De gemiddelde effectieve dosis ioniserende straling in
advertisement
Moleculair onderzoek naar de effecten van X-stralen bij patiënten na een contrast CTonderzoek Ans ROMBOUT Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. H. Thierens Vakgroep Medische Basiswetenschappen Academiejaar 2009-2010 “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.” 25 mei 2010 Ans Rombout Prof. Dr. H. Thierens I Voorwoord Wetenschappelijk onderzoek is een voltijdse job. Het verzamelen van data, de verwerking van resultaten en het rapporteren van deze resultaten in een masterproef zijn opdrachten die veel tijd en energie vragen. Met enige trots kan ik u hier mijn masterproef presenteren, de bekroning op mijn opleiding Biomedische Wetenschappen. Niet alle lof komt echter mijzelf toe, alleen was mij dit immers nooit gelukt. Gelukkig heb ik beroep kunnen doen op verschillende personen die mij hierbij enorm hebben geholpen. In de eerste plaats wil ik mijn promotor, Prof. Dr. H. Thierens, bedanken om mij de mogelijkheid te bieden dit onderzoek te doen. Hierdoor is mijn interesse voor medische stralingswetenschappen en wetenschappelijk onderzoek enorm gegroeid. Daarnaast wil ik mijn begeleidster M. Sc. Laurence Beels uitdrukkelijk bedanken voor zowel haar professionele als persoonlijke steun. Haar hulp bij het aanleren van de nodige technieken, de statistische verwerking van de resultaten en het schrijven van mijn thesis was onmisbaar. Graag wil ik ook Dr. Ir. Kim De Ruyck bedanken voor haar hulp bij het real-time PCR werk. Mijn oprechte dank gaat ook uit naar het personeel werkzaam op de dienst medische fysica van het instituut voor nucleaire wetenschappen. Zij maakten het labo tot een leuke werkomgeving waar ik altijd op hulp kon rekenen. Uiteraard ook een dankjewel aan mijn mede-thesisstudenten Iris en Marlies, voor hun luisterend oor, hun steun, hun hulp en voor de vele leuke momenten in ons lokaaltje. Mijn dank gaat ook uit naar alle patiënten die bereid waren deel te nemen aan deze studie. Uiteraard wil ik ook het UZ-personeel dat mij geholpen heeft bij het verzamelen van de bloedstalen bedanken voor hun onbaatzuchtige inzet en interesse voor mijn studie en voor de leuke sfeer tijdens het wachten. Ten slotte wil ik mijn vrienden en familie en in het bijzonder mijn ouders en mijn vriend Yuri bedanken. Zonder hun vertrouwen, hun steun en peptalk nu en dan, zou ik de voorbije vijf jaar nooit zo soepel hebben doorlopen. Aan iedereen die zijn steentje heeft bijgedragen tot deze masterproef: bedankt! II Inhoudstafel Samenvatting ....................................................................................................................... - 1 - 1 Inleiding.......................................................................................................................... - 2 1.1 Introductie ................................................................................................................. - 2 1.2 Computer tomografie ................................................................................................ - 2 1.3 Risico’s van lage dosis ioniserende straling .............................................................. - 3 1.3.1 Het LNT model ................................................................................................. - 4 - 1.3.2 Gamma-H2AX foci als biomerker voor stralingsschade .................................. - 7 - 1.3.3 Moleculaire biomerkers voor stralingsschade ................................................. - 10 - 1.4 Kwantitatieve real-time PCR .................................................................................. - 12 1.4.1 Principe............................................................................................................ - 12 - 1.4.2 Targetgenen GADD45A en CDKN1A ........................................................... - 13 - 1.4.3 Referentiegenen ............................................................................................... - 14 - 1.5 Doelstelling ............................................................................................................. - 15 - 2 Materialen en Methoden ............................................................................................. - 17 2.1 Inleiding .................................................................................................................. - 17 2.2 Onderzoekspopulatie ............................................................................................... - 17 2.3 Gamma-H2AX foci scoring .................................................................................... - 17 2.3.1 Staalafname en lymfocyt isolatie .................................................................... - 17 - 2.3.1.1 Staalafname ............................................................................................ - 17 - 2.3.1.2 Lymfocyt isolatie ................................................................................... - 18 - 2.3.1.3 Tellen van de lymfocyten....................................................................... - 18 - 2.3.2 Immunofluorescentiekleuring ......................................................................... - 19 - 2.3.3 Scoring van gamma-H2AX foci ...................................................................... - 20 - 2.3.4 Data analyse en statistische verwerking .......................................................... - 20 - 2.4 Kwantitatieve real-time PCR .................................................................................. - 20 2.4.1 RNA isolatie .................................................................................................... - 20 - 2.4.1.1 Bloedafname en stabilisatie van RNA in RNAlater solutie .................. - 20 - 2.4.1.2 Cellyse en initiële RNA zuivering ......................................................... - 21 III 2.4.1.3 RNA isolatie........................................................................................... - 21 - 2.4.1.4 DNase I behandeling .............................................................................. - 22 - 2.4.1.5 Opbrengst en kwaliteit RNA .................................................................. - 22 - 2.4.2 2.4.2.1 Reactiemix voor cDNA synthese ........................................................... - 22 - 2.4.2.2 cDNA synthese ...................................................................................... - 23 - 2.4.3 Primers ............................................................................................................ - 23 - 2.4.3.1 Primerdesign .......................................................................................... - 23 - 2.4.3.2 Primers oplossen in buffer ..................................................................... - 24 - 2.4.4 3 cDNA synthese ................................................................................................ - 22 - Real-time PCR................................................................................................. - 24 - 2.4.4.1 Reactiemix voor real-time PCR ............................................................. - 24 - 2.4.4.2 Real-time PCR ....................................................................................... - 25 - 2.4.5 In vitro real-time PCR experiment .................................................................. - 25 - 2.4.6 Data analyse en statistische verwerking .......................................................... - 26 - 2.4.6.1 Primerefficiëntie .................................................................................... - 26 - 2.4.6.2 Stabiliteit van de referentiegenen........................................................... - 27 - 2.4.6.3 Relatieve kwantificatie........................................................................... - 27 - Resultaten ..................................................................................................................... - 28 3.1 Gamma-H2AX foci scoring .................................................................................... - 28 3.1.1 Optimalisatie protocol voor gamma-H2AX foci scoring ................................ - 28 - 3.1.2 In vivo dosis-respons curve ............................................................................. - 28 - 3.1.3 Vergelijking in vivo – in vitro data.................................................................. - 32 - 3.2 Kwantitatieve real-time PCR .................................................................................. - 33 - 4 3.2.1 Primer design................................................................................................... - 33 - 3.2.2 Primerefficiëntie .............................................................................................. - 34 - 3.2.3 In vitro real-time PCR experiment .................................................................. - 37 - 3.2.3.1 Stabiliteit van de referentiegenen........................................................... - 37 - 3.2.3.2 Effect van dosis en tijd op de genexpressie van de targetgenen ............ - 37 - Bespreking.................................................................................................................... - 40 4.1 Gamma-H2AX foci scoring .................................................................................... - 40 4.1.1 Optimalisatie protocol voor gamma-H2AX foci scoring ................................ - 40 - 4.1.2 In vivo dosis-respons curve ............................................................................. - 40 - 4.2 Kwantitatieve real-time PCR .................................................................................. - 44 IV Algemeen besluit ................................................................................................................ - 47 - Referentielijst ..................................................................................................................... - 48 - V Afkortingen 53BP1 53 binding protein 1 A Adenine acc acceleration Alu Arthrobacter luteus ATM Ataxia Telangiectasia Mutated ATR ATM and Rad3-related B2M Beta-2-Microglobulin bp baseparen BRCT BRCA1 C-terminus BSA Bovine Serum Albumine C Cytosine CDKN1A Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 1 cDNA complementary DNA cm centimeter CT Computer Tomografie Cq cycling quantity DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole DLP dose length product DNA DeoxyriboNucleicAcid DNA-Pk DNA-Dependent Protein Kinase dNTP deoxynucleotidetrisphosphate DSB dubbelstrengbreuk EDTA EthyleenDiamineTetraAcetaat ETBD equivalent total body dose FCS Foetal Calfs Serum G Guanine ×g times gravity GADD45A Growth Arrest and DNA Damage A GAPDH Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase gDNA genomic DNA VI Gy Gray HMBS HydroxyMethylBilane Synthase IRIF Ionizing Radiation Induced Foci kVp peak kilovoltage L lengte LNT linear-no-treshold LSS Life Span Study min minute µg microgram µl microliter µM micromolair Mdc1 Mediator of DNA damage checkpoint protein 1 mGy milliGray ml milliliter MRe11 Meiotic Recombination 11 MRI Magnetic Resonance Imaging mSv milliSievert MWU Mann-Whitney U Nbs1 Nijmegen Breakage Syndrome 1 NF normalization factor ng nanogram NO Nitric Oxide NRQ normalized relative quantification nt nucleotide NT controle no template controle nr nummer PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PIKK Phosphatidylinositol 3-Kinase Protein Kinase-like RAM-TRITC rabbit anti-mouse antibody conjugated with Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate RNA RiboNucleicAcid ROS Reactive Oxygen Species rpm Rounds Per Minute VII RPMI Roswell Park Memorial Institute medium RT-mins Reverse Transcriptase minus RQ relative quantification SE standard error SEM standard error of the mean sec seconden SNP Single Nucleotide Polymorfisme SPSS Statistical Package for the Social Sciences SYBR Synergy Brands T Thymine Ta annealingstemperatuur TE Tris EDTA U/ml units/ml UCSC University of California Santa Cruz UZ Gent Universitair Ziekenhuis Gent V volume v15 versie 15 qRT-PCR kwantitatieve real-time PCR VIII Samenvatting Ioniserende straling kan verschillende schadelijke effecten induceren bij de mens. Stralingsgeinduceerde dubbelstrengige DNA breuken vormen de kritische lesies die bijdragen tot een verhoogd risico op kanker. Risico’s op stralingsgeïnduceerde kanker bij blootstelling aan lage dosissen ioniserende straling worden geschat door extrapolatie van hoge dosis data met behulp van het ‘linear-no-treshold’ model. De validiteit van dit model wordt echter in vraag gesteld door een aantal radiobiologische fenomenen zoals het bystander effect, lage dosis hypersensitiviteit en adaptieve respons. Recent kon lage dosis hypersensitiviteit aangetoond worden bij kinderen in de interventionele cardiologie. In deze masterproef werd onderzocht of deze hypersensitiviteit in het lage dosis gebied ook aangetoond kon worden bij volwassen patiënten die een CT-onderzoek hebben ondergaan. Hiervoor werd gebruik gemaakt van γ-H2AX foci als gevoelige biomerker voor DNA dubbelstrengbreuken in de lage dosis regio. Daarnaast werd getracht de condities te optimaliseren voor in vivo kwantitatief real-time PCR onderzoek, dat tot doel heeft de onderliggende oorzaken van de lage dosis hypersensitiviteit te achterhalen. Voor deze masterproef werden 61 volwassen patiënten beschouwd die een abdominaal of thoracaal contrast CT-onderzoek ondergingen. Van elke patiënt werd een bloedstaal verzameld kort voor en kort na het CT-onderzoek. Op elk bloedstaal werd achtereenvolgens een lymfocytscheiding en een immuunkleuring voor γ-H2AX foci uitgevoerd. Bij het uitzetten van het geïnduceerd aantal γ-H2AX foci ten opzicht van de DLP-waarde, werd hypersensitiviteit in het lage dosis gebied geobserveerd. Voor het qRT-PCR luik van deze masterproef werden de targetgenen GADD45A en CDKN1A en de referentiegenen HMBS, B2M, GAPDH en Alu-repeats beschouwd. Voor deze genen werden primers gezocht en werd de primerefficiëntie bepaald. Vervolgens werd een in vitro qRT-PCR experiment gedaan om de stabiliteit van de referentiegenen en het tijdstip van maximale genexpressie van de targetgenen te bepalen. De expressie van beide genen werd gemoduleerd door in vitro bestraling met lage dosissen X-stralen maar aangezien de genexpressie daarnaast ook beïnvloed werd door de in vitro experimentele condities, zijn de geobserveerde dosis-respons en tijd-respons relaties zeer complex. Trefwoorden: Computer tomografie / γ-H2AX foci / qRT-PCR -1- 1 Inleiding 1.1 Introductie De gemiddelde effectieve dosis ioniserende straling in België wordt geschat op 4,6 mSv per jaar per inwoner, waarvan 2,1 mSv afkomstig is van toepassingen van ioniserende straling, voornamelijk in de medische beeldvorming [1]. Het grootste deel van deze dosis kan toegeschreven worden aan computer tomografie (CT) [2]. Het gebruik van CT is de laatste jaren sterk gestegen. CT laat immers toe een snelle en accurate diagnose te stellen van een groot aantal pathologieën die dikwijls niet zichtbaar zijn met conventionele beeldvormingstechnieken [3]. Hoewel CT voor een enorme vooruitgang heeft gezorgd in de medische beeldvorming en in de gezondheidszorg van de patiënt, mag er niet uit het oog verloren worden dat een CT-scan gepaard gaat met een blootstelling aan X-stralen. De biologische effecten van X-straling worden reeds jaren uitgebreid bestudeerd via epidemiologische studies. Er bestaat geen twijfel over het feit dat intermediaire en hoge dosissen schadelijke effecten veroorzaken bij de mens, zoals blijkt uit studies van de overlevenden van de atoombommen van Hiroshima en Nagasaki. Voor lage dosissen is de situatie echter niet zo duidelijk [4]. Het zijn echter de effecten van deze lage dosissen die van belang zijn voor de populatie, en in het bijzonder voor patiënten blootgesteld aan X-stralen voor medische doeleinden. 1.2 Computer tomografie Bij een CT-scan wordt de patiënt op een gemotoriseerde tafel doorheen een cirkelvormige opening (de gantry) van de CT-scanner geschoven. In de CT-scanner bevindt zich een Xstralenbron die synchroon met een set van X-straaldetectoren roteert. Deze detectoren bevinden zich aan de tegenovergestelde zijde van de X-stralenbron in de gantry [5]. De beeldvorming gebeurt op basis van de attenuatie van de straling door het lichaam van de patiënt. Tijdens de rotatie van de X-stralenbron en de detectoren, wordt de hoeveelheid straling gemeten, geabsorbeerd door de verschillende weefsels en organen die doorkruist worden door de X-stralenbundel. Al deze datapunten worden verwerkt door de computer tot twee dimensionele cross-sectionele beelden. Deze beelden kunnen vervolgens gebruikt worden om een driedimensioneel beeld van het bestudeerde weefsel of orgaan van de patiënt te reconstrueren [6]. -2- Bepaalde anatomische structuren hebben een gelijkaardige densiteit als het omgevend weefsel, waardoor ze zeer moeilijk te onderscheiden zijn van de achtergrond. In dat geval kan men een contraststof introduceren in de patiënt om de verschillen in absorptievermogen van de verschillende structuren te vergroten en zo het weefsel van interesse op te lichten. Veel gebruikte contraststoffen zijn barium en iodine, die onder andere via intraveneuze injectie worden toegediend. Deze contraststoffen hebben een hogere densiteit dan het normale weefsel. Als gevolg wordt de X-stralenbundel meer verzwakt door het weefsel dat de contraststof heeft opgenomen, waardoor dit weefsel wit of grijs gekleurd is en beter te onderscheiden is van omgevende donkergrijs of zwart gekleurde structuren [7]. CT is een onmisbaar diagnostisch hulpmiddel en heeft een revolutie teweeg gebracht in de medische praktijk. Toch worden er soms onnodige scans uitgevoerd en herhaald zonder rekening te houden met de gevolgen voor de patiënt [2]. Een CT-scan stelt patiënten immers bloot aan hogere dosissen ioniserende straling dan de meeste andere radiologische onderzoeken. In vergelijking met een posterior-anterior borstradiografie met een effectieve dosis van 0,02 mSv, gaat een abdominale of thoracale CT-scan gepaard met een dosis van 5-10 mSv. Bovendien is het aantal CT-scans dat per jaar uitgevoerd wordt de laatste 20 jaar sterk gestegen. Deze hoge frequentie in het gebruik van CT en de relatief hoge dosissen die daarmee gepaard gaan, leiden echter tot een verhoogde blootstelling aan ioniserende straling voor de populatie. Hoewel de voordelen van CT meestal opwegen tegen de schadelijke effecten van blootstelling aan ioniserende straling, moet er rekening gehouden worden met het feit dat geen enkele blootstelling aan ioniserende straling zonder risico is. Recente technologische verbeteringen en stralingsprotectie maatregelen hebben reeds geleid tot optimalisatie van de dosis in functie van de vereiste diagnostische kwaliteit. Verdere inspanningen moeten geleverd worden om het aandeel van CT in de stralingsdosis per jaar per inwoner in België te reduceren [8]. 1.3 Risico’s van lage dosis ioniserende straling Risico’s geassocieerd met blootstelling aan ioniserende straling kunnen onderverdeeld worden in 2 categorieën; deterministische effecten en stochastische effecten. Deterministische effecten, zoals erytheem en cataract, worden veroorzaakt door celdood. Voor deze effecten stijgt de ernst met stijgende dosis en bestaat er een drempeldosis die moet overschreden worden opdat deze effecten zouden optreden. Deterministische effecten worden zelden gezien bij diagnostische X-straal onderzoeken, waaronder CT, daar de dosissen die hiermee gepaard -3- gaan de drempeldosis voor deterministische effecten niet overschrijden. De belangrijkste risico’s geassocieerd met CT-onderzoeken, zijn de risico’s op stochastische effecten, zoals de inductie van kanker en genetische schade. Voor de stochastische effecten neemt niet de ernst, maar wel de kans op optreden van het effect toe met toenemende dosis. Bovendien bestaat er voor deze effecten geen drempeldosis. Als gevolg brengt elke kleine dosis ioniserende straling een bepaald risico op stochastische effecten met zich mee. Eén enkele CT-scan verhoogt dus het risico op kanker voor de patiënt [8]. 1.3.1 Het LNT model Schattingen van kankerrisico’s voor dosissen typisch gebruikt bij CT-onderzoeken zijn moeilijk te verkrijgen via epidemiologische data. Om voldoende statistische power te behouden, stijgt de noodzakelijke sample size immers zeer sterk met dalende dosis. Als gevolg zijn zeer grote epidemiologische studies noodzakelijk om deze lage dosis risico’s te kwantificeren. Indien er bijvoorbeeld 500 personen nodig zijn om het effect van 1000 mSv te bestuderen, zouden er ongeveer 5 miljoen personen nodig zijn voor een dosis van 10 mSv [4]. Daarom worden risico estimaties voor deze relatief lage dosissen gebaseerd op extrapolatie van bestaande hoge dosis data afkomstig van epidemiologische studies van de overlevenden van de atoombommen van Hiroshima en Nagasaki (LSS); het linear-no-treshold (LNT) model. Dit model veronderstelt dat het risico op stralingsgeïnduceerde kanker en genetische effecten lineair stijgt met stijgende dosis zonder drempelwaarde. Volgens het LNT model kan elke kleine dosis ioniserende straling dus biologische effecten induceren en veroorzaakt elke toename in dosis in de lage dosis regio een proportionele toename in biologisch effect [9]. Hoewel het LNT model algemeen gebruikt wordt, zijn er twijfels over de validiteit van dit model bij lage dosissen. Niet iedereen is het eens met de lineaire vorm van de dosis-respons relatie van het LNT model [10]. Brenner et al. vatten de verschillende mogelijke scenario’s die afwijken van het LNT model samen in figuur 1.1. -4- Figuur 1.1: Schematische voorstelling van de verschillende mogelijke dosis-repons relaties, door extrapolatie van hoge dosis epidemiologische data naar het lage dosis gebied. Uit [5]. Volgens sommige bronnen zou de assumptie van lineariteit de lage dosis risico’s overschatten (curves c en d). Enerzijds wordt het bestaan van een tresholddosis gesuggereerd (d). Dit houdt in dat zolang de dosis onder een bepaalde drempeldosis blijft, het risico op stralingsgeïnduceerde gezondheidseffecten gelijk is aan nul. Daarnaast is er in de literatuur ook sprake van het bestaan van een adaptieve respons (c). Zeer lage dosissen ioniserende straling zouden mechanismen induceren waardoor cellen zich beter kunnen wapenen tegen daaropvolgende blootstellingen aan hoge dosissen. Deze geïnduceerde stralingsresistentie in bestraalde cellen heeft als gevolg dat de schade geïnduceerd door de hoge dosis blootstelling minder groot is in vergelijking met cellen die vooraf niet werden bestraald [10]. Andere bronnen suggereren dat de vorm van de dosis-repons relatie eerder een neerwaarts buigende kromme zou zijn in plaats van een rechte (curve b). Dit wil zeggen dat de respons in het lage dosis gebied veel sterker zou stijgen dan verwacht op basis van het LNT model [4]. Recent kon dit worden aangetoond door Beels et al. Uit de bloeddosis van kinderen die een cardiologische catheterisatie ondergingen (dosis soms lager dan 1 mGy) en het aantal γH2AX foci geïnduceerd door deze blootstelling, kon vastgesteld worden dat het LNT model niet overeenstemt met de werkelijk geïnduceerde schade. In het lage dosis gebied werd immers een sterke stijging in het aantal foci waargenomen (zie figuur 1.2) [11]. -5- Figuur 1.2: γ-H2AX foci per cel geïnduceerd door in vivo blootstelling aan X-stralen in functie van de dosis bij pediatrische patiënten (○). Dosis-respons curve van γ-H2AX foci na in vitro bestraling van bloedstalen met X-stralen (●). De stippellijn geeft de lineaire extrapolatie van het aantal γ-H2AX foci geïnduceerd door in vitro bestraling met hoge dosis (0.5 Gy) volgens het LNT model weer. Uit [11]. Deze hypersensitiviteit in het lage dosis gebied kon ook reeds door andere onderzoeksgroepen worden aangetoond. In een studie van Ojima et al. werd de dosis-respons relatie voor het aantal DNA dubbelstrengbreuken (DSB), geïnduceerd in bestraalde humane fibroblasten (dosis 1,2 tot 200 mGy), onderzocht. De inductie van DSBs vertoonde eveneens een supralineaire dosis-respons relatie. Stralingsgeïnduceerde non-targeted effecten, ook gekend als bystander effecten zouden dit fenomeen kunnen verklaren [12]. Een bystander effect duidt op het doorgeven van schade signalen van bestraalde naar niet bestraalde cellen, wat resulteert in stralingsschade in deze niet bestraalde ‘bystander’ cellen. Dit effect werd reeds geobserveerd voor verschillende eindpunten en stralingskwaliteiten. Hoewel het onderliggende mechanisme nog niet helemaal gekend is, wordt er verondersteld dat de signalen worden doorgegeven via de secretie van oplosbare factoren, zoals ROS (reactive oxygen species), NO (nitric oxide) en cytokines, door de bestraalde cellen en/of door intercellulaire communicatie via gap-junctions [13]. Om te testen of deze lage dosis hypersensitiviteit toe te schrijven is aan bystander effecten, werd in bovenvermelde studie van Ojima et al. het aantal DSBs onderzocht in cellen behandeld met lindaan, een inhibitor van stralingsgeïnduceerde bystander effecten. In dit geval werd er geen supralineaire dosis-respons relatie gevonden. Meer nog, het aantal DSBs beko- -6- men door het aantal foci in lindaan behandelde cellen af te trekken van het aantal foci in onbehandelde cellen, was proportioneel met de dosis is het gebied van 1,2-5 mGy en satureerde bij dosissen van 10-200 mGy. De toename in aantal DSBs in de regio 1,2-5 mGy was dus grotendeels toe te schrijven aan stralingsgeïnduceerde bystander effecten. Bij dosissen hoger dan 10 mGy werden de DSBs hoofdzakelijk geïnduceerd door dosis afhankelijke directe stralingseffecten en deels door dosis afhankelijke stralingsgeïnduceerde bystander effecten [12]. Bystander effecten zijn dus vooral relevant bij blootstelling aan lage dosissen ioniserende straling, daar bij hoge dosissen deze bystander respons gemaskeerd wordt door de respons van de bestraalde cellen zelf [13]. Aangezien stralingsgeïnduceerde bystander effecten celschade kunnen verhogen, is het mogelijk dat de dosis-respons relatie voor biologische effecten in de lage dosis regio niet consistent is met een lineair dosis-respons model. Als gevolg kan het bystander effect een significante impact hebben op de risico bepaling bij lage dosis straling. Omwille van het toenemende gebruik van radio-diagnostische procedures, is verder onderzoek naar de validiteit van de geobserveerde hypersensitiviteit in het lage dosis gebied en de mogelijke rol van een bystander effect van groot belang. 1.3.2 Gamma-H2AX foci als biomerker voor stralingsschade Naast epidemiologische studies, die gebruikt worden om de biologische effecten van lage dosissen ioniserende straling te bestuderen, kan er ook gebruik gemaakt worden van biomerkers. Ioniserende straling induceert een breed spectrum van schade, waarvan DNA DSBs de belangrijkste vorm van schade is die kan leiden tot stochastische effecten zoals kankerinductie [9,14]. Deze DNA dubbelstrengbreuken (DSBs) kunnen indien niet of foutief hersteld aanleiding geven tot celdood, mutaties, vorming van chromosoomaberraties en micronuclei. Dergelijke stralingsgeïnduceerde chromosomale aberraties en micronuclei in perifere bloedlymfocyten kunnen gebruikt worden als biomerkers voor evaluatie van de opgelopen schade bij blootstelling aan ioniserende straling [15]. Deze cytogenetische testen zijn echter niet gevoelig genoeg voor de individuele biologische dosimetrie van patiënten blootgesteld aan de lage dosissen ioniserende straling die typisch gepaard gaan met CT-onderzoeken. Recent werd echter een andere test voor de evaluatie van de opgelopen stralingsschade beschreven, die toelaat rechtstreeks de geïnduceerde DNA dubbelstrengbreuken te visualiseren; de γ-H2AX foci scoring. DNA dubbelstrengbreuken zijn de belangrijkste vorm van schade -7- aan het genoom. Aangezien onherstelde DSBs genomische instabiliteit en carcinogenese kunnen induceren, leidt de inductie van DSBs onmiddellijk tot de activatie van een DNA schade respons. Die schade respons zal uiteindelijk leiden tot activatie van celcyclus checkpoints en/of herstel van schade [16,17]. Eén van de vroegste gebeurtenissen in deze cellulaire respons, is de specifieke fosforylatie van histon H2AX. Het H2AX eiwit is een variant van de H2A familie van histoneiwitten, die deel uitmaken van het histon octomeer in de nucleosomen [14]. Het humane DNA, bestaande uit 6,4 x 109 baseparen, is georganiseerd in een compacte structuur opdat het zou passen in de celkern. De dubbele DNA helix windt zich om een centrale kern van acht histoneiwitten (histon octomeer) in de nucleosomen, die op hun beurt georganiseerd zijn in verschillende hogere orde structuren met vorming van chromatine. Een nucleosoom bestaat uit 145 bp DNA en 8 histoneiwitten; 2 van elk van 4 histoneiwit families H4, H3, H2B en H2A [18]. Figuur 1.3: Model voor de vorming van γ-H2AX foci. Uit [19]. In figuur 1.3 wordt een model voor γ-H2AX foci vorming voorgesteld. Een onherstelde DNA DSB wordt herkend door verscheidene eiwitten, waaronder deze van het MRN complex; Mre11, Nbs1 en RAD50. Het MRN complex rekruteert dan het ATM (ataxia telangiectasia mutated) eiwit via een directe interactie tussen ATM en het BRCT-domein van Nbs1. Hoe ATM geactiveerd wordt, is voorlopig nog niet duidelijk. Het ATM eiwit behoort samen met ATR en DNA-PK tot de familie van de PIKK (phosphatidylinositol 3-kinase protein kinaselike) eiwitten. Naast betrokkenheid in onder andere celcyclus checkpoints en apoptose, reguleert fosforylatie door PIKKs ook nucleaire foci vorming. Eén van de onmiddellijke targets van de PIKKs is het histon H2AX eiwit. Enkele seconden na de generatie van een DSB worden duizenden H2AX moleculen in de nabijheid van de DSB gefosforyleerd ter hoogte van de serineresidu’s (serine 139) in hun unieke carboxy-terminus. Hierdoor ontstaat een gemodifi- -8- ceerde vorm; γ-H2AX. Elk van de PIKK eiwitten is in staat γ-H2AX eiwitten te genereren, maar bij de mens gebeurt dit vooral door het ATM eiwit [19,20]. De gefosforyleerde γ-H2AX eiwitten zijn niet homogeen verspreid in de kern, maar vormen foci; IRIF of ionizing radiation induced foci. Na fosforylatie worden de γ-H2AX eiwitten herkend en gebonden door Mdc1. Mdc1 beschermt op deze manier de H2AX eiwitten tegen defosforylering door fosfatasen en doet daarnaast ook dienst als docking plaats voor de binding van additionele MRN eiwitten. Interacties tussen ATM en MRN en/of tussen ATM en Mdc1 leiden dan tot de verdere rekrutering van geactiveerde ATM moleculen naar chromatine regio’s die de DNA breuk flankeren. De vorming van γ-H2AX eiwitten verspreidt zich op deze manier over het chromatine dat de breuk flankeert en geeft aanleiding tot de vorming van een zichtbare γ-H2AX focus [19]. Naast de binding van het MRN eiwit complex ter hoogte van het beschadigde DNA, leidt de inductie van een DNA DSB ook tot de decondensatie van het chromatine. Hoe dit gebeurt is tot nu toe nog niet duidelijk, maar deze verandering in het chromatine is van functioneel belang. Behandelingen die chromatine decondensatie verhinderen, interfereren immers met de accumulatie van DNA herstel eiwitten ter hoogte van beschadigde DNA regio’s. Chromatine decondensatie leidt onder andere tot de expositie van modificaties van histon eiwitten zoals de methylatie van histon H3 op lysine 79. De verhoogde toegankelijkheid van deze histonmethylatie, als gevolg van de decondensatie, zou leiden tot de binding van 53BP1 (p53 binding protein 1) op het chromatine, wat betrokken is in DNA schade herstel [21,22]. Het uiteindelijke gevolg van al deze gebeurtenissen is dat DNA repair gestimuleerd wordt door de concentratie van de noodzakelijke hersteleiwitten ter hoogte van het beschadigde DNA. γ-H2AX is niet vereist voor de initiële rekrutering van deze eiwitten, maar zorgt ervoor dat deze eiwitten kunnen binden ter hoogte van plaatsen met DSBs en kunnen accumuleren tot zichtbare foci. γ-H2AX is dus betrokken in de retentie van herstelfactoren in de buurt van de breuk [16, 20]. Daarnaast heeft de vorming van IRIF ook een belangrijke rol in de activatie van DNA-schade checkpoints. De amplificatie van IRIF eiwitten zorgt ervoor dat het schade signaal gecreëerd door slechts enkele DSBs, zoals na blootstelling aan lage dosissen ioniserende straling, voldoende versterkt wordt om een celcyclus arrest te bekomen. Op deze manier is er voldoende tijd voor herstel van de DNA schade vooraleer de cel een volgende fase in de celcyclus bereikt [19]. -9- De vorming van γ-H2AX foci is een snelle en gevoelige cellulaire respons op het optreden van DNA dubbelstrengbreuken [18]. Gebruik van fluorescente antilichamen specifiek voor deze γ-H2AX eiwitten en fluorescentie microscopie laten toe deze nucleaire foci te visualiseren. Aangezien het aantal γ-H2AX foci sterk gerelateerd is aan het aantal dubbelstrengbreuken (verhouding 1:1), zijn deze foci bruikbare en betrouwbare biomerkers voor dubbelstrengige DNA breuken [17,23]. Bovendien kunnen foci reeds waargenomen worden bij zeer lage stralingsdosissen (1 mGy), wat deze test geschikt maakt om de opgelopen stralingsschade bij lage dosis blootstelling te bestuderen zowel in vitro als in vivo [11]. 1.3.3 Moleculaire biomerkers voor stralingsschade Afhankelijk van de dosis kan ioniserende straling vitale fysiologische functies van blootgestelde individuen ernstig beschadigen binnen uren of weken na de blootstelling, wat kan leiden tot levenslange gezondheidsgevolgen. In het geval van een stralingsaccident zijn snelle en betrouwbare bioassays dan ook noodzakelijk om blootgestelde individuen te identificeren en hun opgelopen stralingsdosis te bepalen. Dit is voornamelijk van belang in de eerste uren na de blootstelling, wanneer de dosisinformatie cruciaal is voor snelle triage1 van slachtoffers. Hoewel stralingsbiomerkers, gebaseerd op cytogenetische assays, beschouwd worden als de gouden standaard voor detectie van de stralingsschade, hebben deze methoden een aantal praktische beperkingen voor gebruik in triage biodosimetrie. Aangezien het meerdere dagen of weken kan duren eer de resultaten van deze assays bekend zijn, is een snelle schatting van de individuele stralingsdosis, noodzakelijk voor triage doeleinden, niet mogelijk. Als gevolg is de interesse in snellere, automatische en weinig arbeidsintensieve testen voor detectie van stralingsschade de laatste jaren sterk gegroeid. Het toenemend inzicht in de vroege biochemische respons van bestraalde cellen en weefsels, laat toe moleculaire biomerkers voor stralingblootstelling te ontwikkelen [24]. Humane cellen hebben een complexe moleculaire respons op fysiologische en genotoxische stressfactoren ontwikkeld. Deze stressfactoren omvatten onder andere trauma, oxidatieve stress, metabole toxines en agentia die het DNA beschadigen zoals chemische mutagenen en ioniserende straling. Blootstelling van humane cellen aan ioniserende straling activeert dus verschillende signaaltransductiepathways, die opgebouwd worden door verschillende over- 1 Triage is het onderverdelen van slachtoffers in verschillende categorieën naargelang de ernst van de verwondingen of het ziektebeeld bij grote ongevallen of rampen. - 10 - lappende componenten, zoals cytokines, groeifactoren, oncogenen en genen betrokken bij de celcyclus, apoptose en DNA herstel. De activatie van deze pathways resulteert in een verandering in de regulatie en expressie van verschillende targetgenen (GEC of gene expression changes). Het uiteindelijke lot van een bestraalde cel is immers grotendeels afhankelijk van de veranderingen in genexpressie, die als gevolg van blootstelling aan ioniserende straling zijn opgetreden. Genexpressie veranderingen in deze stralingsresponsieve genen kunnen dus gebruikt worden als moleculaire merkers voor blootstelling aan ioniserende straling [25-27]. Aangezien bovenvermelde stressrespons zeer complex is en uit verschillende overlappende componenten bestaat, is het duidelijk dat de klassieke aanpak voor het bestuderen van individuele genen niet langer volstaat. Moleculair biologische technieken die in staat zijn om de expressie van meerdere genen simultaan te meten in één experiment zijn hiervoor beter geschikt. Hierbij gaat de aandacht vooral uit naar micro-array en kwantitatieve real-time PCR technieken die toelaten up- of downregulatie van genen op te sporen. Gecombineerd met bioinformatica methoden, kan men genexpressie profielen ontwikkelen die dienst kunnen doen als bruikbare biologische indicatoren van stralingsschade over een grote dosisrange [25,26,28]. Verschillende studies konden reeds transcriptionele veranderingen aantonen na blootstelling aan ioniserende straling zowel in vitro als in vivo [29,30]. Uit de literatuur blijkt bovendien dat er zowel kwantitatieve als kwalitatieve verschillen in genexpressie bestaan afhankelijk van de dosis [31]. Daarnaast is er ook een verschil in pathway activatie na hoge of lage dosis blootstelling. In tegenstelling tot celproliferatie en apoptose bij hoge dosis, is de meest dominante biologische respons na lage dosis bestraling cel-cel communicatie, DNA schade respons en signaaltransductie betrokken bij herstel van DNA breuken. Activatie van genen betrokken in cel-cel communicatie bij lage dosissen is van groot belang vanuit het standpunt van een bystander effect [32]. Hoewel de betrokkenheid van verschillende signaalmoleculen zoals cytokines, ROS, NO, calcium, cyclooxygenase-2 en MAP kinasen in het bystander proces reeds aangetoond kon worden, werden de regulatorische mechanismen die aan de basis liggen van deze non-targeted effecten nog niet volledig opgehelderd [33]. Om inzicht te verwerven in de signaal pathways en de sleutelfactoren die betrokken zijn in de bystander respons, kan men ook gebruik maken van genexpressie analyse via micro-array en kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) [31]. - 11 - 1.4 Kwantitatieve real-time PCR 1.4.1 Principe De polymerase chain reaction of PCR is één van de meest krachtige technologieën in de moleculaire biologie. PCR wordt gebruikt om specifieke sequenties in een DNA of cDNA template, bepaald door de gebruikte primers, duizenden tot miljoenen keren te kopiëren of amplificeren. Een PCR reactie bestaat uit drie stappen; de denaturatie-, de annealing- en de extensiestap. In de eerste stap, de denaturatiestap, wordt het dubbelstrengige cDNA geïncubeerd bij hoge temperatuur (90-98°C), wat leidt tot denaturatie. Hierna daalt de temperatuur tot de annealingof smelttemperatuur van de primers (Tm) zodat de specifieke synthetische primers kunnen hybridiseren met het enkelstrengige DNA in de annealing stap. Vervolgens wordt de temperatuur opnieuw verhoogd tot de optimale temperatuur voor elongatie van de primers door het DNA polymerase (72°C). Bij traditionele PCR gebeurt detectie en kwantificatie van de geamplificeerde sequentie op het einde van de reactie, na de laatste PCR cyclus. Bij real-time PCR wordt de hoeveelheid PCR product na elke cyclus gemeten door het gebruik van fluorescente merkers die geïncorporeerd worden in de PCR producten. De toename van het gemeten fluorescent signaal is direct proportioneel aan het aantal gegenereerde PCR product moleculen (amplicons). Real-time PCR laat dus simultane amplificatie en kwantificatie toe. Deze kwantificatie kan absoluut zijn of relatief. In het geval van een absolute kwantifcatie kan men op basis van een standaardcurve het aantal kopies van een onbekend staal berekenen. In het geval van een relatieve kwantificatie wordt de expressie van verschillende stalen vergeleken, om up- of downregulatie te detecteren. Er zijn twee verschillende fluorescente detectiemethoden die gebruikt kunnen worden voor de detectie van PCR producten in real-time PCR. Beide methoden zijn gebaseerd op de generatie van een fluorescent signaal dat proportioneel is met de hoeveelheid PCR product die gevormd wordt. Men kan gebruik maken van niet-specifieke kleurstoffen die fluoresceren wanneer ze binden op het geproduceerde dubbelstrengige DNA, zoals SYBR Green. Daarnaast kan er ook gewerkt worden met sequentie-specifieke DNA probes, zoals TaqMan probes, die bestaan uit - 12 - oligonucleotiden gelabeld met een fluorescente reporter die enkel detectie toelaat na hybridisatie van de probe met zijn complementaire DNA target. De verandering in fluorescentie over het verloop van de RT-PCR reactie wordt gemeten door een instrument dat PCR technologie combineert met scanning. De software van het RT-PCR toestel genereert een amplificatieplot door de fluorescentie uit te zetten tegenover het aantal cycli (zie figuur 1.4). Deze amplificatieplot geeft de accumulatie van PCR product weer over de duur van de volledige PCR reactie. In de exponentiële fase van de PCR reactie wordt een fluorescentiedrempel of treshold (T) bepaald. Deze drempel wordt berekend als functie van de hoeveelheid achtergrondfluorescentie en bevindt zich bij dat punt waar het fluorescentiesignaal significant hoger is dan het achtergrondsignaal of de baseline. Het aantal PCR cycli dat nodig is om voldoende fluorescentie te genereren om deze drempelwaarde te bereiken, wordt de Cq (cycling quantity) waarde genoemd. De Cq waarden zijn direct proportioneel met de hoeveelheid starttemplate en worden gebruikt om de RNA expressie levels of het aantal DNA kopies te berekenen [34,35]. Figuur 1.4: De qRT-PCR amplificatieplot van drie RNA stalen met aanduiding van de drie bijhorende Cq waarden en de treshold. Uit [35]. 1.4.2 Targetgenen GADD45A en CDKN1A Cellen hebben, zoals reeds vermeld, uitgebreide en complexe mechanismen ontwikkeld om de genomische integriteit te controleren (checkpoints) en correcte transmissie van genetische informatie te verzekeren. Ioniserende straling is in staat dubbelstrengige DNA breuken te induceren, wat leidt tot de activatie van DNA schade checkpoints. Eén van de sleuteleiwitten in de checkpointpathways is de tumorsupressor TP53. TP53-afhankelijke effecten in respons op - 13 - DNA schade worden gemedieerd door TP53 zelf of via transcriptionele controle (up- of downregulatie) van targetgenen. Deze targetgenen beïnvloeden verschillende responspathways en bepalen het uiteindelijke lot van de cel; celoverleving via inductie van groeiarrest gevolgd door herstel van DNA schade of celdood via inductie van irreversibele groeiarrest of apoptose. Twee belangrijke targetgenen van TP53 die upgereguleerd worden als reactie op ioniserende straling zijn GADD45A (growth arrest and DNA damage A) en CDKN1A (cyclin-dependent kinase inhibitor 1A) [36]. Verschillende onderzoeksgroepen vonden een stralingsgeïnduceerde upregulatie van beide genen. De meerderheid van deze studies die de regulatie van genexpressie in respons op stralingsgeïnduceerde stress onderzoeken, maken echter gebruik van hoge tot zeer hoge dosissen. De transcriptionele respons bij deze hoge dosissen voorspelt echter niet noodzakelijk de respons bij meer biologisch relevante dosissen. In vitro studies konden wel reeds een significante upregulatie van beide genen na lage dosis blootstelling aantonen. De humane in vivo transcriptionele respons bij lage dosissen ioniserende stralingen werd echter nog niet uitgebreid bestudeerd [37]. In een onderzoek naar de moleculaire basis van de bystander respons, kon bovendien met behulp van qRT-PCR een upregulatie van CDKN1A gevonden worden in zowel de direct bestraalde cellen als in de bystander cellen. Deze en andere studies wijzen erop dat de TP53/CDKN1A pathway betrokken zou zijn in de bystander respons [38]. Andere studies concludeerden echter dat de TP53 respons hoofdzakelijk beperkt is tot direct bestraalde cellen en weinig of niet aanwezig is in niet-bestraalde bystander cellen [32]. Analyse van genexpressieprofielen laat toe de rol van de TP53 targetgenen CDKN1A en GADD45A in de bystander respons en de betrokkenheid van deze respons in de hypersensitiviteit in het lage dosis gebied te bepalen. 1.4.3 Referentiegenen De gemeten variatie in genexpressie tussen verschillende stalen is de som van de echte biologische variatie en verschillende confounding factoren die leiden tot niet specifieke variatie in expressie. Het doel van normalisatie is deze niet-biologische variatie te beperken door de confounding factoren zo veel mogelijk te controleren. Verschillende normalisatie strategieën zijn gekend, maar het gebruik van één of meer referentiegenen is de huidige gouden standaard - 14 - voor normalisatie. Deze strategie wordt verkozen boven andere omdat referentiegenen dienst doen als interne controles die onderworpen worden aan alle mogelijke bronnen van variatie gedurende het hele experiment, op dezelfde manier als de genen van interesse [39]. Bij de selectie van referentiegenen, is het belangrijk dat men erop toeziet dat de expressie van deze interne controles stabiel blijft onder de experimentele condities [40]. In deze masterproef worden de genen B2M (beta-2-microglobulin), HMBS (hydroxymethylbilane synthase) en GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) onderzocht op hun bruikbaarheid als referentiegenen voor de gebruikte experimentele set-up. Arenz et al. bestudeerden de stabiliteit van deze en andere frequent gebruikte referentiegenen voor genexpressiestudies met vergelijkbare studie-opzet. Deze drie genen behoorden tot de groep van referentiegenen met de laagste variatie in expressie [41]. Naast bovenvermelde genen, zal ook de bruikbaarheid van Alu-repeats als referentiegen voor qRT-PCR onderzocht worden. Alu repeats zijn, met meer dan één miljoen kopieën, de meest abundante repeatsequenties in het humane genoom. Ongeveer 75% van alle humane genen bevatten tenminste één Alu in hun introns en/of onvertaalde regio’s (UTRs). Recent werd door Vandesompele et al. een nieuwe strategie voor RNA normalisatie gebaseerd op EAR of expressed alu repeat amplificatie voorgesteld. De keuze van stabiele referentiegenen is niet eenvoudig in (pathologische) condities die gekarakteriseerd worden door transcriptionele disregulatie. Veranderde activiteit van transcriptiefactoren beïnvloedt niet alleen de expressie van de targetgenen, maar kan eveneens de stabiliteit van RNA expressie van de geselecteerde referentiegenen beïnvloeden, wat kan leiden tot een fout in de kwantificatie van het RNA van interesse. Aangezien Alu repeats echter zo sterk verspreid voorkomen over het hele humane genoom, zal de differentiële expressie van een aantal genen de totale hoeveelheid geëxpresseerde Alu repeats niet beïnvloeden. Dit principe vormt de basis voor de ontwikkeling van deze normalisatiestrategie gebaseerd op EAR amplificatie, die een snelle en precieze kwantificatie van RNA met qRT-PCR in humane biologische stalen zou toelaten [40]. 1.5 Doelstelling Deze masterproef kadert binnen een multicentrische studie waarvoor het departement Medische Basiswetenschappen van de Universiteit Gent samenwerkt met het Belgian Nuclear Re- 15 - search Center SCKCEN in Mol. Het doel van deze studie is onderzoeken of de hypersensitiviteit in het lage dosis gebied, recent geobserveerd bij kinderen in de interventionele cardiologie, ook aangetoond kan worden bij kinderen die een CT-onderzoek ondergaan. Hiervoor zal gebruik gemaakt worden van γ-H2AX foci als kwantitatieve biomerker in de lage dosis regio. Daarnaast zal met behulp van kwantitatieve real-time PCR en micro-array getracht worden de onderliggende oorzaken van de hypersensitiviteit in het lage dosis gebied te achterhalen. De γ-H2AX foci scoring en de real-time PCR experimenten zullen uitgevoerd worden in Gent, het onderdeel van de studie dat gebaseerd is op micro-array zal uitgevoerd worden in Mol. Onderstaand schema geeft de experimentele set-up van de multicentrische studie weer. bloedafname vóór CT CT onderzoek bloedafname 5 minuten na CT bloedafname x uur na CT lymfocyt isolatie & immunofluorescentiekleuring RNA-isolatie & cDNA synthese gamma-H2AX foci scoring kwantitatieve realtime PCR micro-array (Gent) (Mol) (Gent) Figuur 1.5: Overzicht van de experimentele set-up van de multicentrische studie. Deze masterproef is een pilootstudie die als doel heeft de proefopzet voor deze multicentrische studie bij kinderen te optimaliseren. Hiertoe zal de hypersensitiviteit in het lage dosis gebied onderzocht worden bij volwassenen die een contrast CT-onderzoek ondergaan met behulp van de γ-H2AX foci scoring. Deze techniek werd in de onderzoeksgroep reeds geoptimaliseerd en succesvol toegepast in de studie op interventionele cardiologie. Daarnaast zullen in vitro kwantitatieve real-time PCR experimenten gedaan worden ter voorbereiding op het in vivo real-time PCR werk. - 16 - 2 Materialen en Methoden 2.1 Inleiding Bloedstalen van patiënten die een contrast CT-onderzoek ondergaan in het Universitair Ziekenhuis (UZ) in Gent worden verzameld. Op elk staal wordt achtereenvolgens een lymfocytisolatie en een imuunofluorescentiekleuring uitgevoerd in het labo van de vakgroep. Vervolgens worden γ-H2AX foci gescoord in 100 tot 150 cellen met behulp van de Metafer microscoop. Voor het qRT-PCR luik worden primers voor real-time PCR gezocht voor de target- en referentiegenen en worden de primerefficiënties bepaald. Vervolgens wordt een in vitro experiment gedaan om de stabiliteit van de referentiegenen en het tijdstip van maximale genexpressie van de targetgenen te bepalen. 2.2 Onderzoekspopulatie De onderzoekspopulatie voor deze masterproef bestaat uit 61 volwassen patiënten die een thoracaal of abdominaal contrast CT-onderzoek ondergaan in het UZ Gent met de Toshiba Aquillon 32 (generatie 2005) CT-scanner of met de Siemens Somatom Definition Flash (generatie 2010) CT-scanner. Patiënten die behandeld worden voor kanker, hetzij via radiotherapie, hetzij via chemotherapie worden niet opgenomen in de studie. Aan alle deelnemers van de studie werd gevraagd een ‘informed consent’ te ondertekenen. Het onderzoeksproject werd goedgekeurd door de ethische commissie van het UZ Gent. 2.3 Gamma-H2AX foci scoring 2.3.1 Staalafname en lymfocyt isolatie 2.3.1.1 Staalafname Van elke patiënt worden twee bloedstalen afgenomen via de catheter en gecollecteerd in heparinebuisjes (Venosafe). Er wordt één bloedstaal afgenomen voor de start van de procedure en één ongeveer vijf minuten na het onderzoek. De bloedstalen worden na afname in een warmwaterbad (Fisher Scientific) geplaatst bij 37°C gedurende 15 minuten om enige repair toe te laten. De keuze voor een repairtijd van 15 minuten is gebaseerd op gegevens uit de literatuur waaruit blijkt dat het maximum aantal γ-H2AX foci gevormd wordt tussen 15 en 30 minuten - 17 - na blootstelling aan ioniserende straling. Om de DNA repair te stoppen, worden de bloedstalen vervolgens gedurende 10 minuten in ijswater afgekoeld. 2.3.1.2 Lymfocyt isolatie Als de bloedstalen verzameld zijn, worden ze getransporteerd naar het labo. Daar wordt de RosetteSep bloedscheiding (StemCell Technologies) uitgevoerd om de T-lymfocyten te isoleren. Aan 2 ml bloed wordt 100 μl RosetteSep Human T-cell Enrichment Cocktail toegevoegd. Dit wordt 20 minuten geïncubeerd op kamertemperatuur. Vervolgens wordt deze suspensie toegevoegd aan 2 ml PBS + 2% foetaal kalfserum (FCS) (Invitrogen). Nadien wordt dit mengsel traag, onder een hoek van 45° toegevoegd aan 3 ml RosetteSep DM-L en gedurende 20 minuten gecentrifugeerd (Eppendorf) op 1200xg (acc is 2 en brake is 0). De cellaag met de lymfocyten wordt vervolgens verwijderd en toegevoegd aan een 5 ml PBS + 2% FCS oplossing. Hieraan wordt nogmaals 5 ml PBS + 2% FCS toegevoegd en vervolgens wordt er gedurende 10 minuten gecentrifugeerd op 300xg (acc is 7 en brake is 7). Het supernatans wordt verwijderd en deze wasstap wordt herhaald. De cellen worden nadien opgelost in 8 ml compleet RPMI medium voor lymfocyten (84% RPMI-1640, 15% FCS, 1% L-glutamine, 50 U/mL penicilline, 50 µg/mL streptomycine; Life Technologies) waarin de cellen kunnen bewaard blijven. 2.3.1.3 Tellen van de lymfocyten Voor de immuunkleuring zijn ongeveer 200 000 cellen per 500 μl nodig. Hiervoor worden de T-cellen geteld met behulp van de Bürker telkamer (Assistent). Er wordt een ½ verdunning van 30 μl celoplossing en 30 μl trypaan blauw (Sigma) gemaakt. Van deze verdunning wordt een kleine hoeveelheid op de Bürker telkamer gebracht. Het aantal levende lymfocyten in 16 vakjes wordt geteld met behulp van een lichtmicroscoop (Axiolab, ZEISS). De cellen aanwezig in de uiterste rechterrand en de uiterste onderrand worden niet meegeteld. Het aantal lymfocyten aanwezig in het bloedstaal wordt dan berekend door het aantal lymfocyten in 16 vakjes te vermenigvuldigen met 2 (de verdunning), met 8 (het totaal aantal ml waarin de cellen opgelost zijn) en met 10 000 (een conversiefactor om over te schakelen van diepte (0,1 mm² = 0,1 μl) naar ml ( = 1x10³ μl)). - 18 - Figuur 2.1: Bürker-telkamer. De witte bolletjes worden meegeteld, de zwarte niet. 2.3.2 Immunofluorescentiekleuring Na de bloedscheiding wordt een immunofluorescentiekleuring gedaan om de foci te visualiseren. Hiervoor zijn ongeveer 200 000 cellen per 500 μl nodig. Indien blijkt dat de cellen in minder dan 8 ml RPMI medium moeten verdeeld worden, moet de falcon voor 6 minuten bij 1000 rpm gecentrifugeerd worden. Hierdoor wordt een celpellet verkregen en kan het teveel aan medium verwijderd worden. Vervolgens wordt 500 μl van de cellen in compleet RPMI medium op de polysine slides (VWR International) gedruppeld, waarna deze (in de houders) voor 10 minuten bij 1200 rpm gecentrifugeerd worden. Men laat de cellen kort drogen aan de lucht. De cellen worden gefixeerd op de slides door ze in 3% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) te plaatsen voor 15 minuten. Het teveel aan fixatief wordt verwijderd en nadien worden de slides voor 5 minuten in PBS geplaatst. Na het drogen van de slides, worden ze op ijs geplaatst, waarna op elke slide 100 μl permeabilisatie-oplossing TritonX-100 (0.2%; Sigma-Aldrich) gebracht wordt. Na 5 minuten incubatie worden de slides 3 maal gewassen gedurende 10 minuten in het blockingserum PBS (1% BSA; Roche diagnostics). Vervolgens worden de slides in een vochtige kamer gebracht. Er wordt 100 μl anti-fosfo-histone H2AX als primair antilichaam (1:1000; BioLegend) op de slides gedruppeld en men laat het geheel 1 uur incuberen op een bewegende plaat. Hierna worden de slides opnieuw 3 maal gewassen en wordt 100 μl RAM-TRITC als secundair (fluorescent) antilichaam (1:1000; DakoCytomation) op de slides gebracht. Na een incubatieperiode van 1 uur in een donkere vochtige kamer op een bewegende plaat, worden de slides 4 maal gewassen in PBS (in het donker) gedurende 10 minuten. Tenslotte worden de slides gedroogd en wordt 35 μl (2%) DAPI gelmount mounting medium (Sigma-Aldrich) op de cellen gedruppeld. Na het aanbrengen van een dekglaasje, worden de slides in de ijskast (24°C) gedroogd. - 19 - 2.3.3 Scoring van gamma-H2AX foci Op elke slide worden 1000 cellen opgenomen met behulp van de automatische slide scanning fluorescentie Metafer microscoop (Metasystems). Hierbij worden beelden opgenomen in 10 verschillende vlakken volgens de z-as (Z-stack 10). Op de gescande beelden wordt het aantal γ-H2AX foci per cel automatisch geteld voor 1000 cellen. Daarnaast worden γ-H2AX foci ook manueel gescoord voor 150 cellen. Het aantal foci geïnduceerd door de CT-scan wordt berekend door het gemiddeld aantal foci per cel in het bloedstaal voor het onderzoek af te trekken van het gemiddeld aantal foci per cel in het bloedstaal na het onderzoek. 2.3.4 Data analyse en statistische verwerking Voor de statistische verwerking van de resultaten zal Microsoft Office Excel 2007 en het SPSS (Statistical Package for Social Sciences) v15 software pakket gebruikt worden. De Wilcoxon signed-rank test voor gepaarde waarden wordt gebruikt om te onderzoeken of het gemiddeld aantal γ-H2AX foci voor en na het CT-onderzoek significant verschillend is. Als de p-waarde kleiner is dan 0,05, is het resultaat statistisch significant. Om te bepalen of er een significant verschil is in geïnduceerd aantal γ-H2AX foci en in DLPwaarden tussen de CT-scanner generatie 2005 en de CT-scanner generatie 2010 na een gelijkaardig onderzoek, wordt gebruik gemaakt van de Mann-Whitney U test. Als de p-waarde kleiner is dan 0,05, is het verschil statistisch significant. 2.4 Kwantitatieve real-time PCR 2.4.1 RNA isolatie Voor de isolatie van RNA uit bloed en de DNase behandeling wordt gebruik gemaakt van de RiboPure Blood Kit (Ambion). 2.4.1.1 Bloedafname en stabilisatie van RNA in RNAlater solutie Er wordt bloed afgenomen en gecollecteerd in EDTA-buisjes (BD Vacutainer). De bloedstalen worden gemixt door de buisjes enkele keren om te keren. Vervolgens wordt 500 µl ongestold bloed toegevoegd aan 1,3 ml RNAlater in een 2 ml RNase-vrij buisje. Dit geheel wordt eveneens goed gemixt. Men laat de stalen nu 1 uur rusten bij kamertemperatuur. - 20 - 2.4.1.2 Cellyse en initiële RNA zuivering De stalen worden gecentrifugeerd gedurende 1 minuut. Hierdoor vormen de bloedcellen en de plasma-eiwitten een pellet. Het supernatans wordt verwijderd. Om de bloedcellen te lyseren, wordt 800 μl Lysis Solution en 50 μl Sodium Acetate Solution toegevoegd aan de celpellet. Vervolgens worden de stalen gevortext tot de volledige pellet is losgekomen. Hierna wordt 500 μl Acid-Phenol:Chloroform toegevoegd aan het cellysaat, waarna het staal gevortext wordt gedurende 30 seconden. Vervolgens wordt het mengsel 5 minuten op kamertemperatuur geïncubeerd. Om de waterige en organische fase te scheiden worden de stalen gecentrifugeerd gedurende 1 minuut. De bovenste waterige fase, die het RNA bevat, wordt overgebracht in een nieuw 2 ml epje. Hieraan wordt 600 μl 100% ethanol (Sigma-Aldrich) toegevoegd en er wordt kort maar krachtig gevortext en zeer kort gecentrifugeerd. 2.4.1.3 RNA isolatie De Elution Solution (100 µl per staal) wordt opgewarmd tot ~ 75°C in een RNase-vrij epje. Het staal (waterige fase + ethanol) wordt op de filter gebracht en kort gecentrifugeerd gedurende 5-10 seconden om de vloeistof doorheen de filter te brengen. Het filtraat in de Collection Tube wordt weggegooid. Vervolgens wordt 700 μl Wash Solution 1 op de filter gebracht en wordt er opnieuw kort gecentrifugeerd gedurende 5-10 seconden om de solutie doorheen te filter te brengen. Het filtraat wordt weggegooid en de filter wordt op dezelfde Collection Tube geplaatst, waarna er 700 μl Wash Solution 2/3 op de filter wordt gebracht. Na kort te centrifugeren gedurende 5-10 seconden, wordt het filtraat in de Collection Tube weggegooid en wordt bovenstaande stap herhaald met een tweede 700 μl Wash Solution 2/3. Nadat het laatste filtraat weggegooid is, wordt de filter op dezelfde Collection Tube geplaatst en wordt er nogmaals gecentrifugeerd gedurende 1 minuut om de resterende vloeistof van de filter te verwijderen. Hierna wordt de Filter Cartridge overgebracht in de tweede Collection Tube. Op het midden van de filter wordt 50 μl van de voorverwarmde (75°C) Elution Solution gebracht. De gesloten Collection Tube wordt nu 20 seconden bij kamertemperatuur geïncubeerd. Vervolgens wordt de Collection Tube met Filter Cartridge gecentrifugeerd gedurende 20-30 seconden bij maximale snelheid om het RNA te recupereren. Deze stap wordt herhaald met een tweede 50 μl Elution Solution. De Collection Tube met Filter Cartridge wordt nogmaals gecentrifugeerd gedurende 1 minuut om alle Elution Solution in de Collection Tube (II) te verzamelen. - 21 - 2.4.1.4 DNase I behandeling De DNase I digestie wordt uitgevoerd om contaminerend gDNA van het geëlueerde RNA te verwijderen. Hiervoor wordt 1/20 volume 20X DNase buffer en 1 μl DNase I aan het geëlueerde RNA toegevoegd en het geheel wordt goed gemengd. Dit mengsel wordt gedurende 30 minuten bij 37°C geïncubeerd. Vervolgens wordt een hoeveelheid DNase Inactivation Reagent toegevoegd dat gelijk is aan 20% van het RNA volume dat behandeld wordt. Er wordt kort en krachtig gevortext en het geheel wordt 2 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Hierna wordt het staal gecentrifugeerd gedurende 1 minuut zodat de DNase Inactivation Reagent een pellet vormt. Tenslotte wordt de RNA solutie overgebracht in een nieuwe RNase-vrij buisje. De RNA stalen worden bewaard bij -80°C. 2.4.1.5 Opbrengst en kwaliteit RNA De concentratie of de opbrengst van het geïsoleerde RNA wordt gemeten met behulp van de ND-1000 spectrofotometer (Nanodrop Technologies). Daarnaast is het ook belangrijk om de kwaliteit van het geïsoleerde RNA te kennen. Deze wordt gemeten met behulp van de Experion (Biorad). Aangezien deze toestellen niet ter beschikking stonden in het labo, werden deze metingen op de dienst van de Medische Genetica van het UZ Gent uitgevoerd door een persoon die hiervoor opgeleid werd. 2.4.2 cDNA synthese 2.4.2.1 Reactiemix voor cDNA synthese Om het RNA om te zetten in cDNA wordt gebruik gemaakt van de iScript cDNA Synthesis Kit (Biorad). Aan een RNase-vrij epje worden volgende componenten toegevoegd: Tabel 2.1: Reactiemix voor cDNA synthese. Componenten Volume per reactie 5x iScript reactie mix 4 µl iScript reverse transcriptase 1 µl Nuclease-vrij water x µl RNA x µl Totaal volume 20 µl - 22 - De exacte hoeveelheden nuclease-vrij water en RNA zijn afhankelijk van de concentratie van het RNA en de hoeveelheid cDNA die men wenst te synthetiseren. Er wordt doorgaans gewerkt met een totaal volume van 20 µl. Indien echter een grote hoeveelheid cDNA nodig is, kan een eindvolume van 40 µl gebruikt worden. 2.4.2.2 cDNA synthese De eigenlijke cDNA synthese gebeurt via een eenvoudige PCR reactie. De complete reactiemix wordt geïncubeerd gedurende 5 minuten bij 25°C, gedurende 30 minuten bij 42°C, gedurende 5 minuten bij 85°C en vervolgens wordt het staal afgekoeld tot 4°C. Het gevormde cDNA wordt bewaard bij -20°C. 2.4.3 Primers 2.4.3.1 Primerdesign Een primerpaar bestaat uit een forward primer en een reverse primer, respectievelijk voor amplificatie van de 5’- en de 3’ cDNA streng. Bij het zoeken naar de optimale primers moet er rekening gehouden worden met de volgende regels [34]: de primers mogen niet te lang zijn (18-28 nucleotiden) de primers mogen geen grote herhalingen van nucleotiden bevatten de primers morgen geen SNPs of secundaire structuren (vb. hairpins) bevatten, deze kunnen efficiënte annealing van de primers en amplificatie van het DNA verhinderen de smelttemperatuur van forward en reverse primer mag niet meer dan 5°C verschillen en moet gelegen zijn rond 58-60°C Eerst wordt er in de literatuur gezocht naar primers voor real-time PCR. Hierbij wordt er specifiek gezocht naar studies die, analoog aan de experimentele set-up van deze masterproef, genexpressie van stralingsgevoelige genen bestuderen in bloed na blootstelling aan lage dosissen ioniserende straling met behulp van kwantitatieve real-time PCR. Daarnaast wordt er ook gezocht naar primers via de RT primer database [42]. Deze databank geeft voor elk primerpaar de lengte en sequentie van de primers en van het amplicon en geeft ook een aanduiding van de annealing temperatuur. Bovendien verkrijgt men hier ook informatie over de eventuele aanwezigheid van SNPs in de primersequenties. - 23 - Indien een primerpaar van een gen van interesse gevonden is, wordt dit ingebracht in de UCSC databank [43]. Deze databank voert een in silico PCR reactie uit, om te controleren of de primers specifiek binden. Tevens verschaft deze databank ook informatie over de lengte van het amplicon en de smelttemperatuur van beide primers. 2.4.3.2 Primers oplossen in buffer Er wordt gebruik gemaakt van een werkoplossing met primerconcentratie 5 µM. Eerst wordt er een stockoplossing bereid met een primerconcentratie van 50 µM. Afhankelijk van de geleverde primerconcentratie wordt de poedervormige primer verdund met TE buffer tot de gewenste primerconcentratie van 50 µM bereikt is. Hierna wordt de stockoplossing 10 keer verdund, zodat een werkoplossing met een primerconcentratie van 5 µM verkregen wordt. De stock- en werkoplossingen worden bewaard bij -20°C. 2.4.4 Real-time PCR 2.4.4.1 Reactiemix voor real-time PCR De standaard reactiemix voor de real-time PCR reactie wordt weergegeven in tabel 2.2. Tabel 2.2: Reactiemix voor real-time PCR. Componenten Volume per reactive Mastermix (2X) 7.5 µl Forward primer (5µM) 0.75 µl Reverse primer (5µM) 0.75 µl Sigma H2O x µl cDNA x µl Totaal volume 20 µl De mastermix is een bufferoplossing die het DNA polymerase, de SYBR Green probe en de deoxynucleotiden (dNTP’s) bevat. De mastermix wordt in het donker bewaard bij -20°C. Alvorens de mastermix toe te voegen dient deze ontdooid en gecentrifugeerd te worden. Ook de primers, het sigma H2O en het cDNA worden bewaard bij -20°C en moeten eerst ontdooien alvorens ze kunnen worden toegevoegd aan de mix. De primers en het cDNA worden kort gevortext en gecentrifugeerd. Het totaalvolume van de real-time PCR reactie bedraagt doorgaans 15 µl per well van de 96 well plaat. De mix wordt aangevuld met sigma H2O tot dit volume bereikt is. Om accuraat- 24 - heid en reproduceerbaarheid van de resultaten te verzekeren, wordt elk staal in drievoud geladen op de plaat. Alle experimenten bevatten een negatieve controle (NT of non template control; sigma H2O ipv cDNA) en een RT-minus controle (gDNA ipv cDNA) om genomische contaminatie te detecteren. Bij het maken van de reactiemix en het vullen van de plaat wordt continu op ijs gewerkt. 2.4.4.2 Real-time PCR Nadat de plaat gevuld wordt met reactiemix voor real-time PCR, wordt deze afgedekt met een seal, gevortext en gecentrifugeerd. Vervolgens wordt de plaat in het real-time PCR toestel gebracht. Voor deze masterproef wordt gewerkt met het Applied Biosystems 7500 Fast toestel en de geassocieerde Applied Biosystems software v2.0. Het real-time PCR programma wordt hieronder weergegeven (tabel 2.3). Tabel 2.3: Real-time PCR programma. Holding stage 95°C 10' DNA polymerase activatie Cycling stage 95°C 15'' Denaturatie aantal cycli: 45 60°C 45'' Annealing/extensie startcyclus: 2 95°C 15'' 60°C 01' 95°C 30'' Melt curve stage 15°C Afkoelen 2.4.5 In vitro real-time PCR experiment De up- of downregulatie van de targetgenen na bestraling zal slechts na enige incubatietijd gezien kunnen worden. Via een in vitro experiment wordt het tijdstip na bestraling waarop de genexpressie maximaal is, bepaald. Dit tijdstip is immers belangrijk om te weten op welk moment na het CT-onderzoek de bloedafname bij de patiënt moet gebeuren. Bovendien kan aan de hand van dit experiment bepaald worden welke van de kandidaat referentiegenen het meest stabiel blijven onder de gebuikte experimentele condities. Voor dit experiment werd bloed van drie gezonde donoren gebruikt. Het bloed werd verdeeld over 3 buisjes waarvan één dienst doet als controle, één bestraald werd met 50 mGy en één met 100 mGy X-stralen. Voor de bestraling wordt gebruik gemaakt van een stralingskwaliteit van 100 kVp en een filtratie van 2 mm Al met een Philips MG420 X-straal generator gekop- 25 - peld aan een MCN420 buis. Vervolgens wordt het bloed bij elk dosispunt verdeeld over vijf buisjes die men respectievelijk 0, 1, 2, 3 of 4 uur laat incuberen op een schuddende plaat, waarbij de buisjes in een hoek van 45° worden geplaatst. Na de incubatietijd wordt 500 µl bloed toegevoegd aan 1,3 ml RNAlater en wordt de RNA isolatie met de RiboPure Blood kit gestart. Na de RNA isolatie wordt het RNA omgezet in cDNA met behulp van de iScript cDNA synthesis kit. Dit cDNA wordt vervolgens gebruikt voor de RT-PCR reactie. 2.4.6 Data analyse en statistische verwerking 2.4.6.1 Primerefficiëntie Een primerefficiëntie van 100% wijst op een perfecte verdubbeling van de template bij elke cyclus gedurende de exponentiële amplificatiefase. Indien de efficiëntie 90% bedraagt, zal de template vermenigvuldigd worden met een factor 1,9 bij elke cyclus, voor efficiënties van 80% en 70% wordt dit respectievelijk een factor 1,8 en 1,7. Hieruit blijkt dat een klein verschil in efficiëntie een groot verschil in de totale hoeveelheid product teweeg brengt. Na 10 cycli zal de toename van de template 210 zijn bij een efficiëntie van 100% en 1,910 bij een efficiëntie van 90%. Algemeen kan men stellen dat na n cycli de hoeveelheid template gelijk zal zijn aan [1 + efficiëntie]n. Bij het berekenen van de relatieve hoeveelheid (RQ waarde) van een staal aan de hand van de Cq waarde, moet de primerefficiëntie in rekening gebracht worden. De primerefficiëntie wordt bepaald aan de hand van een standaard curve, die gebaseerd is op een verdunningsserie van gekende template concentraties. In de standaard curve wordt het logaritme van de concentraties in de verdunningsserie uitgezet tegenover de bijhorende Cq waarde. De helling van de curve is een maat voor de primerefficiëntie. Een efficiëntie van 100% komt overeen met een helling van -3,32, berekend volgens de formule: Efficiëntie = 10 -1/helling -1. Primerefficiënties tussen 90 en 110% zijn aanvaardbaar. Dit komt overeen met een helling van de standaardcurve van -3,6 tot -3,1. Verschillende experimentele factoren kunnen de efficiëntie beïnvloeden en resulteren in efficiënties die buiten de aanvaardbare range vallen [34, 35]. - 26 - 2.4.6.2 Stabiliteit van de referentiegenen De stabiliteit van de referentiegenen wordt bepaald met behulp van het geNorm algoritme. Dit algoritme, gebaseerd op het principe dat de expressieratio van twee ideale referentiegenen identiek zou moeten zijn in alle stalen, duidt de referentiegenen met de meest stabiele expressie aan en geeft het optimaal aantal referentiegenen aan. Het programma berekent de ‘gene expression stability mesaure M’ of M waarde van een referentiegen gebaseerd op de gemiddelde paarsgewijze variatie tussen alle onderzochte referentiegenen. Hoe lager de M waarde, hoe groter de stabiliteit van het beschouwde referentiegen [35]. 2.4.6.3 Relatieve kwantificatie Voor de relatieve kwantificatie wordt gebruik gemaakt van de Cq waarden. Eerst wordt van elk staal de gemiddelde Cq waarde van de drie replicaten berekend. Vervolgens worden de gemiddelde Cq waarden geconverteerd naar relatieve hoeveelheden of RQ waarden. De RQ waarde duidt de hoeveelheid input van elk staal bij het begin van de real-time PCR reactie aan, relatief ten opzichte van een referentiestaal. Indien de efficiëntie 100% bedraagt, wordt de RQ waarde als volgt berekend: RQ = 2 ΔCq waarbij ΔCq het verschil is tussen de Cq waarde van het referentiestaal en de gemiddelde Cq waarde van het beschouwde staal. Welke referentie Cq men kiest heeft geen effect op de RQ waarde van de stalen. Om de fout te beperken, wordt het gemiddelde van alle Cq waarden gebruikt als referentie Cq. Indien de primerefficientie 90% bedraagt in plaats van 100% wordt bovenstaande formule herleidt tot RQ = 1,9 ΔCq. De algemene formule voor de berekening van de RQ waarde wordt dus: RQ = [1 + efficiëntie]ΔCq. Verschillen in RQ waarde tussen stalen kunnen te wijten zijn aan verschillen in genexpressie, maar daarnaast ook aan experimentele en technische variatie, zoals verschillen in kwaliteit en kwantiteit van het startmateriaal. Om te corrigeren voor deze experimentele en technische variatie, wordt de expressie van een targetgen genormaliseerd ten opzicht van de expressie van één of meerdere referentiegenen. Deze normalisatie laat directe vergelijking van de ‘normalized RQ’ of NRQ waarden tussen verschillende stalen toe. Voor elk staal wordt een normalisatiefactor (NF) berekend door het geometrisch gemiddelde van de RQ-waarden van de door geNorm gekozen referentiegenen te nemen. De NRQ waarde wordt dan als volgt berekend: NRQ = RQ/NF. Vervolgens wordt deze NRQ waarde herschaald tot de ‘rescaled NRQ’ waarde. Deze rescaled NRQ waarde wordt verder gebruikt om de resultaten te analyseren [34, 35]. - 27 - 3 Resultaten 3.1 Gamma-H2AX foci scoring 3.1.1 Optimalisatie protocol voor gamma-H2AX foci scoring Het protocol voor γ-H2AX foci scoring werd binnen de onderzoeksgroep reeds geoptimaliseerd voor de manuele scoring met behulp van de Olympus BX60 fluorescentie microscoop. Voor het eerste antilichaam (anti-fosfo-histon H2AX) werd gebruik gemaakt van een 1:300 concentratie. In deze masterproef worden de foci echter zowel manueel als automatisch gescoord met de Metafer scanning microscoop. Wanneer we bovenvermelde concentratie voor het eerste antilichaam gebruiken, is het aantal foci vóór CT geteld door de Metafer microscoop onrealistisch hoog. Dit is mogelijks te wijten aan het feit dat er bij een 1:300 concentratie van antilichaam 1 te veel achtergrondkleuring is, die eventueel verkeerdelijk als foci gescoord zou kunnen worden door de Metafer microscoop. Om dit te testen, werden voor een aantal patiëntstalen drie immuunkleuringen met variabele antilichaamconcentraties (1:300, 1:500, 1:1000) uitgevoerd. Bij een 1:1000 concentratie van antilichaam 1 bleek de achtergrondkleuring voldoende laag te zijn, zodat het aantal foci vóór CT realistischer was in vergelijking met het aantal bij de andere concentraties (1:300 en 1:500). Als gevolg werd er beslist om voor de andere patiëntstalen te werken met een 1:1000 concentratie, zowel voor de manuele als voor de automatische scoring. 3.1.2 In vivo dosis-respons curve In figuur 3.1 werd het gemiddeld aantal γ-H2AX foci per cel geïnduceerd door de in vivo Xstraal blootstelling van de individuele patiënten uitgezet tegenover de DLP-waarde (dose length product) van het CT-onderzoek (data in bijlage A.1). De DLP-waarde is een radiodiagnostische eenheid die proportioneel is met zowel de lokale dosis als de blootgestelde lengte van het lichaam. Voor bijna alle patiënten werd een stijging in het aantal foci gezien als gevolg van blootstelling aan X-stralen gedurende het CT-onderzoek. De in vivo dosis-respons curve heeft een bifasisch verloop met hypersensitiviteit in het lage dosis gebied. - 28 - In vivo dosis-respons curve Geïnduceerd aantal foci/cel 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 1000 2000 3000 4000 5000 -0,5 DLP (mGycm) Figuur 3.1: Het gemiddeld aantal foci per cel geïnduceerd door in vivo X-straal blootstelling in functie van de DLP-waarde van de individuele patiënten bij een contrast CT-onderzoek uitgevoerd met de CT-scanner generatie 2005 () of de CT-scanner generatie 2010 (●). Voor de foutbalken werd gebruik gemaakt van de SE waarde of de standaard error (aantal foci ± SE). De SE wordt als volgt berekend: SE of the mean) standaarda fwijking/ 2 (SEM VOOR 2 SEM NA ) met SEM (standard error (n) waarbij n het aantal cellen voorstelt waarin foci werden gescoord (±150). Om te bepalen of het gemiddeld aantal γ-H2AX foci voor en na het CT-onderzoek significant verschillend is, werd de Wilcoxon signed-rank test gebruikt, waarvan het resultaat wordt weergegeven in tabel 3.1. De p-waarde is kleiner dan 0,05 wat erop wijst dat het verschil in aantal foci voor en na het CT-onderzoek statistisch significant is. Tabel 3.1: Resultaat van Wilcoxon signed-rank test ter vergelijking van het aantal foci voor en na het CT-onderzoek. Wilcoxon signed-rank Test gemiddelde p-waarde waarde gemiddeld # foci voor gemiddeld # foci na 0,65 0,000 1,22 - 29 - Voor deze masterproef werden bloedstalen verzameld van patiënten die een contrast CTonderzoek ondergingen met een CT-scanner generatie 2005 (patiënten 1 – 35) of met een dual-energy CT-scanner generatie 2010 (patiënten 36 - 61). De dual-energy CT-scanner is uitgerust met twee X-straalbuizen die simultaan roteren rond de patiënt en straling uitzenden van een verschillende energie. Het gebruik van twee X-straalbuizen heeft als belangrijkste gevolg dat de scantijd sterk vermindert, wat aanleiding geeft tot een reductie van de dosis waaraan de patiënten blootgesteld worden. Om te zien of er inderdaad een verschil in dosis is tussen beide CT-scanners, werden de in vivo dosis-respons curves voor beide CT-scanners vergeleken met elkaar. Belangrijk hierbij is dat de patiënten gegroepeerd werden naargelang het soort onderzoek (thoracale CT of abdominale CT) dat zij ondergingen. In figuur 3.2 worden de in vivo dosis-respons curves van de CT-scanner generatie 2005 () en generatie 2010 () weergegeven voor de patiënten die een abdominale CT-scan (A) ondergingen en voor patiënten die een thoracale CT-scan ondergingen (B). A. In vivo dosis-respons, Abdomen A. In vivo dosis-respons, Abdomen Geïndcueerd aantal foci/cel Geïnduceerd aantal foci/cel 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 1000 2000 3000 4000 5000 -0,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 1000 DLP (mGycm) 3000 4000 5000 DLP (mGycm) B. In vivo dosis-respons, Thorax B. In vivo dosis-respons, Thorax 2,0 2,0 Geïnduceerd aantal foci/cel Geïnduceerd aantal foci/cel 2000 -0,5 1,5 1,0 0,5 0,0 0 1000 2000 3000 4000 5000 -0,5 1,5 1,0 0,5 0,0 0 1000 2000 3000 4000 5000 -0,5 DLP (mGycm) DLP (mGycm) Figuur 3.2: In vivo dosis-repons curves van patiënten die een abdominale (A) of een thoracale (B) CTscan ondergingen voor de CT-scanner generatie 2005 ( - 30 - Zoals blijkt uit bovenstaande figuur, zijn de DLP-waarden gegenereerd door de CT-scanner generatie 2010 inderdaad gelegen bij lagere waarden in vergelijking met de CT-scanner generatie 2005 voor gelijkaardige onderzoeken. Om te bepalen of dit verschil in DLP-waarden tussen beide scanners statistisch significant is, werd een MWU test uitgevoerd voor beide onderzoeksgroepen afzonderlijk (abdominaal en thoracaal) en voor alle onderzoeken samen. Daarnaast werd ook een MWU test gedaan voor de 3 bovenvermelde groepen om te evalueren of ook het geïnduceerd aantal foci tussen beide toestellen significant verschillend is. De resultaten van deze testen worden weergegeven in onderstaande tabel (tabel 3.2). Tabel 3.2: Resultaten van de Mann-Whitney U Test ter vergelijking van de CT scanner generatie 2005 en de CT-scanner generatie 2010. Mann-Whitney U Test CT-scanner gemiddelde p-waarde waarde Alle onderzoeken gemiddelde delta foci gemiddelde DLP Abdominale gemiddelde delta foci onderzoeken gemiddelde DLP Thoracale gemiddelde delta foci onderzoeken gemiddelde DLP 2005 0,74 2010 0,34 2005 1693,78 2010 806,65 2005 0,63 2010 0,36 2005 1496,33 2010 827,38 2005 0,90 2010 0,27 2005 1989,95 2010 719,60 0,001 0,014 0,063 0,163 0,019 0,034 Wanneer alle soorten onderzoeken samen worden beschouwd, is zowel de gemiddelde DLPwaarde als het gemiddeld aantal foci significant lager bij de CT-scanner generatie 2010 (p < 0,05). Ook voor de groep van thoracale onderzoeken zijn beide variabelen significant verschillend tussen beide CT-toestellen. Voor de groep van abdominale onderzoeken is het verschil in DLP-waarden tussen beide toestellen echter niet significant, wat bevestigd wordt door het feit dat er ook voor het geïnduceerd aantal foci geen significant verschil geobserveerd wordt. - 31 - 3.1.3 Vergelijking in vivo – in vitro data Om de γ-H2AX foci dosis-respons na in vivo en in vitro bestraling te vergelijken, wordt gebruik gemaakt van de in vitro dosis-respons curve bepaald in de studie van Beels et al. Deze dosis-respons curve geeft het aantal foci geïnduceerd door in vitro bestraling weer in functie van de dosis (in mGy), uitgemiddeld over 3 gezonde donoren. In de huidige studie werd echter gebruik gemaakt van DLP (in mGycm) als dosiseenheid. Om de vergelijking tussen in vivo en in vitro dosis-respons curves te kunnen maken, werd de DLP (in mGycm) van de in vivo dosis-respons curve geconverteerd naar equivalent total body dose (ETBD) (in mGy). Hiervoor werd gebruik gemaakt van volgende formule: Equivalent total body dose = (DLP/Lromp) x (Vromp / Vtotaal lichaam) waarbij L staat voor lengte (cm) en V voor volume (cm3). De waarden van V en L voor mannen en vrouwen worden in tabel 3.3 weergegeven [44]. Tabel 3.3: Waarden voor lengte en volume van de romp en volume van het totale lichaam voor mannen en vrouwen. Lromp (cm) Vromp (cm3) Vtotaal lichaam (cm3) man 70 43982 69746 Vrouw 66 36642 58259 De equivalent total body dose wordt voor alle patiënten weergegeven in bijlage A.1. Figuur 3.3 geeft het gemiddeld aantal γ-H2AX foci per cel geïnduceerd door de in vivo Xstraal blootstelling uitgezet in functie van de berekende ETBD. De in vitro dosis-respons curve bepaald door Beels et al. wordt eveneens weergegeven in figuur 3.3. Deze in vitro dosisrespons curve heeft een bifasisch verloop; het geïnduceerd aantal foci stijgt sterk in het zeer lage dosis gebied tot 6 mGy, gevolgd door een minder sterke stijging bij hogere dosissen. Deze in vivo en in vitro data vertonen een min of meer gelijkaardige dosis-respons, maar het aantal foci per cel geïnduceerd door de in vivo bestraling bij het contrast CT onderzoek is over het algemeen lager dan het aantal na in vitro bestraling. - 32 - Figuur 3.3: γ-H2AX foci per cel geïnduceerd door in vivo blootstelling aan X-stralen in functie van de equivalente total body dose van volwassen patiënten die een contrast CT ondergaan ( ). In vitro dosis-respons curve ( ) (uit [11]). Voor de foutbalken van de in vitro data werd gebruik gemaakt van de standaard afwijkingen voor de interindividuele variabiliteit tussen de 3 dono ren. 3.2 Kwantitatieve real-time PCR 3.2.1 Primer design De primers voor de genen HMBS en B2M en voor de Alu repeats werden in de literatuur (referenties [41,45] ) gevonden. Via ‘RT primer database’ werden de primers voor de genen GAPDH, CDKN1A en GADD45A gevonden. De gekozen primers worden weergegeven in tabel 3.4. Tabel 3.4: Primers voor real-time PCR. Nr. Naam Sequentie Lengte (# nt) Ta (°C) 127 HMBS/8.756F 5’ CAGCTTGCTCGCATACAGAC 3’ 20 60 128 HMBS/9.235R 5’ GAATCTTGTCCCCTGTGGTG 3’ 20 60 130 GAPDH/5.026F 5’ CGCTCTCTGCTCCTCCTGTT 3’ 20 60 131 GAPDH/5.346R 5’ CCATGGTGTCTGAGCGATGT 3’ 20 60 132 B2M/2.443F 5’ TGCTGTCTCCATGTTTGATGTATCT 3’ 25 60 133 B2M/2.528R 5’ TCTCTGCTCCCCACCTCTAAGT 3’ 22 60 134 CDKN1A/10.822F 5’ TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA 3’ 21 60 135 CDKN1A/12.090R 5’ GGCGTTTGGAGTGGTAGAAATC 3’ 22 60 136 GADD45A/391F 5’ TCAGCGCACGATCACTGTC 3’ 19 60 - 33 - 137 GADD45A/473R 5’ CCAGCAGGCACAACACCAC 3’ 19 60 138 Alu-Sx-1-F 5’ TGGTGAAACCCCGTCTCTACTAA 3’ 23 60 139 Alu-Sx-1-R 5’ CCTCAGCCTCCCGAGTAGCT 3’ 20 60 20 62,2 Extra reverse primer voor GADD45A 164 GADD45A/465R 5’ CACAACACCACGTTATCGGG 3’ 3.2.2 Primerefficiëntie Om accuraatheid van de data te verzekeren is het belangrijk dat alle primers gebruikt voor de qRT-PCR experimenten een aanvaardbare efficiëntie hebben. De primerefficiëntie E wordt bepaald aan de hand van de helling van de standaardcurve. Om voor alle genen een primerefficiëntie te bekomen gelegen binnen de aanvaardbare range (90% - 110%), werd de standaardcurve bepaald bij verschillende reactiecondities. De startconcentratie van het cDNA, de verdunning, het aantal verdunningspunten in de standaardcurve en het aantal µl cDNA toegevoegd aan de RT-PCR mix werden gevarieerd. Indien de startconcentratie van de verdunningsreeks te hoog (60 ng en 40 ng) was, werd voor alle genen behalve CDKN1A en GADD45A een efficiëntie gemeten hoger dan 110%. Dit wijst erop dat de amplificatie van het cDNA op de een of andere manier geïnhibeerd werd bij de hoogste concentratiepunten. Als de hoeveelheid startmateriaal in een staal hoger is, dan zijn de Cq waarden proportioneel lager. Een lagere Cq waarde wijst erop dat er minder PCR cycli nodig zijn om voldoende fluorescentie te genereren om de treshold T te overschrijden. Men zou dus verwachten dat bij stalen met een hogere cDNA startconcentratie, de amplificatiecurves vroeger verschijnen dan deze van de stalen met een lagere startconcentratie. Dit was echter niet het geval voor de hoogste concentratiepunten, zoals men kan zien in onderstaande figuur. Figuur 3.4 A geeft de amplificatiecurve weer bij inhibitie, figuur 3.4 B geeft ter vergelijking de normale amplificatiecurve weer zonder inhibitie. - 34 - 40 ng 10 ng 2,5 ng 0,625 ng Figuur 3.4 A: Amplificatieplot van de verdunningsserie (40 ng - 0,625 ng) van het gen HMBS met inhi bitie. De rode amplificatiecurve van het staal met cDNA concentratie van 40 ng is gelegen bij een groter aantal cycli en verschijnt dus later in vergelijking met de gele en groene amplificatiecurves van de stalen met een lagere cDNA concentratie. 20 ng 5 ng 1,25 ng 0,312 ng Figuur 3.4 B: Amplificatieplot van de verdunningsserie (20 ng - 0,312 ng) van het gen HMBS zonder inhibitie. De rode amplificatiecurve van het staal met cDNA concentratie van 20 ng is gelegen bij een lager aantal cycli en verschijnt dus vroeger in vergelijking met de gele en groene amplificatiecurves van de stalen met een lagere cDNA concentratie. De inhibitoren kunnen aanwezig zijn in het staal zelf of afkomstig zijn van gecontamineerde reagentia, epjes of ander laboratoriummateriaal. Een mogelijke bron van inhibitoren zou de DNase I behandeling kunnen zijn die uitgevoerd wordt na de RNA isolatie om contaminerend gDNA uit het geïsoleerde RNA te verwijderen. Om dit te onderzoeken werd een real-time experiment gedaan startende van 40 ng cDNA dat na RNA isolatie geen DNase I behandeling had gekregen. Ook hier werd opnieuw inhibitie gezien bij de hoogste concentratiepunten. De oorzaak van inhibitie was dus niet gelegen bij de DNase I behandeling. Mogelijk was de inhibitie afkomstig van reagentia gebruikt bij de RNA isolatie. Aangezien inhibitie leidt tot efficiënties buiten de aanvaardbare range, werd getracht deze te beperken door de standaardcurve te starten bij een lagere cDNA concentratie (20 ng). Op deze manier werd ook de inhibitor verdund, waardoor deze zijn effect minder of niet kon uitoefenen. Dit gaf inderdaard voor alle primers een verbetering van de efficiëntie. - 35 - Een bijkomende manier om het effect van inhibitie op de efficiëntie weg te werken, is door de stalen met de hoogste cDNA concentratie te verwijderen en de standaardcurve te reanalyseren. Dit werd gedaan om een aanvaardbare efficiëntie te bereiken voor de primers van de Alurepeats. Belangrijk hierbij is dat elk concentratiepunt dat verwijderd werd of niet opgenomen werd in de standaardcurve niet gebruikt mag worden gedurende het effectieve experiment. Naast deze efficiënties hoger dan 110% te wijten aan het optreden van inhibitie, werd voor GADD45A steeds een efficiëntie gemeten lager dan 90%. Verschillende oorzaken kunnen aan de basis liggen van deze lage efficiëntie, zoals suboptimale reagentconcentraties, lengte van het amplicon of primerdesign. Door de standaardcurve te starten bij 20 ng cDNA werd reeds enige verbetering van de efficiëntie gezien. Aangezien de oorzaak van de lage efficiëntie ook aan de primers zelf te wijten kan zijn, werd een andere reverse primer voor GADD45A gezocht via ‘RT primer database’ (zie tabel 3.4). Dit nieuwe primerpaar gaf echter geen hogere efficiëntie in vergelijking met het eerste primerpaar, integendeel de bekomen efficiëntie was nog lager. Daarom werd beslist om toch de oorspronkelijke reverse primer te behouden. Een andere factor die de efficiëntie kan beïnvloeden, is technische variatie die ontstaat bij het toevoegen van de reactieproducten in de wells van de plaat. Indien de Cq waarden van de replicaten sterk verschillen, ziet men dat de efficiëntie daalt. Door de wells met slechte replicaten te verwijderen en de standaardcurve te reanalyseren, zien we doorgaans een verbetering van de efficiëntie. Dit werd voor de genen GADD45A, CDKN1A en HMBS gedaan om de efficiëntie verder te verbeteren [34, 35, 46]. De reactiecondities die een aanvaardbare primerefficiëntie gaven voor alle genen en de bijhorende primerefficiënties worden weergegeven in tabel 3.5. Tabel 3.5: Primerefficiëntie van de target- en referentiegenen. Gen Start concentratie (ng) Verdunning Aantal verdunningspunten Aantal µl cDNA HMBS 20 1 op 4 5 2 92,4 B2M 20 1 op 4 5 2 99,1 GAPDH 20 1 op 4 5 2 95,8 Alu 20 1 op 4 5 2 100,5 CDKN1A 20 1 op 4 5 2 94,3 GADD45A 20 1 op 4 5 2 88,8 - 36 - Primerefficiëntie (%) De standaardcurves voor de verschillende genen met bovenstaande reactiecondities worden weergegeven in bijlage B.1. 3.2.3 In vitro real-time PCR experiment Aan de hand van de resultaten van het in vitro experiment werd onderzocht welke de meest stabiele referentiegenen zijn. Daarnaast werd ook het effect van de dosis en de tijd na bestraling op de genexpressie van de targetgenen CDKN1A en GADD45A geanalyseerd. 3.2.3.1 Stabiliteit van de referentiegenen Voor de in vivo studie bij patiënten die een contrast CT-onderzoek ondergaan, zal er gewerkt worden met drie referentiegenen. Normalisatie van qRT-PCR data met 3 referentiegenen wordt immers beschouwd als de meest geschikte en universeel toegepaste methode [35]. Om te bepalen welke van de kandidaat referentiegenen HMBS, B2M, GAPDH en Alu het meest stabiel blijven onder invloed van straling, werden de RQ waarden van deze genen, resulterend uit het in vitro experiment (zie bijlage B.2), ingevoerd in geNorm. De genen HMBS, B2M en Alu werden door dit algoritme als beste referentiegenen aangeduid. 3.2.3.2 Effect van dosis en tijd op de genexpressie van de targetgenen Met behulp van de door geNorm gekozen referentiegenen, werd het effect van de dosis en tijd op de genexpressie van de targetgenen CDKN1A en GADD45A geanalyseerd. De data van deze real-time PCR reactie worden weergegeven in bijlage B.3 en B.4. Aangezien in dit in vitro experiment twee variabelen, de tijd en de dosis, getest worden, kan herschaling van de NRQ waarde gebeuren naar de dosis of naar de tijd (zie bijlage B.3 (dosis) en B.4 (tijd)). Wanneer we het effect van de dosis op de genexpressie van de targetgenen willen bekijken, herschalen we naar de dosis. Hiertoe zal voor elk dosispunt (0, 50, 100 mGy) de NRQ waarde van elk staal (0, 1, 2, 3 of 4 uur) gedeeld worden door de NRQ waarde van het controlestaal (0 mGy) bij hetzelfde tijstip. Deze rescaled NRQ waarden worden vervolgens voor elk tijdstip uitgezet ten opzichte van de dosis (zie figuur 3.5). - 37 - Rescaled NRQ waarde A. GADD45A (dosis) 5 0 hrs 4 1 hrs 3 2 hrs 2 3 hrs 4 hrs 1 0 0 50 100 Dosis (mGy) Figuur 3.5 A: NRQ waarden herschaald naar de dosis uitgezet in functie van de dosis voor GADD45A. De curves van 1, 2 en 3 uur stijgen in functie van de dosis. De expressie van GADD45A van het staal dat men 4 uur laat incuberen daalt bij bestraling met 50 mGy en stijgt bij bestraling met 100 mGy. Indien onmiddellijk na bestraling de RNA isolatie wordt gestart (0 uur incubatie) blijft de genexpressie nagenoeg stabiel ongeacht de stralingsdosis. Rescaled NRQ waarde B. CDKN1A (dosis) 5 0 hrs 4 1 hrs 3 2 hrs 2 3 hrs 1 4 hrs 0 0 50 100 Dosis (mGy) Figuur 3.5 B: NRQ waarden herschaald naar de dosis uitgezet in functie van de dosis voor CDKN1A. Enkel bij een incubatietijd van 2 uur stijgt de expressie in functie van de dosis. Bij een incubatietijd van 0, 1 of 3 uur zien we wel een stijging van de expressie onder invloed van bestraling, maar niet in functie van de dosis (de expressie bij een dosis van 100 mGy stijgt wel, maar niet zo sterk als bij een dosis van 50 mGy). De curve van 4 uur incubatietijd daalt in functie van de dosis. Een andere variabele waarvan we het effect op de genexpressie van de targetgenen willen bekijken, is het effect van de tijd na bestraling. Hiervoor herschalen we naar de tijd door voor - 38 - elk tijdstip (0, 1, 2, 3, 4 uur) de NRQ waarde van elk staal (0, 50 of 100 mGy) te delen door de NRQ waarde van het controle staal (0 uur) bij dezelfde dosis. Deze rescaled NRQ waarden worden vervolgens voor elk dosispunt uitgezet ten opzicht van de tijd (zie figuur 3.6). A. GADD45A (tijd) Rescaled NRQ waarde 4 3 0 mGy 50 mGy 2 100 mGy 1 0 0 1 2 3 4 Tijd (uur) Figuur 3.6 A: NRQ waarden herschaald naar de tijd uitgezet in functie van de tijd voor GADD45A. De GADD45A expressie van het onbestraalde controlestaal daalt in functie van de tijd tot een minimum wordt bereikt bij een incubatietijd van 3 uur. De curves van 50 mGy en 100 mGy fluctueren over het hele tijdsverloop. Het tijdstip van maximale genexpressie wordt bereikt op 3 uur voor het staal bestraald met 50 mGy en op 4 uur voor het staal bestraald met 100 mGy. Rescaled NRQ waarde B. CDKN1A (tijd) 4 3 0 mGy 50 mGy 2 100 mGy 1 0 0 1 2 3 4 Tijd (uur) Figuur 3.6 B: NRQ waarden herschaald naar de tijd uitgezet in functie van de tijd voor CDKN1A. Indien het staal niet bestraald werd, stijgt de expressie van CDKN1A in functie van de tijd na bestraling, met een maximum bij 2 uur. De expressie van het staal van 50 mGy stijgt ook infunctie van de tijd met een maximum bij 3 uur. Bij bestraling met 100 mGy daalt de expressie gedurende het eerste uur en stijgt vervolgens tot een maximum bij 2 uur. - 39 - 4 Bespreking 4.1 Gamma-H2AX foci scoring Het doel van deze masterproef is onderzoeken of de hypersensitiviteit in het lage dosis gebied, recent geobserveerd in een studie bij kinderen in de interventionele cardiologie, ook aangetoond kan worden bij volwassen die een CT-onderzoek ondergaan. Hiervoor werd gebruik gemaakt van γ-H2AX foci als biomerker in de lage dosis regio. 4.1.1 Optimalisatie protocol voor gamma-H2AX foci scoring De optimalisatie van het protocol voor γ-H2AX foci scoring bestond er vooral in de automatische scoring van foci door de Metafer microscoop te optimaliseren. Zoals reeds vermeld werd de concentratie van het eerste antilichaam aangepast van 1:300 naar 1:1000 om te vermijden dat achtergrondsignalen verkeerdelijk als foci werden gescoord door de Metafer microscoop. Deze 1:1000 antlichaam 1 concentratie leverde in vergelijking met de 1:300 en 1:500 concentratie reeds meer realistische resultaten. Toch was het aantal foci vóór CT voor sommige stalen nog onrealistisch hoog in vergelijking met de manuele tellingen bij dezelfde concentratie van antilichaam 1 (1:1000). Als gevolg werd beslist enkel de manuele foci scoring te beschouwen voor deze masterproef. Verdere optimalisatie van de automatische foci scoring voor het lage tot zeer lage dosisgebied met behulp van de Metafer microscoop is noodzakelijk om betrouwbare en realistische resultaten te bekomen. 4.1.2 In vivo dosis-respons curve De berekening van risico’s op stralingsgeïnduceerde kanker is gebaseerd op het LNT model, dat veronderstelt dat de DNA schade proportioneel is aan de dosis en dat cellulaire repairmechanismen even efficiënt werken bij lage en hoge stralingsdosissen. De validiteit van deze extrapolatie van hoge naar lage dosissen wordt in vraag gesteld door een aantal radiobiologische fenomenen waaronder lage dosis hypersensitiviteit en het bystander effect. In de huidige studie werd bewijs gevonden van bovenvermelde effecten die het LNT model in vraag stellen. In figuur 3.1 werd het geïnduceerd aantal foci uitgezet in functie van de DLPwaarde voor patiënten die een contrast CT-onderzoek ondergingen. Het aantal foci stijgt zeer - 40 - sterk bij DLP-waarden van 0-500 mGycm, gevolgd door een minder sterke stijging bij hogere DLP-waarden. Voor bijna alle patiënten werd een stijging in aantal foci gezien, wat er op wijst dat deze lage dosis CT-onderzoeken in bijna alle patiënten DNA schade induceren. Reeds bij een DLP-waarde van 170 mGycm, wat overeenkomt met een equivalente total body dose van 1,5 mGy, kon een significante stijging in aantal foci geobserveerd worden. Deze resultaten bevestigen dus de lage dosis hypersensitiviteit geobserveerd in een studie van de vakgroep bij kinderen die een cardiologische catheterisatie ondergingen. Hier werd reeds een stijging in geïnduceerd aantal foci gezien bij een bloeddosis van 1 mGy. Ook andere in vivo studies bevestigen deze resultaten. Löbrich et al. bestudeerden eveneens de stijging in aantal γ-H2AX foci in lymfocyten geïnduceerd door thoracale of abdominale CT-onderzoeken bij volwassen patiënten. Hier werd, overeenkomstig de resultaten van deze masterproef, reeds een stijging in aantal foci geobserveerd bij een DLP-waarde van 150 mGycm. De in vivo dosis-respons curve gebaseerd op het aantal geïnduceerde γ-H2AX foci en de DLP-waarde heeft hier echter een lineair verloop waardoor de lage dosis hypersensitiviteit niet teruggevonden werd in de studie van Lobrich et al. [47]. Een mogelijke verklaring wordt verderop in deze sectie besproken. Om de γ-H2AX foci dosis-respons na in vivo en in vitro bestraling te kunnen vergelijken, werd in figuur 3.3 de in vitro dosis-respons curve bepaald door Beels et al. vergeleken met de in vivo dosis-respons curve van deze studie. Analoog aan de experimentele opzet in deze in vivo studie, werd voor de in vitro dosis-respons curve vol bloed bestraald met lage dosissen X-stralen en werd het geïnduceerd aantal γ-H2AX foci in T-lymfocyten bepaald. Beide dosisrespons curves hebben een bifasisch verloop met hypersensitiviteit in het lage dosis gebied. Het in vivo gedrag geobserveerd in de huidige studie wordt dus bevestigd door het in vitro gedrag eerder geobserveerd binnen de vakgroep. In figuur 3.3 is te zien dat het aantal foci geïnduceerd in vivo over het algemeen lager is dan in vitro. Om de in vitro data te vergelijken met de in vivo data, werd de DLP geconverteerd naar ETBD. De ETBD is echter niet helemaal representatief voor de fractie bloed die bestraald werd gedurende het CT-onderzoek. Om de ETBD te berekenen, werd de fractie van het volume van de romp tot het volume van het totale lichaam in rekening gebracht, waarbij verondersteld werd dat het bloed evenredig verdeeld is over het menselijk lichaam. De romp bevat, in vergelijking met het hoofd en de benen echter het meeste bloed aangezien de grote bloedvaten, het hart en de grote organen hierin gelegen zijn. Indien de dosissen van het hart, de longen, de lever en de andere grote organen in de romp berekend zouden worden en indien er - 41 - rekening zou gehouden worden met de bloedinhoud, zouden de dosis-waarden nauwkeuriger zijn en licht stijgen, met als gevolg dat de in vivo dosis-respons curve nauwer zou aansluiten bij de in vitro dosis-respons curve. Naast bovenvermelde studie zijn er ook andere onderzoeksgroepen die de dosis-respons curve voor γ-H2AX foci na in vitro bestraling bestuderen. In een studie van Ojima et al. werden ATM foci gescoord in fibroblasten bestraald met X-stralen met dosissen van 1,2 tot 200 mGy. De dosis-respons curve vertoonde, analoog met de curve gevonden door Beels et al. een bifasisch verloop met hypersensitiviteit in het lage dosis gebied (1,2 - 5 mGy) [12]. Ook bij bestraling van fibroblasten met lage dosissen α-partikels werd een gelijkaardige bifasische dosis-respons curve geobserveerd [48]. Deze in vitro data ondersteunen dus ook het in vivo gedrag geobserveerd in deze studie. Andere studies echter vonden een lineaire in vitro dosis-respons curve voor γ-H2AX foci [9,14,23]. Zoals reeds vermeld, werd door Löbrich et al. ook in vivo een lineaire dosis-respons curve gevonden [47]. Deze verschillen in resultaten kunnen te wijten zijn aan het soort celtype dat bestudeerd wordt, aan de gebruikte dosissen en aan verschillen in gebruikte stralingskwaliteit. Daarnaast zou ook de omgeving van de cellen op het moment van bestraling een rol kunnen spelen. Recent werd hiervoor bewijs geleverd in een studie uitgevoerd binnen de vakgroep. Er werd immers aangetoond dat de lage dosis hypersensitiviteit geobserveerd bij bestraling van geïsoleerde lymfocyten met X-stralen veel minder uitgesproken is als bij bestraling van vol bloed. Daarnaast werd bij γ-bestraling van zowel geïsoleerde T-lymfocyten als vol bloed een lineaire dosis-respons curve gezien, terwijl bij bestraling X-stralen een bifasische dosis-respons curve met hypersensitiviteit in het lage dosis gebied werd geobserveerd [49]. De geobserveerde lage dosis hypersensitiviteit in γ-H2AX foci inductie in vivo en in vitro wordt door vele auteurs toegeschreven aan non-targeted effecten zoals het bystander effect bij lage dosissen, waarbij niet alleen in de bestraalde maar ook in de naburige niet bestraalde ‘bystander’ cellen DNA schade optreedt [11,12,48,49]. Aangezien stralingsgeïnduceerde bystander effecten aldus de DNA schade zouden kunnen verhogen, is het mogelijk dat het LNT model de kankerrisico’s bij lage dosis blootstelling onderschat. Naast de globale in vivo dosis-respons curve van alle individuele patiënten, werd in deze masterproef ook een vergelijking gemaakt tussen de in vivo dosis-respons curves van een CT- 42 - scanner generatie 2005 en een CT-scanner generatie 2010 (zie figuur 3.2). In tabel 3.2 worden de resultaten van de MWU test weergegeven, waarmee de significantie van het verschil in zowel het geïnduceerd aantal γ-H2AX foci als het verschil in DLP-waarden tussen beide CTscanners werd geëvalueerd. Deze resultaten wijzen erop dat de geobserveerde reductie in de DLP-waarde terug te vinden is in het effect, namelijk een significant lager geïnduceerd aantal foci per cel. Thoracale onderzoeken uitgevoerd met de CT-scanner generatie 2010 geven aanleiding tot significant lagere DLP-waarden, wat zich uit in een significant lager geïnduceerd aantal foci en dus minder schade voor de patiënt. Deze conclusie moet echter genuanceerd worden, gezien het klein aantal patiënten dat een thoracaal CT-onderzoek op de CT-scanner generatie 2010 hebben ondergaan. Voor abdominale onderzoeken zijn de DLP-waarden niet significant verschillend tussen beide CT-scanners, wat wordt weerspiegeld in het feit dat ook het verschil in geïnduceerd aantal foci niet significant is. Een verklaring voor het feit dat het verschil tussen beide CT-scanners niet significant is voor de abdominale onderzoeken, is dat er bij het CT-toestel generatie 2005 toch ook een aantal onderzoeken zijn met een vrij lage DLP-waarde en overeenkomstig een laag geïnduceerd aantal foci. Een verband met het soort onderzoek werd niet gevonden. De DLP-waarde geeft dus een goede indicatie voor lage dosis effecten. De significante daling in geïndcueerd aantal foci wijst erop dat de dosisreductie van de nieuwe generatie CTscanners resulteert in een reductie in schade voor de patiënt. Als gevolg is het van groot belang dat er in de toekomst meer geïnvesteerd wordt in deze nieuwe dosisreducerende CTscanners. Besluit De lage dosis hypersensitiviteit geobserveerd bij kinderen in de interventionele cardiologie werd ook in deze masterproef bij volwassen patiënten die een contrast CT-onderzoek hebben ondergaan teruggevonden. De in vivo dosis-respons curves van beide studies hebben een gelijkaardig bifasisch verloop met een zeer sterke stijging in geïnduceerd aantal foci in het lage dosis gebied. Deze data stellen dus eveneens het LNT model in vraag en duiden erop dat er voorzichtig moet omgesprongen worden met het gebruik van ioniserende straling voor medische doeleinden. - 43 - 4.2 Kwantitatieve real-time PCR Uit de resultaten van het in vitro experiment kan één ding met zekerheid gesteld worden, namelijk dat in vitro bestraling van vol bloed met lage dosissen X-stralen de expressie van de targetgenen CDKN1A en GADD45A beïnvloedt. Er kunnen echter geen eenduidige besluiten getrokken worden met betrekking tot de relatie tussen de dosis of de tijd en het niveau van genexpressie. De curves van de dosis-respons en tijd-respons relatie weergegeven in figuur 3.5 en 3.6 hebben een complex, moeilijk te interpreteren patroon. Genexpressie studies zijn het doorgaans eens over de genen of genfamilies waarvan de expressie gemoduleerd wordt door bestraling in verschillende celtypes. Over de richting en de mate van deze transcriptionele modulatie bestaat echter geen eenduidig antwoord. Variabiliteit in de transcriptionele respons wordt ook voor de bestudeerde targetgenen GADD5A en CDKN1A geobserveerd door verschillende auteurs. De belangrijkste factoren verantwoordelijk voor deze kwantitatieve en kwalitatieve variabiliteit zijn verschillen in bestudeerd species, weefsel- en celtype en verschillen in experimentele condities (dosis, dosistempo, cultuurcondities, tijd). In een studie van Amundson et al. werd een gelijkaardig in vitro experiment uitgevoerd in humane myeloïde tumor cellen bestraald met gamma stralen met dosissen van 20 tot 500 mGy. Voor zowel GADD45A als CDKN1A werd een stijgende dosis-respons relatie gevonden. Bovendien verlopen de curves voor alle dosissen ook stijgend in functie van de tijd tot het moment van maximale genexpressie bereikt is, daarna dalen de curves opnieuw. Voor alle bestudeerde dosispunten (20-50-100-250-500 mGy) is het punt van maximale genexpressie bovendien gelijk (3 uur na bestraling voor beide genen) [50]. Vele van deze bevindingen worden niet teruggevonden in de resultaten van het in vitro qRTPCR experiment van deze masterproef. Wanneer we de grafiek beschouwen met de NRQ waarden herschaald naar de dosis, kan men met zekerheid zeggen dat de expressie van beide targetgenen inderdaad gemoduleerd wordt door in vitro bestraling met lage dosissen Xstralen. Indien bestraling geen effect zou hebben op de genexpressie, zouden alle curves horizontaal lopen bij een y-waarde van 1. Met betrekking tot de dosis-respons relatie kan geen eenduidig besluit geformuleerd worden. Voor GADD45A werd enkel een min of meer stijgende dosis-respons relatie gevonden voor de curves van 1, 2 en 3 uur. Voor CDKN1A kon dit enkel voor de curve van 2 uur geobserveerd worden. - 44 - Uit de grafiek met de NRQ waarden herschaald naar de tijd blijkt dat de modulatie van de genexpressie inderdaad pas na een bepaalde incubatietijd optreedt. Indien dit niet het geval zou zijn, zouden alle curves horizontaal lopen bij een y-waarde van 1. Het tijdstip van maximale genexpressie zou bepaald kunnen worden aan de hand van het tijdstip waarop de verschillende curves een maximum bereiken in deze grafiek of aan de hand van de curve die gelegen is bij de hoogste rescaled NRQ waarden in de grafiek met NRQ waarden herschaald naar de dosis. Voor beide genen bestudeerd in deze masterproef kon niet één punt bepaald worden waarbij de genexpressie maximaal is. Bovendien zou men tenminste verwachten dat de curves van de onbehandelde controlestalen (0 mGy) horizontaal zouden lopen bij een y-waarde van 1 in de grafiek van de NRQ waarden herschaald naar de tijd. Voor GADD45A loopt deze curve nog min of meer horizontaal, maar voor CDKN1A is dit helemaal niet het geval. Dit wijst er op dat het effect van de tijd mogelijks groter is dan het effect van de bestraling op de genexpressie. Incubatie van het controlestaal bij 37°C zonder bijkomende behandeling gaf immers ook reeds aanleiding tot een verandering in genexpressie, waardoor het effect van de bestraling zeer moeilijk te bepalen is. Aangezien het tijdstip van bestraling niet voor alle stalen (0,1,2,3,4 uur incubatie) binnen een bepaalde dosisgroep gelijk was, zou dit dus ook een mogelijke invloed kunnen hebben op de genexpressie. Een poging om deze variatie te reduceren is poolen van het bloed. In plaats van na bloedafname het bloed onmiddellijk te verdelen in vijf buisjes overeenkomstig de bestudeerde tijdspunten en deze buisjes afzonderlijk te bestralen, kan men één bloedstaal bestralen en vervolgens het bloed uitverdelen om dit verschil in tijd te vermijden. Ook andere artikels beschrijven zeer complexe relaties tussen de tijd en de expressie en tussen de dosis en de expressie. In humane huidbiopsies bestraald met lage dosissen ioniserende straling (10-100-1000 mGy) werd de expressie van onder andere GADD45A en CDKN1A onderzocht na 1, 4 en 24 uur met behulp van real-time PCR. Ook hier werd geen lineaire dosisrespons relatie voor expressie veranderingen van GADD45A en CDKN1A gevonden [51]. Hier werd ook reeds benadrukt dat de tijd een kritische parameter is bij de interpretatie van genexpressie resultaten. Een klein verschil in tijd tussen bestraling van de verschillende stalen kan aanleiding geven tot grote verschillen in expressie van niet alleen de targetgenen zelf maar ook van de referentiegenen. Verschil in expressie van de referentiegenen gebruikt voor normalisatie heeft uiteraard ook een grote invloed op de interpretatie van de resultaten. Kwantitatieve in vitro RT-PCR experimenten kunnen dus leiden tot belangrijke inzichten op cellu- - 45 - lair en moleculair niveau maar met de interpretatie van de resultaten moet voorzichtig omgesprongen worden omwille van de extreme gevoeligheid van deze techniek. Besluit Opdat er duidelijke conclusies getrokken zouden kunnen worden uit de resultaten van een dergelijk in vitro experiment, moet de variatie tussen de verschillende stalen zoveel mogelijk gereduceerd of vermeden worden. Een mogelijkheid om variatie in tijd te reduceren werd reeds vermeld. Naast de tijd zijn er echter nog een groot aantal (oncontroleerbare) factoren die de interpretatie van de resultaten bemoeilijken. De ideale oplossing zou een in vivo experiment zijn, waarbij bloed van een vrijwilliger vóór (0 mGy) en 1, 2, 3 en 4 uur na bestraling wordt afgenomen. Aan de hand van de resultaten van dergelijk in vivo experiment zou men de beoogde optimalisatie voor het qRT-PCR luik van de multicentrische studie bij kinderen kunnen voltooien. In deze multicentrische studie zal via in vivo onderzoek naar de genexpressie van GADD45A, CDKN1A en andere stralingsgevoelige genen bij kinderen getracht worden de moleculaire basis van de lage dosis hypersensitiviteit te achterhalen. - 46 - Algemeen besluit Het LNT model wordt algemeen beschouwd als de gouden standaard voor evaluatie van kankerrisico’s na blootstelling aan lage dosissen ioniserende straling. De validiteit van dit model wordt echter in vraag gesteld door de resultaten van de huidige studie bij volwassen patiënten die een contrast CT-onderzoek hebben ondergaan. De dosis-respons curve gebaseerd op scoring van γ-H2AX foci in perifere bloedlymfocyten is immers niet lineair, maar heeft een bifasisch verloop met hypersensitiviteit in het lage dosis gebied. Dit zou erop kunnen wijzen dat het LNT model de risico’s op stralingsgeïnduceerde kanker onderschat. Hieruit blijkt duidelijk het belang van deze studie. Ondanks het veelvuldig gebruik van lage dosissen ioniserende straling voor medische toepassingen, bestaat er immers nog geen consensus omtrent de risico’s op stralingsgeïnduceerde kanker in dit dosisgebied. Verder onderzoek naar deze problematiek is dus een noodzaak. Bovendien duiden deze resultaten ook op het belang van dosisreductie en rechtvaardiging van CT-onderzoeken. Al te dikwijls worden er immers onnodige CT-scans uitgevoerd terwijl er alternatieven voorhanden zijn die gepaard gaan met een veel lagere dosis aan ioniserende straling (radiografie) of helemaal geen ioniserende straling (MRI, ultrasonografie). In dit kader is het ook van groot belang dat radiologen er zich van bewust worden dat CT-onderzoeken gepaard gaan met hogere dosissen ioniserende straling en daarmee gepaard gaande hogere kankerrisico’s in vergelijking met andere radiologische procedures. - 47 - Referentielijst 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 www.sckcen.be Fayngersh, V, Passero M (2009). Estimating radiation risk from computed tomography scanning. Lung 187 (3): 143-148. Voress M (2007). The increasing use of CT and its risks. Radiologic technology 79 (2): 186-190. Brenner DJ, Doll R, Goodhead DT (2003). Cancer risks attributable to low doses of ionizing radiation: assessing what we really know. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America 100 (24): 13761-13766. Brenner DJ, Hall EJ (2007). Computed tomography – an increasing source of radiation exposure. The New England journal of medicine 357: 2277-2284. Bacher K (2010). Medische beeldvorming. Gent: Universiteit Gent. Webb S (1988). The physics of medical imaging. Third edition. New York: Taylor & Francis Group. Kalra MK, Maher MM, Toth TL, Hamberg LM, Blake MA, Shepard JA, Saini S (2004). Strategies for CT radiation dose optimization. Radiology 230 (3): 619-628. Rothkamm K, Lobrich M (2003). Evidence for a lack of DNA DSB repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America 100 (9): 5057-5062. Matsumoto H, Takahashi A, Ohnishi T (2004). Radiation-induced adaptive responses and bystander effects. Biological sciences in space 18 (4): 247-254. Beels L, Bacher K, De Wolf D, Werbrouck J, Thierens H (2009). Gamma-H2AX foci as a biomarker for patient x-ray exposure in pediatric cardiac catheterization: are we underestimating radiation risks? Circulation 120 (19): 1903-1909. Ojima M, Ban N, Kai M (2008). DNA double-strand breaks induced by very low X-ray doses are largely due to bystander effects. Radiation research 170 (3): 365-371. Nuta O, Darroudi F (2008). The impact of the bystander effect on the low-dose hypersensitivity phenomenon. Radiation and environmental biophysics 47 (2): 265-274. Rothkamm K, Balroop S, Shekhdar J, Fernie P, Goh V (2007). Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: A quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology 242 (1): 244-251. Leonard A, Rueff J, Gerber GB, Léonard ED (2005). Usefulness and limits of biological dosimetry based on cytogenetic methods. Radiation protection dosimetry 115 (1-4): 448-454. Kobayashi J, Tauchi H, Chen B, Bruma S, Tashiro S, Matsuura S, Tanimoto K, Chen DJ, Komatsu K (2009). Histone H2AX participates the DNA damage-induced ATM activation through interaction with NBS1. Biochemical and biophysical research Communications 380 (4): 752-757. Kuo LJ, Yang LX (2008). Gamma-H2AX – a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo 22 (3): 305-309. Rogakou EP, Pilch DR, Orr AH, Ivanova VS, Bonner WM (1998). DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of biological chemistry 273 (10): 5858-5868. Stucki M, Jackson SP (2006). γH2AX and MDC1: anchoring the DNA-damage-response machinery to broken chromosomes. DNA repair 5 (5): 534-543. Fernandez-Capetillo O, Celeste A, Nussenzweig A (2003). Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors. Cell cycle 2 (5): 426-427. FitzGerald JE, Grenon M, Lowndes NF (2009). 53BP1: function and mechanisms of focal recruitment. Biochemical society transactions 37 (4): 897-904. Su TT (2006). Cellular responses tot DNA damage: one signal, multiple choices. Annual reviews of genetics 40: 178-208. Suzuki K, Okada H, Yamauchi M, Oka Y, Kodama S, Watanabe M (2006). Qualitative and quantitative analysis of phosphorylated ATM foci induced by low-dose ionizing radiation. Radiation research 165 (5): 499-504. Marchetti F, Coleman MA, Jones IM, Wyrobek AJ (2006). Candidate protein biodosimeters of human exposure to ionizing radiation. International journal of radiation biology 82 (9): 605-639. Amundson SA, Fornace AJ (2001). Gene expression profiles for monitoring radiation exposure. Radiation protection dosimetry 97 (1): 11-16. Chaudhry MA (2008). Biomarkers for human radiation exposure. Journal of biomedical science 15 (5): 557563. - 48 - 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 Paul S, Amundson SA (2008). Development of gene expression signatures for practical radiation biodosimetry. International journal of radiation oncology, biology, physics 71 (4): 1236-1244. Amundson SA, Bittner M, Meltzer P, Trent J, Fornace AJ (2001). Induction of gene expression as a monitor of exposure to ionizing radiation. Radiation research 156 (5): 657-661. Amundson SA, Do KT, Shahab S, Bittner M, Meltzer P, Trent J, Fornace AJ (2000). Identification of potential mRNA biomarkers in peripheral blood lymphocytes for human exposure to ionizing radiation. Radiation research 154 (3): 342-346. Fachin AL, Mello SS, Sandrin-Garcia P, Junta CM, Ghilardi-Netto T, Donadi EA, Passos GA, SakamotoHojo ET (2009). Gene expression profiles in radiation workers occupationally exposed to ionizing radiation. Journal of radiation research 50 (1): 61-71. Ghandhi SA, Yaghoubian B, Amundson SA (2008). Global gene expression analyses of bystander and alpha particle irradiated normal human lung fibroblasts: synchronous and differential responses. BMC medical genomics 1: 63. Ding LH, Shingyoji M, Chen F, Hwang JJ, Burma S, Lee C, Cheng JF, Chen DJ (2005). Gene expression profiles of normal human fibroblasts after exposure to ionizing radiation: a comparative study of low and high doses. Radiation research 164 (1): 17-26. Nuta O, Darroudi F (2008). The impact of the bystander effect on the low-dose hypersensitivity phenomenon. Radiation and environmental biophysics 47: 265–274. www.invitrogen.com www.biogazelle.com Fei P, El-Deiry WS (2003). P53 and radiation responses. Oncogene 22: 5774–5783. Snyder AR, Morgan WF (2004). Gene expression profiling after irradiation: clues to understanding acute and persistent responses. Cancer metastasis reviews 23 (3-4): 259-268. Chaudry MA (2006). Bystander effect: biological endpoints and microarray analysis. Mutation research 597: 98-112. Logan J, Edwards K, Saunders N (2009). Real-time PCR: Current technology and applications. United Kingdom: Caister Academic Press. Marullo M, Zuccato C, Mariotti C, Lahiri N, Tabrizi SJ, Di Donato S, Cattaneo E (2010). Expressed Alu repeats as a novel, reliable tool for normalization of real-time quantitative RT-PCR data. Genome biology 11. Arenz A, Stojicic N, Lau P, Hellweg CE, Baumstark-Khan C (2007). Suitability of commonly used housekeeping genes in gene expression studies for space radiation research. Advances in space research 39:10501055. medgen.ugent.be/rtprimerdb/ genome.ucsc.edu/ Kramer R, Zankl M, WilliamsG, Drexler G (1986). The calculation of dose from external photon exposures using reference human phantoms and Monte Carlo Methods, Part I. München: Institut für Strahlenschutz. Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F (2002). Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome biology 3 (7): 1-11. Wilson IG (1997). Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Applied and environmental microbiology 10: 3741-3751. Löbrich M, Rief N, Kühne M, Heckmann M, Fleckenstein J, Rübe C, Uder M (2005). In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proceedings of the national academy of sciences 25: 8984-8989. Hu B, Han W, Wu L, Feng H, Liu X, Zhang L, Xu A, Hei TK, Yu Z (2005). In situ visualization of DSBs to assess the extranuclear/extracellular effects induced by low-dose α-particle irradiation. Radiation research 164: 286–291. Beels L, Werbrouck J, Thierens H (2010). Dose response and repair kinetics of γ-H2AX foci induced by in vitro irradiation of whole blood and T-lymphocytes with X- and γ-radiation. International journal of radiation biology [in press]. Amundson SA, Do KT, Fornace AJ Jr (1999). Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiation research 152 (3): 225-231. Goldberg Z, Schwietert CW, Lehnert B, Stern R, Nami I (2004). Effects of low-dose ionizing radiation on gene expression in human skin biopsies. International journal of radiation oncology, biology physics 58 (2): 567-574. - 49 - Bijlagen I Bijlage A Resultaten γ-H2AX foci scoring A.1 Data voor de in vivo dosis-respons curve CT-scanner generatie 2005 Nr. Geslacht Onderzoekscategorie DLP (mGycm) ETBD (mGy) # foci voor SD SEM # foci na SD SEM Delta foci SE CT1 v abdomen 986,90 9,41 0,95 0,18 0,11 1,25 0,21 0,12 0,30 0,16 CT2 m thorax 438,00 3,95 0,96 0,17 0,11 1,79 0,25 0,16 0,83 0,19 CT3 m abdomen 1388,40 12,51 1,06 0,19 0,12 1,91 0,26 0,13 0,85 0,18 CT4 v thorax 1172,50 11,17 1,11 0,19 0,11 2,45 0,25 0,13 1,34 0,17 CT5 m abdomen 513,80 4,63 0,18 0,08 0,04 1,51 0,24 0,12 1,33 0,13 CT6 m thorax 1819,80 16,39 0,93 0,19 0,1 1,72 0,25 0,13 0,79 0,16 CT7 m abdomen 518,20 4,67 1,33 0,21 0,13 1,77 0,24 0,14 0,44 0,19 CT8 m thorax 2953,20 26,60 1,33 0,21 0,13 2,72 0,29 0,17 1,39 0,21 CT9 v abdomen 486,50 4,64 1,21 0,20 0,12 1,88 0,24 0,15 0,67 0,19 CT10 v abdomen 432,10 4,12 1,08 0,20 0,11 1,63 0,21 0,13 0,55 0,17 CT11 m abdomen 4338,50 39,08 0,73 0,14 0,09 2,59 0,30 0,17 1,86 0,19 CT12 v abdomen 558,90 5,33 0,52 0,13 0,09 1,01 0,18 0,12 0,49 0,15 CT13 m thorax 831,00 7,49 0,85 0,14 0,1 1,51 0,22 0,13 0,66 0,16 II CT14 m abdomen 3078,30 27,73 0,85 0,17 0,09 1,98 0,24 0,16 1,13 0,18 CT15 v abdomen 551,50 5,26 0,97 0,17 0,11 1,39 0,20 0,12 0,42 0,16 CT16 m abdomen 2141,80 19,29 0,94 0,16 0,09 1,91 0,25 0,16 0,97 0,18 CT17 m abdomen 1801,60 16,23 0,70 0,12 0,07 1,24 0,20 0,11 0,54 0,13 CT18 m abdomen 4468,90 40,26 0,62 0,12 0,08 1,86 0,22 0,13 1,24 0,15 CT19 m thorax 4248,80 38,28 0,89 0,15 0,1 1,97 0,23 0,13 1,08 0,16 CT20 v abdomen 933,30 8,89 1,00 0,18 0,11 1,07 0,18 0,1 0,07 0,15 CT21 v thorax 398,80 3,80 0,67 0,12 0,07 1,64 0,23 0,11 0,97 0,13 CT22 v abdomen 1742,80 16,61 0,76 0,16 0,09 1,23 0,20 0,12 0,47 0,15 CT23 v thorax 1101,90 10,50 0,66 0,15 0,09 1,33 0,22 0,12 0,67 0,15 CT24 v abdomen 855,00 8,15 0,45 0,13 0,08 0,41 0,12 0,08 -0,04 0,11 CT25 v abdomen 477,00 4,55 1,04 0,19 0,09 1,02 0,15 0,1 -0,02 0,13 CT26 m abdomen 1335,80 12,03 0,66 0,15 0,09 0,76 0,16 0,08 0,10 0,12 CT27 m thorax 3073,60 27,69 0,23 0,09 0,06 1,19 0,19 0,11 0,96 0,13 CT28 v abdomen 945,30 9,01 0,26 0,10 0,05 0,45 0,12 0,07 0,19 0,09 CT29 v abdomen 3298,90 31,44 0,72 0,16 0,1 1,53 0,24 0,13 0,81 0,16 CT30 m thorax 4574,40 41,21 0,18 0,05 0,03 1,50 0,24 0,11 1,32 0,11 CT31 m thorax 3640,20 32,79 0,35 0,11 0,07 1,35 0,20 0,13 1,00 0,15 CT32 m thorax 613,90 5,53 1,23 0,22 0,14 1,24 0,13 0,1 0,01 0,17 CT33 v thorax 2599,00 24,77 0,22 0,07 0,05 1,45 0,20 0,12 1,23 0,13 CT34 m abdomen 569,40 5,13 0,51 0,09 0,08 1,35 0,16 0,13 0,84 0,15 CT35 m thorax 394,20 3,55 0,43 0,09 0,06 0,73 0,12 0,08 0,3 0,10 III CT-scanner generatie 2010 Nr. Geslacht Onderzoekscategorie DLP (mGycm) TBDE (mGy) # foci voor SD SEM # foci na SD SEM Delta foci SE CT36 v abdomen 182,00 1,73 0,12 0,06 0,04 0,28 0,08 0,06 0,16 0,07 CT37 m abdomen 221,00 1,99 0,5 0,09 0,07 1,22 0,14 0,12 0,72 0,14 CT38 v abdomen 340,00 3,24 0,76 0,12 0,09 1,03 0,13 0,1 0,27 0,13 CT39 v abdomen 661,00 6,30 0,36 0,08 0,06 0,73 0,12 0,08 0,37 0,10 CT40 m thorax 767,00 6,91 0,62 0,1 0,07 1,55 0,16 0,13 0,93 0,15 CT41 v abdomen 660,00 6,29 0,88 0,12 0,1 1,18 0,14 0,11 0,3 0,15 CT42 v abdomen 735,00 7,00 0,49 0,08 0,06 1,12 0,14 0,09 0,63 0,11 CT43 m abdomen 254,00 2,29 0,98 0,13 0,09 1,01 0,13 0,09 0,03 0,13 CT44 v abdomen 1123,00 10,70 0,43 0,08 0,06 1,03 0,13 0,09 0,6 0,11 CT45 v abdomen 579,00 5,52 0,27 0,07 0,05 1,65 0,19 0,14 1,38 0,15 CT46 v abdomen 496,00 4,73 0,51 0,09 0,07 0,89 0,12 0,08 0,38 0,11 CT47 m abdomen 946,00 8,52 0,25 0,06 0,04 0,43 0,09 0,06 0,18 0,07 CT48 v abdomen 703,00 6,70 0,37 0,08 0,06 0,51 0,09 0,07 0,14 0,09 CT49 m thorax 2060,00 18,56 0,2 0,06 0,07 0,38 0,08 0,06 0,18 0,09 CT50 v abdomen 597,00 5,69 0,32 0,07 0,05 0,48 0,08 0,06 0,16 0,08 CT51 m abdomen 1066,00 9,60 0,31 0,07 0,05 0,73 0,11 0,08 0,42 0,09 CT52 m abdomen 1448,00 13,04 0,24 0,06 0,05 0,42 0,08 0,06 0,18 0,08 CT53 m thorax 348,00 3,13 0,16 0,05 0,03 0,21 0,06 0,04 0,05 0,05 CT54 m thorax 254,00 2,29 0,09 0,04 0,02 0,18 0,05 0,04 0,09 0,04 CT55 m thorax 169,00 1,52 0,19 0,05 0,04 0,28 0,07 0,05 0,09 0,06 CT56 m abdomen 1183,00 10,66 1,14 0,14 0,11 1,89 0,17 0,13 0,75 0,17 IV CT57 m abdomen 1566,00 14,11 1,37 0,18 0,12 1,74 0,2 0,15 0,37 0,19 CT58 m abdomen 1248,00 11,24 0,28 0,07 0,04 0,47 0,09 0,06 0,19 0,07 CT59 v abdomen 1727,00 16,46 0,71 0,11 0,08 1,24 0,14 0,1 0,53 0,13 CT60 m abdomen 1175,00 10,59 0,86 0,12 0,11 0,43 0,08 0,07 -0,43 0,13 CT61 v abdomen 465,00 4,43 0,78 0,11 0,09 1,02 0,13 0,1 0,24 0,13 V Bijlage B Resultaten qRT-PCR experimenten B.1 Standaardcurves voor de target- en referentiegenen HMBS helling: -3.5 efficiëntie: 92.4% B2M helling: -3.3 efficiëntie: 99.1% VI GAPDH helling: -3,43 efficiëntie: 95,85% Alu helling: -3,31 efficiëntie: 100,5% GADD45A helling: -3.6 efficiëntie: 88.8% CDKN1A helling: -3.5 efficiëntie: 94.3% VII B.2 Data van de referentiegenen Staal Cq HMBS gemiddelde Cq 21,932 RQ Cq 0,811103015 17.16 B2M gemiddelde Cq 17,159 RQ Cq 0,708413852 14,96 0 mGy_0 u 21,83 0 mGy_0 u 21,70 17,26 15,26 0 mGy_0 u 22,26 17,06 15,45 0 mGy_1 u 22.39 0 mGy_1 u 22,42 15,93 14,46 0 mGy_1 u 22,36 15,98 14,11 0 mGy_2 u 21,00 0 mGy_2 u 21.31 16,20 15,02 0 mGy_2 u 21,63 16,42 14,62 0 mGy_3 u 21,38 0 mGy_3 u 21.38 16,15 13,50 0 mGy_3 u 21,37 16,31 13,47 0 mGy_4 u 20,67 0 mGy_4 u 21,14 16,54 15,40 0 mGy_4 u 21,46 17,46 15.24 50 mGy_0 u 21,77 50 mGy_0 u 21,84 22,389 21,313 21,376 21,089 21,690 0,601354393 1,216569304 1,167111867 1,408070255 0,95002987 15.95 15,953 16,17 16,263 15,97 16,146 17,27 17,092 16,01 16,116 16,31 1,625987673 1,313442802 1,423699598 0,742103374 1,453079761 14,96 14,16 13,95 15,10 14,50 14,34 VIII Alu gemiddelde Cq 15,222 0,566470385 14,507 0,931320456 14,600 0,873477454 13,640 1,702620136 15,247 0,556713022 14,280 1,091298057 RQ 50 mGy_0 u 21,46 16,03 50 mGy_1 u 22,59 50 mGy_1 u 22.64 16,73 14,03 50 mGy_1 u 22,67 16,05 14,42 50 mGy_2 u 21,36 50 mGy_2 u 21,65 16,53 14,17 50 mGy_2 u 21,52 16,45 13,95 50 mGy_3 u 22,34 50 mGy_3 u 21,85 17,22 14,37 50 mGy_3 u 22,41 17,32 14,43 50 mGy_4 u 20,28 50 mGy_4 u 19,95 15,99 13,41 50 mGy_4 u 20,62 16,10 13,15 100 mGy_0 u 21,55 100 mGy_0 u 21,38 16,84 14,68 100 mGy_0 u 20,55 17,25 14,77 100 mGy_1 u 22,17 100 mGy_1 u 20,82 16,48 14,18 100 mGy_1 u 21,39 16,50 14,37 100 mGy_2 u 21,03 22,632 21,510 22,200 20,285 21,163 21,461 21,136 0,513054512 1,06884487 0,680501537 2,383129632 1,341690686 1,103695668 1,365560024 14,00 16,72 16,498 16,69 16,561 17,18 17,240 15,85 15,979 16,90 16,998 16,32 16,433 16,31 16,457 IX 1,117129619 1,069768783 0,670154927 1,596577084 0,791582277 1,168206424 1,149266982 14,51 14,15 14,50 13,58 14,93 14,30 13.88 14,323 1,059054952 14,090 1,24499939 14,433 0,980767929 13,378 2,0426148 14,794 0,762749342 14,284 1,088004554 13,887 1,433464123 100 mGy_2 u 21,24 16,31 13,81 100 mGy_2 u 21.14 16,75 13,97 100 mGy_3 u 21,81 100 mGy_3 u 22,11 16,75 13,98 100 mGy_3 u 21,70 17,16 14,30 100 mGy_4 u 23,14 100 mGy_4 u 22,34 17,99 15,28 100 mGy_4 u 20,91 17,98 15,14 Referentie Cq 21,873 22,131 0,84277365 0,712203529 17,15 17,020 17,92 17,966 21,612 16,659 X 0,779722854 0,406328121 14,30 15,17 14,194 1,157875636 15,197 0,576604143 14,405 B.3 NRQ waarden van de targetgenen herschaald naar de dosis CDKN1A Staal Cq Gemiddelde Cq RQ NF HMBS-B2M-Alu NRQ HMBS-B2M-Alu rescaled NRQ HMBS-B2M-Alu 0 mGy_0 u 24.21 24,208 0,226517245 0,687881173 0,329297056 1 0 mGy_0 u 24,16 0 mGy_0 u 24,25 0 mGy_1 u 22.62 22,254 0,829939274 0,969279348 0,856243637 1 0 mGy_1 u 22,39 0 mGy_1 u 22,11 0 mGy_2 u 21,77 21,713 1,188425885 1,117548996 1,063421728 1 0 mGy_2 u 21,66 0 mGy_2 u 21.71 0 mGy_3 u 21,88 21,765 1,148427912 1,41432604 0,811996583 1 0 mGy_3 u 21,79 0 mGy_3 u 21,62 0 mGy_4 u 22,75 22,724 0,607241705 0,834782566 0,727424997 1 0 mGy_4 u 22,99 0 mGy_4 u 22,44 XI 50 mGy_0 u 21,46 50 mGy_0 u 21,52 50 mGy_0 u 21,17 50 mGy_1 u 21,91 50 mGy_1 u 21,81 50 mGy_1 u 21,65 50 mGy_2 u 21,26 50 mGy_2 u 20,99 50 mGy_2 u 20,90 50 mGy_3 u 21,27 50 mGy_3 u 21,05 50 mGy_3 u 20,85 50 mGy_4 u 21,61 50 mGy_4 u 21,50 50 mGy_4 u 21,41 100 mGy_0 u 22,28 100 mGy_0 u 21,91 100 mGy_0 u 21,71 100 mGy_1 u 21,78 100 mGy_1 u 21,79 100 mGy_1 u 21,62 21,383 1,4796829 1,146366181 1,290759379 3,919741634 21,791 1,128448993 0,846697981 1,332764478 1,556524827 21,053 1,842798367 1,124927617 1,638148392 1,540450368 21,058 1,836455072 0,764757117 2,401357283 2,957349 21,507 1,362922145 1,98080327 0,688065375 0,94589185 21,968 1,003511547 0,932202156 1,076495631 3,269071533 21,728 1,176427645 1,119437575 1,050909556 1,227348748 XII 100 mGy_2 u 20.58 100 mGy_2 u 20,56 100 mGy_2 u 20,58 100 mGy_3 u 21,67 100 mGy_3 u 21,51 100 mGy_3 u 21,37 100 mGy_4 u 24,46 100 mGy_4 u 23,57 100 mGy_4 u 25,03 20,573 2,534323242 1,310306365 1,934145562 1,818794474 21,517 1,353924688 0,912930485 1,483053431 1,826428167 24,353 0,205726912 0,550536672 0,373684302 0,51370836 21,973 Referentie Cq GADD45A Staal Cq Gemiddelde Cq RQ NF HMBS-B2M-Alu NRQ HMBS-B2M-Alu rescaled NRQ HMBS-B2M-Alu 0 mGy_0 u 28,63 28,562 0,856819106 0,687881173 1,245591737 1 0 mGy_0 u 28,46 0 mGy_0 u 28,59 0 mGy_1 u 29,28 28,696 0,786611094 0,969279348 0,811542199 1 0 mGy_1 u 28,66 0 mGy_1 u 28,14 XIII 0 mGy_2 u 29,33 0 mGy_2 u 28,88 0 mGy_2 u 28,87 0 mGy_3 u 29,17 0 mGy_3 u 28,96 0 mGy_3 u 28,38 0 mGy_4 u 28,99 0 mGy_4 u 28,62 0 mGy_4 u 28,29 50 mGy_0 u 28,46 50 mGy_0 u 28,16 50 mGy_0 u 27,89 50 mGy_1 u 28,78 50 mGy_1 u 28,45 50 mGy_1 u 28.62 50 mGy_2 u 28,70 50 mGy_2 u 28,42 50 mGy_2 u 28,02 50 mGy_3 u 28,86 50 mGy_3 u 28,43 50 mGy_3 u 28,16 29,027 0,637354336 1,117548996 0,570314445 1 28,836 0,719517761 1,41432604 0,508735426 1 28,631 0,819659188 0,834782566 0,981883453 1 28,170 1,099224409 1,146366181 0,958877214 0,769816614 28,618 0,826471157 0,846697981 0,976110933 1,202785184 28,381 0,961146598 1,124927617 0,854407504 1,498134076 28,481 0,902127178 0,764757117 1,179625738 2,318741093 XIV 50 mGy_4 u 28,64 50 mGy_4 u 28,37 50 mGy_4 u 27,96 100 mGy_0 u 28,59 100 mGy_0 u 28,36 100 mGy_0 u 27,97 100 mGy_1 u 27,79 100 mGy_1 u 27,77 100 mGy_1 u 27,44 100 mGy_2 u 27,80 100 mGy_2 u 27,70 100 mGy_2 u 27,22 100 mGy_3 u 27,74 100 mGy_3 u 27,37 100 mGy_3 u 27,60 100 mGy_4 u 27,82 100 mGy_4 u 27,96 100 mGy_4 u 28,03 Referentie Cq 28,325 0,996140519 1,98080327 0,502897251 0,512176113 28,305 1,00852019 0,932202156 1,081868546 0,868557902 27,666 1,513807783 1,119437575 1,352293166 1,666325136 27,572 1,607143722 1,310306365 1,226540422 2,150638884 27,571 1,607947192 0,912930485 1,76130299 3,462119796 27,936 1,275032093 0,550536672 2,315980312 2,358712029 28,318 XV B.4 NRQ waarden van de targetgenen herschaald naar de tijd CDKN1A Staal Cq Gemiddelde Cq RQ NF HMBS-B2M-Alu NRQ HMBS-B2M-Alu rescaled NRQ HMBS-B2M-Alu 0 mGy_0 u 24.21 24,208 0,226517245 0,687881173 0,329297056 1 0 mGy_0 u 24,16 0 mGy_0 u 24,25 0 mGy_1 u 22.26 22,254 0,829939274 0,969279348 0,856243637 2,600216496 0 mGy_1 u 22,39 0 mGy_1 u 22,11 0 mGy_2 u 21,77 21,713 1,188425885 1,117548996 1,063421728 3,229369074 0 mGy_2 u 21,66 0 mGy_2 u 21.71 0 mGy_3 u 21,88 21,765 1,148427912 1,41432604 0,811996583 2,465848294 0 mGy_3 u 21,79 0 mGy_3 u 21,62 0 mGy_4 u 22,75 22,724 0,607241705 0,834782566 0,727424997 2,209023688 0 mGy_4 u 22,99 0 mGy_4 u 22,44 XVI 50 mGy_0 u 21,46 50 mGy_0 u 21,52 50 mGy_0 u 21,17 50 mGy_1 u 21,91 50 mGy_1 u 21,81 50 mGy_1 u 21,65 50 mGy_2 u 21,26 50 mGy_2 u 20,99 50 mGy_2 u 20,90 50 mGy_3 u 21,27 50 mGy_3 u 21,05 50 mGy_3 u 20,85 50 mGy_4 u 21,61 50 mGy_4 u 21,50 50 mGy_4 u 21,41 100 mGy_0 u 22,28 100 mGy_0 u 21,91 100 mGy_0 u 21,71 100 mGy_1 u 21,78 100 mGy_1 u 21,79 100 mGy_1 u 21,62 21,383 1,4796829 1,146366181 1,290759379 1 21,791 1,128448993 0,846697981 1,332764478 1,032542935 21,053 1,842798367 1,124927617 1,638148392 1,269135377 21,058 1,836455072 0,764757117 2,401357283 1,860422106 21,507 1,362922145 1,98080327 0,688065375 0,533070212 21,968 1,003511547 0,932202156 1,076495631 1 21,728 1,176427645 1,119437575 1,050909556 0,976232068 XVII 100 mGy_2 u 20,58 100 mGy_2 u 20,56 100 mGy_2 u 20,58 100 mGy_3 u 21,67 100 mGy_3 u 21,51 100 mGy_3 u 21,37 100 mGy_4 u 24,46 100 mGy_4 u 23,57 100 mGy_4 u 25,03 20,573 2,534323242 1,310306365 1,934145562 1,796705446 21,517 1,353924688 0,912930485 1,483053431 1,37766786 24,353 0,205726912 0,550536672 0,373684302 0,347130347 21,973 Referentie Cq GADD45A Staal Cq Gemiddelde Cq RQ NF HMBS-B2M-Alu NRQ HMBS-B2M-Alu rescaled NRQ HMBS-B2M-Alu 0 mGy_0 u 28,63 28,562 0,856819106 0,687881173 1,245591737 1 0 mGy_0 u 28,46 0 mGy_0 u 28,59 0 mGy_1 u 29,28 28,696 0,786611094 0,969279348 0,811542199 0,651531457 0 mGy_1 u 28,66 0 mGy_1 u 28,14 XVIII 0 mGy_2 u 29,33 0 mGy_2 u 28,88 0 mGy_2 u 28,87 0 mGy_3 u 29,17 0 mGy_3 u 28,96 0 mGy_3 u 28,38 0 mGy_4 u 28,99 0 mGy_4 u 28,62 0 mGy_4 u 28,29 50 mGy_0 u 28,46 50 mGy_0 u 28,16 50 mGy_0 u 27,89 50 mGy_1 u 28,78 50 mGy_1 u 28,45 50 mGy_1 u 28,62 50 mGy_2 u 28,70 50 mGy_2 u 28,42 50 mGy_2 u 28,02 50 mGy_3 u 28,86 50 mGy_3 u 28,43 50 mGy_3 u 28,16 29,027 0,637354336 1,117548996 0,570314445 0,457866272 28,836 0,719517761 1,41432604 0,508735426 0,40842871 28,631 0,819659188 0,834782566 0,981883453 0,788286743 28,170 1,099224409 1,146366181 0,958877214 1 28,618 0,826471157 0,846697981 0,976110933 1,017972812 28,381 0,961146598 1,124927617 0,854407504 0,891049962 28,481 0,902127178 0,764757117 1,179625738 1,230215633 XIX 50 mGy_4 u 28,64 50 mGy_4 u 28,37 50 mGy_4 u 27,96 100 mGy_0 u 28,59 100 mGy_0 u 28,36 100 mGy_0 u 27,97 100 mGy_1 u 27,79 100 mGy_1 u 27,77 100 mGy_1 u 27,44 100 mGy_2 u 27,80 100 mGy_2 u 27,70 100 mGy_2 u 27,22 100 mGy_3 u 27,74 100 mGy_3 u 27,37 100 mGy_3 u 27,60 100 mGy_4 u 27,82 100 mGy_4 u 27,96 100 mGy_4 u 28,03 Referentie Cq 28,325 0,996140519 1,98080327 0,502897251 0,524464701 28,305 1,00852019 0,932202156 1,081868546 1 27,666 1,513807783 1,119437575 1,352293166 1,249960701 27,572 1,607143722 1,310306365 1,226540422 1,13372408 27,571 1,607947192 0,912930485 1,76130299 1,628019408 27,936 1,275032093 0,550536672 2,315980312 2,140722476 28,318 XX
