Samenvatting

Samenvatting
Gewoonlijk worden de effecten van vrije radicalen in cellen geassocieerd met
ziekte en celdood. Dit ontstaat door een verkeerde balans tussen vrije
radicaalproductie enerzijds en de werking van anti-oxidanten anderzijds, en het
onvermogen om deze balans te herstellen.
Gedurende de differentiatie en rijping van gameten komen zowel eicellen als
spermacellen in contact met zuurstofradicalen en stikstofradicalen. De mate van
radicaal gemedieerde beschadiging van moleculen zal voor een deel bepalen
welke geslachtscellen als beste geselecteerd worden en daardoor de rijping
kunnen voltooien. Bovendien is aangetoond dat bepaalde radicaalconcentraties de
activiteit van diverse signaaltransductiepaden kunnen beïnvloeden. Deze
signaaltransductiepaden zijn betrokken bij de capacitatie van de zaadcel, de rijping
van de eicel en het gereedmaken van de eicel voor de bevruchting. Mede als
gevolg hiervan is de eicel na de bevruchting in staat het arrest van het metafase II
stadium van de meiose op te heffen.
In dit proefschrift worden allereerst methoden beschreven om schade in
spermacellen op te sporen, vervolgens worden studie’s beschreven waarin de
detectie van peroxidatie van moleculaire substraten wordt beschreven en de
effecten van oxidatieve stress op de bevruchtingscapaciteit van spermacellen en
op de vroeg-embryonale ontwikkeling.
In hoofdstuk 1 wordt een uitgebreid overzicht gegeven van de verschillende
aspecten van moleculaire oxidatie en de effecten hiervan op zoogdierreproductie.
Oxidatieve modificaties die optreden bij lipiden, eiwitten en DNA van zaadcellen
worden in dit hoofdstuk beschreven. Daarbij wordt speciale aandacht besteed aan
de mogelijke invloed van deze processen op de differentiatie en de rijping van
geslachtscellen.
In hoofdstuk 2 worden nieuwe technieken beschreven die gebruikt kunnen worden
om oxidatie van lipiden in de plasmamembranen van zaadcellen te detecteren. Het
gaat hierbij voornamelijk om oxidatie van cholesterol en van het fosfolipide,
fosfatidylcholine. De mate van oxidatie is bestudeerd zowel voor als na een invriesontdooi procedure. Invriezen en ontdooien ten behoeve van het cryopreserveren
van zaadcellen lijkt de oxidatieve schade aan fosfolipiden te versterken en kan
daardoor de bevruchtingscapaciteit van ontdooide zaadmonsters verminderen.
In hoofdstuk 3 worden andere technieken beschreven om de integriteit van
zaadcellen te bestuderen. De principes van bepalingen voor de integriteit van de
plasma membraan, de acrosoom en de mitochondriën alsmede van het DNA van
de zaadcel worden beschreven. De integriteit van het zaadcel DNA is van belang
Samenvatting
voor een normale ontwikkeling van het toekomstige embryo. Beschadigingen van
het DNA in de zaadcel kan resulteren in een remming of blokkering van de
embryonale ontwikkeling na de eerste klievingsdeling(en). Echter, de integriteit van
de mitochondria, de acrosoom en de plasmamembraan van zaadcellen is slechts
voorafgaand en tijdens de bevruchting van belang. De integriteit ervan is van
belang voor de binding aan de zona pellucida, de zona penetratie en de binding en
fusie aan de eicelplasmamembraan. Daarna worden deze structuren door de
bevruchte eicel afgebroken. Naast deze integriteitsbepalingen wordt in dit
hoofdstuk beschreven hoe de organisatie en de oxidatie van lipiden in de
plasmamembraan van zaadcellen kan worden geanalyseerd en gevolgd
gedurende de zaadcelcapacitatie en voor en na cryopreservering.
In dit proefschrift wordt de oxidatie van cholesterol in het plasmamembraan van de
spermacel in detail beschreven. De specifieke aandacht voor cholesterol komt
voort uit het gegeven dat dit molecuul enerzijds van belang is voor de stabilisatie
van membranen en anderzijds een belangrijke precursor is voor verschillende
steroïd-hormonen die betrokken zijn bij de rijping van gameten. Daarnaast is de
concentratie en laterale organisatie van cholesterol van belang bij de capacitatie
van zaadcellen en daarmee tevens in een optimale zaadcel-zona pellucida
interactie die cruciaal is voor de bevruchting van de eicel. In hoofdstuk 4 wordt
geconcludeerd dat oxidatie van cholesterol al heeft plaatsgevonden in
geëjaculeerd sperma, maar dat niveau’s van oxysterolen of oxidatieproducten van
cholesterol (COPs) gelijk bleven na invriezen-ontdooien van sperma. Dit is in
tegenstelling tot geoxideerde niveau’s van fosfatidylcholine. Als zaadcellen werden
blootgesteld aan pro-oxidanten namen de niveau’s van COPs significant toe, maar
de concentratie van de meest toxische COP (3,5,6-cholestaan-triol) bleef gelijk. Dit
suggereert dat de spermacellen oxysterolen kunnen metaboliseren maar om dit
hard te kunnen maken is nader onderzoek noodzakelijk.
De organisatie van membraanlipiden in zaadcellen kan veranderen na
cryopreservering van zaadmonsters of door incubatie van zaadmonsters met
oxidatieve stressoren. Deze veranderingen zouden de bevruchtingskans van een
eicel kunnen verminderen. Zowel cryopreservering als pro-oxidantia kunnen
tevens het zaadcel DNA beschadigen hetgeen de embryonale ontwikkeling kan
remmen/blokkeren. Daarom is onderzocht of en hoe pro-oxidanten de bevruchting
en de vroege embryonale ontwikkeling kunnen beïnvloeden. Hiervoor werden
zaadcellen blootgesteld aan pro-oxidanten voordat ze gebruikt werden voor in vitro
fertilisatie. De bevruchtingspercentages werden gescoord, de bevruchte eicellen
vervolgens in vitro gekweekt en de ontwikkeling van deze embryo’s vastgesteld tot
9 dagen na bevruchting. In hoofdstuk 5 werden spermacellen experimenteel
blootgesteld aan oxidatieve stress waarbij scenario’s nagebootst werden van
oxidatieve stress waaraan spermacellen worden blootgesteld in het mannelijk of
164
Samenvatting
vrouwelijk geslachtsapparaat, zowel onder fysiologische als pathologische
(ontsteking) omstandigheden. Er werd waargenomen dat blootstelling van
spermacellen aan pro-oxidanten het proces van bevruchting niet beïnvloedde. Er
werd echter een groter percentage blastocysten gevormd wanneer spermacellen
waren blootgesteld aan lagere concentraties van oxidanten, terwijl de embryonale
ontwikkeling tot blastocysten volledig geblokkeerd was op het twee-cellige stadium
wanneer spermacellen vóór bevruchting waren blootgesteld aan drie verschillende
oxidanten. Deze blokkade in embryonale ontwikkeling was geassocieerd met
abnormale celdeling, abnormaal functioneren van mitochondria en verhoging in de
oxidatie van lipiden. Op eerste gezicht zouden deze effecten verklaard kunnen
worden door de oxidatie van zaadcel DNA die er zorg voor draagt dat de
embryonale ontwikkeling na de eerste klieving gaat stoppen (na begin van de
expressie van het embryonale genoom dus post-fertilisatie). Echter experimenteel
kon er geen correlatie aangetoond worden tussen de mate van DNA oxidatie
(gedetecteerd met 8-oxoguanine) en de remming van de embryonale ontwikkeling.
De mate van lipiden-peroxidatie in zaadcellen correleerde daarentegen juist wel
met verslechterde embryonale ontwikkeling. Hoewel er geen verklaring voor deze
correlatie is suggereert dit resultaat dat de eicel een belangrijk herstelmechanisme
heeft om de oxidatieve schade die een spermacel heeft ondergaan teniet te doen
na de bevruchting.
Deze resultaten kunnen bruikbaar zijn voor de humane voortplantingsgeneeskunde
waarbij spermacellen van mannen met verminderde vruchtbaarheid gebruikt
kunnen worden in IVF klinieken. Nadat deze spermacellen blootgesteld zijn aan
een specifieke cocktail van anti-oxidanten kan door de vermindering van oxidatieve
schade mogelijk het succes van bevruchting, de hoeveelheid embryo’s, de kwaliteit
van de gevormde embryo’s en uiteindelijk de kans op een succesvolle
zwangerschap vergroot worden.
165