Screeningsmethode voor simultane bepaling van anabolica

Screeningsmethode voor simultane
bepaling van anabolica
en corticosteroïden
in urine en feces met LC-MS
Anabole steroïden en corticosteroïden
Anabolica zijn stoffen (hormonen en stoffen met hormonale werking) met anabole werking, dat wil zeggen, zij
beïnvloeden de stofwisselingsprocessen, waarbij bestanddelen worden gevormd die nodig zijn voor de opbouw
en het functioneren van cellen, weefsels en organen. Dit in tegenstelling tot katabole stoffen, die een rol spelen
bij de afbraak van verbindingen. Anabolica worden in de veeteelt illegaal gebruikt als groeibevorderaars en door
sportbeoefenaars als doping. Het gebruik van anabolica in de veeteelt is negatief in de belangstelling gekomen
als gevolg van een aantal incidenten met het vroeger regelmatig gebruikte DES (diëthylstilbestrol). Behalve als
groeibevorderaar bij runderen werd DES in de jaren vijftig ook gebruikt als medicijn bij zwangere vrouwen om
een dreigende abortus te voorkomen. In de jaren zeventig bleken dochters van deze zogenaamde DES-moeders
een verhoogde kans op vagina- en baarmoederhalskanker te hebben. In 1980 werd in Italië DES aangetroffen in
babyvoeding. Bij baby’s, die deze voeding hadden gekregen, ontstond borstvorming. Zeer waarschijnlijk waren
bestanddelen van de babyvoeding afkomstig van dieren die illegaal waren behandeld met DES.
Het is dit soort gebeurtenissen dat de consument zeer wantrouwig maakt ten aanzien van het gebruik van groeibevorderaars en dat in het algemeen het woord „hormoon” een negatieve bijklank gegeven heeft.
Anabolica kunnen een eiwit- of een niet-eiwit-structuur bezitten. De laatste groep betreft vooral steroïden,
waarbij een onderscheid kan gemaakt worden tussen stoffen met androgene, estrogene en gestagene werking.
Groeihormonen of somatotropines zijn eiwithormonen die in het lichaam van een mens of dier de groei stimuleren. Ze worden aangemaakt in de hypofysevoorkwab.
Corticosteroïden worden frequent gebruikt in de menselijke geneeskunde en de diergeneeskunde, vaak in
combinatie met andere geneesmiddelen, zoals antimicrobiële middelen of ß-agonisten. Twee groepen worden
onderscheiden nl. mineralocorticoïden en glucocorticoïden, die van nature gesynthetiseerd worden uit cholesterol in de bijnierschors. De mineralocorticoïden zijn een groep steroïdhormonen die qua structuur lijken op aldosteron en invloed hebben op de water-zout balans van het lichaam (elektrolyt homeostase) en daarmee onder
andere ook op de bloeddruk. Ze hebben gemeenschappelijk dat ze natrium vasthouden en de uitscheiding van
kalium vergroten. Glucocorticoïden worden onder invloed van ACTH (AdrenoCorticoTroop Hormoon), dat wordt
afgegeven door de hypofyse, geproduceerd. Ze bevorderen de omzetting van eiwitten en vetten in glucose. Hierdoor stijgt het bloedsuikergehalte. Ze hebben een belangrijke functie bij het reguleren van de activiteit van het
immuunsysteem, worden versterkt afgegeven bij stress en onderdrukken ontstekingsreacties.
Vaak hebben corticosteroïden een activiteit in beide groepen. Voorbeelden van natuurlijke glucocorticoïden zijn
cortisol en cortisone. Dexamethasone en prednisolone zijn welbekende synthetische glucocorticosteroïden.
Het gebruik van beide groepen groeibevorderende middelen is verboden in de Europese Unie (Richtlijn 96//EG
en Richtlijn 96//EG).
Methodeontwikkeling
De bepaling van anabolica en corticosteroïden in urine en feces werd in het verleden in het FLVVG uitgevoerd na
een extractie met diëthylether. Na indampen van de ether werd het residu verdeeld over een water / methanol
- mengsel en iso-octaan, waardoor apolaire stoffen verwijderd worden en er voor feces een ontvetting wordt
8
bekomen. De extracten met hormonale stoffen werden vervolgens onderworpen aan Solid Phase Extractie (SPE).
Het primaire extract werd op een OASIS-kolom gebracht, verschillende malen specifiek gewassen en tenslotte geëlueerd. Dit eluens werd daarna op een NH2-kolom gebracht, geëlueerd en vervolgens gechromatografeerd over
een reversed phase HPLC-kolom. De fracties rond de retentietijd van de te bepalen stoffen werden opgevangen
en verder onderzocht met LC-MS enerzijds en met GC-MS na derivatisatie anderzijds. HPLC-fractionatie was nodig
om de GC te beschermen.
Recent werd een gradiënt U(H)PLC methode geoptimaliseerd voor de meting van meer dan 30 componenten,
waaronder zowel anabolica als corticosteroïden. De U(H)PLC/MS scheiding vereist slechts een run van 10 min.
Na een enzymatische hydrolyse van urine, wordt een extractie met acetonitril uitgevoerd gebaseerd op het
QuEChERS-principe. Een verdere opzuivering op SPE-kolommetjes is noodzakelijk voor injectie in het LC/MS-systeem. Voor feces werd een analoge extractiemethode ontwikkeld maar hier wordt de extractie uitgevoerd met
diëthylether. Na een SPE-opzuivering wordt een extra voorzuiveringsstap uitgevoerd op een door het CER (Centre
d’économie rurale - Laboratoire d’Hormonologie, Marloie, België) aangemaakte multi-immunoaffiniteits-chromatografie (MIAC) gel. Deze wordt bereid door het mengen van verscheidene individuele gels, bereid met specifieke
antilichamen.
Fig. 1: Opzuivering op MIAC-kolommetjes
Fig. 2: Detectie met LC-MS
Alle polyclonale antilichamen tegen anabolica werden bereid door hyperimmunisatie van konijnen. De immunoglobulines (IgGs) werden gekoppeld met cyanogeen bromide geactiveerde Sepharose 4B (GE Healthcare
Bio-Sciences AB, Uppsala, Zweden) volgens de instructies van de leverancier. De finale MIAC gel werd bereid door
mengen van adequate volumes van de individuele gels. De antilichamen en gels werden geproduceerd door de
afdeling Santés animale et humaine (CER Groupe). Deze zijn commercieel beschikbaar, individueel of collectief.
De MIAC gel kan verschillende malen hergebruikt worden. Voorzuivering op immuno-affiniteitskolommetjes zorgt
voor een verhoging qua gevoeligheid door het verbeteren van de signaal/ruis verhouding en van de specificiteit.
De opzuivering met de SPE-kolommetjes en de multi-immunoaffiniteitskolommetjes werd geautomatiseerd
op een automatische monstervoorbereider met 4 naalden om de throughput en de efficiëntie te verhogen. De
validatie werd uitgevoerd volgens Beschikking 2002/657/EG als een screeningsmethode: beslissingsgrens (CCα),
detectievermogen (CCβ) en specificiteit werden bepaald. Het detectievermogen lag tussen 0,5 en 5 ng g−1
afhankelijk van de component en de matrix.
Mieke Van de Wiele (FLVVG, Gentbrugge)
[email protected]