Nucleosomen (bestaand uit Histonen) verdubbeld, er is dus een
tekort. De histonen delen zich op tussen de twee dochterstrengs en bij vrijliggend DNA worden
nieuwe nucleosomen aangemaakt. Met behulp van tweeling DNA weet de cel wat er moet zitten.
Epigenetica: Wetenschap die zich
bezighoudt met overerving van
eigenschappen die niet ontstaan door
veranderingen in nucleotiden
sequentie maar door:
Genregulerende eiwitten
Erfelijke modificaties van
Histon eiwitten en DNA
Epigenetica is dus niet erfelijk
De barrière tussen heterochromatine (niet afleesbaar) en euchromatine (wel afleesbaar) kan
verschuiven. Hiermee wordt de expressie gereguleerd.
1
acetylering en methylering zorgen ervoor dat eiwitten niet meer afleesbaar zijn (genregulatie)
acetylering
methylering
Fosfolysering:
bepaalde modificaties van histonen bij nucleosomen zorgt
ervoor dat er een code-reader complex kan binden. Wanneer
dit is verboden kunnen andere eiwit-complexen binden dat
zorgt voor:
genexpressie
gene silencing
etc…
Barrière eiwitten zorgen ervoor dat dit complex wordt
afgeremd. Deze eiwitten zitten in de keten en blokkeren of
verwijderen (verdere) modificaties.
Loops: in de loop is er meer genexpressie door hogere
toegankelijkheid. Ook kunnen deze loops zich bevinden in
verschillende gebieden in het cel dat ook de expressie
verhoogd of juis verlaagd.
Vuistregel = hoe meer in het midden van de cel, hoe meer
genexpressie.
2
Col 2: DNA Replicatie / Recombinatie / Reparatie (HS 4-5;
MM)
Bij DNA replcatie zijn weinig fouten. Per een miljoen jaar verandert 0.1% van de basenparen van het
genoom.
transpositie: verplaatsing van DNA
In coderende stukken DNA veranderen de sequenties veel minder (purifying selection)
Bij verschillende organismes zie je dat de genen op intronen veel veranderen maar de genen bij
exonen blijven vaak hetzelfde.
genduplicatie is belangrijk in de evolutie
en hierdoor maakt het DNA grote
stappen.
DNA verschil tussen mensen is ongeveer 0.1%
Verschil in een gen -> deze plekken heten Single Nucleotide Polyfmorfism (SNP)
Verschil in het aantal kopiën van hetzelfde gen -> deze plekken het Variable Number Tandem
Repeats (VNTR)
DNA polymerase maakt de dubbelstrengs DNA, dit enzym controleert nog of de koppelingsreactie
tussen de basenparen klopt.
Soms gaat er een verkeerde base aan zitten (een tautomere vorm van C bijvoorbeeld) en vormt zo
een verkeerd basenpaar. Bij deze basepaar zal de waterstofbruggen niet kloppen. Alleen bij de juiste
binding van de basenparen kan polymerase verder gaan, hierdoor wordt deze fout verbeterd door
dit basepaar terug te brengen naar de editing site. Dit proces heet Editing.
DNA polymerase heeft een primer
nodig omdat bij het polymeraseeiwit niet zomaar kan beginnen. Er
moet al een stukje zijn anders kan
polymerase er niet verder aan
werken.
DNA helicase zorgt ervoor dat de
strands uit elkaar gaan.
Clamp-eiwit zorgt ervoor dat de DNA
polymerase doorgaat en niet loslaat.
3
Door dit mechanisme is er kans op supercoiling.
Dit wordt opgelost door Topoisomerase:
Topoisomerase 1:
Een basen strand wordt opengemaakt en een kant
naast de splitsing wordt opgedraaid.
Topoisomerase 2:
Een strand wordt geknipt en
over de andere strand heen
gehaald. Belangrijk hierbij is
dat de strands goed worden
vastgehouden.
4
Strand directed mismatch repair:
gaat over het DNA heen om een mismatch te
zoeken en repareert deze.
Probleem: welk van de twee die verkeerd
gematcht zijn is de juiste base?
De RNA primer in de lagging strand (door okazaki
fragmenten) word herkend en daarbij zit een
‘nick’, hierdoor is te zien welk van de twee de
originele strand is.
In leading strands worden blijkbaar ook ooit
nicks gevormd. (Niet duidelijk in boek)
Replication Bubble
Modificaties aan histonen zijn
belangrijk of de genen eraan
gebonden actief zijn.
Nu verdubbeling van DNA
zijn er maar de helft van de
histonen en ook de
epigenetische informatie
moet worden hersteld. Dit
gebeurt met een readerwriter complex
Bij eukaryoten kom je bij mitose op een
probleem, want de lagging strand heeft
telkens primers nodig. Een klein stukje blijft
dus op het einde over waar geen polymerase
overheen kan gaan. met de enzym
telomerase verlengt het laatste stukje en zo
kan het laatste stukje nog worden
bijgevoegd.
Dit mechanisme is belangrijk omdat anders
het DNA telkens eens stukje korter wordt.
Een hoge telomerase activeit is dus
belangrijk voor een snelle celdeling.
5
6
Col 3: Homologe recombinatie / transpositie / transcriptie (HS
5-6; MM)
Depurinering: de base wordt vervangen door een OH groep
Deanimering: een cytosine-groep wordt vervangen door een uracil groep. Dus een NH2 groep door
een O-groep
Op deze manier ontstaan mutaties
DNA reparatie method: base excision repair (‘flipping out’ mechanisme’)
Dit enzym scant voortdurend het DNA of er een een uracil in zit en verwijdert deze. De juiste base
zal er dan in gaan. dit enzym heet uracyl DNA glycosylase. Iedere van zulke mutaties heeft zijn eigen
DNA glycosylase.
Flipping out mechanisme: een voor een worden de basen naar buiten geflipt en controleert zo of het
klopt.
DNA reparatie methode:
nucleotide excision repair
Herkent verstoringen van
normale lineaire DNA
structuur. Dit komt doordat
basen met elkaar een
verbinding zijn aangegaan.
Hierdoor ontstaat een knik in
strand en dit stuk wordt
verwijdert en opnieuw
polymerase gedaan.
Iedere base heeft zijn eigen geanimeerde vorm en deze vormen zouden kunnen gebruikt worden als
basen in de strands. De reden dat dit niet gebeurd is omdat de cel dan niet meer kan zien welke
basen zijn geanimeerd en dus niet juist zijn.
nonhomologe end-joining: eventuele
strand-breaks worden verwijdert en
laatste stukjes gewoon aan elkaar
geplakt. Kans op risico is klein, want
meestal is het niet erg (intronen)
homologe recombinatie: na
verdubbeling wordt de exacte kopie
gebruikt om te kijken wat het
uitgeknipte stukje moet zijn en wordt op
die manier hersteld.
7
Reparatie van gebroken replicatie vork:
Deze stappen kennen!
recA katalyseert dit proces.
Reparatie van een dubbelstrengs DNA breuk via homologe recombinatie:
Dit proces is gevaarlijk wanneer dit gebeurt ergens anders op het DNA, omdat dan de strand niet
precies gelijk zijn. Hierdoor wordt homologe recombinatie sterk gereguleerd:
Te weinig: ophoping van DNA schade
Te veel: uitwisseling tussen homologe chromosonen -> verlies van heterozygositeit
Je kunt dus homozygoot voor iets worden wanneer de twee strand elkaar gaan
verbeteren terwijl je ervoor heterozygoot was.
8
Mitose: verdubbeling van een cel
Meiose: ontstaan geslachtscellen
Tijdens de splitsing van de chromosonen tijdens meiose ontstaat er ook homologe recombinatie
plaats, waardoor uitwisseling tussen de moedergenen en vadergenen plaatsvind. Hierdoor zijn de
geslachtcellen een mengsel tussen moedergenen en vadergenen. (cross-over)
Tijdens meiose zijn er echter geen
breuken, dus die moeten nog gemaakt
worden om homologe recombinatie
mogelijk te maken. Deze breuken
worden door speciale enzymen
gemaakt. Uiteindelijk worden die
strands geknipt en dit kan zorgen voor
crossover of geen crossover:
Tijdens deze homologe recombinatie
kan dit zorgen voor mismatchen. Hierbij is er dan niet een juiste base, er is geen originele strand.
Hierbij wordt willekeurig een van de twee weggehaald. Dit proces heet mismatch repair.
Voorkomen homologe recombinatie:
Mismatch detection. Wanneer er teveel mismatches zijn bij homologe recombinatie zal dit proces
worden gestopt.
Homologe recombinatie:
Sequenties moeten sterk homoloog zijn
Uitwisseling tussen chromosonen, maar volgorde van genen blijft in stand
Transpositie/conservatieve specifieke inegratie:
Homologie niet vereist
 Mobiele genetische elementen (jumping genes/ selfish DNA)
 Verantwoordelijk voor evolutie en >50% of genomic DNA
DNA-only transposons: een stuk DNA wordt ergens weggehaald en
wordt ergens anders weer neergeplaatst. Hiernaast zitten
sequenties sequences waaraan de grenzen herkent worden.
transposon wordt tijdelijk circulair en zit nog vast aan het
eiwitcomplex. Waar dit complex weer wordt neergezet is
willekeurig.
Door homologe recombinatie kan het gat dat overblijft weer
worden hersteld tot een nieuw transposon en zo kan het aantal
mobiele transposons meer worden.
9
retroviral transpositie:
een virus infecteerd
zich in de cel en maakt
van zijn RNA een DNA
dubbelstrand. Hierbij
plant het zich in het
DNA. Bij Transcriptie
zal dan nieuwe RNAvirus worden
aangemaakt.
Hierbij is reverse
transcriptase nodig om
RNA om te zetten in
dubbelstrengs DNA
Nonretroviral retrotransposons:
Deze DNA sequentie maakt een RNA
aan met de typerende AAA groep.
Deze strand plakt zich in een ander
DNA ergens en vervolgens gebeurt
hier weer reverse transcriptase
plaats. Hierdoor plakt het zich in een
andere plaats in het chromosoon.
Deze klasse van transposon is nog
sterk actief in het humane DNA.
Vergelijkbaar met het experiment
van biochemie (de Alu-sequentie)
Conservatieve specifieke integratie:
Hierbij zijn de specifieke sequenties
aan de zijkant ook aanwezig in de
homologe sequentie. Hierdoor zijn
deze stukken alleen op bepaalde
stukken mogelijk om ingeplakt te
worden. hiermee kun je stukken eruit
halen (knippen) of juist erin plakken
(integratie).
Een andere vorm hiervan is wanneer
de sequentie die eruit wordt gehaald
wordt omgedraaid. Hierbij wordt deze
sequentie inactief. Dit is belangrijk om
genen aan of uit te schakelen. Hiermee kun je experimenten doen door bepaalde stukken sequenties
tussen twee specifieke sequenties te zetten en zo bepaalde genen aan en uit zetten. Zo kun je zien
wat het effect is van een bepaald gen op een organisme.
10
Verschil DNA en RNA:
Bij RNA gebruik je ribose en in RNA gebruik desoxyribose
Bij RNA zit een uracil groep en bij DNA zit een thymine groep
DNA komt voor als dubbelstrand en RNA is singelstrand, echter bij RNA vormen allerlei basenparen
onderling waardoor een grote drie-dimensionale structuur plaatsvind (bijv. tRNA).
Bij DNA polymerase zijn er primers nodig en bij RNA polymerase niet. Bij RNA synthese zijn er
hierdoor veel meer fouten. Is niet erg, want RNA is tijdelijk.
In prokaryoten:
Bij RNA synthese zoekt de sigma-factor naar een promoter op het DNA en brengt deze dan naar RNA
polymerase. Hierbij start dan de synthese van RNA en stopt dit pas bij een terminater signaal. (AT
stretch + stem loop)
Eukaryoten heeft drie soorten RNA polymerasen. Iedere soort maakt zijn eigen RNA. Dit is omdat de
verschillende RNA’s op verschillende manieren worden gemodificeerd nadat ze gemaakt zijn.
RNA synthese in eukaryoten:
1. initiatie transcriptie (vorming transcriptiecomplex)
Begint bij een promotor sequentie (TATA box). Hierop gaan transcriptiefactoren zitten en herkennen
de promotor sequentie. Aan deze factoren gaat dan de polymerase zitten. voordat de transcrptie
echt begint wordt er eerst nog gecontroleerd door het polymerase eiwit of het de juiste
transcriptiefactoren zijn. Als het klopt zal transcriptie beginnen en laten de transcriptiefactoren los.
2. transcriptie
een uitdaging hierbij is dat het zich door de chromatine (nucleosom en) moet bewegen. Met behulp
van bepaalde eiwitten (histon modificerende complexen) zorg je ervoor dat de DNA streng vrij komt
te liggen.
Het grote DNA complex draait niet mee bij transcriptie. Hierbij ontstaat positieve en negative
supercoiling. Dit wordt opgelost met topoisomerase 1 en 2.
3. capping en methylering
een stuk mRNA codeert voor meerdere eiwitten in prokaryoten, maar voor slechts één eiwit in
eukaryoten.
Stukken mRNA worden aan de 5’ kant een 5’ cap geplaatst en aan de 3’-kant wordt een poly-A
sequentie geplaatst.
4. RNA splicing
Tijdens splicing worden de intronen (intervening sequences) losgehaald van de exonen (expressie).
De meeste vormen van RNA splicing moeten worden gekatalyseerd, maar bij sommige gebeurt het
spontaan. Bepaalde sequenties in het DNA geven exonen en intronen aan. Deze sequenties kunnen
worden verschoven of inactief worden waardoor alternatieve splicing ontstaat. Hierdoor worden
grote stukken er soms uitgehaald. Hier kunnen dan dus ook exonen bij zitten.
5. klieving van RNA (AAUAA) 6. toevoeging poly-A straat
Transcriptie terminatie en polyadenylering. In eukaryoten genen erkennen bepaalde eiwitten
bepaalde sequenties en zorgt ervoor dat het RNA wordt geklieft en hierdoor stopt RNA-polymerase.
Zij trekken dan poly-A aan en zorgen voor de capping aan het uiteinde.
7. transport naar cytoplasme
mRNA wordt zo gemodificeerd om te kijken of alle processen op de juiste manier heeft
plaatsgevonden. mRNA moet actief worden getransporteerd door de celkernwand, omdat deze te
groot zijn om door de poorten te gaan. alle eiwitten die op de mRNA zitten blijven erop zitten en
hierdoor wordt gecontroleerd of alle modificaties wel juist zijn gebeurd.
11
12
Col 4: Translatie, proteasome (HS 6; MM)
Eiwitsynthese vind plaats in het cytosol, rna-synthese vind plaats in de nucleus.
rRNA bestaat uit RNA en eiwitten.
De genetische code is universeel. Dit komt omdat een mutatie in de code alle codons verandert, dus
is er een grote barrière om dit te veranderen. Dus blijft dit gelijk.
Het codongebruik is niet universeel. Zo gebruiken E. coli bacteriën veel minder arginine dan mensen.
tRNA zorgt voor vertaling codon naar aminozuur. De
anticodon staat voor de codon die vertaalt. Er zijn veel
minder tRNA dan dat er mogelijk codons zijn. Dit komt
door het Wobble-baseparing. De derde positie heeft de
Wobbleposition die ook kan staan voor een I. die I het
nucloetide Inosine (gedeanimeerde A). zo kan een tRNA
voor meerdere codons staan.
Aminozuur dat op tRNA
wordt gezet:
Met behulp van het enzym
(aminoacyl-)tRNA synthetase
wordt de aminogroep
geactiveerd met een ATPgroep. En die wordt
vervolgens gekoppelt aan
een tRNA groep.
Er dus maar een ATP groep
nodig hiervoor.
13
Editing:
Om te controleren of het juiste aminogroep op de juiste
tRNA groep zit wordt dit gecontroleerd door ditzelfde
enzym (aminoacyl)-tRNA synthetase. Hij controleert de
aminogroep twee keer door eerst te kijken of de
aminogroep niet te groot is en vervolgens wordt er
gekeken of het niet te klein is. Kost energie maar is
belangrijk om zeker te weten dat de juiste aminogroep
erop zit.
Foutenmarge 1 op de 40.000
De tRNA synthetase controleert welke tRNA hij heeft door
te kijken welke anticodon het tRNA heeft. Ook kan hij
kijken naar andere specifieke RNA-sequenties elders in de
tRNA.
Ribosoom:
Bestaat uit twee grote subunits.
Die bestaan uit rRNA. Alle
essentiële processen in het
ribosoom gebeuren in het rRNA.
Mechanisme van ribosomale eiwitsynthese:
14
Elongatie factoren:
Elogantiefactor Tu: bind aan het tRNA in
een GTP gebonden vorm, dit complex
bind aan het ribosoom. Dit zorgt ervoor
dat er controle is of er echt de juiste 3
basen zijn gevormd. Zodat je zeker weer
dat de 3 juiste basen zijn gevormd.
Dan wordt GTP weer GDP en kan de
nieuwe aminozuur op plaats A in
ribosoom aanvallen op volgende
aminozuur.
Elongatiefactor G: dit zorgt ervoor dat
het grote subunit 3 basen opschuift en
een nieuwe vrije A ruimte creeërt voor
de volgende tRNA. Dit gebeurt ook met
behulp van GTP.
Translatie initiatie:
Is sterk gereguleerd. Er is een initiator tRNA en is
gekoppeld aan de kleine subunit. Met behulp van
initiatiefactors zullen zij op de 5’ cap komen en dan
over de mRNA strand gaan verplaatsen. In
eukaryoten zal dit complex een AUG (startcodon)
zoeken en hier zal dan de eiwitsynthese beginnen.
Wanneer de startcodon gevonden zal de grote
subunit erbij gaan.
Bij prokaryoten kan een stuk mRNA coderen voor
meerdere eiwitten. Hierbij is dus ook geen 5’ cap.
Hierbij zit voor iedere startcodon een ribosomebinding site die ervoor zorgt dat een ribosoom bind
en zo de verschillende eiwitten kunnen worden
gemaakt op een mRNA.
Veel antibiotica remmen prokaryote eiwitsynthese
15
Translate terminatie:
het stopcodon wordt herkent door een
eiwit, dus niet door een tRNA. Zo’n
release factor zal ervoor zorgen dat de
esterbinding in de peptideketen zal
losbreken.
Kwaliteitscontrole van
mRNA voor het de kern
verlaat:
Voordat dat mRNA de
nucleus uitgaat zat er eerst
splicing plaatsvinden. Op de
plaatsen van splicing zal een
exon junction complex zich
bevestigen en blijft hierop
zitten totdat het ribosoom in
het cytosol voorbijkomt en
het hierdoor eraf gaat.
Wanneer de splicing niet
goed is gegaan zullen er
stopcodons in de intronen zitten. wanneer het ribosoom een stopcodon in de intron tegenkomt, zal
het vanaf daar zoeken naar een volgend exon junction complex. Wanneer hij die vind weet het
ribosoom dus dat dit mRNA niet goed is gespliced en zal dit mRNA worden verwijderd.
Dit is belangrijk omdat er anders mogelijk verkeerde eiwitten worden geproduceerd.
Inbouw van het 21ste aminozuur
selenocysteine:
Een aminozuur dat geen eigen duidelijk
codon. Maar er is wel een tRNA van. Zijn
anticodon van de tRNA is complementair
voor een stopcodon. In de mRNA na de
codon zit dan een structuur die ervoor
zorgt die selenocysteïne inbouwt met
behulp van GTP.
16
Wat moet er allemaal gebeuren om niet natuurlijke aminozuren in te bouwen in een cel?
Een nieuw tRNA maken dat op een van de stopcodons bind. Zodat het zich inbouwt in de
aminoketen.
Een tRNA nodig voor een specifiek nieuwe aminozuur.
Je hebt nog een tRNA synthetase nodig die deze nieuwe aminozuur op zo’n tRNA plaatst.
Je hoeft dus niet het ribosoom aan te passen!
Eiwitsynthese is nu nog niet klaar, je hebt alleen nog een
polypeptideketen. Hiervoor is eiwitvouwing nodig, dit
gebeurd spontaan. Deze informatie hiervoor zit erin en de
polypeptide keten maakt bindingen met zichzelf en zal
vanzelf de juiste 3D constructie vinden.
Het is niet zo simpel als het lijkt, omdat de vouwing niet altijd
juist gaat. Eiwitvouwing volgt namelijk een pad waarbij het
naar de meeste stabiele (minste energie) vorm gaat.
Probleem: wanneer er zwavelbruggen ontstaan bij vouwende
eiwitten die niet de bedoeling zijn, zal de vouwing fout gaan
en komt het eiwit niet meer in de juiste conformatie.
Om dit op te lossen zijn er enzymen die constant
zwavelbruggen kapot maken, hierdoor is de kans groter dat
de eiwitten zich vouwen naar de stabielste vorm en zullen zo
de juiste zwavelbruggen worden gevormd.
In de cel heb je het probleem tot aggregatie. Wanneer nog niet compleet gevouwen eiwitten elkaar
tegenkomen zullen ze samen een vouwing aangaan en kan dat zorgen voor aggegratie. Zo kunnen er
grote constructies zijn van meerdere eiwitten.
Tweede probleem: eiwitsynthese is eerder dan eiwitvouwing. Dus kunnen eiwitten zich al vouwen
terwijl het nog niet helemaal af is.
Hiervoor zijn een aantal systemen in de cel om dit
op te lossen:
1 chaperone eiwitten:
HSP70 (Heat Shock Protein): dit eiwit herkent een
fout gevouwen eiwit, bind daaraan en geeft het de
tijd om opnieuw te vouwen. Het zorgt ervoor dat
de vouwing nog even wacht en zo kan het later
nog goed vouwen.
2 Chaperonines: een eiwitvouwingskooi. In deze ruimte
kan het eiwit zich opnieuw gaan vouwen. Verkeerd
gevouwen eiwitten worden herkent aan hydrofobe
ketens aan de buitenkant van de eiwit. De chaparone
trekt ze aan doordat zij hydrofoob zijn aan de
binnenkant. Wanneer er een verkeerd gevouwen eiwit
eenmaal inzit en de cap erop zit, zal er met behulp van
17
ATP de binnenkant hydrofiel
worden en zal dit de vouwing van
het eiwit katalyseren.
Proteasomen zorgen ervoor dat
niet goed gevouwen eiwitten
opgeruimd. Dit eiwitcomplex
bestaat uit een cilinder. In het
midden worden de verkeerde
eiwitten uit elkaar gehaald. In het
bovenste stuk worden de verkeerd
gevouwen eiwitten herkent en
ontvouwen. Hiervoor is energie
nodig.
Deze verkeerde eiwitten worden getagd door ubiquitine en hiermee herkent de proteasomen welke
hij moet verwijderen.
Een compleet complex bepaald welke eiwitten worden geubiquitilineerd. Eiwitten die fout
gevouwen zijn hebben
een hydrofobe patch en
hieraan wordt een
ubiquitine gemaakt.
Hieraan wordt dan een
hele serie van ubiquitine
geplaatst. Erg belangrijk
dat dit proces sterk
word gereguleerd.
Ubiquitine kan ook verschillende boodschappen hebben. het hoeft niet altijd afbraak te betekenen.
Eiwitvouwingsziektes:
Loss of function door verkeerd gevouwen eiwitten: taaislijmziekte en sikkelcelamine
Door aggregatie wordt het complex dat ontstaat toxisch, dit gebeurt bij alzheimer of parkinson.
Amyloïde:
Goed gestructureerde eiwitaggregaten die zo
stabiel en sterk zijn dat ze niet meer
afbreekbaar zijn.
Het zijn grote placks die niet meer los te
maken zijn.
Tegenwoordig wordt er gedacht dat de grote
eindvorm van deze amyloide niet toxisch is,
maar de tussenvormen toxisch zijn.
Sommige amyloïde zijn infectueus. Ze zorgen
ervoor dat goed gevouwen eiwitten ook mee
gaan doen met de grote aggregatie complex.
Hiermee zijn ziektes overdraagbaar naar
andere organismen.
Amyloïde is zo stabiel, dat de snelheid
waarmee dit wordt gevormd wordt onderdrukt.
18
Col 5: Moleculaire methoden (HS 8; MM)
Organel: een organel (compartiment) is een gespecialiseerd onderdeel van de cel, omgeven door
een membraam en in het bezit van een eigen karakteristieke set enzymen en functie.
Peroxisomen: hierin vinden oxidatiereactie plaats.
Golgi apparatus: transportcentrum voor allerlei vesculaire transportprocessen. Sortering.
Endosomen: opname voedingsstoffen in blaasjes
Lysosomen: specialisatievorm van endosomen
Evolutionair voordeel van organellen: verschillende processen kun je van elkaar scheiden en door de
grote van eukaryote cellen heb je meer energie nodig, hiervoor is meer membraam nodig.
Er zijn drie verschillende soorten van eiwit
transport
1. Gated transport
2. Transmembrame transport
3. Vesculiar transport
Wat bepaald welke bestemming een eiwit
heeft?
Bepaalde sequenties in een eiwit zorgen
daarvoor.
Het membraam van het nucleus is dubbel: innernuclear en outer nuclear.
Ieder membraam zijn eigen specifieke eiwitten.
Hierin zitten nuclear Pore Complex (NPC). Hierdoor kunnen kleine moleculen
zich snel doorheen diffunderen maar grotere eiwitten kunnen er niet
doorheen. Maar wel als het een Nuclear Localization Signal (NLS) heeft. Dit
zorgt ervoor dat de grotere moleculen (zoals een mRNA keten) wordt
doorgelaten door deze poriën.
Hiermee kunnen t-cellen (voor immuunsysteem) worden geactiveerd.
19
Hoe zorg je ervoor dat de juiste eiwitten de juiste NLS
krijgen voor de juiste transport? Receptor eiwitten
zorgen ervoor dat de juiste worden getarget
Ran-GAP (Ran eiwit) zorgt ervoor dat de transport de
juiste kant op gaat. In het cytosol is het in GDP vorm en
in de nucleus is het in de GTP vorm. Het bevind zich dus
in beide ruimtes en weet de cel dus welke kant het
transport op moet.
Je hebt hiervoor ook een proces dat op de zelfde manier
werkt maar dan aangeeft dat het die ruimte uit moet.
Mitochondriën:
Oorspronkelijk parasiet van cel
Eigen DNA
Gedeeltelijk eigen eiwitproductie
Levert energie in vorm van ATP aan de cel
Heeft een dubbele membraam
Er zijn speciale sequenties in eiwitten die
naar de mitochondrieën moeten waardoor
het cytosol weet dat het naar de
mitochondrieeën moet.
In de membramen zijn complexen om
ervoor te zorgen dat de
polypeptidenketens worden
getransporteerd:
TOM complex: Transport Outer
Membrame
TIM complex: Transport Inner Membrame
Wanneer een eiwit al gedeeltelijk door het
TOM complex is vervoerd, kan het al
beginnen aan het transport door het TIM complex. Wanneer het eiwit eenmaal in de
mitochondrieën is wordt de signaalsequentie afgeknipt.
Belangrijk hierbij is dat deze eiwitten ontvouwen blijven als het nog naar de mitochondriën gaat.
Anders kan het niet door de TIM en TOM complexen. Dit gebeurt met behulp van de chaperone
eiwitten.
Dit transport kost energie omdat er een membraampotentiaal nodig is. Het kost dus energie om een
eiwit over twee membramen heen te transporteren.
Je hebt hierbij varianten die niet helemaal erdoorheen gaan, maar soms tussen de membramen
blijven of zelf een inner membrame protein worden.
20
Peroxisomen:
Compartimenten voor uitvoering oxidatieracties (o.a. beta-oxidatie van vetzuren) waarbij toxische
peroxide wordt gevormd.
Catalasen in peroxisomen breken peroxide af tot water en zuurstof.
Weinig over bekend en ook verder weinig over te zeggen.
Endoplasmatisch recticulum:
Hier worden alle membraam eiwitten en eiwitten die worden uitgescheden gemaakt.
Het ER is op te delen in Rough ER (RER) en Smooth ER (SER).
Functies ER:
Eiwitsynthese (alle extracellulaire eiwitten, alle membraameiwitten, ER, golgi, en endosomale
eiwitten)
Ca2+ opslag en regulatie
RER -> eiwitmodificatie en transport: compartementaliseren, klieving, glycolyseren, vouwen
(processing)
SER -> Lipide/lipoprotein ein hormoon-synthese
Tijdens eiwitsynthese wordt het eiwit meteen getransporteerd naar het ER zoals te zien in dit
plaatje. Eiwit transport naar ER is dus co-translationeel.
Het signaal waar het eiwit heenmoet zit in de signaalsequentie. Deze sequentie zit een ne Nterminus want die komt als eerst uit het ribosoom. Zodra dat uit het ribosoom komt wordt dit
herkent door het signal recognition particle (SRP). deze blokkeert tijdelijk het eiwitsynthese en bind
het geheel aan het membraam. Wanneer het geheel vastzit aan het membraam zal de SRP loslaten
en gaat de eiwitsynthese weer verder. Zo kan er ook een reeks van gedokte ribosomen achter elkaar
zitten op een membraam
Deze translocase eiwitten zijn normaal gesproken
gesloten zodat calcium er niet doorheengaat. Alleen
wanneer er een signaalsequentie komt bij zon
translocase gaat er een ‘plug’ af en kan een eiwitketen
erdoorheen. Deze translocase heeft 2 uitgangen. Het
heeft namelijk ook een uitgang aan de zijkant voor
membraameiwitten.
Translocatie van eiwit met een transmembraam helix.
Hierbij moet een stukje van het eiwit in het membraam
blijven zitten. het komt een stop-transfer sequenties
21
tegen en de translocatie wordt gestopt. Hiermee krijg transmembraam eiwittien. Sommige eiwitten
hebben hiermee meer transmembrame eiwitten. Dit wordt geregeld met hydrofobe en hydrofiele
onderdelen, omdat in het membraam is het hydrofoob en aan de buitenkant is het hydrofiel.
Meeste ER eiwitten worden geglycolyseerd op N. dit vind plaats wanneer een eiwit in het ER komt.
Er komt een grote suikergroep aan. De functie hiervan is: dat het een kwaliteitscontrole is voor
eiwitvouwing en het labels het eiwit voor verdere vesculaire transport.
Hieraan zitten 3 glucose groepen dit zullen binden aan calnexine. Dit is een chaperone eiwit die de
vouwing van eiwitten katalyseert. Wanneer een eiwit fout gevouwen is zat er door een ander eiwit
een nieuwe glucose groep eraan
worden gezet en zal dit eiwit
opnieuw aan calnexin gaan binden
totdat het goed gevouwen is. Dit
proces zal doorgaan totdat het
eiwit goed is gevouwen en dan zal
het eiwit verder gaan.
Er wordt niet alleen 3 glucose
groepen aan gezet maar ook een
groep manose. Deze manose
worden ook langzaam weggehaald.
Wanneer alle manose weg is, zal dit
eiwit worden verwijdert en naar
proteasome gebracht en
afgebroken. Hierdoor zal een eiwit
niet voor eeuwig in deze cyclus vast
blijven zitten.
Intracellulair vesicle transport:
endocytose: opname stoffen
exocytose: uitscheiding stoffen
Verschillende soort vesicles krijgen allemaal een krijgen karakteristieke groep aan de buitenkant van
het vesicle.
Clathrin eiwitten: zitten rondom de vesicles
en geven aan waar het vesicle heenmoet.
22
Doordat het clathrin zich aan de buitenkant plaatst zal het membraam bol gaan staan en langszaam
losgaan. De echte afsnoering gebeurd door een ander
eiwit.
Elke vesicle heeft zijn eigen phosphatidyl inositol
phosphate (PIPs) samenstelling.
De verschillende soorten PIPs bepalen waar de vesicles
heen moeten en wat er moet dit vesicle moet gebeuren.
Fusie van vesicles:
Dit gebeurt met behulp van Rab
eiwitten. Zorg voor de juiste
fusie. Het rab eiwit bind zich aan
het membraam. De verschillende
vesicles hebben ook hun rab
eiwitten.
De daadwerkelijke fusie tussen
deze vesicles gebeurt met SNARE
eiwitten. Dit zijn twee eiwitten
die zich in elkaar gaan draaien en
zo de vesicles tegen elkaar aan
duwen waardoor fusie ontstaat.
Hiermee kan fusie duidelijk
worden gereguleerd.
Gogli apparaat:
In het golgi apparaat worden de
vesicles getransporteerd. Eerst
komen veel vesicles vanuit het ER
samen in een grote vesicle en
sluiten zich dan aan de cis-kant.
Hoewel de vesicles heel dynamisch
zijn en constant veranderen,
blijven ze vaak wel in dezelfde
regio omdat ze zich bewegen over
de microtubili.
Eiwitten worden vanuit hier naar
23
andere organellen gestuurd. Eiwitten die echter in het ER moeten blijven worden weer
teruggestuurd naar het ER. Zij hebben tweede herkenningssequentie zodat het Golgi systeem dit
weet.
Lysosomen:
Organellen waar afbraak plaatsvind. Hier kunnen allerlei dingen worden afgebroken. Het pH in het
lysosoom is 5. Een stuk lager dan is het cytosol (<- 7.2).
1. Beavatten hydrolytische enzymen die nodig zijn voor intracellulaire vertering
2. Breken voedingsstoffen af, maar ook cel-vreemde deeltjes (bv bacteriën)
3. Inhoud is gevaarlijk voor cel (necrose)
Signaal om een vesicle naar een lysosoom te brengen is een bepaalde suikergoep.
Exocytose:
Twee verschillende vormen:
Constitutive secretory pathway: gebeurt constant en is geen controle op
Regulated secretory pathway: is sterk gereguleerd. Moet worden getriggerd door een special
signaalsequentie.
Excretie vaak gericht in gepolariseerde
cellen.
Om ervoor te zorgen dat excretie de
juiste kant eruit gaat wordt met behulp
van speciale eiwitsamenstellingen in de
wanden deze excretie de juiste richting
in gestuurd.
Endocytose:
Phagocytose:
opname van grote deeltjes (micro-organismen, dode cellen)
gespecialiseerde cellen: macrophagen en meutrophilen
vaak getriggerd:
Fc receptoren herkennen antilichamen
Herkenning van phospatidyl serine (apoptotische cellen; geprogrammeerde celdood)
Pinocytose:
Opname van vloeistof, voortdurende uitwisseling
Continue proces van endocytose/exocytose
Clathrin coated pits
Receptor mediated endocytose
Efficiënte vorm van opnamen van specifieke moleculen
Sterk gereguleerd
24
Col 6: Moleculaire methoden (HS 8; MM)
Primaire cellen:
4. Worden geïsoleerd uit weefsels
5. Losmaken uit het extracellulaire matrix met behulp van enzymen (zoald trypsine en
collogenase) en EDTA
6. Eerste probleem: Cellen die we hebben geïsoleerd, zullen zich maar een aantal keren kunnen
delen. Dit komt door tekort aan telomeren.
7. Tweede probleem: veel cellen groeien en delen alleen als ze zich op een oppervlakte kunnen
hechten. (cell-dish, vaak gecoat met polylysine; collageen).
8. Celkweekmedium bevat complexe mix van onder andere groeifactoren
Een mechanisme om
cellen te isoleren is
microdissection:
Dit geeft echter een mix
van cellen en deze cellen
moeten nog verder
worden geïsoleerd.
Fluorescence-Activitated Cell Sorting (FACS)
Cellen in een vloeistof worden door een hele kleine naar
benede gedruppelt, zodat in iedere druppel zich maar één cel
bevindt. Daarna worden de cellen door een laser geraakt,
hierbij ‘scattert’ dit licht en kun je zo verschillende cellen
sorteren (iedere cel scattert op een andere manier door grootte
en vorm.). bepaalde druppels kun je dan een lading geven en
deze druppels worden door een magnetisch veld gehaald. Ook
kun je bepaalde druppels verschillende antilichamen geven. Op
deze manier zullen bepaalde cellen afbuigen en zo kun je de
druppels isoleren.
Probleem bij Eukaryote cellen:
Cellen kunnen vaak maar een beperkt aantal keren delen:
Oplossing 1: replicative cell senescence
Overexpressie van recombinant telomerase geeft immortalized cells.
Oplossing 2: check-point mechanisms
Maakt gebruik van tumor cellijnen. Het zorgt ervoor dat cellen niet zichzelf controleren en zo zorgen
dat de cellen constant blijven delen.
25
Cellen kunnen in principe onbeperkt delen en in vloeibare Stikstof (-196 C) bewaard worden
Embryonale stamcellen worden ook graag geïsoleerd. Die zijn nog niet gedifferentieerd en kunnen
nog naar ieder gewenst celtype differentiëren. Tegenwoordig worden stamcellen uit volwassen
weefsels geïsoleerd.
Somatic nuclear transplantation:
Om ervoor te zorgen dat deze
stamcellen dezelfde erfelijke
informatie heeft, moet je de kern
eruit halen en dan een kern uit
een andere cel plaatsen in deze
stamcel.
Zo kun je stamcellen maken die
specifiek zijn voor een bepaalde
ziekte
Hiermee kun je dus klonen
Toch is klonen erg inefficiënt. Veel cellen gingen ook vroegtijdig dood. Deze klonen vertoonde een
groot aantal genetische defecten.
Monoklonale antilichamen uit hybridoma
cellijnen.
Een muis injecteren met een antigen, die zal dan
antilichamen maken tegen dit antigen. De Blymfocyten die deze antilichamen maken worden
dan geïsoleerd en worden gefuseerd met een
tumorcellijn. Zo krijg je een hybridoma cel en
heeft dna van beide cellen. Zo krijg je een fusie cel
die de antilichamen creëert en ook veel zullen
blijven delen.
Deze bepaalde hybridomas kun je isoleren enzo
verschillende specifieke hybridomas selecteren.
Organellen isoleren: Cel
fractionering
Bij verschillende snelheden de
organellen van een cel laten
centrifugeren en zo kun je de
organellen op grote isoleren en de
verschillende organellen isoleren.
Je kunt dit ook met een gradient
doen door de organellen door een
vloeistof te laten zakken en de grote
organellen zullen dan onderaan
komen te zitten.
26
Recombinant DNA technologie
Om DNA te analyseren of manipuleren zijn er tegenwoordig veel manieren om dit te doen:
1. restrictie endonucleases
2. DNA ligatie
3. DNA clonering mbv vertoren of PCR
4. Hybridisatie
5. DNA sequencing
6. mRNA detectie met micro-arrays
restrictie endonucleases
erkent een bepaalde sequentie in
cel en kan zo bepaalde stukken
uitschakelen in een cel. Beschermt
bacteriën tegen vreemd DNA. Het
knipt het DNA. Vaak op
verschillende manieren.
De stukken die zo ontstaan kun
analyseren. Dat doe je met
electroforese. Je maakt daarbij een
gel en scheidt de fragmenten op basis van grootte door invloed van het elektrisch veld. Hoe groter
een fragment, hoe groter de lading. Hiermee kun je dan uitzoeken hoe groot ieder stukje geknipt
DNA is.
Deze fragmenten hebben geen kleur. Deze DNA sequenties worden aangekleurd met een stuk
fluorescent molecuul. En worden zichtbaar wanneer ze zich tussen het DNA hebben genesteld.
Hybridisatie
Specifieke detectie van DNA via
hybridisatie probes. Wanneer je DNA
verhit, zal het losgaan. Dan kun je
bepaalde probes laten binden aan deze
strands. De condities waaronder je deze
probes gebruikt zijn erg belangrijk. Bij
bepaalde temperaturen zullen
verschillende interacties gebeuren.
Deze probes worden gebruikt in
verschillende blottings, zoals Southern,
Northern en Western. (begrijp niet
helemaal hoe die werken)
DNA cloning
Een vector gebruiken om een stuk DNA te
vermenigvuldigen. Je kunt het bijvoorbeeld in een stuk
plasmide DNA zetten en zo ervoor zorgen dat het DNA
wordt vermenigvuldigd.
27
Plasmiden
heeft altijd origin of replication.
Ze krijgen ook een resistentie tegen
een antibiotica, en die zullen dan
als enige blijven overleven zodat je
zo de juiste plasmiden kunt
gebruiken.
Om ervoor te zorgen dat bacteriën andere
dingen door de celwand heenlaten, kun je
verschillende technieken gebruiken.
Heat shock
Lading
Of met DNA coated beats.
Plasmiden worden op verschillende maniere gebruikt:
Cloneren
Bibliotheek van maken
Eiwitten productie
RNA productie
Het maken van bibliotheken met plasmiden:
Een lange DNA streng in kleine stukken knippen en deze in een plasmide plaatsen. Dan kun je deze
plasmide in een cel stoppen en zo kun je de fragmenten opslaan. Deze cellen kunnen zich dan ook
nog reproduceren. Echter zitten hier ook niet nuttig DNA
tussen (intronen).
cDNA: complementair DNA
van een stuk mRNA wordt door reverse transcriptase een DNA
streng gemaakt. Bij deze nieuwe DNA streng wordt de
originele streng in stukjes geknipt zodat er overal primers zijn.
Dan wordt deze strand weer compleet gemaakt door
transcriptase.
28
Het voordeel hiervan is dat je alleen DNA hebt van eiwitten en dus alleen een bibliotheek van
nuttige DNA. Dus zonder intronen
Nadeel: je zult alleen DNA krijgen van eiwitten die veel tot expressie komen. De bibliotheek is dus
celspecifiek en zal moeilijk het hele DNA in
kaart brengen.
DNA dideoxysequencing
Met een singlestrand DNA molecuul bouw je
een dubbelstrand. Je gebruik een
enkelstrand, een primer en de vier
bouwstenen van DNA (A,C, G en T). je voegt
ook één dideoxy toe. Wanneer deze dideoxy
erin wordt toegevoegd zal de polymerisatie
niet verder gaan, want er 3’ OH-groep is
daarbij weg.
Vroeger moest je deze proef op 4 manieren doen, dus met de vier verschillende bases als dideoxy
groep. Je weet van bij deze vier fragmenten dus op welke
base ze eindigen. Wanneer je dan alle basen sorteert op
grote kun je zo achterhalen welke basevolgorde er in het
DNA zit
Tegenwoordig heeft iedere base zijn eigen kleur gekregen
en zo hoef je de proef maar een keer te doen. Met behulp
van een computer kun je dan het humane genoom lezen.
29
30
Col 7: intracellulaire compartmenten en eiwit transport
(HS12-13; MM) Hoofdstuk 8
Alberts hoofdstuk 8:
- studying gene expression and function
- extra stof
Hoe weten we dat een stuk DNA een gen is en welke functie het heeft?
- Algemene herkenningstekens van een gen
o Promoter
o Open reading frame (bij een coderend stuk zul je een startcodon vinden en
uiteindelijk een stopcodon bij een gen. Bij een intron echter zul je veel meer
stopcodons vinden, ongeveer om de 20 codons)
o Etc.
- Transcript
- Structuur eiwit
- Verlies van functie bij verlies genexpressie
- Verkrijgen functie bij aanschakelen gen
Wat is de functie van een gen/eiwit in een organisme?
Kan je op twee manieren onderzoeken:
Classical genetics: bepaald fenotype geconstateerd -> Genotype zoeken wat erbij hoort
Reverse genetics: bepaald genotype gevonden -> zoeken welk fenotype erbij hoort
Tegenwoordig wordt de reverse genetics steeds meer gebruikt, dat komt omdat we nu het humane
genoom hebben en heel veel moleculaire biologische technieken om genen te manipuleren.
Gen: een functionele “unit” die codeert voor een eiwit
Genoom: alle genen bij elkaar
Allelen: twee kopiën van een gen
Heterozygoot: twee verschillende allelen
Homozygoot: twee dezelfde allelen
Recessief:
Dominant:
Klassieke Genetica:
Makkelijkste te onderzoeken bij simpele organismen.
Screen organisme voor mutanten met een bepaald fenotype
Gemakkelijkste voor snel delende organismen (prokaryoten, gist, fruitvlieg, C. elegans)
Mutaties bij deze organismen vaak ginduceerd:
DNA schade door chemicaliën
Gebruik transposon sequenties die zich random on het chromosoon nestelen (voordeel
hiervan is dat je hierop een marker kan zetten en zo snel kan terugvinden waar de mutaties heeft
plaatsgevonden.
In mensen: vaak genetische ziektes als startpunt. (ethisch onverantwoord om mutaties te induceren)
31
klassieke genetica: transposons
een transposon dat zich snel nestelt in Gen met
twee Internal Repeat (IR) sequenties. En in het
DNA van dit transposon zit dan ook een
bepaalde unieke DNA sequenties zodat je
duidelijk kan zien wat er is gemuteerd.
Verschillende soort mutaties:
- lethal mutations (dodelijk)
- Conditional mutation (mutatie
alleen onder bepaalde
condities)
- Loss-of-function mutation
- Null mutation (zelfde als lossof-function mutation)
- Gain-of-function mutation
(hogere of andere activiteit, is
vaak dominant)
- Dominant-negative mutation (mutatie die leidt tot een inactief gen, heeft dus alleen effect
op een heterozygoot allel)
- Suppressor mutation (komt alleen tot epressie als een ander gen ook is gemuteerd)\
Conditional mutations zijn belangrijk voor het identificeren van genen betrokken bij fundamentele
processen in de cel. Zo kun je bijvoorbeeld de invloed van bepaalde eiwitten onderzoeken in
verschillende fasen
Klassiek experiment in de genetica
waarin je kunt zien of er meerdere
defecte genen zijn:
32
Linkage analysis
Je maakt hierbij gebruik dat tijdens meiose
homologe recombinatie plaatsvind
(crossover). De kans dat twee genen met
elkaar wisselen hangt af van de afstand tussen
deze 2 genenn. Hoe groter de afstond tussen
twee genen, hoe groter de kans de ze van
elkaar scheiden tijdens meiose.
Je kunt zo kijken naar bepaalde markers in
verhouding met ziektes. En wanneer mensen
met deze ziekte vaak ook dezelfde marker
hebben, zullen deze twee genen dicht bij elkaar
op het genoom liggen.
Haplotype blocks:
Heel veel variaties in het chromosoon
komen vaak in blokken voor. Door weinig
crossover zijn deze nog altijd hetzelfde
gebleven. Hierbij kun je dan de correlatie
vinden tussen deze blokken en de ziekte van
een bepaalde persoon.
Reverse genetics:
1. Start met eiwit, gen of genoom sequenties
2. Breng gericht mutaties aan in DNA
3. Introduceer gemuteerd gen in chromosoom van organisme
4. Bekijk effect van mutaties in fenotype, mRNA expressie etc.
Zo kun je homologe recombinatie gebruiken:
gene replacement: normale gen vervangen door een gemuteerd gen. Kan leiden tot een interessant
fenotype, maar kan ook dodelijk zijn. Ook kun je het vervangen met een mutant gen, waarvan je de
acitiviteit kunt regelen, en zo de impact kunt bestuderen.
Gene knockout: het gen verwijderen.
33
Gene addition: een gen toevoegen zodat je overexpressie krijgt. Dit is random.
Dominant negative mutations
Wanneer je bij gene addition zorgt voor
meer eiwitten die samen zorgen voor
een groter eiwit (bijv. tetrameer). Kan
dit ervoor dat, terwijl je ook gezonde
eiwitten hebt, dit ervoor zorgt dat de
grotere complexe eiwitten inactief
worden.
Site-directed mutagenese (PCR)
Dit kan ook bij circulair
DNA:
De primers bij beide
strands worden
gedeactiveerd en de
kopie die ontstaat na
celdeling heb je nodig
voor verder onderzoek.
Gebruik van liposomen om DNA in een cel te krijgen:
Lipiden met aan de binnenkant het de DNA sequentie. Deze lipiden worden vaak
snel opgenomen in de cel, vooral cellen die snel delen hebben behoefte aan
lipiden. Zo krijg je het DNA in de cel.
34
Het hele proces om DNA in een cel te brengen heet transfectie
- Transiente transfectie (tijdelijke transfectie)
Het DNA wordt wel opgenomen in de cel, maar wordt niet in het DNA zelf ingebouwd. Wanneer de
cel gaat delen zullen de plasmiden weer weggaan. Voor gebruikt om te onderzoeken wat er gebeurt
bij overexpressie van een bepaalt gen of eiwit. DNA is dus niet stabiel ingebouwd in het
chromosoom.
Stabiele transfectie
In het DNA komt een selectie marker waardoor het DNA toch stabiel wordt ingebouwd in het
chromosoom. Erg inefficiënt proces, veel cellen zullen het niet goed inbouwen.
Transgene organismen
Eerst worden er bij gezonde cellen een bepaalde nieuwe sequentie ingevoerd die zal zorgen voor
knockout-genen of andere mutaties aan genen. Na kweken zullen slechts bij enkele cellen deze
sequentie goed worden ingebouwd en deze cellen laten ze uitgroeien tot een organisme.
Zo worden deze cellen dan bijvoorbeeld ingevoerd bij een embryonale cel van een muis en deze
cellen zullen meegroeien tot een groot organisme. Echter deze eerste muis die groot wordt is een
hybride muis. Niet alle cellen van deze muis zijn transgeen. Dan zoek je de muis die deze
gemodificeerde transgene cellen inbouwd in zijn geslachtscellen. Wanneer deze muizen met elkaar
worden gekruist, zullen de muizen helemaal knock-out zijn.
35
Conservatieve specifieke integratie
Om ervoor te zorgen om een bepaald
gen te onderzoeken dat dodelijk is
wanneer je het uitschakelt, kun je
gebruik maken van conservatieve
specifieke integratie. Hiermee kun je
genen aan en uitschakelen. Onder
invloed van een bepaald enzym kun je
zo een gen reguleren en kiezen
wanneer je het aan en uitschakelt.
hierbij moet je eigenlijk twee genen
inbrengen. Je brengt hierbij ook een
recombinase gen in dat het proces van
conservatieve specifieke integratie
katalyseert. Je brengt recombinase zo in dat
je de expressie van dit gen zelf kan reguleren
of dat het alleen activeert in een bepaald
weefsel.
Dit proces van het inbrengen van een nieuw
gen met behulp van homologe recombinatie
is erg inefficiënt. Het proces verloopt heel
sloom en is sterk gereguleerd. In gistcellen
niet, daar gebeurt homologe recombinatie
veel vaker.
Om de homologe recombinatie in dieren sneller te maken,
moet je eerst het gen dat je wil veranderen aan passen. Je
maakt erin een dubbelstrandsbreuk. Door homologe
recombinatie worden deze gerepareerd, zal dit dus vaker
voorkomen.
Normale restrictie enzymen zijn niet bruikbaar om te
gebruiken om deze breuken te maken. Hiervoor zijn nieuwe
restrictie-enzymen gemaakt, met behulp van Zink-vingers, die
veel specifieker zijn.
36
RNA interference
Cellen erkennen doublestrand RNA en kinppen dit op in kleinere stukken. Dit worden dan
dubbelstrands siRNA’s (silencing RNA) dit kan de expressie van genen blokkeren. hier worden twee
dingen mee gedaan:
- Het siRNA wordt enkelstrands
gemaakt en bind aan een
eiwitcomplex (RISC complex) en
hybrodiseert met mRNA.
Wanneer dat gebonden is zal het
RISC eiwit zorgen voor degradatie
van het mRNA. De siRNA zorgt er
dus voor dat mRNA wordt
afgebroken. Hiermee kun je dus
de expressie van mRNA
reguleren.
- Wat ook kan is dat het stukje
RNA dat ontstaat bind zich aan
een nieuw vormend mRNA en
hieraan bind zich dan weer een
RITS eiwit. Dit is een signaal voor
de kern om de transcriptie van
dit gen te blokkeren. Hiermee
kun je dus ook genen blokkeren.
Reporter genen
Een gen waarvan makkelijk de activiteit te volgen is. Dit gen wordt op de plaats gezet waarvan je
graag de regulatie wilt volgen. Je kijkt dan in welke type cellen
en in welke condities deze genen tot expressie komen.
Luciferase (reporterenzym)
Een gen dat zorgt voor een lichtreactie. Dit kan gebruikt
worden om bepaalde cellen te detecteren in bepaalde fases.
Zo kun je bijvoorbeeld de spreiding van een bacterie volgen of
de groei van een tumorcel.
Dit werkt alleen bij kleine proefdieren omdat dit licht niet
door veel weefsels heen kan. Bij grotere proefdieren kun je dit
dus niet doen.
Green Fluorescent Protein (reporterenzym)
Een gen dat fluorescent is. Absorbeert blauw licht en zend groen licht uit.
Een eiwit dat een beta-barrel eiwit vormt. Hierbinnen vinden twee reacties plaats wat alleen
hierbinnen zorgt voor de uitzending van groen licht.
Dit eiwit fuseer je dan met een eiwit waarna je geïnteresseerd bent en zo kun je dat blijven volgen
37
38
Col 8: Tussentoets en Controle over gen-expressie (HS7; LB)
Je kunt door het toevoegen van de juiste invloeden aan een cel er voor zorgen dat het zich weer
terug differentieert naar een stamcel.
Tijdens het gehele traject van DNA naar een eiwit zitten overal controle op.
Als DNA is opgerold in een dubbele
helix, zijn de waterstof bruggen tussen
de basenparen niet toegankelijk. Voor
herkenning van DNA sequentie
(bijvoorbeeld voor transcriptie), moet
er dus op een andere de basenparen
herkent worden. de herkenning wordt
gedaan met behulp van de grote en de
kleine groeve. Vanaf deze groeven kun
je zien waar er waterstofbrug
acceptors en waterstofbrug donors
zitten. in de kleine groeve zijn er
echter maar kleine moleculaire
verschillen tussen de basenparen. In
de grote groeve wel, dus die wordt
ook vooral gebruikt voor herkenning.
Zoals te zien in het plaatje hiernaast is
in de grote groeve wel duidelijk
verschillen te zien.
Zo zijn er eiwitten die deze lange reeksen vormen en waterstofbruggen vormen met deze reeks. Zo
ontstaat er een herkenning van een specifieke
basenreeks.
Er zijn bepaalde alpha-helixen die dan in deze groeve
gaan zitten. zo kan er precies een alpha-helix in een grote
groeve. Daarop gaan dan meerdere alpha helixen in een
eiwit inbouwen. Ze zijn met een afstand van 3.4 nm van
elkaar geplaats. Dat is de precies de lengte tussen 2 grote
groeve. Zo krijg je dus een grotere selectiveit doordat je
meerdere basenparen herkent en een grotere affiniteit.
39
Zo zijn er veel verschillende helix
combinaties voor verschillende genen
zo heb je ook coiled coils (twee in elkaar
draaiende alpha helixen), waarbij de
plek dat de coils uit elkaar gaan, ze
precies in twee grote groeve gaan zitten
en zo dit gen reguleren.
Zo kun je meerdere eiwitten met elkaar
combineren, en verschillende coiled
coils maken.
Zn-vinger
Zo heb je ook de zinkvinger. Zink gaat een binding aan
het 2 histidine-aminozuren en 2 cysteïne aminozuren
en stabiliseert zo een lange reeks aminozuren. Met nog
extra alphahelixen ontstaat er zo een structuur die in
de grote groeven gaat zitten en voor herkenning zorgt
van een gen. Meestal zitten er meerde Zink vingers bij
elkaar en herkennen zo een groter stuk van het gen.
De loop in de alpha-helix is belangrijk voor herkenning
in een Zn-vinger. In het plaatje hieronder zie je dat er
verschillende zinkvingers zijn voor verschillende genen.
“dus de alphahelixen zijn dus een subtiel framework,
waarop verschillende aminozuren geplaats kunnen
worden en door het juist plaatsen van verschillende
aminozuren kan je de verschillende DNA-sequenties
uitlezen.”
Zo heb je dus de terugkoppeling en communicatie voor
het wel of niet aflezen van bepaalde genen.
40
Chromatine ImmunoPrecipitatie (CHIP)
Om te onderzoeken welk genregulerend eiwit bind aan welk gen, kun
je onderzoeken met CHIP.
Je maakt hierbij chemische crosslinks tussen het DNA en je
genregulerend eiwit (met formaldehyde). Zo blijft het eiwit vast aan
het DNA. Dit DNA wordt dan kapotgemaakt in stukken. Daarna
gebruik je een antilichaam tegen genregulerend eiwit A. zo kun je
specifiek de DNA sequenties en eiwitten isoleren met een bepaald
gen regulerend eiwit. met behulp van PCR wordt dit eiwit
verveelvoudigt en zo kun je ophelderen op welke genen dit
regulerend eiwit zit. Zo weet je dus welk gen dit eiwit reguleert.
CHIP on CHIP
Hierbij zet je deze techniek van
CHIP en een daadwerkelijk Chip. Zo
kun je met verschillende celtypes
op iedere chip een array maken en
zo zie je precies waar welke genen
reageren bij welke regulerende
eiwitten.
Genregulerende eiwitten kunnen
leiden tot blokkade, maar ook tot
juist meer activiteit
verschillende combinaties leidt tot
verschillende regulaties. Dus A en C
kan zorgen voor activatie en A en B
tot inhibitie.
Gen regulerende eiwitten zijn geen schakelaars. Het zijn eerder dimschakelaars. Genen worden
nooit helemaal uitgezet. Ze kunnen alleen geremd of versneld worden.
41
42
Col 9-10: Cel communicatie (HS15; LB)
Er zijn vier verschillende mechanismen voor
epigenetische overerving.
1. Histon modificaties
(Methylering, acetylering, fosfylering)
2. De aanwezigheid van een
transcriptiefactor.
De aanwezigheid van een transcriptie
factor zorgt ervoor dat hij zichzelf
verder aanmaakt en ook andere
targetgenen. Als dit transcriptiefactor
dus niet aanwezig is, zullen deze
genen niet tot expressie komen. Bij
deling neemt iedere cel de helft van
de transcriptiefactoren mee en zo is
er dus overerving. Net als bij de
histonmodificaties.
3. DNA modificaties
Hierbij wordt DNA gemethyleerd. Dit zorgt ervoor dat het chromatine compacter wordt
opgeslagen tot heterochromatine (niet afleesbaar). Bij deling zal alleen bij de nieuwe DNA
keten methylering blijven. Echter wordt dit herkent door enzymen en zal de methylering ook
plaats vinden bij de andere keten. Hiermee wordt ook herkent welke de originele keten is.
En vind reparatie alleen plaats bij de andere keten.
4. Overerving van misgevouwen eiwitten
Eiwitten die verkeerd gevouwen zijn worden overgenomen in de nieuwe cellen. Deze
verkeerde vouwing katalyseert andere eiwitten om ook verkeerd te gaan vouwen. Vaak te
zien bij ouderdomsziektes zoals Alzheimer.
Alternative RNA splicing
Er zijn verschillende manieren van splicing waarbij ook exonen er
ooit uit worden gespliced.
Dit kan worden gecontroleerd door eiwitten. Zo zijn er
repressors die op een intron gaan zitten zodat er geen splicing
plaatsvind en je hebt activators die juist ervoor zorgen dat
splicing plaatsvind.
Werking HIV-virus:
Wanneer er van het ingebouwde HIV virus in het DNA, mRNA
gemaakt is, kunnen deze mRNA’s nog niet naar buiten. Deze
mRNA worden afgebroken tot kleinen mRNA’s en deze kunnen
wel de celkern uit. in het cytoplasma wordt met deze mRNA’s
het Rev-eiwit gemaakt, en deze gaan terug de cel in, binden zich aan het originele mRNA van het
HIV-virus en zorgen ervoor dat dit nu wel de celkern uit kan en infecteren dan andere cellen.
43
Controle start van de translatie
Dit zijn mechanismes om ervoor te zorgen
dat mRNA wel of niet wordt uitgevouwen.
Zo kunnen de startcodons in en dubbele
helix zitten van het mRNA zelf.
Milieuveranderingen, zoals verhoging van
de temperatuur (bij koorts), breekt deze
dubbele helix en kan dit mRNA wel
worden afgelezen. (zie afbeelding B).
Bij A is het mRNA zo gevouwen dat
bepaalde eiwitten er precies in kunnen
zitten en zo de translatie blokkeren
Bij C zijn er kleine moleculen nodig, om
ervoor te zorgen dat de vouwing van RNA
verandert en ervoor zorgen dat een startcodon wel of niet afleesbaar is.
Bij D kan een mRNA worden geblokkeerd met antisense (RNA interference) (zie blz 40) (wordt
uitgelegd einde college).
Hoofdstuk 15
Wanneer het eiwit eenmaal
gevormd is, betekent dat niet dat er
geen controle meer op is. Op dit
eiwit zitten ook heel veel controlos.
Zie plaatje
Dit hele proces hiernaast heet cel
communicatie en signalering
Je hoeft niet de afkortingen te
kennen, maar de concepten.
Quorum Sensing ( cel communicatie
begin tussen bacteriën)
Bacteriën vallen pas een organisme
aan wanneer ze met veel zijn.
Wanneer ze alleen zijn zullen ze
snel worden weggewerkt door het
immuunsysteem. Met behulp van
signalen die ze naar elkaar sturen,
weten de bacteriën “met hoeveel ze
zijn”. Wanneer er genoeg zijn worden de
bacteriën getriggerd om het organisme
aan te vallen. Dit proces werkt ook zo bij
menselijke cellen, maar is een stuk
ingewikkelder.
44
bij de mens wordt dus eerst een
signaal opgevangen aan de
buitenkant van een cel. Dit signaal
wordt verder gegeven via eiwitten.
Niet het eiwit wordt doorgegeven,
maar het signaal wordt doorgegeven.
Dus het eiwit beweegt er niet
doorheen.
Hierna worden uiteindelijk eiwitten
geactiveerd. Bijvoorbeeld eiwitten
die zorgen voor gentranscriptie,
eiwitten zie de structuur veranderen
of eiwitten die zorgen voor celdeling.
De eiwitten die elkaar in een reeks
activeren worden vaak bij elkaar
gebracht in een scaffold (platform), zodat meerder eiwitten zich kunnen binden en juist zijn
voorgepositioneerd. Hierdoor wordt het signaal veel makkelijker doorgegeven.
Signalen kunnen op twee manieren
in de cel worden doorgegeven
1. Het signaal wordt
opgevangen aan de
buitenkant van de cel
Daar heb je vaak te maken
met grote moleculen of
kleine moleculen die heel
polair zijn.
2. Het signaal gaat de cel in en
wordt daar verwerkt.
Vaak zijn dit kleine
hydrofobe moleculen
doordat zij makkelijker het membraam doorkunnen.
Intracellulaire signalering: Er zijn vier verschillende soorten signalering:
A. Daadwerkelijk celcontact. De cellen moeten fysiekcontact maken voor signalering. Waarbij
de ene aan de buitenkant signaalmoleculen zitten en aan de andere cel receptor eiwitten. Zo
kan je een mooie afscheiding maken tussen verschillende celtypes
B. Synaptische signalering. Gebeurt vaak in het zenuwstelsel. De synapsen geven een signaal af
en worden opgevangen door andere cellen. Hierbij worden signaalmoleculen afgegeven die
zorgen voor het signaal.
C. Paracine signaal. Een cel maakt een signaal
aan dat door het weefsel heen diffundeert en
wordt ontvangen door de omringende cellen.
D. Endocrine signaal
Een signaal dat niet alleen door het weefsel
wordt gediffundeert maar door het hele
lichaam wordt verspreid, maar alleen de
celtypen met de juiste receptors zullen iets
doen met dit signaal.
45
Afhankelijk van welk signaal, gebeurt er iets met dit cel. Vaak zijn er meerder signalen, en
combinaties hiervan, wil er iets gebeuren met dit cel. Zo kunnen verschillende combinaties zorgen
voor deling, differentiatie of opaptose.
Effect is ook afhankelijk van concentraties. Zo kunnen verschillende concentraties van hetzelfde
molecuul ervoor zorgen dat dezelfde cel zich differentieert in verschillende cellen.
Ook kan hetzelfde signaal zorgen voor verschillende effecten. Zo reageren botcellen anders op een
signaal dan bijvoorbeeld hartcellen of slijmproducerende cellen. Dit komt omdat de receptoren wel
hetzelfde zijn maar de pathways in een cel verschillend zijn.
Directe intercellulaire signalering via intracellulaire receptoren
- NO (stokstofmonoxide) signalering
door geactiveerde synapsen wordt er
in een endotheel cel acetylcholine
doorgegeven. In deze endotheelcel
worden dan arginine afgebroken tot
NO. Dit NO zorgt ervoor dat er in de
spiercellen GTP wordt omgebouwd
tot cyclisch GMP. Hierdoor ontspant
de cel zich.
Zo zijn er medicijnen die ervoor
zorgen die dat het GTP niet wordt
omgebouwd tot GMP. Een variant
hiervan is viagra.
-
Nucleaire receptoren
(kernreceptoren)
Dit zijn transcriptiefactoren die alleen in samenwerking werken met bepaalde signaal moleculen.
Deze moleculen worden ergens anders in het lichaam geproduceerd. Wanneer de moleculen dus
niet meer worden aangemaakt zullen de cellen een bepaald gen niet meer aflezen. Zo kun je deze
signaalmoleculen blijven slikken om toch
de werking van deze transcriptiefactoren
te blijven activeren. Signaalmoleculen
kunnen dus ook hormonen zijn.
Kern receptoren zijn multidomein
eiwitten. Dus zitten voor een gedeelte aan
het DNA gebonden en een ander domein
een ligand accepteert. En zo een inhibitieeiwit loslaat. Hierbij komen dan
coactivator-eiwitten die leiden tot
histonacetylering en andere chromatineremodelling activeiten.
Na activatie van het transcriptiefactoren
kunnen dus ook andere eiwitten worden geactiveerd die ervoor zorgen dat meer andere
transcriptiefactoren worden geactiveerd.
46
Cel-oppervlakte receptoren
1. Ion kanaalgekoppelde receptoren
Bij een ligand wordt dit kanaal geopend en kunnen er ionen de
cel in.
2. G-eiwit gekoppelde cellen
Een receptor in het membraam met aan de binnen g-eiwitten.
Die activeren samen enzymen dat leidt tot een signaal (wordt
later uitgelegd) niet enzymatisch actief, andere eiwitten worden
dus actief
3. Enzym gekoppelde receptoren
Worden geactiveerd door een ligand en worden dan zelf
enzymatisch actief. Het gaat dus zelf een reactie versnellen of
veranderen. (wordt later uitgelegd)
Signaleringsmechanismen van eiwitten: moleculaire schakelaars
- Fosforylering vs. Defosforylering
Met behulp van het eiwit kinase en ATP
wordt een eiwit gefosfolyseerd en zo
geactiveerd om een signaal door te geven. Dit
eiwit blijft dan actief totdat de fosfaatgroep
er wordt afgehaald. Dit moet er worden
afgehaald door phosphatase. Vaak zijn er
verschillende signalen nodig die zorgen voor
verschillende fosforylering en zo het eiwit
activeren.
-
Bindingstoestand GTP vs. GDP
Hierbij wordt GDP uitgewisseld met
GTP(het wordt dus NIET gefosfolyseerd
maar vervangen) en zo ontstaat er een
conformatieverandering en wordt het
eiwit geactiveerd.
Om te deactiveren moet er worden ge
hydrolyseert. Hierbij ontstaat dus wel
echt defosforylering. Dit doet het eiwit
zelf. Afhankelijk van de activeit gaat dit
wel of niet snel. Bij kankercellen gebeurt
deze deactivatie veel minder.
47
- Migratie / assemblage
Eiwitten bij elkaar brengen. Eiwitten worden zo bij elkaar verzameld
dat het signaal snel wordt doorgegeven. Dit kan met scaffold
eiwitten (blauwe eiwit)
Maar er zijn ook transmembrame eiwitten die zelf een scaffold-eiwit
worden bij activatie.
Verder kun je dit ook doen met fosforlipides die een
dockingplatform vormen en zo de eiwitten binden die erin passen.
Zo kunnen er makkelijker signalen worden doorgegeven als die
achter elkaar zijn geplaatst.
- Signaal – respons
in de cellen heb je vaak twee
verschillende reacties op een
signaal. Zo heb je cellen die
langzaam actiever worden bij
meer signaal, of je hebt signalen
die een bepaalde barrière over
moeten en dan ook helemaal
actief zijn.
Dit heeft veel te maken met
positieve en negatieve feedback. Zo kan het
signaal intact blijven of kan het signaal weggaan
of afremmen. Hierdoor wordt de activeit flink
beïnvloedt.
48
Er zijn verschillende manieren om een signaal te te blokkeren. Zo zie hieronder. (1) receptoreiwit
met signaal molecuul wordt van de wand weggehaald en het signaalmolecuul wordt verwijdert. De
receptoreiwit wordt teruggeplaatst. (2) de receptoreiwit met signaalmolecuul wordt verwijdert en
recyclet. (3) de receptor wordt geïnactiveerd. (4) het eiwit dat het signaal ontvangt van het
receptoreiwit wordt geïnactiveerd (5) een inhiberend eiwit deactiveert het signaal. (zo kan een eiwit
fosfaat laten binden aan deze eiwitten zodat aan die fosfaatgroepen een eiwit bind die de signalen
blokkeert)
G-eiwit gekoppelde receptoren
Een membraam eiwit wordt
geactiveerd door een
signaalmolecuul en wordt zo
actief. Wanneer dit actieve eiwit
in contact komt met een inactief
G-eiwit, maakt hij het G-eiwit
actief. Bij het G-eiwit wordt de
GDP groep vervangen met een
GTP groep en dit zorgt ervoor dat
de alpha groep loslaat van de
beta-gamma groep. Dit zorgt
voor twee actieve eiwitten die
ieder weer verder andere
eiwitten activeren en zo zorgen
voor een signaal-pathway.
Wanneer bij het alpha eiwit de GTP groep weer defosfolyseert tot een GDP groep, zal het alpha eiwit
zich weer binden met de beta-gamma groep. Wanneer het membraam-eiwit nog steeds actief is zal
de GDP groep weer opnieuw vervangen worden en begint het proces opnieuw. Het membraameiwit
kan worden gestopt door een eiwit door het membraameiwit te fosfolyseren zodat er een ander
eiwit aan kan binden. Dit andere eiwit zorgt ervoor dat er geen G-eiwitten meer bij kunnen.
49
in de cel zijn veel secundairy
messengers die na het
primaire signaal het signaal
verder doorgeven,
belangrijke voorbeelden
hiervan zijn cyclisch AMP,
calcium ion, inositoltrifosfaat
en diacylglycerol.
Deze secundairy messengers
activeren weer andere
eiwitten.
Cyclisch AMP
Cyclisch AMP activeert protien kinase A
(PKA). Cyclisch AMP zorgt ervoor dat het
eiwit wat PKA vasthoudt een corformatie
verandering aangaat en ervoor zorgt dat
het katalytische PKA subunit wordt
losgelaten. Dit kan weer andere eiwitten
gaan fosfolyseren.
Deze geactiveerde kalatische subunits
gaat de nucleus in omdat het nu klein
genoeg is. Dit fosfolyseert een transcriptiefactor CREB en sam die bindt samen met een ander eiwit
op responseiwitten en zo wordt de transcriptie gestart.
Hiernaast wordt fosfolipase C
geactiveerd door het G-eiwit. Dit eiwit
zorgt ervoor dat de binding tussen
inositol en diacylglycerol wordt
gebroken. Hiermee komen er dus
twee signaal moleculen die inactief
zijn als ze aan elkaar vast zitten. de
losse inositol groep gaat naar het ER
en zorgt ervoor dat er calcium
vrijkomt uit het ER, omdat inositol
bind aan een calciumkanaal. Dit
caluim bind samen met een kinaseeiwit aan het vrije diaglycerol eiwit en
dit geeft dan weer signalen door aan
andere eiwitten.
50
Calcuim respons (naast actieve PKC)
Bind aan calmoduline, welke weer aan heel veel andere eiwitten bindt en hun activiteit beïnvloedt.
Bijv: calmoduline activatie kan leiden tot:
CaM kinase activatie
Autofosforylatie
Fosforylatie target eiwit (bv transcriptiefactor)
Emzym gekoppelde receptoren
Enzym = bind ergens aan maar doet zelf geen
chemische reacties
2 typen enzymgekoppelde receptoreiwitten:
- Een receptor eiwit dat zelf zorgt voor
kinase activiteit
- Een receptor eiwit dat een ervoor zorgt dat
een ander enzym recruteren en zo kinase
activiteit doorgeven
Dit signaal wordt dan verder doorgegeven in de cel.
Tyrosine kinase eiwitten
Een eiwit dat niet actief is pas als het aan een
ligand bind en gaat het demeriseren. Hierdoor
krijgt het een conformatieverandering
waardoor de twee eiwitten elkaar gaan
fosforyleren. Hiervoor is dus een ligand nodig
om het te activeren.
Deze nieuwe fosfolyseringen zorgt ervoor dat
andere signaleringseiwitten kunnen binden.
Deze kunnen dan interactie met elkaar
aangaan of met andere eiwitten in de cel.
Je moet die pathways kunnen volgen en wat er
gebeurt en wat er gefosfolyseert worden. stap
voor stap vertellen. Conformatieveranderingen.
Signaleringsroutes GCPRs en RTKs lopen parallel
en beïnvloeden elkaar.
51
Receptor serine/threonine kinase. Die fosfolyseren geen tyrosine maar serine of threonine.
Receptoreiwitten veranderen van vorm en rekruteren kinase enzymen
deze receptoreiwitten hebben een
bindingsite eraan zitten en hebben
kinase uit het cytoplasma nodig.
Zoals te zien hiernaast zie je twee
cytokine receptoren met bindingsites
voor kinase-receptoren. Bij binding met
ligand fosfolyseren de kinases elkaar.
Deze kinases fosfolyseren dan ook het
receptoreiwit en wordt zo weer een platform voor andere eiwitten. Die geven een signaal door en
activeren transcriptie.
Gereguleerde proteolyse (Wnt, NF-kappaB)
Hierbij wordt een signaal doorgegeven door een eiwit te knippen. Hierbij wordt dus een eiwit
afgebroken.
Voorbeeld: NF-kappaB
Belangrijk bij ontstekingsreacties.
Door een receptor wordt de pathway aan gezet als het in
contact komt met een signaalmolecuul (tnf-alpha).
Uiteindelijk wordt dan de inhibtor afgebroken. Het wordt
gefosfolyseert en hierdoor komt er ubiquitine-staart op en
dit zorgt ervoor dat NF-kappaB vrij komt.
De Hedgehog
Normaal gesproken wordt de lange C-eiwit (rode
staafje) afgebroken, wanneer er geen signaal is.
Wanneer er het hedgehog signaal is zorgt ervoor dat
het donkergroene eiwit zich nestelt in het membraam
en daardoor zal het C-eiwit niet worden gefosfolyseert
en niet worden afgebroken.
Deze mechanismes zijn erg belangrijk bij stamcellen.
52
Col 11: controle van celcyclus en apoptose (HS17-18; LB)
De M-fase is nog onderscheidt in verschillende subfases. Zie plaatje.
Met behulp van flow cytometrie kun
je zien hoeveel DNA er in iedere cel
zit. Zo kun je dus duidelijk zien in
welke fase een cel zit.
in de cyclus van de celdeling zijn
er drie controlpunten of de
deling wel goed gaat. Deze
controle punten zijn:
1. Tussen G1 en S fase
2. Tussen de G2 en de M
fase
3. En halverwege de Mfase, namelijk tussen de
metafase en de anafase
Deze controlepunten zijn
definitief. Als het goed gecheckt
is gaat hij ook helemaal door
met de deling.
Deze controle wordt door
eiwitten gedaan.
53
Cycline-afhankelijke kinases
Deze kinase is normaal gesproken
inactief maar is wel tijdens de gehele
celdeling actief. Het wordt pas actief als
cycline aanwezig is. Deze cycline is maar
af en toe aanwezig tijdens de celdeling.
In dit plaatje zie de drie verschillende
cycline-afhankelijke kinases. Deze
cyclines zijn dus al eerder aanwezig of
een langere tijd aanwezig tijdens een
bepaalde gedeelte van de celcyclus.
Hiermee worden andere functies
geactiveerd.
Er zijn allerlei verschillende cycline
afhankelijke kinases.
De concentraties van de cyclines zorgt ervoo dat de cel een ander stadium van de celdeling ingaat.
De activiteit hiervan wordt sterk gereguleerd door:
- Cdk’s worden:
o Ge(de-)fosforyleerd -> activatie en inhibitie
o Geïnhibeerd middels eiwittetn
- Cyclines worden gesynthetiseerd/afgebroken
- Inhiberende eiwitten worden afgebroken
De binding van cycline aan CDK zorgt
ervoor dat de T-loop een andere
formatie aangaat en dat zorgt ervoor dat
de active-site vrij komt te liggen. Dit
wordt herkent door CDK-activating
kinase en die fosfolyseert de T-loop zodat
de active site nog meer vrij komt te
liggen. Hiermee wordt CDK geactiveerd.
CDK kan weer worden gedeactiveerd door het nog een
keer te fosfolyseren. Zie plaatje.
Daarnaast heb je ook nog CKI’s. dit eiwit bind aan het
actieve complex en zorgt ervoor dat er niks meer aan kan
binden. De actieve site wordt geblokkeerd door dit extra
eiwit.
Deze twee mechanisme kunnen weer worden
teruggedraaid door op het eiwit een ubiquitinestaart te
zetten. Dit zorgt ervoor dat het eiwit weer weggaat en zo
is de activiteit te reguleren.
54
Ook heb je nog het APC-eiwit. Dit zorgt ervoor
dat de cel de anafase ingaat. Dit zorgt ervoor
dat de M-cycline (die ervoor zorgt dat de cel de
M-fase ingaat) wordt afgebroken. Het APC
eiwit doet dit door de M-cycline te
ubiquitineren. Dit zorgt ervoor dat de cel de
anafase ingaat.
In een overzichtsplaatje ziet het
er dan zo uit:
Hierbij zijn ook nog externe
complexen te zien waardoor
mechanismes weer geremd
worden.
Apoptose
Gecontroleerde celdood
Caspasen
Eiwitten die zorgen voor
apoptosen. Deze enzymen knippen
cytosolische eiwitten en eiwitten
die de nucleus bij elkaar houden.
Daardoor verliest de cel zijn
stabileit en schrompelt hij in elkaar.
Deze caspasen zijn niet de hele tijd
actief. De zijn wel al in de cel, maar
niet actief, dan heten ze nog
procaspase. Ze worden was actief
als demeriseren. Caspasen worden
geactiveerd als het prodomein (grijze domein) wordt weggeknipt en de groene en lichtgroene
stukken gaan los. Zij vormen samen een heterodimeer en met een ander heterodimeer een groot
dimeer.
Als er eenmaal een paar caspasen zijn, kunnen zij elkaars prodomein eraf knippen en zo zijn er heel
snel veel caspasen en gaat de apoptose erg snel.
55
Extrinsieke route. Activatie van signalen van buiten de cel
Een lymfocyte cel komt tegen de receptor van een target cel die dood moet en activeert de caspasen
eiwitten. De caspasen komen daar dicht bij elkaar bij de activatoreiwit en activeren daar elkaar.
Intrinsieke route: activatie van signalen van binnen de cel
De cel laat cytochrome c los uit de mitochondriën en die bind zich aan een aantal eiwitten. Dit zorgt
voor een conformatieverandering waardoor zij een complex vormen waarop caspasen zich kunnen
binden. Hiermee start dan de apoptose.
Hier zit weer een controlingsmechanisme op, dit zijn de overlevingssignalen. Deze zorgen ervoor dat
er bepaalde eiwitten vrij komen die apoptose tegenkomen. Deze cellen zullen dus blijven leven en
niet doodgaan of delen.
56
Col 12: kanker (HS 20; LB)
Cellen die zich zelfzuchtig delen en geen “rekening” meer houden met andere cellen.
Grootste risicofactor voor ontstaan tumoren is ouderdom.
Kanker = verzameling van ziektes waarbij cellen aggresief en ongecontroleerd groeien
Normaal gesproken is ons lichaam in evenwicht, er komen even veel cellen bij als dat er doodgaan.
Bij kanker is de celgroei te groot. Dit kan komen door te grote celgroei of te kleine celdood. Dit is
vaak een combinatie van beide
Dit komt allemaal door misregulatie in de cel. In de pathways van een cel is er dan iets misgegaan.
Kanker komt vaak door een verzameling van puntmutaties bij elkaar. Op latere leeftijd heb je meer
puntmutaties en is de kans groter dat deze puntmutaties bij elkaar komen en waar iets mis mee is,
waardoor het cel niet meer gereguleerd wordt.
Heel vaak is de oorzaak van kanker niet duidelijk.
De omgeving waarin je woont is ook belangrijk.
Kankercellen hebben twee belangrijke kenmerken:
- Reproduceren onder omstandigheden welke dit normaal gesproken niet toelaten. Zij
negeren dus bijvoorbeeld signalen die zeggen dat ze moeten stoppen met groeien
- Invaseren en koloniseren weefsel van andere celtypen. Normale cellen kunnen dat niet.
80% van de kanker zijn van carcinoma (epiteelcellen). Dit komt omdat deze cellen zich veel sneller
delen dan andere cellen en omdat deze cellen veel in contact komen met de omgeving omdat ze aan
de buitenkant van de weefsels zitten.
Dit is weer op te delen in twee groepen:
- Goedaardige kanker: is niks goedaardigs aan, maar is nog niet uitgezaaid. En daardoor veel
makkelijker te behandelen.
- Kwaadaardige kankers: heeft zich wel al verspreid en koloniseert andere weefsels
Kanker ontstaat meestal uit een ontspoorde
cel die vervolgens nakomelingen krijgt die
steeds verder ontaarden. Maar dit kost tijd
en meerdere mutaties zijn nodig voor
ontsporing.
Gezonden cellen hebben een grote
cytoplasme en een kleine nucleus.
Kankercellen of tumorcellen hebben een veel
grotere nucleus in verhouding met hun
cytoplasme.
57
Carcinogenese door combinatie van (epi)genetische veranderingen
Kanker komt niet alleen door genetische variaties maar ook door epigenetische variaties….
… maar ook door genetische instabiliteit
- Breuken in chromosonen
- Verkeerde stukken chromosoom aan elkaar geplakt
- Extra of juist verlies chromosomen.
Eigenschappen die kankercellen moeten hebben:
- In staat zijn om zelfstandig te overleven
- Relatief ongevoelig voor anti-proliferatie signalen (misregulatie cel signaling)
- Minder (gevoelig voor) apoptose inductie
- Missen controle mechanisme voor proliferatie arrest (misregulatie cel cyclus)
- Zijn in staat omliggende cellen te activeren
- Induceren angiogenese (bloedvaten voor toevoer)
- Kunnen metastaseren – groeien in een andere omgeving
- Zijn genetisch instabiel
- Zijn in staat hun telomeren te stabiliseren
Genen betrokken bij ontstaan van kanker
Overexpressie (gain of function): proto-oncogenen ->
oncogenen
Het toevoegen van een eiwit waardoor een cel
ongeremd gaat delen heet een oncogenen
Bij oncogenen hoeft maar een van de twee genen te
muteren om bij te dragen aan een functioneel
kankercel
Verlies expressie (loss of function): Tumor
suppressor genen
Als er een eiwit(productie) wegvalt dat niet je dat
een tumor suppressor gen
Hierbij moeten er twee genen tumoren om een gen
te blokkeren en te leiden tot een kankercel
58
Proto-oncogenen bevinden zich al in het DNA en door bepaalde veranderingen worden zij actief.
Hiervan zijn een aantal voorbeelden hoe een oncogeen uit een proto-oncogeen kan ontstaan: (1)
een puntmutatie waardoor het gen een stuk actiever wordt en meer substraat loslaat. (2) hierbij
ontstaat er meer eiwitten, doordat de regulerende sequentie voor het gen verandert. (3) het gen
kan gedupliceert worden en vaker in het genoom komen (4) door een uitwisseling staat er een
promoter voor het gen waardoor het gen veel meer wordt uitgelezen.
Dit hoeft maar op een van de twee allelen te gebeuren
Tumor suppressor gen:
Een gen dat altijd al op het genoom zat, maar wat dan wegvalt.
Het Rb-eiwit
Dit eiwit zorgt ervoor dat de transcriptiefactor wordt vastgehouden, waardoor het gen niet kan
worden uitgelezen. Wanneer het Rb-eiwit niet aanwezig is, of gefosfolyseert wordt, of iets anders,
kan het gen worden afgelezen en kan de tumor zich ontwikkelen.
Bij een tumorsuppressorgen moet dus bij beide allelen het gen wegvallen. Wanneer er maar eentje
wegvalt, kan het andere gen de vermindering van een bepaalde eiwitproductie compenseren.
Belangrijke celbiologische pocessen en hun verstoringen bij kanker
- Celproliferatie / celcyclus-regulatie
- Geprogrammeerde celdood (apoptose)
- Signaaltransductie
- Transcriptie-regulatie
59
Rb en controle celcyclus
Bij kankercellen is er geen
controle meer op de
celcyclus en gaat de cel
meteen de S-fase in. Dit
komt door inactivatie van
het Rb eiwit. Dit eiwit zorgt
er normaal voor dat de
transcriptiefactor die zorgt
voor het doorgaan naar de
S-fase wordt geïnhibeerd.
Bij kankercellen in dit Rbeiwit inactief en zal dit gen
worden afgelezen en gaat een cel meteen de S-fase in.
Ook celgroei is nodig
De opname bij glucose bij de glucose transporter.
Apoptose
Normal gesproken gaat een cel dood als het
bepaalde signalen van buiten gaat. Het p53
eiwit wordt geactiveerd en dit zorgt ervoor
dat de cel dood gaat. Een tumor cel heeft
puntmutatie waardoor p53 niet meer actief
is.
Wanneer p53 ontbreekt in een cel gaat een
cel met een kapotte DNA-strand gewoon de
S-fase in. Dit zorgt ervor dat er een breuk zit
wanneer de genen zijn verdubbelt. Dit is te
zien in het plaatje hiernaast. Deze breuk
wordt gerepareerd door het te plakken aan
de andere chromosoom. Hierdoor kunnen er
twee genen op een chromosoom staan.
60
Virus
Cellen kunnen door een virus
ook een kankercel worden.
Wanneer een virus zich indringt
in een cel zorgt dit ervoor dat
het wordt afgelezen en voor
nieuwe eiwitten zorgt. Echter
zat dit duidelijk te zien zijn.
Wanneer dit virus zich echter
juist in de DNA sequentie
nestelt, zal het veel beter
worden afgelezen en kan dit
leiden tot een kwaadaardige kankercellen.
De eiwitten die hierbij worden aangepast zijn de Rb-eiwitten en het p53-eiwit.
61
62
Col 13: immunologie (HS 25; LB)
Inhoud:
- Algemene immuunsysteem en lymfocyten
- B-cellen maken antilichamen
- Moleculaire biologie van antilichaam diversiteit
- T-cellen en MHC eiwitten
- Activatie van T-cellen
Twee immuunsystemen:
1. Aangeboren (innate): algemene afweer tegen vreemde organismen (bijv. bacteriën) en
partikels met lipopolysacchariden
2. Verworven (adaptive): afweer verbetert geleidelijk: geheugen
Dit gaat via T-cellen (cellulaire afweer ) en via B-cellen (humorale afweer m.b.v. antilichamen)
Aan de buitenkant van veel bacteriën zit LPS. Dit is een bepaalde suikergroep die wordt herkent door
het aangeboren immuunsysteem. Dit zorgt ervoor dat deze bacteriën worden opgeruimd.
Antigen + antilichaam generator: molecuul of partikel dat productie antilichamen opwekt
Antigene determinant (epitoop): deel van molecuul dat herkend wordt
Cytokine: factor geproduceerd door cel die reactie van andere cellen opwekt
63
hierbij wordt een cel geïnfecteerd door een virus.
Hierbij zet het aangeboren immuunysteem het
verworven immuunsysteem aan. Hierbij zijn twee
reacties mogelijk:
1. De B-cellen gaan antilichame produceren en
pathogenen herkennen en deze vastpakken.
Deze antilichamen worden herkent en
worden opgeruimd door macrofagen
2. T-cellen die de cellen die geïnfecteerd zijn
door een virus opruimen. De geïnfecteerde
cellen zullen hierdoor doodgaan.
Dendritische cellen:
Deze cellen vangen bacteriën op in het
lichaam die binnenkomen door
bijvoorbeeld een snee. Deze breken de
bacteriën op in stukken en presenteren
kleine stukken en gaan naar een
lymfeklier. Deze stukken worden
herkent door T-cellen en vormen een
juiste combinatie. Hierdoor wordt de Tcel geactiveerd en gaat delen en
differentiëren. Deze geactiveerde cel
gaat naar de plek van infectie en daar
de geïnfecteerde cellen doden.
Ontwikkeling T- en B-cellen
Deze cellen worden gemaakt in het beenmerg.
Hier worden ook bloedcellen gemaakt, dus rode
en witte bloedcellen en bloedplaatjes. Ze
ontstaan uit een overeenkomstige cel en kan een
B-cel of T-cel worden. B-cellen worden in het
beenmerg gevormd en T-cellen in de Thymus.
Die worden naar het lymfestelsel gebracht en
zijn daar aan het rusten. Totdat er een antigen
bind en worden de T-cellen en B-cellen
geactiveerd.
64
Clonale selectie, of hoe B-cellen 1012 verschillende antilichamen coderen
Één B-cel codeert voor een antilichaam.
Wanneer een B-cel wordt gevormd zal het zich
differentiëren en allerlei verschillende B-cellen. Bij
een pathogene infectie worden de antigenen
herkent. Dit doen ze door hun antilichaam aan de
buitenkant van hun membraam te presenteren.
Wanneer een antigen dan aan dat antilichaam
bindt zal de B-cel zich gaan prolifereren en
differentiëren. Er komen dus meer van deze cellen
en ze worden groter. Ze zullen dit antilichaam gaan
aanmaken als oplosbaar antilichaam waardoor het
lichaam door kan.
Dit wordt gedaan via alternatieve splicing en
worden de exonen niet meer meegenomen en is
het niet meer transmembraam en zal er een oplosbaar eiwit ontstaan.
Wanneer een cel al eerder een bepaalde ziekte heeft gekregen, blijft er een kleine populatie van de
B-cellen over. Hierdoor zul je altijd antilichamen in je lichaam houden. Bij een nieuwe besmetting
zullen deze B-cellen sneller reageren en zal er sneller een respons zijn. Deze cellen die overblijven
heten memorycellen.
Immunoglobines
Verzamelnaam voor
antilichamen. Worden
gemaakt door B-cellen en
herkent een specifieke
antigen. Er zijn 1012
verschillende antilichamen
mogelijk.
Bestaat uit vier zware ketens
en 2 lichte ketens. In het
midden zit een “hinch”, een
draaipunt. Aan het uiteinde
van een zware en lichte
keten zit een
antigenbindende plek. Op
deze plekken worden
hetzelfde antigen gebonden.
Dit heeft als voordeel dat wanneer je meer antigenen hebt, dat
deze antigenen en antilichamen gaan clusteren. Deze clusters
worden herkent door macrofagen.
De verschillende immunoglobines verschillen in grote en aantal
ketens, maar ook in functie. Dit systeem moet herkent worden
door macrofagen, dat gaat door middel van de zware keten, want
hierop zit een herkenning. Dit wordt herkent door macrofagen.
65
Hoe kunnen we zo veel verschillende antilichamen maken met zzo weinig genen? Of, moleculaire
biologie van antilichaam diversiteit
immunoglubuline bestaat dus uit een
heavy-chain en een light-chain. De
light chain bestaat uit een variabel
gedeelte en een constant gedeelte.
En de heavy chain bestaan uit drie
constant gedeeltes en een variabele
gedeelte. In de variabele regios zitten
weer hypervariabele gedeeltes
waardoor een antigen nog
makkelijker kan binden.
Door deze verschillende bindingen
kan je een hogere affiniteit maken.
Vorming constante gedeelte:
Ieder contstant deel heeft zijn eigen exon.
De intronen worden er dan uitgespliced en
zo ontstaat het constante domein.
Bestaat uit een dubbele beta-sheet
structuur.
Vorming variabele domein:
Bestaat ook uit een dubbele beta-sheet structuur.
Zij hebben hier echter nog drie lange loops aan
het uiteinde en zijn heel verschillend. Zij kunnen
hierdoor verschillende formaties maken en zo
verschillende antigenen binden.
66
Vorming variabele deel light chain
Het variabele deel bestaat niet uit
een exon, maar uit verschillende
exonen. Het wordt opgebouwd uit
twee exonen. Een combinatie tussen
een v-segment en een j-segment. Er
zijn er van beide heel veel, daardoor
zijn er veel combinaties mogelijk.
Door splicing in het DNA wordt er in
het stamcel een gedeelte DNA
kwijtgeraakt. Maar dit kan op vele
verschillende manieren. Hierdoor kan
hij heel veel verschillende
combinaties maken.
Hieruit zijn dan 200 verschillende
Light chains mogelijk
vorming variabele deel heavy chain
dit deel staat uit een v-deel, een d-deel én een j-deel. Hierdoor heb je meer variatie. Hiermee zijn
6000 verschillende combinaties mogelijk. Dit werkt hetzelfde als bij light variable chain.
Het koppelen van de V-deel met het Jdeel is bewust onnauwkeurig. Hierdoor
ontstaan er nog meer combinaties.
Wanneer V en J worden geknipt, worden
er door 2 grote eiwitten een circulair
stukje gemaakt. Dan wordt dit circulair
stuk eruit geknipt en wordt met behulp
van een eiwit het V-deel en het J-deel aan
elkaar geknipt. Dit gebeurt echter heel
onnauwkeurig en er komen zo nog andere
basen tussen. Hierdoor is nog meer
variatie in deze chains.
Dit zorgt echter voor een probleem, want
wanneer je niet een drietal van
basenparen invoegt, klopt het
readingframe niet meer. Dit komt omdat
altijd 3 basen coderen voor een aminozuur. Dit kan zorgen voor niet functionele eiwitten.
Somatische hypermutaties
Mutaties die niet in geslachtscellen voorkomen. Bij deze cellen vinden veel meer mutaties plaats (106
meer dan bij normaal DNA). Hierdoor zullen deze antilichamen zich nog verder variëren. In veel
gevallen zijn ze minder goed bindend, maar sommige zijn beter bindend. De cellen die het sterkst
binden aan het antigen zullen worden geactiveerd en eruit geselecteerd. Deze cellen zullen beter
overleven en meer worden geproduceerd.
67
T-cellen: antilichaam-achtige
heterodimeren
T-cellen hebben ook soortgelijke
receptoren als bij B-cellen en kunnen ook
antigenen binden. Deze arm lijkt dan ook
op een van de armen van een
antilichaam.
Een T-cel herkennen eiwitfragmeten
gepresenteerd aan de buitenkant van een
dendritische cel met behulp van MHC
eiwitten.
B-cellen herkennen dus intacte eiwitten,
T-cellen herkennen eiwitfragmenten.
Er zijn drie type T-cellen:
- Cytotoxische T-cellen
- Helper T-cellen
- Regulatoire T-cellen (zorgt ervoor dat het immuunsysteem niet eigen cellen aanvalt) (zal het niet
echt over gaan)
T-cellen binden met een lagere affiniteit aan een andere cel. Dit wordt gecompenseert, omdat de Tcellen veel meer van deze binding siten heeft (chains). Doordat er dus veel van deze zwakkere
bindingen zijn zal de T-cel toch goed binden.
MHC-eiwitten
Dit zijn transmembraam eiwitten die constant
eiwitfragmenten laat zien. Of korte stukjes peptide die de
cel zijn ingekomen. Deze MHC-eiwitten worden gescreend
door de T-cellen. Wanneer deze cel wordt herkent als
lichaamsvreemd zal het T-cel binden en zijn werking doen.
De cellen zullen dus zichzelf presenteren als verkeerde
cellen.
Er zijn twee klassen:
Klasse 1: laat peptides zien voor cytoxische T-cellen (heeft
een transmembraam reeks)
Kan voornamelijk peptide tentoonstellen van 8 tot 10
peptideketens
Klasse 2: laat peptides zien voor helper T-cellen (heeft twee
transmembraam reeksen)
Kan langere peptidesequenties tentoolstellen.
De MHC bind zich aan de backbone, zodat bijna alle
peptidesequenties zich kunnen presenteren in deze MHC-eiwitten.
68
Vooral de derde loop van de
T-cellen binden aan het
gepresenteerde
peptideketen in een MHC.
De andere twee ketens
binden vooral aan de MHCeiwit. Zo krijg je herkenning
van de peptidesequentie en
van het MHC eiwit.
CD8 eiwitten: helpen bij erkenning van MHC eiwitten klasse 1 voor cytoxische cellen (8x1=8)
CD4 eiwitten helpen bij erkenning van MHC eiwitten klasse 2 voor T-helper cellent (4x2=8)
Deze eiwitten zorgen ervoor dat de binding stabieler is.
Activatie T-cellen
Het activeren van een T-cel gebeurt met een dendritische cel.
Geactiveerde T-cellen gaan
prolifereren en differentiëren.
Deze T-cellen gaat zijn eigen
signaalmolecuul aanmaken
zodat ook andere T-cellen ook
te activeren.
Cytotoxische T-cellen helpt
andere cellen dood te gaan. dit doet hij door met zijn T-cel receptor te binden aan de geïnfecteerde
cellen. Dit zal pathways activeren waardoor de cel dood zal gaan. hierbij wordt dus twee
verschillende apoptose pathways geactiveerd en zal de cel doodgaan.
T-helper cellen worden op dezelfde manier
geactiveerd en zullen eerst andere cellen
activeren van het immuunsysteem. Er zijn
twee typen. Type 2 activeren B-cellen en
zorgen voor de productie van antilichamen.
En type 1 helpen voor de productie van
macrofagen.
69