Microbes and Human Disease - bioplein.nl

Medische Microbiologie
Studietaak 1: De prokaryote cel:
H4 (Bacteria; archaebacteria niet)
Kom verder. Saxion.
Kom verder. Saxion.
Wat is medische microbiologie?
KLASSIEK:
•
•
Patiënt  arts  lichamelijk onderzoek  klinische diagnose
Monster-afname
–
–
•
Juiste monster (bloed, urine, pus, faeces, liquor)
Juiste afname, labeling, transport/opslag
Microscopisch onderzoek
–
•
gekleurd/ongekleurd (bijv. Gram-preparaat)
Kweek en reinkweek
–
–
–
•
op voedingsbodems
in voedingsmedia
identificatie m.b.v. biochemische en/of serologische testen
Gevoeligheid voor antibiotica
–
Diffusiemethoden, breekpunten/MIC
MOLECULAIR:
• Serologische diagnostiek: meting specifieke
antistoffen
• DNA-technologie
Kom verder. Saxion.
Prokaryoten
Eukaryoten
• Klein, < 2 µm
• 1 circulair
chromosoom
• Geen
kernmembraan
• Geen histonen
• Geen organellen
• Ribosomen 70S
• Peptidoglycaancelwand
• Binaire deling
• Groter, 2-20 µm
• Gepaarde
chromosomen
• Kernmembraan
• Histonen
• Organellen
• Ribosomen 80S (muv
mito: 70S)
• Evt. polysacharide
celwand
• Mitose
Kom verder. Saxion.
• Gemiddelde grootte: 0,2 –1,0 µm  2 8 µm
• Basisvormen: zie boek!
Kom verder. Saxion.
Geen leerstof
• Bijzondere vormen
– Stervormige Stella
– Rechthoekige Haloarcula
• Meeste bacteriesoorten zijn monomorf (één vorm)
• Sommigen zijn pleomorf (meerdere vormen)
Figure 4.5
Kom verder. Saxion.
Rangschikkingen
• Paren: diplococci,
diplobacilli
• Clusters:
staphylococci
• Ketens:
streptococci,
streptobacilli
Kom verder. Saxion.
Bouw van bacteriën
•
•
•
•
•
•
•
Celmembraan
Celwand
Flagellen/fimbriae/pili
Kernmateriaal
Endporen
Een of twee membranen
Slijmlaag/kapsel
Figure 4.6a, b
Kom verder. Saxion.
Celwand
• Voorkomt osmotische lysis
• Is bij bacteriën gemaakt van peptidoglycaan
Figure 4.6a, b
Kom verder. Saxion.
Peptidoglycaan
• Polymeer van een disacharide dat is opgebouwd uit
N-acetylglucosamine (NAG) en N-acetylmuraminezuur
(NAM)
• Verbonden door polypeptiden
Figure 4.13a
Kom verder. Saxion.
G+ celwand
• Dikke
peptidoglycaanlaag
• Teichoïnezuren
• Mycolinezuur*)
• Geen LPS
*):
Bij zuurvaste cellen
G- celwand
• Dunne
peptidoglycaanlaag
• Geen teichoïnezuren
• Buitenmembraan
• LPS (endotoxine)
Kom verder. Saxion.
Gram-positieve celwanden
• Teichoïnezuren:
– Lipoteichoïnezuur verbindt met plasmamembraan
– Wand-teichoïnezuur verbindt met peptidoglycaan
• Teichoïnezuren reguleren mogelijk de beweging van
kationen
• Polysachariden zorgen voor antigene variatie
Figure 4.13b
Kom verder. Saxion.
Gram-negatieve buitenmembraan
•
•
•
•
Lipopolysachariden (LPS), lipoproteïnen, fosfolipiden
Omsluit het periplasma
Beschermt tegen fagocyten, complement, antibiotica
LPS:
– Polysacharide-deel: antigeen; bv. onderscheiding van E. coli
O157:H7
– Lipo-deel: lipide A, is een endotoxine
• Porines (eiwitten) vormen kanalen door de membraan
Kom verder. Saxion.
Differentiatiekleuringen
• Onderscheid in bacteriën maken op basis van
kleuring (microscoop)
• Gram-kleuring en Ziehl-Neelsen-kleuring
(zuurvaste kleuring)
Deze komen uit
HOOFDSTUK 3!!
(laatste paar
pagina’s)
Kom verder. Saxion.
Mechanisme Gramkleuring
• Er vormen zich kristalviolet-jodium (KV-I) kristallen in
het cytoplasma
• Gram-positieve cel:
– Alcohol dehydrateert het peptidoglycaan
– KV-I kristallen blijven in de cel
• Gram-negatieve cel:
– Alcohol lost buitenmembraan op en maakt gaten in
peptidoglycaan
– KV-I wordt weggespoeld
Kom verder. Saxion.
Gram Stain
Primary stain:
Crystal violet
Mordant:
Iodine
Decolorizing agent:
Alcohol-acetone
Counterstain:
Safranin
Color of
Gram +
cells
Purple
Color of
Gram – cells
Purple
Purple
Purple
Colorless
Purple
Red
Purple
Kom verder. Saxion.
Zuurvaste kleuring (Ziehl-Neelsen)
• Cellen met mycolinezuur in hun celwand houden
kleuring vast bij behandeling met zure alcohol:
zuurvaste cellen
– Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, Nocardia, sommige
Corynebacteriën
• Niet-zuurvaste cellen verliezen de kleuring als ze
gespoeld worden met
zure alcohol en worden
meestal tegengekleurd
– Geassocieerde flora, ontstekingscellen
Figure 3.11
Kom verder. Saxion.
Speciale kleuringen
• Negatieve kleuring
bruikbaar voor kapsels
• Verhitting nodig om
endosporen te kunnen
kleuren
• Voor het kleuren van
flagellen is een fixatief
(mordant) nodig dat ze
dik genoeg maakt om
ze te kunnen zien
Figure 3.12a-c
Medische Microbiologie
Studietaak 1: De groei en het
kweken van micro-organismen
H6
Kom verder. Saxion.
Kom verder. Saxion.
Microbiële groei
• Groei: toename aantal cellen (niet celgrootte!)
• Benodigdheden/belangrijk:
–
–
–
–
–
Minimum, optimum, maximum kweektemperatuur
pH tussen 6,5 en 7,5 (m.u.v. alkalofiel, acidofiel)
Water (in lab: demiwater / milliQ)
Osmotische druk (m.n. bij halofiel, facultatief halofiel)
Koolstof, stikstof, zwavel, fosfor, spoorelementen,
groeifactoren
Kom verder. Saxion.
THE REQUIREMENTS
FOR GROWTH
PHYSICAL
REQUIREMENTS
Kom verder. Saxion.
TEMPERATURE
Kom verder. Saxion.
• Psychrotrofen:
– Groeien tussen 0°C en 20-30°C
– Veroorzaken voedselbederf
• Mesofielen:
– Optimum groeitemperatuur 25-40°C
– Meest voorkomende type, waaronder de meeste
pathogene - en voedselbedervende m.o.
– Micro-organismen die zich hebben aangepast aan
het leven in een dierlijke gastheer: optimum
temperatuur dichtbij die van gastheer
– Veel pathogene bacteriën: optimum temperatuur
37°C
Kom verder. Saxion.
• Hyperthermofielen:
–
–
–
–
–
Geen leerstof
Optimum temperatuur boven de 80°C
Archaea
Hete bronnen rond vulkanische activiteit
Meestal zwavel nodig voor metabolisme
Interessant voor de biotechnologie, als bron van
hittebestendige enzymen
Pyrococcus
furiosus
Kom verder. Saxion.
pH
Kom verder. Saxion.
•
•
•
•
De meeste bacteriën groeien bij neutrale pH (6,5-7,5)
Fungi groeien bij zure pH (5-6)
Acidofiele bacteriën groeien in zure milieus
Kweken van bacteriën in het lab: uitscheiding van zuren
(anaeroob katabolisme!) die de groei uiteindelijk gaan
remmen  medium bufferen; mogelijke buffers:
– In veel media zit pepton of aminozuren (als N-bron en als azbron); deze bufferen
– In veel media zitten fosfaat-zouten (als P-bron); deze bufferen,
met name in het neutrale pH-gebied
Kom verder. Saxion.
OSMOTIC PRESSURE
Kom verder. Saxion.
• Hypertone omgeving: plasmolyse
– Conservering voeding via extra suiker of zout
– Max. % agar in vaste media (anders te grote osmotische druk)
• Hypotone omgeving (bv. demiwater): water de cel in,
maar celwand behoedt cel meestal tegen lysis
Figure 6.4
Kom verder. Saxion.
Extremofielen
Geen leerstof
• Bij de extremofielen die we tot nu toe gezien hebben
(temperatuur, zout, zuur) gaat het vaak om
Archaebacteriën (Archaea)
Kom verder. Saxion.
THE REQUIREMENTS
FOR GROWTH
CHEMICAL
REQUIREMENTS
Kom verder. Saxion.
CARBON (Koolstof)
• Als basis voor alle biomoleculen en als energiebron
(covalente bindingen tussen C-atomen)
• Chemoheterotrofen gebruiken organische stoffen
(biomoleculen) als C- en energiebron
• Autotrofen gebruiken CO2 als C-bron
Kom verder. Saxion.
NITROGEN, SULFUR,
PHOSPHORUS, TRACE ELEMENTS
• Stikstof: Nodig voor alle aminozuren, eiwitten
– N-bron:
• Meeste bacteriën breken eiwitten af
• Sommige bacteriën gebruiken NH4+ of NO3
• Enkele bacteriën gebruiken N2 (stikstoffixatie)
• Zwavel: nodig voor bepaalde aminozuren, thiamine,
biotine
– S-bron:
• Meeste bacteriën breken eiwitten af
• Sommige bacteriën gebruiken SO42 of H2S
• Fosfor: Nodig voor DNA, RNA, ATP en membranen
– P-bron: fosfaat
• Spore-elementen: kleine hoeveelheden
anorganische elementen, meestal enzym-cofactoren
Kom verder. Saxion.
OXYGEN
Kom verder. Saxion.
• Zuurstof is essentieel voor het leven op aarde, maar
het is in feite een giftig gas
• Op de oer-aarde was er zeer weinig zuurstof en
waarschijnlijk was er zelfs geen leven ontstaan als er
(veel) zuurstof aanwezig was geweest
• Levensvormen met aerobe respiratie hebben zuurstof
nodig voor hun katabolisme, waarbij zuurstof wordt
omgezet in ……:
– Reultaat: veel ATP en neutralisatie van een potentieel giftig
gas (win-win situatie! )
Kom verder. Saxion.
Naamgeving zuurstofbehoefte
• Obligaat aeroben:
– Hebben zuurstof nodig om te leven (aerobe respiratie)
– Zonder zuurstof gaan ze dood
• Facultatief anaeroben:
– Gebruiken zuurstof, maar kunnen ook zonder (switchen tussen
aerobe respiratie (veel ATP) en fermentatie (weinig ATP))
• Obligaat anaeroben:
– Gebruiken geen zuurstof en kunnen er meestal ook niet tegen
– Meesten: alleen fermentatie (incl. glycolyse) ; bep. soorten in staat
tot anaerobe respiratie = respiratie met alternatieve
elektronenacceptor
Kom verder. Saxion.
• Obligaat (strikt) aeroob:
– Vrijwel alle dieren (op organisme-niveau!), de meeste
schimmels, verschillende bacteriën (bv. Pseudomonas
aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis)
• Strikt aerobe micro-organismen kennen geen fermentatie
• Dieren zijn strikt aeroob omdat ze het op organisme-niveau niet
lang uithouden zonder zuurstof (te weinig ATP)
– Veel ‘oxidatieve stress’ = giftige effect zuurstof, dus goed
verdedigingsmechamisme tegen zuurstof nodig (zie later)
Kom verder. Saxion.
• Facultatief anaeroben:
– Hebben verdedigingsmechanisme tegen toxisch effect zuurstof
– Groeien uiteraard beter met zuurstof dan zonder
– Veel bacteriën (bv. Escherichia coli, Bacillus anthracis, Salmonella,
bep. Lactobacilli) en veel gisten en bv. ook dierlijke cellen
• Obligaat (strikt) anaeroben:
– Zijn geen zuurstof gewend
– Hebben daarom geen verdedigingsmechanisme tegen het
toxische effect van zuurstof
– Voorbeelden obligaat anaeroben met fermentatie: bep.
Lactobacilli en andere darmflora-bacteriën, Clostridium
botulinum, Clostridium tetani
– Voorbeelden obligaat anaeroben met alternatieve
elektronenacceptor (= anaerobe respiratie):
methaanproduceerders (‘methanogenen’) in moerassen,
spijsverteringsstelsel van herkauwers, anaerobe
rioolwaterzuivering
Kom verder. Saxion.
Giftige vormen van zuurstof
• Superoxide vrije radicalen: O2
– In kleine hoeveelheden gevormd tijdens aerobe respiratie,
maar ook bij obligaat anaeroben
– Zeer toxisch
– Alle organismen die groeien in aanwezigheid
O2 maken deze vorm van zuurstof onschadelijk via:
Deze formule klopt niet, maar hij zit op deze manier in de ppt
(gemaakt door de auteur) en ik kan deze niet aanpassen: zie boek
voor correcte formule
Kom verder. Saxion.
•Peroxide anion: O22
• Bevindt zich in de H2O2 uit de SOD-reactie
• Giftig, dus: verder verwerkt via een van deze reacties
(meestal katalase)
:
De onderste formule klopt niet, maar hij zit op deze manier in de
ppt (gemaakt door de auteur) en ik kan deze niet aanpassen: zie
boek voor correcte formule
Kom verder. Saxion.
• Obligaat aeroben en facultatief anaeroben:
•
SOD en katalase/peroxidase ontgiften
• Obligaat anaeroben:
•
Geen ontgiftende enzymen
• Aerotolerante anaeroben:
• Wel SOD, geen katalase/peroxidase
• Gedeeltelijke ontgifting
• Microaerofielen:
• Waarschijnlijk geen ontgiftende enzymen, maar wel
zuurstof nodig
• Zuurstof niet giftig bij lage concentraties
Kom verder. Saxion.
• Kies uit: Aerotolerante anaeroben, facultatief
anaeroben, microaerofielen, obligaat aeroben,
obligaat anaeroben
Kom verder. Saxion.
ORGANIC GROWTH
FACTORS
• Essentiële verbindingen
– Biomoleculen die het organisme zelf niet kan
maken
– Om welke biomoleculen het precies gaat, is
afhankelijk van de betreffende bacteriesoort:
veel bacteriën kunnen alle of de meeste
biomoleculen zelf maken
– Vitamines, aminozuren, purines, pyrimidines
Kom verder. Saxion.
THE REQUIREMENTS
FOR GROWTH
CULTURE
MEDIA
Kom verder. Saxion.
Definities
• Definities:
– (Kweek)medium: Mengsel van voedingsstoffen voor groei van
micro-organisme(n)
– Steriel: Geen levende m.o. aanwezig
– Inoculum: Aan (kweek)medium toegevoegde m.o.
– Enten: het toevoegen van het inoculum
– Kweek of culture: M.o. in of op een (kweek)medium
• Meestal van te voren samengesteld door commerciële
leveranciers: ‘just add water’ en steriliseren
Kom verder. Saxion.
Agar
• Complex polysacharide uit
zeewier
• Gebruikt voor de bereiding
van vaste media:
voedingsbodems, schuine
agars e.d.
• De meeste m.o. kunnen agar
niet verteren
• Wordt vloeibaar bij 100°C
• Wordt weer hard bij ~40°C
Kom verder. Saxion.
Soorten media
• Chemisch gedefinieerde media:
– Exacte chemische samenstelling is bekend
– Lastig te maken en langzame groei: alleen speciale toep.
• Complexe media
Kom verder. Saxion.
Complexe media
• Extracten, bv. van gist of vlees (vandaar dat nog vaak
de term ‘bouillon’ wordt gebruikt; dateert uit de tijd
van Pasteur) en
• Peptonen
– Korte, wateroplosbare peptiden, onstaan uit zure hydrolyse of
enzymatische digestie van een eiwitbron (bv. soja, melk, ….)
– Meest gebruikt voor het kweken in het lab
– Voornaamste ingrediënt zijn eiwitten: energiebron, C-bron,
N-bron, S-bron
• Vitaminen en andere organische groeifactoren meestal
via vlees- of gist-extract (= daarnaast ook extra C- en
N-bron)
– Bij anaeroob kweken MOET ook een suiker (meestal glucose)
worden toegevoegd voor de energie!
Kom verder. Saxion.
Gedefinieerd vs. complex medium
Table 6.2 & 6.4
Kom verder. Saxion.
Anaeroob kweken
• Vloeibaar:
– Reducerende media
• Bevatten stoffen (thioglycolaat of oxyrase) die
een verbinding aangaan met O2
• Vlak van te voren verhitten om gebonden O2 te
verdrijven
• Voedingsbodems:
– Anaerobe vaten: zie volgende dia
– Oxyrase/OxyPlate
• Enzym oxyrase zet O2 om in H2O
• Enzym in voedingsbodem: hele plaat wordt
een anaerobe ‘kamer’: de OxyPlate
• Geen speciale apparatuur nodig
Kom verder. Saxion.
• Anaeroob vat
– Zakje met
natriumbicarbonaat
en
natriumborohydride
bevochtigen
– Er onstaat H2 en CO2
– Palladium combineert
H2 met O2 ( H2O)
Figure 6.5
Kom verder. Saxion.
Speciale kweekmethoden
• Bij m.o.’s die niet op of in media groeien:
speciale kweektechnieken nodig, zoals
– Proefdieren
– Celkweek
• Veel m.o.’s groeien slechts bij 5-15% CO2
Figure 6.6
Kom verder. Saxion.
Selectieve en differentiële media
• Selectieve media:
– Gewenste bacteriën groeien wel, ongewenste niet; bv:
• Bismuthsulfietagar bij S. typhi
• Briljantgroenagar bij Salmonella spp.
• Eosinemethyleenblauwagar (EMB) bij E. coli
De voorbeelden zijn
nu nog geen leerstof
(komt vanzelf later in
module)
• Differentiële media:
– Om kolonies van het aan te tonen m.o. te kunnen
onderscheiden van kolonies van andere m.o.; bv:
• Bloedagar: hemolyse door S. pyogenes
• EMB medium Enterobacter aerogenes en Escherichia coli
Figure 6.9b, c
Kom verder. Saxion.
Differentiële media
Om onderscheid te kunnen maken tussen
verschillende bacteriën in een mengsel, om
zodoende specifieke bacteriën aan te kunnen
tonen en te onderscheiden van andere
Staphylococcus aureus
op telluriet-glycine medium
Figure 6.9a
Kom verder. Saxion.
Verrijkingskweken
• In feite selectief medium, maar dan zodanig dat
de groei van een bepaald m.o. zodanig wordt
bevorderd dat detecteerbare hoeveelheden
cellen ontstaan
– Voorbeeld (toepassing): verrijking van fenolafbrekende m.o. in de bodem door te weken met fenol
als enige C- en energiebron
Kom verder. Saxion.
Reinkweken
• Een reinkweek bevat maar één soort of stam
• Een kolonie is een populatie van cellen op een
voedingsbodem die afkomstig is van één cel of spore
of van een groep van aan elkaar vastzittende cellen
• Een kolonie wordt vaak een kolonievormende
eenheid (KVE) of colony-forming unit (CFU) genoemd
Kom verder. Saxion.
Methode om losliggende kolonies krijgen
Figure 6.10a, b
Kom verder. Saxion.
Het bewaren van bacteriekweken
Meest gebruikte manieren:
• Diepvries: -50°tot -95°C (meestal in aanwezigheid van
glycero als antivries!)
• Lyofilisering (vriesdrogen): Bevroren (-54° tot -72°C) en
gedehydrateerd in een vacuüm
Kom verder. Saxion.
THE GROWTH OF
BACTERIAL CULTURES
Kom verder. Saxion.
Vermeerdering/groei van bacteriën
• Bij bacteriën bijna altijd binaire deling
– Synthese celmateriaal
– Instulping celmembraan
– Splitsing in twee cellen
• Groei: aantal bacteriën/bacteriemassa
– Per volume-eenheid: #cellen/ml, droge stof/ml
– Verdubbelingstijd: delingssnelheid (bijv. per uur),
toename massa
– Generatietijd of verdubbelingstijd
Kom verder. Saxion.
Generatietijd
http://www.cellsalive.com/ecoli.htm
Berekening aantal cellen
Per generatie verdubbeling van het aantal cellen
Dus: Aantal cellen = N0 x 2aantal generaties
Website Tortora: Intetractive Tutorials H6: alle drie!
Figure 6.12b
Kom verder. Saxion.
Generatietijd
Zie appendix D
G (generatietijd) = t(tijd, in minuten)/n(aantal generaties)
G = generatietijd = tijd die 1 celdeling duurt = t/n
t = een bepaald tijdsinterval: aan het begin en aan het eind hiervan
wordt het aantal cellen bepaald
Ao = aantal cellen bij het begin van het tijdsinterval
At = aantal cellen aan het eind van het tijdsinterval
Celdeling: At = Ao x 2n
Oplossen voor n:
logAt = logAo + log 2n = logAo + nlog2
nlog2 = logAt – logAo
n = logAt - logAo
log2
n = logAt - logAo
0,301
Kom verder. Saxion.
Berekening aantal generaties en
generatietijd
• Stel: 100 cellen groeien in 5 uur naar een totaal van
1.720.320 cellen:
Aantal generaties n = log(1.720.320) – log(100) =
14,3
log2
Generatietijd G: 5 x 60 min. / n = 21
minuten/generatie
Kom verder. Saxion.
Groeicurve exponentiële groei
Figure 6.13
Kom verder. Saxion.
Groeifasen
http://wps.aw.com/bc_tfc_microplace_8/0,7590,665416-,00.html
Figure 6.14
Meting van bacteriegroei
Kom verder. Saxion.
• Directe methoden
– Plate Count methode
seriële verdunningen van een sample, uitplaten,
incuberen en tellen (platen met 25-250 KVE’s)
– Filtratiemethode (bij lage hoeveelheden
bacteriën)
hoeveelheid filtreren door membraanfilter, filter op plaat
incuberen
– Directe telling
bacteriemonster in telkamer beoordelen
– Meting optische dichtheid
turbiditeit (vlg extinctie) evenredig met
bacterieconcentratie
• Indirect methoden
– Metabole activiteit
– Drooggewicht
Figure 6.15, top portion
Kom verder. Saxion.
Directe meting: Plate Counts
• Kolonies tellen: Monster eerst ‘doorverdunnen’
Figure 6.15, top portion
Kom verder. Saxion.
Plate Counts
• Een aantal
verdunningen
uitplaten
• Waarom?
Figure 6.16
Kom verder. Saxion.
• Na incubatie:Plate
tel aantal
kolonies op
Counts
platen met 25-250 kolonies (CFU/KVE)
Figure 6.15
Kom verder. Saxion.
Filtration
• Bij zeer kleine aantallen, m.n. in watermonsters
Figure 6.17a, b
Kom verder. Saxion.
Direct Microscopic count
Figure 6.19
Kom verder. Saxion.
Direct Microscopic Count
Kom verder. Saxion.
Direct Microscopic Count
• Nadelen:
– Beweeglijke bacteriën moeilijk te tellen
– Dode cellen niet of nauwelijks te onderscheiden van
levende
– Vrij hoge celdichtheden nodig om betrouwbaar te
kunnen tellen
• Voordeel:
– Snel (geen incubatietijd)
Indirecte Methoden
Kom verder. Saxion.
• Troebeling/turbiditeit (= ‘Turbidity’)
Figure 620
Kom verder. Saxion.
Turbiditeit
• Spectrofotometer
• Absorptie (A) / extinctie (E) / optische dichtheid
(OD)
– A / E / OD = -logT; T= transmissie
• Hoe hoger de OD, hoe meer cellen aanwezig
• In logaritmische groeifase loopt OD tegen tijd in
ongeveer een rechte lijn
• Wanneer bekend is hoeveel cellen/ml met een
bepaalde OD overeenkomen (1 keer uitzoeken
en standaardcurve maken), kan men vanuit een
gemeten OD het aantal cellen uitrekenen
• Gevoeligheid: werkt vanaf 107 cellen/ml; bij
lagere aantallen geen troebeling; bij te
hoge OD: verdunnen
Kom verder. Saxion.
Voorbeeld standaardcurve
• Bij Escherichia coli
loopt deze curve
over een groot
gebied lineair als
je de OD meet bij
600 nm;
• vuistregel:
• 1 OD-eenheid bij
600 nm komt
overeen met 8 x
108 cellen
Kom verder. Saxion.
THE END