CELBIO_JVDO_Samenvatting

1. Functionele morfologie van de cel + organellen en cytoskelet +
intermediare filamenten
Inleiding
De cel vormt de kleinste functionele een heid waarbinnen biochemische, fysiologische en pathologische
processen optreden.
Het is duidelijk dat het begin van het ontstaan van de cel ontstond met het vormen van een afscherming;
het plasmamembraan. Dit biomembraan heeft een aantal specifieke, doch cruciale eigenschappen:
Het universele biomembraan bestaat uit een fosfolipiden-dubbellaag, en kan zo specifieke functies
verwezenlijken:
 Het vormt zo, mede door zijn hydrofoob karakter, een uiterst functionele barrière.
 Het kan via aangehechte membraanproteïnen transport van een zeer uiteenlopende groep
moleculen reguleren (en dus ook blokkeren).
 Het kan een aanhechtingsmedium vormen voor membraanproteïnen, voor (hemi)desmosomen
ter celaanhechting resp. matrixaanhechting.
 Draagt receptoren die gevoelig zijn voor hormonen, neurotransmitters of groeifactoren.
Celorganellen
Om de cel zijn functies te kunnen laten verrichten, heeft het celorganellen nodig. Hiervan zijn sommige
omgeven door een dubbel membraan en hebben dus ook een intermembranaire ruimte (kern en
mitochondria). Andere organellen zijn slecht omgeven door een enkel membraan (lysosomen;
peroxisomen; ER en het Golgi-complex).
Endosomen.
Endosoom → Ionen en kleine moleculen gaan cel binnen via transport-eiwitten in celmembraan, maar
eiwitten en macromoleculen in het extracell. Milieu worden opgenomen via ENDOCYTOSE. = invaginatie
van segment van plasma membraan ovv coated pit (coated met clathrine); pit snoert af , wordt membraangebonden vesikel die versmelt met vroeg endosoom dat fungeert als sorteerstation. Van hieruit gaan
sommige eiwitten terug naar celmembraan; andere gaan naar laat endosoom waar verdere sortering
gebeurt. Tenslotte levert het late endosoom inhoud af aan lysosoom tbv afbraak.
Lysosomen.
Lysosoom → afbraak van schadelijke of overtollige componenten in zuur milieu via zure hydrolasen.
1—1
Het interne milieu wordt verzuurd door speciale membraanpompen die H+- pompen. Een elektrische
gradiënt wordt voorkomen door cotransport van Cl--ionen. Wanneer het milieu sterk wordt verzuurd
ondergaan de zure hydrolasen een conformatieverandering en worden zo geactiveerd (nucleasen;
proteasen of fosfatasen).
Ziekte van Tay-Sachs; door een defect lysosomaal enzym (hexosaminidase A) kunnen de gangliosiden niet worden
afgebroken in het lysosoom. Hierdoor worden deze gangliosiden geaccumuleerd in de zenuwcellen wat leidt tot
malfunctie. Deze malfunctie uit zich in schrikachtig gedrag, vertraagde verstandelijke & motorische ontwikkeling,
te lage spierspanning en uiteindelijk blindheid en dementie. Kinderen overlijden meestal voor hun derde levensjaar.
Peroxisomen
Peroxisoom → een celorganel dat toxische moleculen en vetzuren kan degraderen. Het degradeert door
gebruik te maken van oxidasen enzymen die zuurstof gebruiken om organische substanties te oxideren
waarbij corrosief H2O2 wordt gevormd. Het catalase enzymen degenereren H2O2 tot water en zuurstof.
Het komt met name frequent voor in levercellen en in niercellen. Deze enzymen worden in een pas
gevormd peroxisoom (ontstaan uit ER membraan) ingebracht vanuit het cytosol via een peroxisomaal
membraan proteïne.
Syndroom van Zellweger; een stofwisselingsziekte waarbij er een defect is in een membraanproteïne waardoor
eiwitten (enzymen) niet geïmporteerd kunnen worden in de peroxisomen. Hierdoor zullen levercirrose, dementie en
gaten in de hersenen optreden. Met name dit laatste leidt tot fouten in de aanleg en ontwikkeling van de hersenen.
Endoplasmatisch Reticulum
Endoplasmatisch reticulum (ER) → Er bestaan 2 varianten; een SER (Smooth endoplasmatisch retculum,
geen ribosomen) en een RER (rough endoplasmatisch reticulum, wel ribosomen):
Functies ER:
 SER: synthese van vetzuren en fosfolipiden:
 Levercel → detoxificatie van hydrofobe producten tot wateroplosbare producten.
 Spiercel → afzondering en opslag van Ca2+
 Bijniercel → steroïdmetabolisme/ hormoonproductie
 RER: synthese van bepaalde proteïnen:
 Bevat chaperones en kan zo bepaalde peptiden helpen vouwen
 Eiwitten bestemd voor secretie; deze blijven in het lumen van het ER voor glycosylatie en
vorming van zwavelbruggen
 Eiwitten voor membranen en organellen; deze blijven op het membraan van ER.
Golgi-complex
Golgi-complex → een reeks afgeplatte cisternen omgeven door vesikels. Dit complex is ingedeeld in
verschillende regio’s; het begin vormt het cis-Golgi gevolgd door het midden-Golgi) en trans-Golgi. In het
Golgi vindt de enzymatische bewerking van proteïnen plaats. Transport gebeurt dan via transport-vesikels
aan transzijde naar celmembraan of naar lysosoom of andere organellen.
De celkern
De nucleaire enveloppen is een dubbelmembraan dat de nucleus scheid van het cytoplasma. Het binnenste
membraan begrenst nucleus en de buitenste membraan en de intermembranaire ruimte zijn continu met
het ER. Lamine vormt een netwerk over het binnenste membraan, waardoor de nucleus vorm heeft.
Transport van ribonucleoproteinen (RNPs) en andere macromoleculen mogelijk doorheen kern-poriën.
rRNA wordt in de nucleolus gesynthetiseerd. mRNA en tRNA wordt in de nucleuplasma gesynthetiseerd
1—2
Het buitenste membraan is continu met RER. Het binnenste membraan is bedekt met lamine; een
intermediair filament voor de stevigheid. Hierbinnen zit DNA, waar het wordt getranscribeerd naar mRNA
dat vervolgens de kern kan verlaten via de kernporiën. In het lumen van de nucleus zit zgn. nucleoplasma,
wat het DNA bevat in eu- of heterochromatische vorm (het DNA is opgevouwen volgens het solenoïde
model; euchromatine: losse strengen DNA die licht gekleurd zijn en waarvan het DNA kan worden
afgelezen, transcript; heterochromatine: DNA in kluwen, donkere kleur, niet aleesbaar, geen transcriptie).
Let wel; alle vormen van RNA worden hier aangemaakt, alleen wordt rRNA aangemaakt in de nucleolus en
kan mRNA binden aan een proteïne tot vorming van een ribonucleoproteine partikel.
Deze kernporiën verzorgen naast het mRNA-transport ook inwaarts transport van histonen, DNA- en RNApolymerasen, boodschapperproteïnen en ribosomale proteïnen. En het uitwaarts transport voor RNA. Het
transport gebeurt via de kernporiën, dus hoe kleiner het molecule, hoe sneller het transport; hoe groter het
molecule, hoe trager het transport. Grotere eiwitten kunnen ook doorheen het membraan mbv een nuclear
localisation signal; hierdoor vindt er binding plaats aan fibrillen zodat deze proteïnen actief
getransporteerd kunnen worden.
De nucleolus (“kern in kern”)
Het kernlichaampje is verdeeld in 3 gedeelten:
1. Het Pars Amorfa → het gedeelte van de nucleolus dat in contact staat met de DNA-sequenties die
coderen voor rRNA (via RNA-polymerase I). In de tekst staat nog het N.O.R. genoemd; dit staat voor
de Nucleolus Organiserende Regio; de plaats waar de nucleolus gevormd wordt; namelijk rond
specifieke genetische loci.
2. Pars fibrosa → deel dat het rRNA en meer dan 80 eiwitten bevat. Dit kan gevisualiseerd worden
met zilverkleuring. Het proteïne nucleoline kleurt hierbij aan.
3. Pars granulosa → in dit deel vindt de assemblage van de ribosomale subunits plaats.
Toepassing: Nucleolus en kanker: hoe groter (zowel aantal als vorm) de nucleolus tov de kern, hoe
kwaadaardiger de kanker
Mitochondria
Men denkt dat deze terecht zijn gekomen in de eukaryote cellen volgens de endosymbiosetheorie; dit
wordt ondermeer ondersteund door de aanwezigheid van mitochondriaal DNA. Deze organellen kunnen
bv. via de citroenzuurcyclus die plaatsvindt in de matrix NADH synthetiseren en vormen zo een uiterst
belangrijk intermediair in het energiemetabolisme.
Een mitochondrion heeft een dubbel membraan, waarbij het buitenste membraan zeer permeabel is i.v.m.
aanwezigheid van porines. Het binnenste membraan vormt cristae en is bovendien zeer impermeabel. Dit
verschil in permeabiliteit ontstaat door de membraanopbouw. Het buitenste membraan bestaat uit
ongeveer 50% lipiden en 50% proteïnen, terwijl het binnenste membraan een verhouding van 20/80 heeft.
De buitenste membraanporines zijn volledig permeabel voor moleculen kleiner dan 10 kD.
Op deze cristae van het binnenste membraan vindt de oxidatieve fosforylatie plaats voor de ATP-synthese.
Alleen bij steroïdsecreterende cellen is het binnenste membraan gevouwen in tubulaire uitstulpingen. In
beide gevallen is er plaats voor ATP-synthasen, transportproteïnen voor ADP; Pi en ATP én er zit nog een
proteïne in dat de protonen tegen kan houden; het cardiolipine. Het organel bevat zijn eigen DNA, zijn
eigen tRNA en zijn eigen ribosomen, die zich in de matrix bevinden.
Het cytoskelet
Het cytoskelet bestaat uit polymeren van eiwit-subunits die op verschillende manieren zijn opgebouwd en
ontstaan uit verschillende bouwstenen:
1. Microfilamenten; bestaande uit actine. Dit zijn subunits van 8 à 9 nm diameter die een gedraaide
dubbelstreng van monomerische actine-subunits vormen, heel sterk.
1—3
2. Intermediaire filamenten; subunits met een diameter van 10 nm die een koordstructuur kunnen
vormen wat verschilt per celtype (weefselherkenning)
3. Microtubuli; de subunits zijn α- resp. β-tubuline die dimere subunits vormen en uiteindelijk
polymeriseren tot een holle buis. De diameter hiervan is zo’n 24 nm. De dimere subunits vormen
eerst protofilamenten, en die polymeriseren tot een microtubulus.
Het cytoskelet is een van de voornaamste organellen in de eukaryote cel; dit om de onderstaande redenen:
 Het zorgt voor het behoud van de celvorm
 Het maakt gecoördineerde beweging mogelijk (microfilamenten), zowel integraal als intern via
schikking; dit wordt overigens mogelijk gemaakt door zijn dynamsiche structuur →
cytomusculatuur
 Het zorgt voor de verdeling van chromosomen tijdens de celdeling (micro tubuli)
 Het kan cellen onderling aan elkaar vasthechten en zo weefsels verstevigen (epitheel)
Het cytoskelet is opgebouwd uit 3 verschillende onderdelen; deze zijn ook nog allemaal verschillend
gelokaliseerd:
 Het actine is geassocieerd aan de celjuncties en kan zo de vorm van de cel bepalen. Het komt dus
met name voor in de cel-cortex.
 De intermediaire filamenten (IF) vormen een netwerk door de gehele cel. Dit wordt vastgemaakt
aan de lamines die onder het kernmembraan liggen, waardoor verankering aan de celjuncties
plaatsvindt.
 De microtubuli (MT) liggen nabij organellen (en zijn dus uitermate geschikt voor intern transport
van bijvoorbeeld proteïnen.)
Hierboven is bovendien duidelijk gemaakt dat het cytoskelet bundels kan vormen → parallel gerangschikte
filamenten, of netwerken → kris-kras verlopende filamenten, dit kan echter 2D en 3D voorkomen. 2D met
name in de nucleaire- en het plasmamembraan en 3D in het cytosol.
De intermediaire filamenten.
De IF kunnen een netwerk vormen tussen de kernenveloppe en het plasmamembraan (dit speelt
waarschijnlijk ook een rol bij de over het algemene centrale ligging van de nucleus). Bovendien kunnen ze
krachten goed verdelen en komen dus ook vaak voor bij het plasmamembraan; geïllustreerd met 2
voorbeelden:
1. Lamine A en -C-netwerk; vormt een nucleaire lamina die vastgehecht is aan de binnenzijde van het
kernmembraan via ankers op lamine B.
2. De concentratie aan plasmamembraan in (hemi)desmosomen.
De structuur van IF is uitermate structureel en kan zo zeer stevige structuren opbouwen, zoals in haar en
nagels. Bovendien is het uitermate stabiel, dit in tegenstelling tot MT en MF; de enige methode van
extractie is via detergenten. Doordat de onderdelen α-helices kunnen vormen ontstaan er koordachtige
filamenten.
De IF vormen een superfamilie; de classificatie vindt plaats volgens weefseldistributie en zeer specifieke;
weefselspecifieke expressie → ze vormen zo een mogelijkheid in de diagnostiek van bepaalde tumoren:
door te kijken naar de IF kan men achterhalen waar de kanker begonnen is en zo een behandeling starten.
Bovendien zijn er nu meer dan 40 pathologieën gekend die veroorzaakt worden door een fout in de IFcoderende genen.
1—4
De opbouw van IF begint met de vorming van een dimeer → de bouwsteen van de IF die bestaat uit een
centrale α-helix (coiled-coil) die aan beide uiteinden een globulaire C- resp. N-terminus bezit. Als die
dimeren dan gevormd zijn, vindt er laterale antiparallele associatie plaats van 2 dimeren; dit vormt dan een
tetrameer. Deze tetrameren kunnen dan aan de uiteinden associëren tot vorming van protofilamenten. 4
protofilamenten zullen dan lateraal associëren tot een protofibril. 4 van deze protofibrillen vormen dan via
laterale associatie een intermediair filament met een diameter van zo’n 10 nm. Deze structuur is dus niet
gepolariseerd; bovendien verklaart deze strikte opbouw meteen zijn mogelijkheid tot het weerstaan van
grote krachten. De N- en C-terminus zijn overigens geen toeval; de N-terminus is sterk van belang bij de
assemblage, terwijl de C-terminus van belang is voor de cellulaire organisatie.
Zoals al eerder is vermeld, zijn deze uitermate sterke structuren toch zeer dynamisch; dit is mogelijk
doordat de subunits (tetrameren) kunnen ‘oplossen’ tot vorming van een cellulaire ‘pool’. Deze subunits
kunnen constant associëren resp. dissociëren. Een zeer duidelijk voorbeeld hiervan is de vroege resp. late
mitose; bij de vroege mitose vindt er afbraak plaats van de laminefilamenten door fosforylatie via Cdk2 en
bij de late mitose zorgen andere fosfatasen voor de herassemblage van de IF.
De superfamilie van de IF is ingedeeld in 5 klassen:
 Klasse I (zuur) en klasse II (basisch) associëren samen; het zijn keratines. Ze kunnen dus
heteropolymeren vormen door associatie van I en II tot vorming van een heterodimeer.
Hier bestaan ook weer varianten in; namelijk zachte en harde keratines. De harde keratines
verkrijgen hun harde structuur door oxidatie van de vele cysteïnes tot vorming van zwavelbruggen.
Het spreekt voor zich dat dit vaak voorkomt in nagels en haren. De zachte keratines zijn met name
breed gedistribueerd in de epithelen.
 Ze kunnen associëren met desmosoomjuncties voor de celstevigheid
 Men denkt dat ze belangrijk zijn bij de organisatie van de organellen in het cytoplasma en dat
ze een rol spelen in de signaaltransductie.
 Elke cel heeft bovendien een karakteristieke combinatie van klasse I en klasse II keratines.
 Dit alles wordt gecodeerd door zo’n 50 genen.
 Klasse III; kan homo- of heteropolymeren vormen:
 Vimentine → vormt met name de bouwsteen in mesenchymale cellen (vb. fibroblasten;
endotheel; witte bloedcellen; bepaalde epitheelcellen); het heeft een functie in:
 Membraansteun
 Kernorganisatie en organelorganisatie
 Ligt samen met de MT
 Desmine → een bouwsteen in spiercellen; hierdoor worden de volgende eigenschappen van
spierweefsel mogelijk:
 Starheid (contractiegeleiding) door hechting van contraherende units aan een membraan,
bovendien kan de cel zo zijn vorm behouden gedurende contractie, waardoor contractie
überhaupt mogelijk wordt.
 Het speelt dus een rol in de organisatie van de celorganellen, omdat het ook aanhecht
aan de nucleus en de mitochondria.
 Dan zijn er nog de GFAP’s (Glia Fibrillary Acid Protein), die met name voorkomen in de
gliacellen; het zorgt in bijv. astrocyten voor het behoud van de mechanische kracht en vorm.
Bovendien speelt het een rol in het functioneren van de bloed-hersenbarrière.
 Klasse IV; de neurofilamenten:
 Het kan heterodimeren vormen, met NF-L (light); NF-M (medium) en NF-H (heavy)
 Het speelt een rol in de groei en het behoud van de diameter in een axon.
1—5
 Klasse V; de lamines
 Het is de progenitor van alle IF
 Het biedt steun aan het binnenste kernmembraan
 Het wordt gecodeerd door 3 genen (1 A en 2 B’s); hiervan komen de B-lamines voor in alle
cellen
 Het speelt in een rol in de organisatie van chromatine en de afstand tussen de kernporiën.
 Bij de mitose kan het gehyperfosforyleerd worden waardoor het wordt afgebroken, om dan in
de telofase opnieuw te worden geassembleerd via herfosforylatie.
Dan zijn er nog proteïnen die associëren met de IF’s om zo bepaalde functies te kunnen vervullen; de IFAP’s
(Intermediate Filament Associated Proteins). Deze kunnen zowel onderling als met een (cel)membraan
crosslinken zodat er een bundel resp. netwerk gevormd wordt door tussenkomst in:
 De organisatie van het IF-skelet
 Integratie van de IF met het MF- en MT-skelet
 Vasthechting van de IF aan het membraan
Een voorbeeld van een IFAP is plakine (plectrine); dit proteïne kan een IF (vimentine) crosslinken/verbinden
met MT en MF. Dit vimentine wordt aan actine gehecht, door het N-terminaal calponine-homologie
domein van de plakines. Verder komt deze IFAP in axonen voor om de neurofilamenten te kunnen
verbinden aan MT via een armpje van NF-H.
De steun aan membranen wordt geleverd door het netwerk van verschillende IF:
 De nucleaire lamina; lamine A en C vormen een netwerk; dit is verbonden aan lamine B, dat kan
binden aan een lamine-B-receptor (IFAP) die in het kernmembraan zit verankerd.
 Vimentine kan binden aan ankyrine (dit proteïne kan actine binden) en aan plectrine (zit vast aan
een integrine) die verankerd liggen in het celmembraan.
 Desmine zit via IFAP’s verankerd aan het celmembraan en rond een sarcomeer.
 Keratine zit verankerd in de hemidesmosomen van het celmembraan.
Gezien de cruciale rol van de IF wat betreft steun en celfunctie, is het op zich logisch dat hier tevens een
aantal ernstige pathologieën aan zijn verbonden; een aantal hiervan staan hieronder genoteerd:
 Musculaire dystrofie → door mutaties in lamine A ontstaan te zwakke spieren. (Te fragiele kernen?)
 Progeria → door mutatie in lamine A wordt het verouderings proces sterk versneld. De dood treedt
meestal in rond het 20e levensjaar.
 Epidermolysis bullosa simplex → door een mutatie in het K14 keratine gen (hangt vast in celmembraan
en zorgt voor vasthechting van cellen) ontstaan er heterodimeren met K4 maar geen protofilamenten.
Epidermolyse met blaarvorming; het vormt een groep van zeldzame huidziekten die erfelijk zijn. Er treedt
blaarvorming op, evenals het loslaten van de epiderma als reactie op druk of letsel.
1—6
2. Technieken om wellen en weefsle te bestuderen +
immunohistochemische technieken + afzonderen van cellen,
organellen en eiwitten
Inleiding
Cellen en weefsels moeten bestudeerd worden; dit gebeurt in de geneeskunde, in de biomedische
wetenschappen (het onderzoek), in farmaceutisch onderzoek etc.
De afkomst van deze weefsels en cellen kan komen via:
 Operatieve wegname van een orgaan resp. weefsel
 Biopsie; endoscopisch (met een tangetje slijm wegnemen), naaldbiopsie of chirurgisch
 Afzonderlijke cellen; aspiratie (zuigend cellen wegnemen), punctie, bloedafname, speeksel, urine of
schraapsel
 Levende of dode cellen; let wel: bij dode cellen is fixatie essentieel!
Visualisatie
Het visualiseren van cellen en organellen kan op verschillende manieren:
2—7
 De meest bekende is de lichtmicroscoop:
 De lichtmicroscoop heeft een resolutie van zo’n 200 nm
 De vergroting wordt bepaald door het objectief te vermenigvuldigen met het oculair.
 Hij is bruikbaar voor fasecontrast- en differentiële interferentie-contrastmicroscopie →
visualisatie van beweging:
 Weinig detail zichtbaar
 Bruikbaar voor afzonderlijke cellen of dunne cellagen
 Voor levende cellen
 Fluorescentie-microscopie; de weefselcoupe geeft een fluorescerend signaal af, bijvoorbeeld
afkomstig van GFP (Green Fluorescent Protein):
 Lokalisatie en kwantificatie van fluorescerende moleculen in levende cellen, alvorens het GFPgen geïntroduceerd is in cellen in cultuur,
 Het visualiseren van bepaalde proteïnen gebeurt dan door fusie van het GFP-gen aan een ander
gen; er ontstaat een chimeer eiwit (verbonden lokalisatie van een proteïne)
 Een andere manier van kleuring is via het tetracysteine tagging en ReAsH; bindt aan C-C-X-X-CC en levert een rode kleur op.
 Via fluorochromen (eiwitten die fluo licht uitzenden)kun je ionenconcentraties bepalen;
verschillende soorten:
 Fura-2 bindt aan Ca2+-ionen en levert fluorescentie op
 Snarf-1 visualiseert de protonenconcentratie.
 Elektronenmicroscopie (zie verder)
 Convocale scanning microscopie (lezen in MCB blz. 189 - 190)
Histologische technieken
Verschillende stappen moeten doorlopen worden alvorens een coupe onder de microscoop gelegd kan
worden; hierbij is de volgorde van cruciaal belang.
De lichtmicroscoop
 Fixatie → techniek waarbij alle levensprocessen worden stilgelegd en de oorspronkelijke structuur
zo goed mogelijk blijft behouden. Zo wordt autolyse voorkomen → ontledingsproces van cellen
doordat bepaalde toxische stoffen ophopen door zuurstofgebrek. Het is van cruciaal belang dat dit
onmiddellijk gebeurt na wegname van het weefsel. De stoffen die hiervoor gebruikt worden zijn
fixativa → stoffen die covalente verbindingen vormen met de N-groepen van proteïnen (crosslinking.) Het nadeel hier van is dat het heel lang duurt, zo’n mm³ per uur.
 Fixativa zorgen dus voor het stilleggen van de levensprocessen
 Het zorgt voor de immobilisatie van de cellen in het weefsel
 Cellen worden permeabel voor kleurstoffen
 Enkele voorbeelden: formaldehyde; glutaraldehyde
N.B. Crosslinking kan ook tussen andere groepen o.i.v. andere stoffen
 Dehydratatie met alcohol (→ water uit weefsel halen), zodat daarna inbedden in paraffine
(waterafstotend) mogelijk wordt:
 Startend met 80°; 90° en 100° alcohol (specifieke alcoholgraden)
 Daarna hetzelfde proces herhalen in tolueen
 Inbedden in paraffine of plastic tot vorming van een hard blok
 Snijden in coupes van 5 micron met een microtoom; hierdoor kan het licht erdoorheen vallen. Deze
coupes komen nu op draagglaasjes te liggen
 Rehydratatie; gebeurt in de omgekeerde volgorde: tolueen → alcohol → water
2—8
 Kleuring; rehydratatie gebeurt omdat de kleurmiddelen wateroplosbaar zijn.
Kleuring berust op selectieve kleuring van celcompartimenten:
 Haematoxyline (basisch) → bindt aan zure componenten (DNA, RNA en zure eiwitten) en geeft
een blauwe kleur
 Eosine (zuur) → bindt aan basische componenten en kleurt rood.
Aantonen van specifieke moleculen in preparaten mbv histochemie, enzyme-histochemie,
immunohistochemie, immunofluorescentie; zie verder.
 Dehydratatie; opnieuw in alcohol gevolgd door tolueen; luchtbellen worden zo voorkomen
 Monteren met een dekglaasje
Het nadeel van fixativa is dat het fixatieproces zijn tijd neemt; zo’n mm3 per uur. Bovendien wordt het RNA
in stukken verkapt. Een alternatief is invriezen tot vorming van vriescoupes:
 Het vriesproces gebeurt in vloeibare stikstof (bij -180°C) en gekoelde isopentaan (-160°C)
 Dit heeft zowel voor- als nadelen:
 Voordelen:
 De snelheid wordt gigantisch verhoogd (zo’n 10 sec)
 Je hoeft daarna niet in te bedden
 Proteïnen blijven bewaard in de oorspronkelijke, natieve toestand.
 Nadelen:
 Er is een sterke kwaliteitsdaling van de coupe.
De elektronenmicroscoop
Algemeen is dit proces veel gevoeliger en heeft meer vereisten dan de lichtmicroscoop:
 Er moeten zeer dunne coupes gesneden worden (zo’n 50 nm)
 Zeer sterke fixatie door glutaraldehyde
 Beeld berust op verschillende mate van absorptie waardoor elektronen op verschillende wijzen
worden verstrooid.
 Het ‘kleuren’ gebeurt d.m.v. OsO4; kleurt de vetbindingen zwart (om accenten te leggen)
 Zwarte regio’s duiden op elektronenverstrooiing
 Immuno-elektronmicroscopie wordt hiermee gevisualiseerd; hierbij zijn antistoffen met Au
gelabeld.
Aantonen specifieke moleculen
Zoals beschreven is bij de lichtmicroscopie kan dit via 4 methoden:
Histochemie.
Histochemie → techniek waarbij bepaalde componenten worden gevisualiseerd door bepaalde stoffen;
zeer globaal! Verschillende stoffen :
 PAS-kleuring (Periodic Acid Schiff); kleurt suikers en suikergroepen (vb. glycolipiden) rood
 PAS na α-amylase of na diastase; hierdoor zijn de vrije suikers verteerd en kleuren dus enkel de
suikergroepen rood (geglycosyleerde proteïnen)
 Toluidine-blauw; Giemsa → kleurstof is blauw, maar kleurt de eosinofiele korrels van granulocyten
rood (metachromatisch)
 Alcian Blue → kleurt zure mucopolysachariden blauw
 Zilverkleuringen → kleurt de reticuline-vezels uit de ECM
 Van Gieson-kleuring → kleuring van meerdere componenten:
 Collageen wordt rood gekleurd
2—9
 Elastine wordt zwart gemaakt
 Spiercellen kleuren geel
Enzymhistochemie.
Enzymhistochemie → een techniek die gebruikt wordt om enzymen te lokaliseren in coupes door gebruik
te maken van hun enzymatische activiteit.
 Incubatie van een coupe in het substraat met zijn co-factoren.
 Het substraat moet zodanig gekozen zijn dat er een onoplosbaar precipaat ontstaat op de plaats
van enzymatische activiteit
 Vriescoupes zijn meestal nodig, omdat fixativa proteïnen ‘fixeren’:
 Voor zenuwcellen wordt acetylcholinesterase gebruikt
 Voor lysosomen zure fosfatasen
 Voor peroxisomen peroxidasen.
Immunologische detectiemethoden.
Immunologische detectie → verschillende technieken die gebruikt worden om een antigen (een eiwit) aan
te tonen in een coupe via een immunologische reactie. Dit gebeurt via een antigen-antistofreactie,
waarvoor specifieke antistoffen vereist zijn, gericht tegen het antigen dat gedetecteerd moet worden.
Vervolgens moet het ook nog gedetecteerd worden in de coupe wat gebeurt via fluorescentie (enkel
vriescoupes zijn bruikbaar) of immunohistochemie (vries- of paraffinecoupes)
Immunofluorescentie
Het aantonen van een molecuul gebeurt d.m.v. een fluorochroom. Dit bindt covalent aan een antistof
tegen het gezochte molecuul (het antigen). Dit fluorochroom is wel zichtbaar omdat het licht uitzendt van
een andere golflente na absorptie van licht dat lagere golflengten heeft.
Enkele voorbeelden van fluorochromen zijn Rhodamine, Texas Rood en FITC, een combinatie voor colokalisatie is mogelijk.
Hier zijn toch ook wel enkele nadelen aan verbonden:
1. Vriescoupes zijn essentieel (kwaliteitsdaling)
2. De immunofluorescentie zal geleidelijk aan verdwijnen; de preparaten zijn niet permanent
3. De achtergrond is donker, dus de architectuur van het weefsel is niet zichtbaar
4. Fluorescentiesignalen uit verschillende delen van de cel kunnen elkaar overlappen
Immunohistochemie.
Immunohistochemie → het aantonen van een antigen m.b.v. de antigen-antistof reactie. De antistof is
hierbij afkomstig van een proefdier en al dan niet gelabeld, het antigeen is vaak een eiwit.
Antistoffen (antilichamen) zijn immunoglobulinen die zowel monoclonaal als polyclonaal kunnen zijn:
Monoklonale antistoffen → antistoffen afkomstig van één kloon van lymfocyten en gericht tegen één
epitoop. Meestal gefuseerd met myelomacellen/kankercellen zodat ze onsterfelijk worden.
Polyklonale antistoffen → een mengsel van antistoffen, die gemaakt zijn door verschillende klonen van
lymfocyten en gericht zijn tegen verschillende epitopen.
Epitoop → elke plaats op een antigen die een reactie van het immuunsysteem uitlokt.
Nadat de reactie dan heeft plaatsgevonden, moet het nog gevisualiseerd worden d.m.v. labeling, hiervoor
kunnen ook weer verschillende methoden gebruikt worden:
1. Fluorescerende moleculen, maar hiervoor is een fluorescentiemicroscoop nodig, en bovendien heb
je geen zicht op de celarchitectuur
2—10
2. Enzymen (vb. peroxidase) gevolgd door enzymhistochemie en vorming van een onoplosbaar
gekleurd substraat. Hiervoor volstaat de lichtmicroscoop en heb je ook zicht op de
weefselarchitectuur
3. Goudbolletjes, meestal voor immuno-EM. Deze goudbolletjes worden dan gehecht aan de antistof,
en daarna wordt het behandeld met zilver, wat zal neerslaan op het goud.
Het resultaat is dan nog afhankelijk van:




Specificiteit van de antistoffen (mono- > polyklonaal)
Affiniteit van de antistoffen
Signaal/ruis-verhouding (het is onzeker of de antistof alleen heeft gebonden aan het antigen)
Mate van denaturatie van het antigen t.g.v. de voorafgaande fixatie, daarom:
 Kun je gebruik maken van vriescoupes
 Probleem met epitope-retrieval; door hitte zullen enzymen denaturen en mogelijk terug
natureren in een andere conformatie, waardoor de antistof niet meer bindt. Een oplossing zit in
het doorbreken van de crosslinks m.b.v. proteolytische enzymen.
Technieken.
Er bestaan verschillende stap-technieken:
1. Directe techniek (1 stap):
a. Elke antistof heeft 2 bindingsplaatsen, maar omdat het maar één-staps is, moet elk antistof
gelabeld worden wat zijn invloed uitoefent op de prijs.
2. Indirecte techniek (2 staps):
a. Er wordt gebruik gemaakt van een antistof voor de antistof. Het tweede antistof draagt hier het
label.
b. Het tweede antistof kan worden hergebruikt omdat deze bindt met alle antistoffe
3. Indirecte 3-staps techniek:
a. Nu draagt zowel de secundair als de tertiaire antistof een label.
b. Je moet het zien in een 3D-toestand, waardoor er tenminste 10 labels ontstaan per
bindingsplaats, wat een veel grotere verhouding label/bindingsplaats heeft en het dus beter
visualiseert.
4. 3-staps ongelabelde peroxidase-antiperoxidase techniek (PAP):
a. Er wordt gebruik gemaakt van een primaire antistof om het eiwit te detecteren,
b. Vervolgens wordt een secundair antistof toegevoegd die de uiteinden van antistof 1 en van het
antiperoxidase complex herkent
c. Dan ontstaat door het toevoegen van peroxidase (wat straks tevens reageert met de kleurstof)
en het antiperoxidase (antistof tegen peroxidase) een peroxidase-antiperoxidase-complex.
N.B. de antistoffen moeten niet gelabeld zijn!
5. Avidine-Biotine complex techniek (ABC):
a. Opnieuw bindt de primaire antistof aan het antigen
b. Een secundaire antistof gelabeld met biotine bindt aan de primaire antistof
c. Vervolgens wordt een complex van avidine en peroxidase-gelabeld biotine toegevoegd; avidine
heeft een extreem hoge affiniteit voor biotine, zodat deze binding snel plaatsvindt.
d. Bovendien heeft avidine 4 bindingsplaatsen voor biotine, en de meeste proteïnen kunnen
verbonden worden met verschillende biotine-moleculen waardoor gemakkelijk grote, dus
detecteerbare, ABC-complexen gevormd kunnen worden.
6. Envision-techniek:
a. De primaire antistof bindt wederom aan het antigen
2—11
b. De secundaire antistof bindt aan de primaire antistof, maar deze is gelabeld met een
dextraanketen waaraan peroxidasen aan vast zijn gehecht.
Nu echter alles gelabeld is, is het nog niet per definitie zichtbaar:




Visualisatie m.b.v. enzym-histochemische reacties
Peroxidase met 3,3’ diaminobenzidine en waterstofperoxide → bruine neerslag
Peroxidase wederom → 3-amino-9-ethylcarbazole en waterstofperoxide → rode neerslag
Alkalisch fosfatase → fast blue B → blauwe neerslag
Toch bestaan al deze technieken niet zonder problemen:
 Het weefsel bevat per definitie endogene peroxidasen, dit wordt geinhibeerd door H2O2 (en kunnen
dus geen reactie meer aangaan)
 Endogene biotine (lever), zit dus ook al in het weefsel, daarom wordt de coupe eerst bedekt met
avidine (proteïne), zodat het gelabelde biotine hier niet meer aan kan binden.
 Endogene alkalische fosfatase.
Organelzuiveringen
Ook hiervoor zijn verschillende methoden ontwikkeld:
 De celsuspensie in een isotone oplossing:
Sonicatie (ultra-hoge tonen) of centrifugatie; beide methoden zorgen voor membraanruptuur
waardoor de celorganelle vrijkomen.
 Tissue homogenizer → onder zeer hoge druk door zeer kleine openingen duwen
 Ruptuur verwekken door de cellen in een hypotone oplossing te doen bij 0°C, dit veroorzaakt
osmotische zwelling.
Na de membraanruptuur kunnen de organellen van elkaar worden gescheiden door differentiële
centrifugering of door densiteitscentrifuge m.b.v. een sucrosegradiënt.
Bovendien vormt een weefsel een mengsel van verschillende cellen, daarom zijn er verschillende methoden
ontwikkeld van celopzuivering:
1. Centrifugatie; werkt via densiteitsverschillen
2. Flowcytometrie; door verschil in uitgezonden licht
3. Op basis van binding van cellen aan fluorescerende antistof m.b.v. fluorescence activated cell
sorter (FACS). Een voorbeeld hiervan zijn de T/B-lymfocyten. Je moet dus zelf het fluorescent
toevoegen, waardoor je nauwkeuriger kunt werken.
4. Op basis van antistoffen, die gebonden zijn aan magnetic beads; er ontstaat een magneet.
Als controle op een effectieve zuivering kun je gebruik maken van verschillende factoren:
1. Onderzoek m.b.v. de elektronenmicroscoop
2. Via kwantificering van organel-specifieke merkers, dus controle op de aanwezigheid van bepaalde
stoffen die specifiek zijn voor bepaalde organellen:
a. Mitochondria → Cytochroom C
b. Peroxisoom → Catalase
c. Lysosoom → zure fosfatase
d. RER → ribosomen (proteïnen)
3. Via organel-specifieke monoklonale antistoffen.
2—12
Het spreekt voor zich dat het niet mogelijk is om membraanproteïnen hiermee te bestuderen, hiervoor heb
je andere technieken nodig; via detergenten:
 Detergenten vormen aan kritische concentratie micellen (CMC)
 De ionische detergenten → geladen, binden aan hydrofobe gebieden en verbreken daar de
ionische- en waterstofbruginteracties wat leidt tot denaturatie (nadeel, nooit het oorspronklijk
eiwit uit het membraan). Een voorbeeld hiervan is Na-deoxycholaat of Na-dodecylsulfaat.
 De niet-ionische detergenten → niet geladen, een voorbeeld is triton X:
 In concentratie lager dan de CMC lossen ze de biomembranen op en vormen gemengde
micellen
 In hogere concentraties dan CMC binden ze aan de hydrofobe regio’s en maken eiwitten
wateroplosbaar, waardoor ze niet kunnen aggregeren en dus precipiteren. Voor de
verschillende vormen van micellen die gevormd worden: zie blz. 19-II nr. 2
3. Epithelen en juncties tussen cellen
Om te beginnen een aantal begrippen:
 Progenitorcel → cel die nog kan differentiëren tot cellen met een specifieke structuur, inhoud en
functie (al naargelang weefseltype waarin het terecht komt)
 Gelijkaardige cel → vormen weefsels met een gemeenschappelijke functie
 Enkelvoudig vs. samengestelde weefsels.
Vb: bindweefsel = steuncellen + de extracellulaire matrix (ECM)
 Weefselgroep → orgaan of een systeem; de vorm zegt vaak iets over de functie; heterogene
weefsels: verschillende soorten weefsels vb bloedvaten, zenuwen
Om de verschillende weefsels hun functie te kunnen uitvoeren, zijn op z’n minst onderlinge interacties
nodig. Om dit te realiseren zijn er moleculaire interacties tussen cellen, die tevens weefsels assembleren.
Dit wordt echter op verschillende niveaus gerealiseerd:
 Cel-cel-adhesie; mogelijk via CAM’s (celadhesiemoleculen) in het celmembraan
CAM’s → proteïnen die verspreid voorkomen in het membraan, geconcentreerd in juncties; ze
maken interacties tussen dezelfde celtypes mogelijk (homotypische adhesie) of tussen
3—13
verschillende typen (heterotypisch). Bovendien kan er nog interactie plaatsvinden tussen identieke
CAM’s of verschillende; (homofiele adhesie resp. heterofiele adhesie)
 Cel-matrix-adhesie; mogelijk via membranaire adhesie; receptoren en liganden in de ECM
Juncties.
Juncties bevatten CAM-clusters, wat het weefsel zijn stevigheid geeft. CAM’s bevatten extracellulaire
domeinen, zodat ze een rol kunnen spelen in de bidirectionele overdracht van informatie van buiten naar
binnen en van binnen naar buiten en controle op de transcellulaire passage van moleculen kunnen
uitoefenen, evenals de beweging van moleculen tussen naburige cellen. De CAM’s bestaan uit 4 families:
1. E-cadherines; deze familie vormt dimeren; homofiele interacties
2. Immunoglobuline-superfamilie; kan zowel homo- als heterofiele interacties ondergaan (enkele
voorbeelden: ICAM; NCAM (neurale); MelCAM (melanine))
3. Integrines; vormen heterodimeren (uit α- en β-) en vormen zo een receptor voor heterofiele
matrixproteïnen, zoals laminine en FN ( belangrijke binding van cel aan ECM)
4. Selectines; tevens dimerisch, (een lectine-familie) en bevatten dus ook lectine-domeinen. Ze
kunnen heterofiele interacties ondergaan. Het lectine-domein bindt daarbij aan suikers van
bijvoorbeeld glycoproteïnen.
CAM’s zijn Cel-Adhesie-Moleculen; zij zijn ingebed in het plasmamembraan en aan de cytosolische zijde
verbonden aan het cytoskelet of aan signaal-transductieproteïnen via adapterproteïnen. De functie van de
CAM’s wordt bepaald door de omgeving waarin ze zitten (outside-in effect).
Aan de buitenkant interageren ze met moleculen die afhankelijk zijn van de vorm en functie van de cel. Hier
geldt het inside-out-effect → de cel beïnvloedt de omgeving.
Er zijn twee typen van interactie die de moleculen kunnen ondergaan:
1. Cis; laterale interactie. Dit vormt homodimeren en uiteindelijk oligodimeren die samen kunnen
clusteren. De onderdelen van de moleculen die kunnen deelnemen in deze interacties variëren al
naargelang de verschillende CAM’s.
2. Trans; intercellulair tussen distale domeinen van CAM’s van naburige cellen genereren een soort
ritsstructuur tussen de cellen. Beide interacties staan dus dwars op elkaar.
De adhesie van de CAM’s wordt bepaald door verschillende factoren die milieuafhankelijk zijn:





Bindingsaffiniteit; afhankelijk van de thermodynamische eigenschappen van de moleculen
Associatie- en dissociatieconstanten; (kinetische eigenschappen
Distributie en dichtheid van de CAM’s
Actieve of inactieve vorm (biochemisch) (actief: wel binden; inactief: niet binden aan buitenkant)
Uitwendige krachten; de flow (dit is uitsluitend mechanisch)
De structuren die de CAM’s zullen vormen zijn de juncties. Deze juncties komen voor in verschillende
weefselsoorten, zoals epithelen, bindweefsels, zenuwweefsels, bloed- en bloedvormende weefsels.
Epithelen.
Een epitheelweefsel dient voor de bekleding van zowel de binnenkant van een orgaan als de buitenkant,
en is opgebouwd uit gepolariseerde cellen (hebben dus per definitie een apicale en een basolaterale zijde).
Aan de basale zijde ligt een basale lamina, die de epitheelcellen scheidt van de extracellulaire matrix.
Hierop zijn de epitheelcellen verankerd via juncties.
Het spreekt voor zich dat er verschillende soorten epitheelweefsels zijn, de morfologie daarvan is
afhankelijk van de lokalisatie en de functie van het epitheel. De verschillende soorten en opbouw :
3—14
 Meerlagig epitheel → barrièrefunctie:
 De huid; heeft een plaveiselig, meerlagig epitheel dat bekleed is met keratine (overschot van
dode cellen) en zo de ondoorlaatbare en stevige eigenschappen van de huid kan realiseren
 De urineblaas; meerlagig overgangsepitheel
 Pseudogestratifieerd epitheel; het lijkt meerlagig door de verschillende kernhoogten, maar alle
cellen zijn ingeplant op de basale lamina. Vb luchtwegen en cilia
 Enkelvoudig prismatisch epiheel → transportfunctie van ionen en kleine moleculen; bevatten
meestal cellen die een mucusproducerende functie hebben:
 In de maag; een speciaal slijmnapepitheel
 Slijmbekercellen in de darm die continu zijn met mucussecreterende klieren; de acini
 Microvilli; apicale structuren waarvan de structuur mogelijk gemaakt wordt door de centrale
actinebundels.
 Enkelvoudig kuboïdaal epitheel → bekleding van lichaamsholten;
 Mesothelen → epitheel dat de bekleding vormt van de sereuze vliezen (buikvlies etc.)
 Enkelvoudig plaveiselig epitheel → bekleding van bloedvaten;
 Endothelen
Om deze functies goed te kunnen uitvoeren, zijn de verschillende juncties essentieel.
Er worden 2 vormen van adhesie onderscheiden:
1. Cel-cel-adhesie; gebeurt via CAM’s, aangehecht aan het cytoskelet via o.a. adapterproteïnen
2. Cel-matrix-adhesie; met name via integrines, die aanhechten aan proteoglycanen, collagenen en
oplosbare matrixproteïnen (fibronectine) van de ECM.
a. De samenstelling van de ECM verschilt per weefsels en orgaan
b. Er vindt een continue remodelling plaats van de ECM en kan daardoor invloed uitoefenen op de
interacties tussen de cel en zijn omgeving
c. De matrix vormt een reservoir van signaalmoleculen, evenals een netwerk waar cellen
doorheen kunnen migreren.
Er bestaan 3 junctietypen:
1. Tightjunctions; deze juncties zijn een voorbeeld van cel-cel-adhesie en cellen kunnen zo de
controle houden over de intercellulaire flow in epithelen. Zijn eigenschappen:
a. Ze liggen net onder het apicale oppervlak van de gepolariseerde cel;
b. Hierdoor blijft de polariteit van de cel behouden; er vindt geen diffusie plaats van
membraanproteïnen en glycolipiden tussen apicaal en basolateraal
c. Het vormt een barrière tegen intercellulair transport
d. Het ontwikkelt een gordel van transmembranaire eiwitten die in contact liggen met dezelfde
bundel van de buurcel door een dubbele rij te vormen van 3-4 nm proteïnen → occludine en
claudine. Beiden hebben 4 transmembranaire domeinen.
e. Verder leveren Junctional Adhesion Molecules (JAM) nog een belangrijke bijdrage aan de
homofiele adhesie → ondoorgankelijk voor wateroplosbare moleculen. Zij zorgen overigens
ook nog voor andere eigenschappen van de tight-junction. De JAM’s behoren overigens tot de
Ig-superfamilie van de CAM’s.
f. Om de tight-junction te kunnen vormen, is Ca2+ vereist (dit is overigens ook essentieel voor de
cel-cel-adhesie gemedieerd door catherinen)
3—15
g. Ondanks het feit dat bovenstaande uiteenzetting het idee geeft dat tight-junctions absoluut
ondoorgankelijk zijn voor elk molecuul resp. ion, is dit niet het geval. Er bestaat namelijk een
paracellulaire en transcellulaire pathway (een ‘lek’ door en tussen de cellen), die afhankelijk is
van verschillende factoren:
I. Er bestaan verschillende isoformen van claudine
II. De tight-junctions staan onder invloed van G-proteïnen en cAMP-concentraties in de cel
wat betreft doorgankelijkheid.
Mutaties in bepaalde claudines kunnen leiden tot:
 Een abnormaal eiwit met verschillende gevolgen:
 Geen normale paracellulaire flow van Mg2+ in de nier, wat leidt tot convulsies (stuiptrekkingen)
 Gewijzigd transport in het binnenoor → aangeboren doofheid
 Vibria cholerae → door toxines ontstaat er een wijziging in de samenstelling of de activiteit van de tightjunction, hierdoor ontstaat diarrhee en daaraan gekoppeld dehydratatie.
2. Verankerende; adhererende juncties; eveneens cel-adhesie en vormen 3 typen in de
epitheelcellen. Ze leggen de connectie tussen de laterale membranen van de epitheelcellen en
liggen precies onder de tightjunctions. Ze zijn binnen de cel verbonden via adapterproteïnen aan
een gordel van actine- en myosine-filamenten, waardoor een soort trekkabel ontstaat die de vorm
van de cel kan behouden.
a. Adhererende junctie; de CAM’s behorende tot deze juncties zijn met name de cadherines1:
I. De klassieke Cadherines (E-; P-; en N-); elk cadherine heeft een karakteristieke
weefseldistributie, hiermee kun je dus het weefseltype achterhalen:
i.
E-Cadherine in epithelen, ook buiten de adhererende junctie
II. Desmosomale Cadherines
III. Proto-cadherines
i.
Ze spelen een belangrijke rol in de morfogenese en kanker-invasie via
op/neerregulatie. Verder zijn ze belangrijk bij de embryonale ontwikkeling.
ii. Cadherines ondergaan homofiele interacties; afhankelijk van de Ca2+-bindende
plaatsen tussen de cadherine-domeinen; er ontstaan rigide oligomeren die transinteracties kunnen ondergaan die vervolgens laterale interacties ondergaan
waardoor een rits-structuur ontstaat.
iii. De cis- en transinteracties ontstaan o.b.v. tenminste 3 van de 5 extracellulaire
cadherine-domeinen
iv. E-Cadherines in de adhererende junctie:
a)
De C-terminus hecht aan actine via α- en β-catenine of via p120-catenine;
Borstkanker kan ontstaan door een mutatie waardoor E-Cadherine verloren gaat.
Mutaties in β-catenine in tumorcellen kan leiden tot een verstoorde cel-cel-adhesie, evenals het ontstaan van vrije
β-catenine die kunnen migreren naar de kern. Wanneer dit in de kern terecht komt, kunnen ze de celcyclus
stimuleren via de Wnt-pathway
b. Desmosomen; deze komen voornamelijk voor in epitheelcellen, evenals gladde spiercellen en
zorgen voor de adhesie aan de buurcel waardoor mechanische krachten verdeeld kunnen
worden. Intracellulair zijn ze verbonden aan de IF
I. De CAM’s van de desmosomen zijn desmogleine en desmocolline (desmosomale CAM’s).
Hiervan interageert het cytosolisch domein via de adapterproteïnen plakoglobine
(analoog aan β-catenine) en plakofilines aan de IF.
1
De Cadherines kunnen een grote familie vormen van 100 leden, onderverdeeld in 6 subfamilies doordat ze
gecodeerd worden door multipele genen en een alternatieve RNA-splicing ondergaan.
3—16
II. Het zijn de adapterproteïnen die de ‘plaques’ vormen op een elektronmicroscopische
foto
Pemphigus Vulgaris → pathologie waarbij het lichaam antistoffen aanmaakt tegen desmogleine; het lichaam kan
deze juncties niet gebruiken voor de aanhechting aan de basale lamina en er ontstaan blaren. Oplossing: steroïden
geven
c. Hemi-desmosomen; dit type lijkt sterk op de desmosoom; alleen komt hij voor aan de basale
pool van epithelen en zorgt daar voor de verankering aan de basale lamina. In het cytosol zijn
ze verbonden met IF.
3. Gap-junctions; cytosolische doorgang tussen 2 cellen waardoor een snelle diffusie van kleine
wateroplosbare moleculen mogelijk wordt. Deze juncties komen bovendien ook voor in nietepitheliale weefsels. Ze vormen clusters in laterale celmembranen in hexagonale structuren
a. Deze vrije doorgang van partikels kleiner dan 2000 D (1; 2 nm diameter) wordt mogelijk
gemaakt door de rijke eiwitstructuur. Let wel; er bestaat een grens op de 1200 D; daaronder is
er absoluut vrije doorgang (dus voor ionen, precursoren van macromoleculen, intermediaire
metabolieten en kleine signaalmoleculen), daarboven is de passage variabel en gelimiteerd.
b. Een gap-junction bestaat uit 12 transmembranaire connexines, waarbij 6 connexines de cilinder
vormen van één membraan; een connexon hemichannel. Het andere membraan vormt ook 6
connexines die tegen elkaar aan komen te liggen
c. Elk connexine bestaat uit 6 transmembranaire domeinen.
d. Er bestaat meer dan 20 soorten connexinen, die onderling verschillen per celsoort.
e. Er bestaan homotypische gap junctiekanalen → cellen die slechts één type connexine tot
expressie brengen, maar meestal zijn het twee of meerdere connexinen → heterotypische
gapjunctie kalanen, hierdoor wordt overigens ook verschillende doorgankelijkheid per
connexon mogelijk gemaakt. Het is zeer belangrijk te realiseren dat de pH, Ca2+ en fosforylatie
invloed hebben op de permeabiliteit van de gapjunctie
f. Functioneel:
I. Door het bestaan van deze juncties in chemische synapsen is er een 1000x snellere
transmissie mogelijk van signalen
II. Gecoördineerde contractie in de hartspier wordt mogelijk door ionuitwisseling tussen
spiercellen
III. In hormoongevoelige weefsels wordt de vorming van IInd messengers geïnduceerd
waarmee de buurcellen gestimuleerd
IV. Ze zijn belangrijk in de metabole koppeling tussen cellen (bouwsteenuitwisseling of
intermediaire metabolietuitwisseling).
3—17
4. Samenstelling van extracellulaire matrix en hechting van (niet-)
epitheliale cellen aan ECM + extravasatie van WBC bij ontsteking
Inleiding
De cel-matrix-adhesie wordt mogelijk gemaakt via adhesie-receptoren in de intercel-matrix-ruimte en aan
proteïnen in de ECM. Deze adhesiereceptoren behoren tot de integrinefamilie.
Dan kun je al onderscheid maken tussen epitheelweefsel en niet-epitheelweefsel:
 De epitheelcellen hechten via integrines aan de basale lamina, terwijl niet-epitheliale cellen
aanhechten via andere CAM’s
 De epitheelcellen hechten aan een multi-adhesief-proteïne in een 2D-ECM: de basale lamina,
terwijl de proteïnen in niet-epitheliale weefsels aanhechten aan een 3D-ECM.
De basale lamina
De integrines die de verbinding leggen tussen de epitheelcel en de ECM liggen voornamelijk geclusterd in
het hemidesmosoom, maar ook daarbuiten.
De basale lamina bevat dan 3 soorten moleculen:
1. De proteoglycanen; een schokdemper omdat hij water aantrekt en moleculen kan binden
2. Collagene vezels om de mechanische krachten te weerstaan
3. Oplosbare adhesieve ECM-proteïnen, die receptoren binden en crosslinken op het cel-oppervlak.
Deze verschillende bouwstenen vormen zo twee lagen; de lamina lucida en de lamina densa.
Microscopische structuur van de basale lamina:
4—18
 Het is een laag van zo’n 60 tot 120 micron dik, bestaande uit een plat 2D netwerk van ECM
 Het ligt onder elk epitheel of rond elke cel bij spier- of vetweefsel.
 De basale lamina speelt een cruciale rol bij weefselregeneratie en bij de embryonale ontwikkeling
(zo blijft een 4-8-cellig embryo rond door de basale lamina)
 Bij de ontwikkeling van het zenuwstelsel kunnen neuronen migreren langs ECM-pathways die
bestaan uit de basale lamina.
 Het maakt het bestaan van de bloed-hersenbarriere in de hersenen mogelijk, evenals het filter in
de nefronen van de nier.
 De componenten van de basale lamina worden aangemaakt door de bovenliggende cellen:
 Type IV collageen die het 2D-netwerk vormt
 Laminine (eiwit); vormt het 2D-netwerk met collageen en legt de verbinding met integrines.
 Entactine/nidogen (eiwit); het zorgt voor de crosslinking/verbinding van collageen met
laminine
 Perlecan (proteoglycan); het bindt en crosslinked ECM-componenten en cel-oppervlakmoleculen, waaronder collageen IV
 De connectie met bovenliggend weefsel wordt gemaakt door adhesie van de α6β4-integrines
(epitheelcelreceptor) aan de laminines (indirect aan collageen) van de basale lamina
 Aan de onderkant ligt het vast in bindweefsel via collageen-vezels, die ingebed liggen in de
proteoglycanrijke matrix (vb. huid: collageen type VII)
Basale membraan = de basale lamina + de collageen-bevattende lagen van epitheel- resp. bindweefsel.
Verdieping voornaamste structuren.
 Collageen type IV:
a. Trimeer proteïne; bestaande uit 3 α-ketens
b. Het proteïne kan een homo- of heterotrimeer vormen (dezelfde of verschillende helices)
c. Één keten = repeterende set van de 3 aminozuren (glycine - proline - OH-proline)
Als glycine vervangen wordt door een ander AZ ontstaat er een mutatie en wordt het collageen
onstabiel, glycine is ALTIJD aanwezig in collageen
d. Als dan de triple helix is gevormd, moet deze nog assembleren tot een netwerk, opnieuw
geïllustreerd in de bijlagen:
I. De C-terminus vormt per definitie de kop
II. 2 C-termini dimeriseren tot een dimeer
III. Vervolgens kunnen de N-termini tetrameriseren tot een tetrameer
e. Draaiing: elke keten in linksom gedraaid in ene helix zodat de H atomen van glycine in het
centrum van de helix liggen en de 3 ketens zijn rechtsom gedraaid in een triple helix
 Laminine:
f. Dit proteïne is cruciaal voor de crosslinking van collageen aan de integrines
g. Het is een multi-adhesief eiwit, dat enkel aanwezig is in de basale lamina waar het zorgt voor
de organisatie van ECM-componenten, regeling van de cel-matrix-adhesie en verantwoordelijk
is voor migratie en celvorm.
h. Het bestaat uit een α, een β en een γ-keten (en is dus heterotrimerisch) die assembleren in een
kruisvorm
i. De (enkele) C-terminus is een α-keten die bestaat uit een globulair LG-domein voor Ca2+afhankelijke binding aan de integrines in de hemidesmosomen en aan proteoglycanen
 Crosslinkende proteïnen:
j. Proteoglycanen → glycoproteïnen met covalent gebonden polysacharideketens (de zgn.
glycosaminoglycanen (GAG))
4—19
k. Komen voor aan het celoppervlak of zijn gesecreteerd door de cel
l. GAG → lange, lineaire polymeer van disachariden, die samen met een glycoproteïne een
proteoglycan vormt (sterk wateraantrekkend). Ze zijn ingedeeld in 4 grote groepen; zie prof.
Van Lint.
m. In de basale lamina zit perlecan die de meeste andere bestanddelen van de basale lamina kan
crosslinken.
Mutaties in dit perlecan kunnen leiden tot dwerggroei en spierafwijkingen.
De extracellulaire matrix van niet-epitheliale weefsels
Zoals hierboven al is aangegeven, hebben deze weefsels geen basale lamina, maar ondergaan wel cel-celen cel-matrix-interacties door gelijkaardige moleculen.
Bindweefsel geeft een voorbeeld:
 De hoeveelheid matrix is sterk overheersend over de celhoeveelheid
 De ECM wordt geproduceerd door vnl. fibroblasten en bestaat hier uit:
 Fibrillaire collagenen (type I, II en III)
 Fibronectine; een multi-adhesief eiwit (equivalent van integrine)
 Proteoglycanen
 Hyaluronan → niet gesulfateerd GAG
 Eventueel nog elastine
Collageen
Er bestaan dus verschillende typen collageen, ingedeeld in 5 verschillende groepen.
De vorming van collageen is een zeer strikt proces:
1. Aan de pro-α-ketens afkomstig van het RER worden oligosachariden aangehecht tot vorming van
een propeptide
2. Deze propeptiden associëren tot vorming van trimeren, die gestabiliseerd wordt door
disulfidebruggen.
3. Vervolgens wordt proline (soms lysine) gehydrolyseerd, waarbij vitamine C van essentieel belang is.
Dit geeft de verklaring waarom scheurbuik op kan treden bij vitamine-C gebrek
4. 3 trimeren draaien rechtsdraaiend in elkaar tot vorming van een triple-helix dat gestabiliseerd
wordt door de binding aan Hsp47 (chaperone) → procollageen
5. Het procollageen wordt getransporteerd naar het Golgi-complex waar er laterale associatie
plaatsvindt en er korte bundels gesynthetiseerd worden. Deze worden gesecreteerd en de N- en Ctermini er nog afgehaald via extracellulaire enzymatische activiteit (peptidasen, vb. bonemorphogenetic protein-1)
6. De typerende dwarse streping van de fibrillen ontstaat door de schuivende zijdelingse associatie
(50-200 nm).
7. De fibrillen crosslinken (Lys en hydroxy-Lys) vervolgens covalent (via vorming reactieve aldehyden),
dit geeft korte, niet-gedraaide segmenten aan het eind die zorgen voor stabilisatie en stevigheid.
 Collageen fibril
Variatie in de verschillende soorten collageen kan optreden in:
1. Het aantal en de lengte van de triple-helix segmenten
2. Flankerende of onderbrekende (de niet-gedraaide) segmenten wat verschil oplevert in de 3Dstructuur (en daarmee verbonden de flexibiliteit)
3. Variatie in de covalente interacties in α-ketens (hydroxylatie, glycolysering, oxidatie of crosslinking)
4. Specifiek voor IV → 2D-netwerk via kop-kop, staart-staart en zijdelingse interacties
4—20
Bespreking van de verschillende soorten collageen.
 Type I collageen (meest frequent in het menselijk lichaam):
 Vormt parallelle bundels ipv dikke vezels, waardoor het grote trekkrachten kan weerstaan (vb.
pezen en botten)
 Het kan type V incorporeren waardoor er dunnere vezels ontstaan
 Het kan dikkere vezels vormen door te binden aan type VI en aan proteoglycans
Osteogenesis imperfecta → mutaties in type I die de glycine muteert en dus zorgen voor een instabiele structuur
van de collageen-helix. Patienten zullen dus bij het minst geringste trauma hun botten breken
 Type II collageen:
 De bundel is dunner dan type I
 Lopen variabel door de proteoglycanmatrix
 Kris-kras gecrosslinked aan de visceuze matrix-proteoglycans door type IX; géén fibrillen
 In kraakbeen zorgt het voor de kracht en weerstand tegen vervorming doordat het
geassocieerd is met bepaalde proteoglycans.
Mutaties in collageen-gerelateerde genen kunnen leiden tot verschillende pathologieën:
 Ehlers-Danlos-syndroom; leidt tot een abnormaal type eiwit door mutaties in:
 Collageen I of V → hypermobiliteit
 Collageen III → vaat-ruptuur
 Lysyl-hydroxylase
 Pseudo-xanthoma elasticum → autosomaal erfelijke systeemziekte gekenmerkt door elastose (degeneratie
van de elastische vezels; weefsel kan je uitrekken maar het gaat niet meer terug naar de oorspronkelijke
vorm.)
 Marfan syndroom → mutatie in fibrilline-1-gen die aanleiding geeft tot fout in een component van de
microfibrillen, die in de ECM zorgen voor de elasticiteit. Dit gen is nodig op plaatsen van mechanische
stress en onder de basale lamina; bv. in de aorta. Bij de (te) sterke uitzetting (verhoogde bloeddruk) kan
dit leiden tot aneurysma (uitzetting, maar geen inkrimping: zakvorming) → dood. Opvallend zijn de
lange vingers en ledematen.
Proteoglycanen in de ECM
Zoals al eerder is beschreven, is een proteoglycan een combinatie van een glycoproteine en een GAG
(glycoaminoglycanen)(meestal 2 verschillende GAG’s). De GAG’s vormen 4 groepen:
1. Hyaluronzuur, dit is niet gesulfateerd en wordt gesecreteerd in de extracellulaire ruimte waar het
kan binden aan een celoppervlak via CD44.
a. Kan cellen scheiden omdat het een losse, gehydrateerde en poreuze substantie vormt.
b. Het speelt een rol bij de celbeweging; meestal gecorreleerd aan een daling van hyaluronan
door een stijging van extracellulair hyaluronidase. Daardoor daalt CD44 ook en de celbeweging
stopt, zodat cel-cel-adhesie geïnduceerd kan worden
c. Het kan een gel vormen wanneer het random-coils vormt. (Een flexibele, waterbindende
structuur)
d. Doordat het water kan binden, zal het opzwellen en zo een rol spelen in drukresistentie
e. Wanneer vele hyaluronans assembleren tot een lang molecuul waarop aggrecan-moleculen
niet-covalent binden vormt het een kraakbeenstructuur
2. Chondroitinesulfaat en dermatansulfaat
3. Heraparansulfaat en heparine (hypergesulfateerd)
4. Keratansulfaat
4—21
De synthese start in het ER met het kernproteïne, vervolgens worden de O-linked of N-linked GAG-ketens
erop aangehecht in het Golgi-complex. Deze GAG’s kunnen dan eventueel nog verlengd of gemodificeerd
(sulfatering) worden.
Deze proteoglycanen (verder onder PG) hebben een uitgebreide functionaliteit, zo komen ze o.a. voor in de
ECM als wel aan het celoppervlak. De erop aangehechte GAG’s blijken essentieel te zijn voor de functie van
het PG, omdat wanneer deze GAG-keten wordt gewijzigd, de functie mee veranderd; 2 belangrijke
voorbeelden zijn:
1. Perlecan (basale lamina); is een groot core-proteïne waarop 3 of 4 GAG’s staan ingepland.
2. Syndecan; komt voor aan het celoppervlak en zorgt voor de celverankering via binding aan
collageen en fibronectine (komt dus voor in niet-epitheliale cellen)
Fibronectine vormt de equivalent van laminine uit de epitheelcel en wordt door veel celtypen gemaakt. Het
komt zowel voor in de ECM als aan het celoppervlak. Het wordt gecodeerd door één gen, maar toch
bestaan er meer dan 20 isovormen. Dit proteïne heeft een uitgebreide functionaliteit:
 Het speelt een rol in de migratie en differentiatie in de embryonale ontwikkeling van cellen
 Het is belangrijk bij de bloedstolling en migratie van bloedstollende factoren (wondheling)
 Het slaat dus de brug tussen de integrines en collageen/heparansulfaat PG (hechting van cellen)
Een fibronectine is een homodimeer van 2 polypeptiden die C terminaal aan elkaar gebonden zijn via 2
disulfide bruggen. Elke keten bezit 6 functionele regio’s met verschillende ligand-bindende eigenschappen
De integrine-binding:
In epitheelcellen zijn de integrines verbonden met de IF, en zorgen zo voor de verbinding aan de basale
lamina (cel-ECM-adhesie) terwijl de integrines in niet-epitheliaal weefsel zijn verbonden met actine
(stressvezels).
In niet-epitheliaal weefsel zijn deze verbindingen variabel, dus kort- of langdurend, maar de verbinding
wordt opnieuw gemaakt via de integrines (fibroblasten en witte bloedcellen) en de proteoglycanen op het
celoppervlak die binden aan fibronectine. Intracellulair zijn ze verbonden met het actine-netwerk of via
andere CAM’s (vb. N-CAM). Een praktisch voorbeeld wordt gevormd door de witte bloedcellen die binden
aan het endotheel van de bloedvatwand voor de extravasatie.
De N-CAM’s (Neuraal cel adhesie molecule)(Ig-CAM) worden gecodeerd door 1 gen, maar er zijn wederom
meerdere isovormen. Extracellulair bevat hij 5 Ig-repeats en 2 FN type III-repeats en is intracellulair
verbonden met het cel-skelet. Het kan siaalzuren binden, die sterk negatief geladen zijn. Wanneer er veel
moleculen worden gebonden, zal dit onderlinge afstoting teweegbrengen, wat cellen op een afstand houdt.
Daarom bestaat ongeveer 25% van de N-CAM’s in een embryo uit siaalzuren, wat later reduceert tot 8%.
Dit maakt o.a. de weg vrij voor bijvoorbeeld axonengroei.
Integrines zijn heterodimeren opgebouwd uit α- en β en vaak celsoort-specifiek. Ze spelen een centrale rol
in de celadhesie, -migratie en in ontstekingsreacties (migratie van de witte bloedcellen). Ze zijn afkomstig
van 2 subgroepen:
 De groep die bindt aan RGD-sequenties (FN)
 En een groep bindend aan laminine
Sommige α-subunits dragen een I-domein voor binding aan collagenen of CAM’s
De adhesie wordt bepaald door de bindingsactiviteit van de integrines; de integrines hebben dan ook 2
conformaties die ze kunnen aannemen:
4—22
1. Low-affinity → het αβ-dimeer is gebogen en de cytoplasmatische C-termini zijn samengebonden.
Dit is de vorm die niet bindt, inactief is, wat bepaald wordt door de cel
2. High-affinity → de integrine is uitgestrekt en de ligand-bindende plaats is nu toegankelijk, omdat
de C-termini uit elkaar staan, het is actief
Deze conformatie van de integrines bepaalt de outside-in-signalling:
 Integrine bindt aan RGD-sequentie (ECM of CAM) → de C-termini wijken uit elkaar
 Adapterproteïnen reageren hierop en gaan signaalmoleculen aanmaken
 De signaalmoleculen worden naar de kern getransporteerd waar ze hun functie op de
gentranscriptie kunnen uitoefenen.
 De veranderende metabole status leidt tot binding of dissociatie van intracellulaire
signaalmoleculen aan/van de C-termini → scheiding/associatie van de C-termini → activatie of
inactivatie van het integrine (vb. de bloedplaatjes)
De adhesie wordt vervolgens weer bepaald door het aantal integrines op het celoppervlak:
 Alleen de rijpe RBC en WBC mogen het beenmerg verlaten en naar het bloed gaan, de voorlopers
blijven in het merg
 Deze voorlopercellen hechten aan de FN van de ECM en aan V-CAM op stromacellen via α4β1integrine wat leidt tot hechting, deling en differentiatie.
 Na de rijping/differentiatie treedt er een daling van het aantal integrines op WBC en RBC op, en die
komen los van de matrix en stromacellen en komen terecht in de bloedcirculatie.
Leukocytmigratie uit de weefsels
Het hele proces wordt geïnitieerd door een opeenvolging van bindingen en loslatingen tussen de WBC en
het endotheel van het bloedvat. Dit vindt enkel plaats in gebieden van ontstekingen. Deze selectiviteit
wordt mogelijk gemaakt door de aanwezigheid van P-selectine op endotheelcellen:
1. Selectief door het Ca2+-dependent lectine-domein dat bepaalde oligosachariden herkent
2. Het verschijnt na activatie van endotheel o.i.v. oplosbare mediatoren → chemokines.
De leukocyt-interactie gebeurt via een 5-staps-reactie, geïllustreerd in de bijlagen.
Leukocyte adhesion deficiency:
1. Type I → defect in de suikeraanmaak dat het ligand vormt voor selectine-P → rolling is niet mogelijk
2. Type II → defect in de synthese van β2-subunits, de rolling kan wel geïnduceerd worden, maar stevige
adhesie blijft uit en de WBC kan dus niet uittreden
Beide zullen tenminste leiden tot chronische ontstekingen.
4—23
5. Actine + actine (de)polymerisatie + actine bindende eiwitten
Inleiding
Het cytoskelet bestaat uit 3 bouwstenen; de microfilamenten, de intermediaire filamenten en de
microtubuli
De microfilamenten
De microfilamenten worden gevormd door actinepolymerisatie en komen voor in:
 Epitheelcellen:
 Ze vormen daar het centrum van microvilli
 Ze vormen een netwerk onder de plasmamembraan; de celcortex
 Ze vormen een adherens band → de band die in verbinding staat met de adhererende junctie
 In migrerende cellen
 Netwerk in ‘leading edge’ via lamellipodium/filopodium
 Tijdens celdeling voor de contractiele ring
Actine
Actine is een zeer belangrijk eiwit in de cel. Het vormt zo’n 1-5% van alle eiwitten in de cel en is uitermate
veelzijdig. Het wordt gecodeerd door 6 genen, die verschillende isovormen hebben (4α voor contractiele
structuren, 1β in de celcortex en de leading-edge (beweging) en 1γ in stress-fibers).
De monomere vorm is G-actine (globulair), wat een filament van polymeren kan vormen → F-actine. Dit Factine is een gedraaide streng van ‘knopen’ van 7-9 nm die zichtbaar zijn bij EM. Elke ‘knoop’ is 1 subunit.
Het gevormde actine-cytoskelet is zeer flexibel en dynamisch, en heeft een aantal cruciale eigenschappen:
 De filamenten kunnen verschillende lengten hebben (i.v.m. de dynamiek)
5—24
 Door crosslinking ontstaan bundels en netwerken
 Snelle assemblage en afbraak is mogelijk waardoor de cel mobiel wordt en celvormvariatie mogelijk
maakt.
 De polymerisatie tot F-actine gebeurt in 3 stappen, met bepaalde omgevingsfactoren:
 G- en F-actine-Mg2+ vormt een complex met ATP of ADP (ATP-G-actine en ADP-F-actine)
 G-actine: 2 lobben + ATPase gleuf met activiteit waar ATP en Mg2+ gebonden kan worden
 Wanneer er geen nucleotide (ATP) bindt → denaturatie/afbraak
 Wel nucleotide-binding → conformatieverandering, en als dan Mg2+ aanwezig is, zal Gactine polymeriseren tot F-actine en ATP gehydrolyseerd worden.
Het gevormde F-actine is een filament → een gedraaid koord van 2 subunit-rijen, en een unit bestaat uit
(2x14) 28 subunits, verdeeld over een afstand van 72 nm. Hierin wijzen alle subunits in dezelfde richting
waardoor er polariteit ontstaat: de -kant is de kant waar de gleuf open ligt, en de +kant is de kant waar de
gleuf contact maakt met de andere subunit.
Een rij subunits is een gedraaide helix waarin iedere subunit (knoop) wordt omgeven door 4 andere
subunits.
Het filament is dus dynamisch; polymerisatie of depolymerisatie zal optreden:
 Wanneer G-actine voorkomt in een ionenrijke oplossing (Na+, K+ of Mg2+) zal er polymerisatie
optreden tot F-actine, hierbij zijn géén bijkomende proteïnen nodig.
 Wanneer F-actine terecht komt in een ionenarme omgeving, zal het depolymeriseren, wat gepaard
gaat met ATP-hydrolyse.
De polymerisatie tot F-actine is via verschillende methoden te bestuderen:
1. Viscometrie → wanneer F-actine langer wordt is de oplossing viskeuzer en is er minder flow.
2. Sedimentatie (ultracentrifugatie) → F-actine zit in de pellet, G-actine in het supernatans
3. Fluorescentie-spectroscopie → methode om de opbouw en afbraak zichtbaar te maken, omdat
fluorescerend F-actine een ander fluorescerend spectrum heeft dan G-actine
4. Fluorescentie video-microscopie → hiermee wordt de groei van F-actine gevisualiseerd.
Polymerisatie van G-actine tot F-actine:
Hierbij wordt geïllustreerd dat de polymerisatie veel sneller verloopt wanneer er reeds een nucleus is
gevormd → een startpunt voor de polymerisatie, bestaande uit tenminste 3 al gepolymeriseerde G-actines.
De daadwerkelijke polymerisatie verloopt dan als volgt:
1. Het proces wordt geïnitieerd doordat ATP-gebonden G-actine-monomeren onstabiele oligomeren
vormen; de lag-phase. Deze worden stabiel als er een nucleus ontstaat en dan terecht komt in de
nucleation phase.
2. Doordat er al een nucleus is gevormd, kan de elongatie veel sneller verlopen aan beide kanten via
toevoeging van ATP-G-actine tot vorming van ATP-F-actine tot er een evenwicht ontstaat tussen Gen F-actine → de steady state.
3. De steady-state-phase is niet statisch, maar dynamisch; er is constante uitwisseling van G-actine,
maar er vindt géén wijziging plaats van de lengte van de filamenten.
Het bestaan van de kritische concentratie van G-actine-monomeren (CC) vormt de grens tussen opbouw
en afbraak:
 Onder de CC vindt er geen assemblage plaats van filamenten, maar vanaf de CC wel.
 De steady-state wordt dus gekenmerkt door de exacte CC: 0,1 micromolair:
5—25
 Minder dan 0,1 μM aanwezig in de cel leidt tot afbraak van F-actine
 Meer dan 0,1 μM leidt tot polymerisatie van G-actine. Op deze wijze blijft de intracellulaire
concentratie van G-actine-monomeren redelijk constant.
Specifieke eigenschappen van beide zijden van F-actine:
 De +kant verlengt zo’n 5-10 keer sneller dan aan de -kant en is afhankelijk van ATP-gebonden Gactine. Dissociatie is bijna hetzelfde als aan de -kant en onafhankelijk van G-actinemonomeerconcentratie.
 De -zijde verlengt dus 5-10 keer trager en is eveneens afhankelijk van ATP-gebonden G-actine. De
dissociatie is bijna gelijk aan de +zijde, en onafhankelijk van de concentratie van de G-actinemonomeren t.g.v. verschil in CC-waarden aan de +- en -kant2.
De gevolgen die optreden wanneer de CC aan beide zijden verschilt; 3 fasen te onderscheiden:
1. Wanneer de concentratie van ATP-gebonden G-actine minder is dan 0,1 μM (< CC+) → géén
filamentaangroei
2. Wanneer de concentratie ligt tussen de 0,1 - 0,6 μM: tussen CC+ en CC- → aangroei aan alleen de
+kant
3. Wanneer de concentratie hoger is dan 0,6 μM: > CC- → groei zal optreden aan beide zijden, alleen
zal de +kant sneller groeien dan de -kant.
Wanneer de steady-state is bereikt (concentratie ligt in situatie 2) kan er groei aan de +kant optreden,
maar afbraak aan de -kant → lengte blijft constant, maar er treedt treadmilling op → door afbraak aan
één zijde en opbouw aan de andere kant zal er beweging ontstaan. Hierbij liggen de oudste
ingebouwde monomeren aan de -kant; ATP-G-actine bouwt in, wordt gehydrolyseerd, maar omdat Pi
traag het filament verlaat → assymmetrie.
De controle op de actinepolymerisatie wordt als volgt gevormd:
De CC ligt op 0,1 μM, maar de totale concentratie in de cel is 0,5 mM, met als gevolg dat de G-actineconcentratie boven de CC ligt. Toch is maar 60% gepolymeriseerd:
 Via stimulerende proteïnen die binden aan G-actine en de treadmilling bevorderen:
 Een Nucleotide Exchange Factor bindt en opent de gleuf waardoor ADP het complex kan
verlaten en ATP opnieuw kan binden; stimulatie van de polymerisatie. (vb. Profiline)
 Het helpt bij de toevoeging van monomeren aan de +kant, omdat het bindt tegenover het
ATP-bindend domein; daarna komt het los
 Controle op de actine-assemblage bij de celmembraan.
 Via inhiberende G-actine bindende proteïnen:
 Thymosine β-4; blokkeert het ATP-bindend domein in G-actine
 Door de blokkering fungeert het als buffer voor monomerisch actine
 Wanneer de concentratie van dit proteïne stijgt, stijgt Tβ-4-G-actine en dus minder Factine; geïllustreerd voor beide proteïnen in de bijlagen.
Treadmilling kan gestimuleerd worden door profiline en cofiline:
1. Cofiline bindt aan een ADP-subunit in F-actine waardoor het een conformatieverandering
ondergaat en het filament afbreekt, wat depolarisatie in de hand werkt, omdat er een tweede -kant
2
De CC-waarde aan de +kant → 0,12 μM
De CC-waarde aan de -kant → 0,60 μM
5—26
ontstaat. Vervolgens komt het los van de ADP-monomeren en kan het opnieuw binden aan ADP-Factine
2. De vrije ADP-monomeren kunnen herladen worden door profiline → inbouw aan de +kant
In het begin is reeds aangegeven dat actine onder verschillende verschijningsvormen kan voorkomen, hier
enigszins uitgebreid. De voorkomenstoestand wordt geregeld door de CH-domein superfamilie:
1. Netwerkvorming; in vitro
2. In vivo; zeer gevarieerd:
a. Bundels (microvilli); bindingsplaatsen liggen dicht bij elkaar (fimbrine en α-actinine)
b. Netwerken; frontvorming van de bewegende cel
c. Via actine-crosslinkende eiwitten met 2 bindingsplaatsen voor F-actine
d. 2 plaatsen op 1 eiwit (fimbrine)
e. Grote afstand tussen bindingsplaatsen: spectrine
f. Flexibel tussen bindingsplaatsen: filamine
Wanneer de bindingsplaatsen voorkomen op afstand en flexibele zijarmen: netwerk in de cel-cortex
(spectrine, dystrofine, filamine), of wanneer eiwitten binden aan eiwitten van het celmembraan kan er ook
nog een netwerk ontstaan in de cel-cortex.
De CH-domein-proteïnen (calpoline homoline) die je moet kennen:
Proteïne
Fimbrine
α-actinine
Domein-organisatie
Lokatie
Microvilli, sterocilia, adhesieplaques, gist-
actinekabels
Filopodia, lamellipodia, stressfibers,
adhesieplaques
Spectrine
Filamine (elastisch
→ beweging)
Corticale netwerken
Filopodia, pseudopodia, stressfibers
De verbinding tussen de actinefilamenten en het celmembraan moet op een andere manier worden
gevormd, namelijk via adapterproteïnen die lateraal op het actinefilament liggen of aan het einde zijn
gebonden. Een voorbeeld is de rode bloedcel:




Een RBC heeft een netwerk van korte filamenten (14 subunits) onder het membraan
De -kant wordt gestabiliseerd door tropomoduline
Zijdelings stabilisatie gebeurt door tropomyosine
Onder het plasmamembraan ligt een 2D-netwerk van filamenten die gecrosslinked zijn door 6
flexibele spectrineproteïnen; er ontstaat een soort visnet waardoor stevigheid én veerkracht
gewaarborgd zijn.
5—27
Spectrine is vervolgens aan het membraan verankerd via ankyrine en glycophorine. Vervolgens zullen Band
3 en glycophorine een tweede manier van verankering vormen, zie de bijlage. Hier is ook duidelijk
geworden hoe het komt dat de RBC zo’n flexibele vorm heeft; door de lange (dunne) spectrines en de korte
bindingen kan de cel snel van vorm veranderen.
Soms moet een cel zeer stabiel (constante lengte) en zeer elastisch zijn, dit kan enkel worden bereikt als
het F-actine kort wordt gehouden, wat mogelijk is door capping. Dit gebeurt dus o.a. in de RBC, of in de
spiercellen aan of de +kant of de -kant:
1. CapZ → een capping-proteïne dat aanhecht aan de +kant:
a. Dit proteïne is in hoge concentraties aanwezig; géén polymerisatie aan de +kant
b. Het staat onder invloed van PIP2, PIP2 kan CapZ inhiberen en d.m.v. regulatorische proteïnen zal
er toch groei plaatsvinden aan de +kant
2. Gelsoline bindt aan de +kant nadat Ca2+ heeft gebonden; dit leidt tot een insertie in F-actine
waardoor er een breuk optreedt en er een nieuwe -kant ontstaat. Gelsoline blijft gebonden aan de
+kant, zodat er daar geen opbouw kan plaatsvinden.
3. Tropomoduline bindt aan de -kant met behulp van tropomyosine:
a. In cellen waar actine een constante lengte moet hebben (sarcomeren of in RBC)
b. Het zorgt voor stabilisatie van F-actine door te binden aan de -kant en aan tropomyosine, wat
gebonden zit aan de zijkant van F-actine
Het cytoskelet vormt een essentieel onderdeel voor de cel om te kunnen overleven of te delen; daarom
vormt het een gewild richtpunt voor toxines. Een aantal staan hieronder genoemd:
1. Cytochalasine → proteïne dat bindt aan de +kant waardoor er depolymerisatie optreedt en er geen
motiliteit meer mogelijk is
2. Latrunculine → proteïne dat bindt aan G-actine, zodat het niet meer kan polymeriseren
3. Falloidine → verbindt de subunits in F-actine zodat er geen depolymerisatie op kan treden, zelfs
niet wanneer de concentratie onder de CC-waarde komt te liggen.
Zoals in het begin al was aangegeven, gebeurt de vorming van een nieuw filament makkelijker wanneer er
reeds een nucleus beschikbaar is. De nucleatiefase bepaalt dus waar en hoeveel F-actine gevormd wordt in
de cel. Ook hiervoor zijn er weer speciale actine-nucleatieproteïnen:
1. Formine → een proteïne dat bestaat uit 2 FH2-domeinen die associëren tot 2 halve ringen en
binden aan de twee terminale actine-monomeren met de +kant naar FH2. Hierop kunnen nieuwe
subunits binden, waarbij de 2 domeinen steeds alternerend aan de nieuw gebonden subunit
hechten en zo aan het uiteinde (de +kant) kunnen blijven. Het FH1-domeine vormt een
landingsplaats voor profiline (het proteïne dat ATP-gebonden G-actine synthetiseert). Het dimeer
dat gevormd wordt is uitermate flexibel, en kan zo overigens ook richtingsbepalend werken.
Formine wordt gebruikt voor de vorming van lange filamenten. Mede doordat formine gebonden
blijft, kan CapZ niet binden en kan het filament blijven groeien. Het spreekt voor zich dat teveel
formine ook niet goed is; daarom zal het eerst geactiveerd moeten worden door een
membraangebonden Rho-GTP; dit bindt aan de RBD-sequentie dat in de sequentie van formine zit
geïntegreerd waardoor het kan openvouwen en in werking zal treden.
2. Arp2/3 complex; dit proteïne is specifiek voor netwerkvorming en bestaat uit een complex van 7
proteïnen waarvan 2 actine-related-proteins zijn. De nucleatie wordt geactiveerd wanneer het
complex gebonden is aan WASp (proteïne) en aan een voorgevormd actine-filament. Het kan dan
binden aan de zijkant van een filament met als gevolg dat het Arp2 en 3 lijken op de +kant van
actine, waardoor actine verder kan groeien onder een hoek van 70°. Ook dit staat onder controle
5—28
van WASp; dit is normaalgesproken dichtgevouwen, maar wanneer GTP-cdc42 bindt, kan WASp
openen en wordt het toegankelijk voor Arp2/3.
6. Microtubuli + interacties tussen cytoskeletcomponenten
Inleiding
De microtubuli vormen de grootste component van het cytoskelet. Ze spelen een rol in de celbeweging
(cilia en flagella) en zijn belangrijk bij vesikeltransport in het cytoplasma via (de)polymerisatie of via
motorproteïnen. Bovendien zijn ze essentieel in het aangeven van de richting bij axonengroei en zorgen
voor de scheiding van de chromosomen bij de celdeling (dynamische microtubuli)
De organisatie van de microtubuli start bij het ‘MTOC’→ het MicroTubuli Organiserend Centrum, dit zorgt
eveneens voor de organisatie van de celpolariteit.
Opbouw van de microtubuli
Microtubuli bestaan uit een polymeer van globulaire tubuline subunits die samen een cilinder vormen met
zo’n 25 nm diameter. Ze zijn (globaal) onder te verdelen in:
 Stabiele microtubuli (richting geven aan cel + transport); deze komen voor in:
 Niet-delende cellen
 Cilia
 Zenuwuitlopers; axonen
 In de periferie van RBC en bloedplaatjes
 Niet-stabiele microtubuli (transport):
 Mitose; het vrijgekomen tubuline wordt dan gebruikt voor de aanmaak van het spoelfiguur.
De bouwstenen van microtubuli zijn de volgende:
1. De subunits van microtubuli zijn α- en β-tubuline die tubuline-dimeren vormen
2. α-tubuline kan diep GTP binden, zonder dat er hydrolyse plaatsvindt en β-tubuline bindt GTP aan
het oppervlak, wat het zal hydrolyseren nadat het is ingebouwd in een microtubulus.
6—29
De tubuline-dimeren kunnen vervolgens polymeriseren tot een protofilament. 13 protofilamenten vormen
een bladstructuur die zal roteren en zo omvormt tot een 25 nm tubulus met een α-subunit aan de -kant en
een β-subunit aan de +kant. Vervolgens sluit de structuur en vormt er een ‘seam’; een naad waar α tegen β
komt te liggen. Er ontstaat een microtubulus van 13 protofilamenten die bij voorkeur polymeriseert aan de
+kant (waar GDP gebonden is)
Een microtubulus komt voor in verschillende vormen:
1. Singlet microtubulus; deze zit in het cytosol
2. Een duplet in cilia en flagella, dit bestaat uit een volledige ‘cirkel’ en een onvolledige;
a. De volledige microtubulus bestaat uit 13 protofilamenten
b. De aangehechte bestaat uit slechts 10 protofilamenten.
3. Triplets; voorkomende in centriolen en de ‘basal body’, vormt 1 volledige en 2 onvolledige:
a. Principe is hetzelfde als bij het duplet; één volledige, bestaande uit 13 protofilamenten
b. Twee microtubuli bestaande uit 10 protofilamenten
De microfilamenten kunnen ook niet ‘spontaan’ polymeriseren, hiervoor is een nucleus nodig; de nucleus
wordt hier gevormd door het MTOC, waarbij de -kant verankerd blijft op het MTOC. Let wel: in mitotische
cellen zijn er dus per definitie 2 MTOC’s, waaruit het volledige spoelfiguur ontstaat. Een cilia of flaggelum
ontstaat vanuit een basal body.
In niet-delende cellen migreert het MTOC altijd naar het centrum van de cel = centrosoom!
Centrosoom → structuur bestaande uit 2 centriolen die zijn omgeven door pericentriolair materiaal.
Centriool → 9 sets van triplet-microtubuli.
pericentriolair materiaal → dit is de daadwerkelijke plaats waarde nucleatie plaatsvindt; en wel vanuit het
γ-tubuline ring complex.
Zoals het geval is met de microfilamenten, zijn de microtubuli ook dynamisch, met een uiterst variabele
levensduur; van de deling van een cel tot de levensduur van een axon (levenslang):
 De polymerisatie van de αβ-dimeren gebeurt in de aanwezigheid van MAP’s → Microtubule
Associated Proteins. Die zorgen voor afbraak (per definitie) bij 4°C en re-assemblage bij 37°C
 Zoals zichtbaar is in de grafiek gebeurt de nucleatiefase langzaam, maar de assemblage gaat
daarentegen zeer snel totdat de steady-state is bereikt (merk de analogie op bij actine)
 Ook het principe van de CC is hier gelijk; de CC ligt hier echter op 0,03 μM van αβ-dimeren.
 De groei gebeurt preferentieel aan de +kant (de kant van het β-tubuline) omdat de –kant gevangen
zit in MTOC
 Opnieuw geldt dat de CC+ lager is dan de CC- (dus verschil in CC aan de - en +kant) waardoor
treadmilling (= groei aan + en verlies aan – kant) mogelijk is (soort transport, ~ actine)
 De cytosolconcentratie ligt rond de 10-20 μM; er dus treedt er preferentieel polymerisatie op. (Hoe
lager de CC, hoe liever er polymerisatie optreedt)
Maar…, niet alle MT gedragen zich hetzelfde wanneer de dimeerconcentratie rond de CC ligt; er bestaan
namelijk catastrofes en rescues → periodes van extreme verkorting of extreme groei. Dit is onafhankelijk
van treadmilling, maar gebaseerd op de verschillende aspecten van de + en -uiteinden.
 Β-tubuline aan de +kant en hydrolyse van het gebonden GTP bij toevoeging van een nieuwe
dimeer:
 Wanneer terminaal een GTP-gebonden β-tubuline zit: recht uiteinde tijdens snelle groei, want
er ontstaat een GTP-cap (de hydrolyse gebeurt langzamer dan de dimeerbinding)
6—30
 Hydrolyse van GTP-β-tubuline tot GDP in terminaal β-tubuline leidt tot kromming; de vorming
van zgn. ramshorens.
 GDP-β-tubuline op het uiteinde → per definitie een gekromd uiteinde (oude MT) en er treedt
verkorting op (catastrophe)
Ook dit proces wordt weer door bepaalde proteïnen beinvloedt:
1. Colchicine → dit proteïne bindt aan de tubuline-dimeren, waardoor ze niet kunnen worden
ingebouwd, maar er vindt nog steeds afbraak plaats van de bestaande MT → de celdeling kan niet
mogelijk worden gemaakt. (Wordt toegepast bij jichtbehandeling)
2. Taxol → toxische stof die bindt aan de MT waardoor er geen verkorting mogelijk wordt en er dus
ook geen mitose op kan treden; dit is een gekend medicijn voor de chemokuren van borst- en
eierstokkankerbehandeling.
3. Vinblastine→ bindt aan + kant waardoor er geen dynamica meer mogelijk is; behandeling van
kanker
De verdeling van de MT in de cel is afhankelijk van de plaats van de MTOC (bij een niet-mitotische cel) en
van search-and-capture → stabilisatie van een MT doordat er een eiwit bindt aan de +kant en het MT geen
catastrophes kan ondergaan.
 Het MT verdwijnt wanneer het veel catastrophes ondergaat en weinig rescues; bij een groeiproces
gebeurt exact het omgekeerde.
 Bij het ontmoeten van een structuur of organel dat de +kant stabiliseert treedt er search-andcapture op: de +kant bindt, dit werkt stabiliserend en catastrophes zijn nu onmogelijk.
De eerder genoemde MAP’s hebben invloed op de dynamiek van de MT, deze zijn aanwezig wanneer
assemblage vereist is.:
1. MT-stabiliserende eiwitten → proteïnen die de MT’s bekleden door MAP’s: er treden minder
catastrophes op of versnelde groei:
a. Ze hebben een basisch domein (positief geladen → binding aan de negatieve zijde van de
tubuline C-terminus),
b. Hebben een zuur-projectie-domein (van variabele lengte) waardoor ze aan een membraan
kunnen binden via IF of andere MT → spacing.
c. Na fosforylatie van het projectiedomein d.m.v. MAP-kinase of CDK → geen binding aan MT,
waardoor de MT’s kunnen afbreken.
Dit ‘spacing’ zorgt ervoor dat er een strikt geordende structuur van MT onderling ontstaat omdat ze
door bepaalde MAP’s andere MT op een afstand kunnen houden; het MAP bindt dan (welke MAP is
afhankelijk van het celtype) en door een dwars-uitstaande uitloper houden ze anderen op een
afstand.
Dan zijn er nog de TIP’s → microtubuli-stabiliserende-proteïnen die binden aan de +kant van
(groeiende) MT:
 Er treden minder catastrophes op, maar meer rescues → blijvende groei
 Het vormt een capture-proteïne voor binding van groeiende MT.
 MT-destabiliserende proteïnen:
 Kinesine-13-proteïnen → proteïnen die binden en zo de uiteinden van de protofilamenten
krommen in GDP-β-tubuline-configuratie; met als gevolg dat de dimeren worden verwijderd
o.i.v. ATP-hydrolyse (afbraak MT)
6—31
 Stathmine → proteïne dat 2 dimeren bindt op een zodanige manier dat ze krommen op het
einde van de MT → de ramshoorn-vorm treedt gedwongen in en er vinden catastrophes plaats.
Dit proteïne is inactief na fosforylering
Tot slot vormt niet elk van de cytoskelet-onderdelen een afzonderlijk skelet; alle 3 de vormen werken
samen om zo één stabiel, dynamisch en intact cytoskelet te vormen. De coördinatie en samenwerking
tussen de verschillende onderdelen wordt geregeld door IFAP’s → Intermediate Filaments Associated
Proteins; proteïnen die de IF’s crosslinken met andere celskeletstructuren waardoor bundels, netwerken en
andere celstructuren kunnen ontstaan:
1. De plakines (familie van IFAP’s) van bv. de (hemi)desmosomen
2. De plakines die de IF verbinden met de MF en de MT, zoals plectine
Kankerbehandeling via ‘tubulin-binding agents’ (TBAs):
TBAs zorgen ervoor dat kanker stopt met groeien en de cel dood gaat. Maar kankercellen passen zich er
aan aan door TBA naar buiten te pompen of door andere tubulines aan te maken zodat TBA niet kan binden
7. Algemene begrippen over kanker + introductie kankergenetica
Inleiding
Kanker → pathologie die ontstaat door een fout in de balans tussen celdeling en celdood. In welke richting
de balans is doorgeslagen is afhankelijk van het celtype. Zo bestaan er (altijd) labiele cellen → cellen die
gedurende het hele leven blijven delen zoals bloedcellen, darmcellen of huidcellen; en stabiele cellen →
cellen die niet meer delen na differentiatie; hartspier- zenuw of levercellen.
Deze verstoorde balans is het gevolg van DNA-beschadiging in de (proto-)oncogenen → genen die de
celgroei bevorderen; of een beschadiging van de tumorsuppressorgenen → de genen die de celdood
kunnen induceren wanneer dit nodig is. Het controle gen is ook gemuteerd
DNA-beschadiging
Om kanker te ontwikkelen, moeten dus DNA-beschadigingen op specifieke plaatsen optreden:
1. Activatie van de proto-oncogenen (in alle normale cellen aanwezig) tot oncogenen (aanwezig in
kankercellen) door mutaties:
a. Mogelijk dat er een verhoogde genexpressie optreedt en er een abnormale hoeveelheid
normaal eiwit wordt geproduceerd
b. Mogelijk dat er een abnormaal proteïne wordt gevormd wat hyperactief is.
2. Verlies van de tumorsuppressorgenen door mutaties; deleties of hypermethylering (dit zorgt ervoor
dat het gen niet meer kan worden afgelezen omdat de transcriptiefactoren niet meer kunnen
werken). Hierdoor zal er verminderde of volledig afwezige gen-expessie optreden
3. Inactivatie van de caretaker-genes → de genen die de integriteit van het genoom bewaren;
wanneer deze worden geïnactiveerd treden er steeds meer en steeds sneller mutaties op die niet
meer gerepareerd worden
Alledrie de bovenstaande gengroepen zijn actief in de regulatie van (in volgorde):
1. De celdeling en de celcyclus
2. Cel-dood via apoptose
3. DNA-herstel
7—32
Deze DNA-fouten kunnen geïnduceerd worden door verschillende factoren; een voorbeeld is de
blootstelling aan carcinogenen (UV-straling; chemische agentia), hierdoor worden mutaties in somatische
cellen geïnduceerd die worden doorgegeven aan de dochtercellen. Dit vormt zo een kloon van gemuteerde
cellen die aanleiding kunnen geven tot een tumor. Let wel: dit is relatief; één toevallige mutatie geeft niet
per definitie aanleiding tot kanker; het zal een serie van mutaties zijn in tal van verschillende genen die dan
na verschillende jaren mogelijk aanleiding kunnen geven tot kanker. Doordat dit een mutatie-afhankelijk
proces is en gezien de lengte van het menselijk genoom (60 miljard basenparen), kunnen er praktisch
oneindig veel soorten kankers ontstaan. Toch hebben al deze kankers 7 eigenschappen gemeenschappelijk
1.
2.
3.
4.
Onafhankelijke proliferatie van de externe signalen
Ongevoelig voor de externe remmende signalen
Ze blijven leven zonder in apoptose te gaan door externe signalen; ze zijn onsterfelijk
Hebben een gewijzigde hechting aan cellen en aan de matrix, zodat ze kunnen loskomen en
migreren en uitzaaien
5. Ze hebben een gewijzigd microscopisch aspect van cellen: hoe meer ze afwijken van normale cellen
hoe kwaadaardiger de kanker
6. Ze kunnen bloedvatgroei induceren binnenin de tumor
7. Ze kunnen metastaseren/uitzaaien
Toch wordt er ook op basis van bovenstaande eigenschappen onderscheid gemaakt tussen tumoren:
1. Benigne tumoren → goedaardig, dit zijn meestal kleine, omgeven door een fibreus kapsel,
celgroepjes die scherp zijn afgelijnd. Bovendien lijken ze op hun normale tegenhangers en
ondergaan een normale adhesie. Let wel; goedaardig betekent niet meteen niet-bedreigend;
wanneer zo’n tumor voorkomt in de hersenen, lijkt de schade me duidelijk.
2. Maligne tumoren → kwaadaardig. Snellere groei, geen normale sterfte en gaan naburig weefsel
invaderen; ze kunnen zo metastaseren en bovendien zijn ze minder gedifferentieerd, waardoor ze
niet meer lijken op de oorspronkelijke cel. De cellen hebben meestal ook een grillige vorm, een
uiterst dense kern etc; alle signalen die duiden op sterk verhoogde activiteit.
Carcinoom → tumoren afkomstig van epitheelweefsel
Sarcoom → tumor in niet-epitheliale, mesenchymale weefsels, bijv. spieren, ECM, bot etc.
Leukemie → tumoren in de bloedvormende cellen en weefsels.
Metastasering
Metastasering → uitzaaiing van tumorcellen op afstand.
Dit proces is niet makkelijk; dit wordt geïllustreerd aan de hand van een epitheliaal carcinoom. Stappen:
1. Oorspronkelijk is hierbij de kanker dus ontstaan in het epitheel, om verplaatsing überhaupt
mogelijk te maken, zullen de tumorcellen zich dus door de basale lamina moeten bewegen.
Dit kan op twee manieren:
- Enzymactivatie; bv. de plasminogeen-activator; dit kan plasmine (proteolytisch enzym) vormen
uit plasminogeen wat leidt tot plaatselijke vertering van de basale lamina.
- Migratie langs de basale lamina tot een punt waar het eruit kan treden, of tot een punt elders
in het epitheel waar het een nieuwe tumor veroorzaakt.
2. Via invadopodia kan de tumorcel nu de ECM invaderen en erdoorheen migreren.
3. Om nu vervoerd te kunnen worden door het bloed, zullen ze de basale lamina van het bloedvat ook
moeten doordringen
7—33
4. Ze komen nu terecht in het bloedvat resp. lymfevat, waar ze toch ook zullen moeten overleven,
terwijl ze in een vreemd milieu zitten, waar bovendien een uitermate actief immuunsysteem
aanwezig is.
Al met al zal slechts 1 op de 10.000 tumorcellen deze metastase overleven, met als gevolg dat de wel
overlevende tumorcel nieuwe eigenschappen moet gaan ontwikkelen → tumorprogressie; dit leidt echter
tot een betere adaptatie en dus hogere overlevingskansen. Nieuwe eigenschappen:
- Nieuwe oppervlaktereceptoren voor makkelijkere binding voor invasie
- Veranderingen in het celskelet voor migratie
- De genen voor overleving zullen zich beter aanpassen; mutaties van DNA.
Recent heeft men een theorie opgesteld over het feit dat sommige kankers steeds terug blijven komen
ondanks het feit dat de tumor is uitgeroeid. Realiseer je hier het feit dat mutaties in delende cellen worden
doorgegeven aan de dochtercellen, en dat mutaties in niet-delende cellen weinig invloed hebben omdat ze
deze toch niet door worden geven. Men denkt dus dat alleen de stamcellen kwaadaardig (slechts een
kleine hoeveelheid) zijn en zo een continue delingsactiviteit ontwikkelen wat leidt tot foutief
gedifferentieerde dochtercellen. Deze stamcellen zijn van nature al weerstandiger en zijn dus (omdat het
nu zgn. tumor-stamcellen zijn) nu nog moeilijker uit te roeien door radio- resp. chemotherapie, wat tevens
de hoge dosages verklaard bij sommige kankers.
Wanneer deze stamcellen aanleiding geven tot kanker, is blijkbaar de controle op dit mechanisme al
weggevallen en zal er dus een accumulatie optreden van oncogene mutaties, wat wordt doorgegeven aan
de dochtercellen die niet normaal zullen differentiëren en opnieuw aanleiding geven tot kanker.
Als een tumorstamcel deelt; ontstaat hieruit een nieuwe (tumor)stamcel, evenals een iets sterker
gedifferentieerde cel (met minder delingsvermogen). Deze tumorstamcellen zijn dus onsterfelijk. Volgens
bovenstaand concept zouden tumoren dus uit oorspronkelijk slechts één cel ontstaan, maar wel
heterogeen zijn → bestaande uit een tumorstamcel, en zijn dochtercel en uit de cellen afkomstig van
verdere deling van de tumordochtercel.
Dit betekent ook dat een minderheid van de cellen daadwerkelijk gevaarlijk is. Bovendien heeft men
ondertussen kunnen aantonen dat de tumorgroei sterk afhankelijk is van zijn omgeving; de niche → de
omgeving van een tumor(cel) die zorgt voor de juiste delingsomstandigheden. Deze zouden dus optimaal
moeten zijn in een niche van de tumorstamcellen.
Directe omgeving
Zoals hierboven reeds uiteen is gezet, kunnen tumoromgevende cellen dus stimuli geven voor de
tumorgroei:
1. Mutaties in de niche leiden zo tot een explosieve groei van normale stamcellen → transformatie
naar tumorstamcellen; dus overmatige stimulatie vanuit de omgeving
2. Mutatie in de tumorstamcellen en aanpassing van de niche kunnen eveneens leiden tot een
explosieve tumorontwikkeling
3. Stamcellen die onafhankelijk zijn geworden van signalen uit de niche zullen zich transformeren
naar tumorcellen
4. Mutaties in de (beperkt delende) progenitorcellen → transformatie naar tumorstamcellen met een
onbeperkte delingscapaciteit.
Bovenstaand verhaal is allemaal leuk en aardig, maar wanneer de tumor blijft groeien, zal hij op den duur
moeten sterven aan zuurstoftekort evenals voedingstekort. Helaas heeft de tumor een manier gevonden
om bloedvaten te laten ingroeien → neo-angiogenese. Was dit namelijk niet het geval, zou een tumor een
maximale grootte kunnen bereiken van zo’n 106 cellen (overeenkomstig aan zo’n 2 mm; let wel: de ernst
7—34
kan hier evenwel aanwezig zijn wanneer zo’n tumor bv. optreedt in de hersenen). Wat overigens dan op zal
treden is dat er een balans ontstaat tussen bijkomende tumorcellen aan de buitenkant en afsterving aan de
binnenkant.
Maar over het algemeen maakt de tumor dus nieuwe bloedvaten aan via het volgende proces:
 Bestaande bloedvaten worden praktisch naar binnen getrokken door de heersende hypoxie; de
tumor zal een transcriptiefactor gaan produceren → Hypoxia Inducing Factor.
 HIF1 zorgt voor de aanmaak van VEGF → Vascular Endothelial Growth Factor, wat instaat voor de
vorming van nieuwe bloedvaten vertrekkende van bestaande bloedvaten; nu:
 Moet de basale lamina van het bloedvat gedegradeerd worden en migreren in de tumor
 De bloedvatendotheelcellen moeten aangezet worden tot deling
 En uiteindelijk moet de basale lamina terug hersteld worden.
De transformatie van cellen in cultuur naar tumor-cellen (tevens in cultuur) gebeurde als volgt; men had
3T3-muizen-fibroblasten via transfectie (→ een techniek waarbij vreemd DNA in een eukaryote cel wordt
gebracht, meestal gevolgd door expressie van een of meerdere genen van het vreemd DNA), in cultuur
gebracht met humaan kanker-DNA. Toen men dit na incubatie bekeek, zag men dat de cellen afgerond
waren, minder adhesief en 3D-clusters begonnen te vormen. Dit werd verklaard door een geactiveerd rasoncogen en een mutant ras-proteïne. Wanneer er transfectie plaatsvond van normale fibroblasten met
hetzelfde humane kanker, nam men géén fenotypische wijzigingen waar.
Het multi-hit model (clonale selectie → tumoren afkomstig van slechts één cel)
Met het begrip multi-hit doelt men op ingetreden mutaties; er zijn dus meerdere mutaties nodig om een
normale lichaamscel te veranderingen in een kankercel. Hierbij geldt het algemeen principe van ‘survival of
the fittest’:
 Mutatie nr. 1 treedt op in de eerste cel; deze cel ontwikkelt (bij toeval) een groeivoordeel
 Mutatie 2 treedt in in een van de dochtercellen, waardoor ongecontroleerde groei ontstaat. Let
wel: je spreekt hier nog altijd van een eventueel ontstane benigne tumor
 Mutatie nr. 3; dit kan mogelijk leiden tot nog meer groeivoordeel. Tot hier heb je dus een celmassa
met 3 mutaties (op een ‘juiste’ plaats)
 Een volgende mutatie kan aanleiding geven tot invasie in weefsels, maar nog geen overleving
 Pas op zijn vroegst de 5e mutatie zou kunnen leiden tot metastasering. Al met al heb je dus
tenminste 5 tot 6 hits nodig op exact de juiste plaats.
Uit bovenstaande theorie wordt duidelijk dat (1) alle kankercellen bepaalde mutaties gemeenschappelijk
hebben. In de praktijk is dit o.a. ook geïllustreerd bij de random inactivatie van het x-chromosoom bij een
vrouwelijk individu; cellen van een vrouwelijke tumor zijn dus clonaal. En (2) dat de kankerincidentie stijgt
met de leeftijd, omdat het grootste deel van de mutaties in jonge individuen nog hersteld kan worden via
reparatiemechanismen en dat ‘slechts’ een accumulatie van mutaties kan leiden tot kanker. Hoe meer
mutaties in een cel, hoe kwaadaardiger de kanker, hoe sneller men sterft.
Colonkanker (darm) is zeer zorgvuldig bestudeerd. Men zag dat de mutaties optraden in een bepaalde
volgorde:
1. Er treedt verlies of inactivatie van beide allelen op van de tumorsuppressor Adenomatosis
polyposis Coli (APC-gen) waardoor er een stijging optreedt van de celdeling door c-myc-activatie.
2. Door die activatie treedt er overexpressie op van de myc-transcriptiefactor waardoor de celcyclus
explosief toeneemt. Nu is er pas sprake van een goedaardige poliep. (Meestal ontwikkelen er
meerdere poliepen.)
7—35
3. Er moet nu een activerende mutatie optreden in het ras-gen; deze ontwikkelt zich tot een oncogen
en er treedt een ongecontroleerde celdeling op → adenoom (goedaardig!)
4. Vervolgens treedt er verlies op van een regio (welke is onbekend) op chromosoom 18, welke leidt
tot de inactivatie van het tumorsuppressorgen p53; nu is er sprake van een carcinoom.
N.B. de volgorde moet kloppen; sommige mutaties zijn namelijk nodig voor de kankervorming, andere
maken invasie mogelijk etc. In een poliep zijn ongeveer 11.000 mutaties per cel ingetreden; kankers leiden
dus aan genetische instabiliteit → überhaupt het mogelijk zijn van zoveel optredende mutaties. Dit is te
wijten aan het verlies van de care-takergenes.
Kanker en genetische koppeling
Bepaalde mutaties in bepaalde genen kunnen makkelijker aanleiding geven tot kanker; hieronder staan een
aantal genen genoemd die daartoe behoren:
 Mutaties of amplificaties in proto-oncogenen; dit leidt tot een gain of function.
 Mutaties, deleties of silencing van tumorsuppressoren en caretaker-genes; loss of function.
 Combinatie van oncogen- en tumorsuppressormutaties
De proto-oncogenen coderen voor proteïnen die celgroei en celdeling stimuleren.
Tumor-suppressorgenen controleren deze celgroei en celdeling op bepaalde checkpoints na DNAbeschadiging of na onjuiste voorafgaande stappen.
Fouten kunnen dus optreden in stap IV, omdat de transcriptiefactoren niet meer loslaten en het DNA tot
expressie blijft komen en de receptoren constant geactiveerd blijven.
Proto-oncogenen
Oncogeen → elk gen dat codeert voor een proteïne dat cellen in cultuur óf kan transformeren óf kanker
kan induceren in proefdieren. Deze oncogenen zijn een gemuteerde vorm van de proto-oncogenen die in
elke cel voorkomen omdat ze nodig zijn voor de celdeling. Enkele voorbeelden:
1.
2.
3.
4.
Signaaltransductieiwitten (Ras; belangrijkste proto-oncogen)
Groei-stimulerende eiwitten en/of hun receptoren
Anti-apoptotische proteïnen
Transcriptiefactoren (c-myc)
Maar, niet zo maar elke mutatie in deze genen zorgt voor de transformatie van een proto-oncogen naar
een oncogen. Let wel: dit gebeurt via gain of function, waarbij slechts 1 allel moet muteren:
 Via een puntmutatie in 1 basenpaar die aanleiding geeft tot hyperactiviteit of constitutieve
activiteit (de rem valt weg) of aanleiding geeft tot abnormaal proteïne (een oncoproteïne) owv
andere conformatie
 Chromosomale translocatie (gen wordt van chromosoom 1 naar chromosoom 2 getransporteerd;
een nieuw hybride fusie-gen ontstaat, die aanleiding geeft tot een constitutief actief hybride
abnormaal eiwit (een oncoproteïne)
 Chromosomale translocatie waardoor het groeiregulerend gen onder een nieuwe, constant actieve
promotor valt en dus constant tot expressie komt van een normaal eiwit
 Amplificatie → abnormale DNA-replicatie; er ontstaan meer dan 2 kopieën op 1 chromosoom of op
‘minute-chromosomen’; er treedt weer overproductie op van het normaal eiwit.
7—36
Tumorsuppressorgenen
Deze mutatie moet een inactiverende werking hebben wil het aanleiding geven tot kanker. Er zijn 5
eiwitgroepen die de celproliferatie remmen. Hiervoor moeten beide allelen gemuteerd zijn in dezelfde cel3:
1.
2.
3.
4.
5.
P16, Rb → proteïnen die een rol spelen bij de progressieregulatie/inhibitie van de celcyclus
TGF β → receptoren voor hormonen of signaaltransducers (werken inhiberend)
P53 → proteïnen die op een checkpoint de celcyclus controleren en kunnen stoppen.
Apoptose-bevorderende eiwitten
Enzymen voor DNA-reparatie; deze laten nu het voortbestaan van andere mutaties toe.
Bovenstaande mutaties kunnen worden doorgegeven aan het nageslacht; er ontstaat zo een erfelijke
voorbeschiktheid om bepaalde kankers te ontwikkelen.
Zo kan in germ-line (gameten) een mutatie optreden in een allel, maar er wordt dan nog net voldoende TSproteïne geproduceerd om de cel normaal te laten functioneren. Vervolgens kan er een somatische mutatie
optreden of een methylering van het andere allel wat aanleiding geeft tot een inactief gen en dus compleet
verlies van TS-productie door die cel. Op deze manier kunnen kankers bij zeer jonge individuen voorkomen.
Een aantal voorbeelden:
 De retinoblastoma; dit illustreert de rol van spontane somatische mutaties. Men observeerde dat
bilaterale tumoren meestal voorkwamen bij jonge kinderen, terwijl unilateraal voornamelijk
voorkwam bij volwassenen. Dit komt omdat kinderen bijna per definitie al een defect allel
genetisch hebben meegekregen. Dit ene allel zorgt voor de ontwikkeling van beide ogen en een hit
is dus voldoende om kanker te doen ontstaan aan beide ogen. Bij volwassenen moet er dus 1 hit
optreden zijn in een somatische cel, waarbij de kans zeer klein is dat dit bilateraal gebeurd, met als
gevolg dat volwassenen eerder unilaterale retinoblastoma’s ontwikkelen.
 Overgeërfde mutaties in TSG die darmkanker kunnen veroorzaken; het individu heeft in zijn
voortplantingscellen een mutatie in een APC-allel, waardoor hij zeer gemakkelijk 1000den poliepen
kan ontwikkelen en de kans dat hij of zij voor zijn 50e levensjaar kanker heeft ontwikkeld zeer groot
wordt.
 Het laatste voorbeeld van genetisch overerfbare kankers is borstkanker; in de germline zit een
mutatie in één BRCA1-allel (breast-cancer 1) waardoor het individu 60% kans heeft om borstkanker
te ontwikkelen tegen 2% van de normale populatie. Dit BRCA1 is een DNA-reparatiegen, maar is
niet betrokken in de sporadische borstkanker.
Toch zijn bijkomende hits bij genetisch overerfbare kankers nodig; een individu heterozygoot voor een
beschadigd TSG-gen zal de helft van zijn nakomelingen het goede allel meegeven en de andere helft het
slechte, en dus moet er nog een bijkomende hit optreden waarbij er verlies optreedt van het heterozygote
karakter (Loss Of Heterozygosity) via:
1. Een deletie of een mutatie van een normaal genkopie (een hit), afkomstig van buitenaf
2. Foutieve celdeling; bv. non-disjunctie → het niet scheiden van de chromosomen (anafase)
3. Mitotische recombinatie
En dan nog zijn aanvullende mutaties vereist. Dit LOH wordt geïllustreerd in de bijlagen.
3
Deze mutatie moet homozygoot optreden (dus in beide allelen) in tegenstelling tot heterozygoot bij de protooncogenen omdat er hier mogelijk nog net voldoende proteïneproductie is om geen tumoren te ontwikkelen.
7—37
8. Moleculaire genetica van kanker: oncogenen en
tumorsupressorgenen
Zoals in het eerste college over kanker al beschreven is, kan het veroorzaakt worden door 2 verschillende
mutaties:
1.
2.
Mutaties in tumorsuppressoren, zodat ze onderdrukt worden
Mutaties in de proto-oncogenen, zodat ze geactiveerd worden tot oncogenen. Dit leidt tot het
ontstaan van:
a. Abnormale eiwitten
b. Teveel normale eiwitten
Bovenstaand is eigenlijk te sterk gesimplificeerd; het gaat namelijk om pathways, en dus kunnen mutaties
die kanker veroorzaken op verschillende plaatsen in de pathway voorkomen:
Mutaties:
 Het geactiveerde oncogen is dominant, dus één hit is voldoende om problemen te veroorzaken.
Mutaties kunnen dan optreden in:
 Extracellulaire signaalmoleculen (overmaat of abnormale eiwitten)
 Signaalreceptoren (bv. de Tyr-receptorkinasen); dit leidt tot constante activatie
 Signaaltransductie-eiwitten
 Transcriptiefactoren
 De tumorsuppressorgenen hebben 2 hits nodig om geinactiveerd te worden. Deze kunnen optreden
in:
 Celcyclus-controlerende eiwitten
 DNA-hersteleiwitten
 De pro- en anti-apoptosegenen (eigenlijk een verzamelnaam voor bovenstaande genen)
 Pro-apoptosegenen → tumorsuppressoren
 Anti-apoptosegenen → oncogenen
8—38
Kanker door signaalreceptoren.
Deze mutaties in receptoren zijn ook weer onderverdeeld; het kan namelijk overgedragen worden door
virussen evenals DNA dat gemuteerd raakt door bijvoorbeeld teveel UV-licht of andere redenen (zie prof.
Claessens)
Kanker ontstaan door DNA-mutaties
Zoals al eerder vermeld staat, is er sprake van een pathway; mutaties die mogelijk aanleiding kunnen geven
tot kanker kunnen dus op verschillende plaatsen optreden; evenals verschillende typen mutaties!
De normale pathway verloopt als volgt:
Ligandbinding activeert de receptor-tyrosine-kinases (RTK) → de receptoren dimeriseren → dimerisatie
geeft aanleiding tot de activatie van het cytosolisch domein met kinase activiteit → de intracellulaire
pathway start en na deze doorlopen te hebben, wordt de celdeling geactiveerd.
1. Een puntmutatie in de receptor geeft aanleiding tot constante dimerisatie en dus constante
activatie van de celdelingspathway. Een voorbeeld is de Her2-receptor, die bij mutaties aanleiding
geeft tot het neu-oncoproteine.
2. Een deletie in het gen coderende voor het extracellulair-ligand-bindend-domein geeft aanleiding
tot een geactiveerde oncogen-receptor; een voorbeeld is de Epidermal Growth Factor (EGF)receptor die muteert naar een ErbB-oncoproteine leidt tot constante celdeling.
In beide bovenstaande gevallen is het ligand niet meer nodig om het signaal te geven.
3. Een amplificatie (genvermenigvuldiging) wat leidt tot overproductie van de normale RTK-receptor.
Dit komt met name voor bij borstkanker; bij lage concentratie van EGF → deling van enkel de
kankercellen; niet de normale cellen
4. Een chromosomale translocatie waarbij een gen van chromosoom x wordt verplaatst naar
chromosoom y. De volgende translocatie komt vaak voor (Trk):
a. Een chimeer eiwit met de N-terminus van tropomyosine i.p.v. het extracellulair domein van de
Trk-receptor
b. Tropomyosine zal dimeriseren een aanleiding geven tot een coiled-coil; wat de receptoren bij
elkaar dwingt.
c. Constante activatie van het kinase-domein
d. Trk-oncoproteine is een cytosolisch eiwit geworden i.p.v. een membraanreceptor voor NGF.
Kanker door oncogene activiteit van virussen
Zoals al gekend is, kan kanker veroorzaakt worden door virussen; er worden 2 virussen behandeld:
1. Het SFFV; Spleen Focus Forming Virus
a. Dit virus kan zorgen voor erythro-leukemie; dit gebeurt als volgt:
I. Het is een retrovirus, dat een mutant eiwit kan overdragen (het gp55) wat de plaats kan
innemen van EPO
II. Normaalgesproken is EPO nodig om de EPO-receptoren te activeren zodat er meer
erythrocyten worden aangemaakt. Als gp55 bindt, geeft dit aanleiding tot een abnormale
toename van het aantal rode bloedcellen
III. Erythro-leukemie ontstaat wel pas na bijkomende mutaties! (Ondanks het feit dat het
gp55 niet meer van de receptoren zal komen).
2. Het HPV; Humaan Papilloma Virus
a. Kan aanleiding geven tot baarmoederhalskanker
I. Het is een sexueel overdraagbaar DNA-virus
8—39
II. Vormt een E5-eiwit (transmembranair) wat een stabiel complex vormt met de PDGFreceptor (Plates Derived Growth Factor)
III. Hierdoor zal E5 di- en trimeren vormen, zodat de receptoren eveneens aggregeren →
dimerisatie van de receptoren treedt op waardoor de receptor geactiveerd wordt en er
een transformatie tot maligne receptor ontstaat.
 Virus geef aanleiding tot viraal eiwit
Kanker door signaaltransductie-eiwitten
Deze vorm van kankerveroorzakende mutaties treedt frequenter op dan voorgaand verhaal. Het Rasproteïne is een voorbeeld.
Ras-proteïne → een signaaleiwit tussen geactiveerde receptoren en proteïne-kinasen. Wanneer er in dit
proteïne een mutatie optreedt in codon 12, 13 of 61, ontstaat een constant geactiveerd Ras-oncogen wat
minder GTPase-activiteit heeft. Hierdoor kan GTP niet of nauwelijks gehydrolyseerd worden en zal het Rasproteïne blijft constant actief.
Ras speelt een rol in de celcyclus; geactiveerd Ras (door een gedimeriseerd RTK zal Ras GTP binden)
activeert proteïne kinase 1 → PK2 → MAP-kinase. Wanneer dit MAPK geactiveerd is, kunnen
transcriptiefactoren gefosforyleerd worden en aanleiding geven tot de initiatie van de celcyclus.
Het is duidelijk dat het Ras geïnactiveerd moet worden nadat het zijn functie heeft uitgevoerd. Hiervoor
zorgt het GAP → GTPase Activating Protein; hierdoor wordt GTP gehydrolyseerd en is Ras geïnactiveerd; is
dit GAP geïnactiveerd, blijft Ras actief. GAP is dus een tumorsuppressor en Ras is een proto-oncogen.
Hierboven staat de activerende mutatie al beschreven; waarbij GTP-Ras minder GTPase-activiteit heeft of
ongevoelig is geworden voor GAP. Een andere mogelijkheid is uiteraard dat GAP geïnactiveerd wordt. Een
voorbeeld waarbij dit gebeurt is neurofibromatose → een goedaardige tumor van de zenuwschede. Let
wel: er moeten 2 hits gebeuren in beide NF-1-allelen door bv. één erfelijke mutatie en een andere,
somatische mutatie in het andere allel.
Een ander voorbeeld is een mutatie in proteïne-kinasen. Hier: c-Abl eiwit → eiwit dat de cytoskelet en
celvorm controleert:
Een chromosomale translocatie geeft aanleiding tot fusie tussen het c-Abl gen (wat codeert voor
cytosolisch non-receptor tyrosine kinase) en het bcr-gen → er ontstaat een bcr-abl-oncogen wat altijd
actief is. Dit is een tetramerisch oncoproteine wat een kinase-activiteit heeft en zo signaaltransductieeiwitten kan fosforyleren. Een voorbeeld is het Philadelphia-chromosoom → translocatie tussen
chromosoom 9 en 22 waardoor bepaalde kankers ontstaan. Een voorbeeld is het CML (Chronisch Myeloide
Leukemie) wat aanleiding geeft tot een overmaat witte bloedcellen. Ook hier geldt dat een eerste mutatie
geen grote ramp is, maar de tweede hit geeft aanleiding tot acute MCL wat dodelijk kan zijn. Nu heeft men
een medicijn (Gleevec) gevonden, wat kan binden aan de active site van het fusieproteïne (bcr-ablproteïne), waardoor het substraat (JAK2 of STAT5) niet meer kan binden en kan het proteïne niet meer
gefosforyleerd worden en wordt zo geinhibeerd.
Kanker door abnormale productie van nucleaire transcriptiefactoren
Veel oncogenen coderen voor transcriptiefactoren!:
 c-myc → proto-oncogen
 c-jun en c-fos → proto-oncogen die afzonderlijk of na associatie een heterodimeer AP1 vormen. Dit
complex kan DNA binden en zo:
 Transcriptie stimuleren van groei-bevorderende genen
 Inhibitie veroorzaken van de transcriptie van groei-onderdrukkende genen
8—40
Het is belangrijk te realiseren dat deze transcriptiefactoren zeer instabiel zijn. Het mRNA van deze factoren,
evenals de transcriptiefactoren zelf zullen snel verloren gaan. Deze instabiliteit staat uiteraard gecodeerd in
het gen, maar wanneer er door mutaties nu een stabiele transcriptiefactor ontstaat, zullen deze uiteraard
zorgen voor meer proteïnen met alle gevolgen van dien. Ook hier kunnen verschillende mutaties voor
verantwoordelijk zijn:
1.
2.
3.
Een deletie in de sequenties die instaan voor de instabiliteit van zowel het mRNA als de
transcriptiefactoren; dit leidt tot het ontstaan van een c-fos-oncogen.
Een translocatie van c-myc naast die van een actief immunoglobuline-zware-keten. Dit komt
namelijk constant tot expressie
Amplificatie van c-myc leidt eveneens tot overexpressie.
Nu men er achter begint te komen hoe kanker kan ontstaan is natuurlijk een ding, maar behandeling is vers
Behandelingen worden wel steeds vaker gericht op moleculaire bevindingen (borstkanker):
 Men neemt een biopsie van het knobbeltje uit de borst, na de diagnose borstkanker is er een
mortaliteit van 30-40%.
 Als men er vervolgens achter kan komen waardoor het ontstaan is:
 Overproductie steroidreceptoren → celgroei (bv. de oestrogeen- en progesteronreceptoren);
dit zal men behandelen met tamoxifen wat de oestrogeenreceptor inhibeert. De mortaliteit
daalt met zo’n 5-15%
 Komt het door een amplificatie van Her2/Neu zal men behandeling van herceptine starten, dit
bindt op het oncoproteïne, waardoor de mortaliteit nu daalt met zo’n 10-20%
Kanker door mutaties in groeiremmede/celcycluscontrolerende tumorsuppressor genen
Een voorbeeld is het TGFβ en de TGFβ-receptor (Transforming Growth Factor β ) → inductie van de Smadtranscriptiefactoren richting kern waar ze gaan binden aan DNA en zo bepaalde genen gaat aan- of
uitzetten. Dit Smad (eiwit) leidt tot expressie van p15 wat leidt tot een stop in de G1-fase.
Het TGF + TGFreceptor geeft aanleiding tot PAI-1-transcriptie (plasminogeen Activator Inhibitor).
Wanneer er nu mutaties optreden in TGFβ of in Smad:
 Geen p15 → celdeling stopt niet.
 Geen PAI-1 → invasie en metastasering omdat plasmine zorgt voor het oplossen van de
omgevende eiwitten en de kankercel makkelijker kan metastaseren
Andere mutaties in proteïnen die zorgen voor de passage van het controlepunt van G1 naar de S-fase; Dit
wordt gecontroleerd door Cycline D, CDK’s en Rb-proteïne:
 Cycline D → wordt geïnduceerd door mitogenen en activeert cycline-CDK-complexen (deze hebben
een kinase-activiteit)
 Het mitogeen verdwijnt waardoor p16 accumuleert; binding aan CDK’s → stop in de G1
 Tijdens de G1 → fosforylatie van Rb door actieve cycline-D-CDK-complexen → activatie van E2Ftranscriptiefactoren voor DNA-synthese
Hierboven staat de ‘gezonde’ weg geïllustreerd, mogelijke mutaties zijn de volgende:
 Translocatie van cycline D1 → gen komt onder een nieuwe promotor en verhoogt de expressie van
cycline D1 gedurende de celcyclus → oncoproteïne (lymfomen)
 Amplificatie van cycline D1 → borstkanker owv te veel kopies
8—41
 Deletie van p164 → geen remming van cycline D-CDK kinase activiteit → overproductie cycline D1
→ hyperfosforylatie Rb (treedt op bij veel kankers)
 Inactivatie van p16 via promotor-hypermethylatie (longkanker) → geen transcriptie omdat het niet
afleesbaar is owv de methylgroep
 Inactivatie van Rb door een mutatie of binding aan een eiwit (E7 van HPV)
Kankers door inactivatie van TSG via onderdrukkende chromatine-structuren:
 SWI en SNF zijn chromatine-remodelling complexen (CRC): Deze zorgen voor een wijziging in de
positie of structuur van de nucleosomen waardoor mogelijke targetgenen (on)toegankelijk worden
voor DNA-bindende eiwitten
Een voorbeeld is het E2F-gen → onderdrukking leidt tot een stop in de celcyclus
 Loss of function-mutatie in het SWI of SNF → celcyclusproblematiek geeft aanleiding tot kanker (bij
de mens mogelijk in nier- prostaat- long- en borstkankers)
P53
P53 wordt gezien als het belangrijkste TSG; het wordt daarom ook wel de waakhond van het genoom
genoemd. Het zorgt op het G1-checkpoint voor de controle op de aanwezigheid van beschadigd DNA.
Mocht dit aanwezig zijn, stopt het de celcyclus en deze kan niet door naar de S-fase.
Dit p53 is instabiel en op een laag concentratieniveau in de cel, stress kan aanleiding geven tot fosforylatie
en zo stabilisatie van het p53 wat leidt tot:
 Expressie van p21 → bindt en remt cycline-CDK-complex; stop in G1 en de cel kan repareren
 P21 → stop in G2 → géén mitose
 P53 remt expressie van cycline B en topo-isomerase II → G2-arrest en géén mitose
Wanneer dit p53 verloren gaat, geeft dit voor 50% zekerheid aanleiding tot kanker → replicatie van
beschadigd en gemuteerd DNA en de apoptose wordt niet meer in gang gezet, wat een essentiële bijdrage
levert aan de tumorprogressie.
P53 bestaat uit een tetrameer van 4 subunits, wat dus betekent dat slechts 20% nog werkt nadat er één
allel is gemuteerd (dominant negatieve mutatie; puntmutatie) Hierdoor kan het niet meer binden aan DNA
en wordt gen-expressie niet geactiveerd.
Mutaties in p53 (loss of function)
 In meer dan de helft van de kanker draagt een replicatie van een beschadigd en gemuteerd DNA en
het gebrek aan apoptose bij aan tomurprogressie
 Een pintmutaties en 1 p53 allel zorgt voor een abnormale en defecte subunit in bijna alle
tetrameren (p53 is een tetrameer van 4 subunits) waardoor en geen binding met DNA mogelijk is
en dus geen activatie van genexpressie
 Dominant negatieve mutatie <-> andere tumorsupressorgenen
Inactivatie van p53
 Het eiwit mdm2 houdt de activiteit van p53 laag doordat het de DNA-binding verhindert en de
nucleaire export en degradatie in het proteasoom stimuleert.
 Door fosforylatie wordt p53 gestabiliseerd en wordt mdm2 verplaatst.
 Er bestaat een p53-feedback-loop waardoor mdm2 zelf transcriptioneel geactiveerd wordt
4
Zoals zichtbaar is in de bijlage houdt p16 het complex bijeen en inactief. Een mutatie kan leiden tot
bindingsonmogelijkheid en continue activiteit.
8—42
 Een amplificatie van mdm2 treedt op (overmaat mdm2) → laag p53 → geen G1-stop en dus géén
apoptose
 HPV-eiwit E6 → remming van de p53-activiteit
 HPV-eiwit E7 → remming van de Rb-activiteit
 E6 en E7 → transformatie → kanker
 E5 → proliferatie
Apoptose-genen
Bovenaan staat al dat deze apoptose-genen een verzamelnaam is voor proto-oncogenen en
tumorsuppressoren.
 Een voorbeeld van kanker is de CLL → Chronisch Lymfatische Leukemie (overmaat lymfocyten;
zonder delingsactiviteit na de 1e hit (alleen geen apoptose); de tweede hit veroorzaakt de
tumorvorming)
 Translocatie geeft aanleiding tot oncogene activatie van anti-apoptotisch bcl2 → accumulatie
van niet-actief delende tumorcellen (nog niet dodelijk)
 Een tweede hit geeft een tumor die wel dodelijk kan zijn.
 PTEN-fosfatase:
 pro-apoptotisch via verlaging van het anti-apoptotische effect van proteïne kinase B
 inactivatie van PTEN → de cel wordt praktisch ontsterfelijk
 P53
 Pro-apoptotisch, na stress (zoals hypoxie, DNA-beschadiging door UV)
Inactivatie van DNA-reparatiegenen
Vb. bij Xeroderma Pigmentosum.) Algemeen heeft 1/3 van de tumoren een mutatie in DNA-polymerase β
(laatste-kans-polymerase, zonder proofreading).
BRCA1 en -2 zijn gemuteerd in erfelijke borst- en ovariumkanker. Dit zijn dus ook DNA-reparatiegenen. Bij
Loss Of Heterozygosity → géén DNA-herstel
Telomerase-activiteit
Het is duidelijk dat dit actief zal moeten zijn in kankercellen, willen ze ‘oneindig’ kunnen delen.
Normaalgesproken is dit telomerase alleen aanwezig in embryonale cellen, geslachtscellen en in stamcellen
waar het telomeer repaets (TTAGGG) toevoegt. In andere cellen verkorten de telomeren steeds na deling,
wat een controlemechanisme vormt. P53 zorgt voor apoptose wanneer de telomeren verloren zijn gegaan.
8—43