Serologische testen in de routine diagnostiek: een update

Dierengezondheidszorg Vlaanderen vzw
Serologische testen in de routine
diagnostiek: een update
Dr. Ellen Van Driessche, DVM, MSc, PhD
Serologie in routinediagnostiek: update
1. Inleiding
2. Serologische testen
1. Agar gel precipitatie test (AGPT)
2. Agglutinatietest (AG)
3. Hemagglutinatie-inhibitietest (HI)
4. ELISA
3. Serum poolen – interpretatie?
4. Conclusies
2
Serologie in routinediagnostiek: update
1. Inleiding
2. Serologische testen
1. Agar gel precipitatie test (AGPT)
2. Agglutinatietest (AG)
3. Hemagglutinatie-inhibitietest (HI)
4. ELISA
3. Serum poolen – interpretatie?
4. Conclusies
3
Inleiding: antigeen
• De meeste effectieve antigenen zijn grote, rigide (vaste
vorm), chemisch complexe moleculen en normaal nieteigen aan het dier of mens
• Epitoop = het deel van het antigeen dat herkend wordt
door de antistof
• Soorten: bacterie, virus, dierlijke cel ...
4
Inleiding: antistof
Er bestaan verschillende antistoffenfracties die verschillende
eigenschappen hebben:
IgG 1 monomeer, agglutinerend
IgA 1-2 monomeren, agglutinerend
IgM begin infectie, agglutinerend, 5
monomeren
IgD 1 monomeer
IgE 1 monomeer
Elke serologische test kijkt slechts naar een deel van de
immuunrespons
5
Inleiding: antigeen-antilichaambinding
• Komt tot stand door niet-covalente krachten:
‐ zwakke krachten
‐ talrijk en daardoor zeer sterk
• Evenwichtsreactie: Ag + As  Ag-As
6
Inleiding: affiniteit
• Sterkte van de binding tussen 1 epitoop van het antigeen
en 1 antigeen-bindende zijde van het antistof
• Of vermogen van 1 antistofmolecule om aan 1 epitoop te
binden
• Beïnvloedende parameters : pH, temp, reactietijd, vaste
fase……
•  AVIDITEIT : functionele term die de prestatie van een
POLYKLONAAL antiserum in een welbepaalde test
weergeeft
Polyklonaal antiserum bevat antistoffen gericht tegen
verschillende epitopen van een antigeen
Monoklonaal antiserum bevat antistoffen tegen slechts 1
epitoop van een antigeen
7
Inleiding: sensitiviteit & specificiteit
Testkarakteristieken van specifieke test:
1. Sensitiviteit
Kans (%) dat een test een positief resultaat geeft in een
populatie 100% positief voor de geteste ziekte
Maat voor vals-negatieve resultaten
bv. PRRSv Se = 98,8%
2. Specificiteit
Kans (%) dat een test een negatief resultaat geeft in een
populatie 100% negatief voor de geteste ziekte
Maat voor vals-positieve resultaten
bv. PRRSv Sp = 99,9%
8
Serologie in routinediagnostiek: update
1. Inleiding
2. Serologische testen
1. Agar gel precipitatie test (AGPT)
2. Agglutinatietest (AG)
3. Hemagglutinatie-inhibitietest (HI)
4. ELISA
3. Serum poolen – interpretatie?
4. Conclusies
9
AGPT: agar gel precipitatie test
Algemeen principe precipitatie
Equivalentiepunt =
Conc immuuncomplexen
Y
YY
precipitatielijn
Y
Y
Afnemende concentratie As
As
Y
YYYY
Y
Y
Y
Afnemende concentratie Ag
Ag
10
AGPT: agar gel precipitatie test
Principe :
antigeen in oplossing en te onderzoeken serum (As)
diffunderen naar elkaar toe doorheen een gel
bij optimale concentratie zal precipitatie optreden
precipitaat wordt vastgehouden door de gel
11
AGPT: agar gel precipitatie test
Praktische uitvoering (dubbele immunodiffusie)
Ag
As
12
AGPT: agar gel precipitatie test
• Redelijk ongevoelige test : er moeten veel As en Ag
aanwezig zijn zodat de grote complexen ontstaan
• Met dit type test kan zowel Ag als As geïdentificeerd
worden in serum
• Geschikt Ag : 40000-60000 Dalton
• Niet kwantitatief
• pH buffer gel en temperatuur beïnvloeden de
precipitatiereactie
• In labo: pluimveeanalysen zoals Adeno, AI, IB, ILT, Marek,
Reo
13
AGPT: agar gel precipitatie test
• Voordelen
‐ Eenvoudige test
‐ Minimum 24h (overnacht incubatie)
‐ Lage kostprijs
• Nadelen
‐ Lage sensitiviteit
‐ Lage specificiteit
14
Serologie in routinediagnostiek: update
1. Inleiding
2. Serologische testen
1. Agar gel precipitatie test (AGPT)
2. Agglutinatietest (AG)
3. Hemagglutinatie-inhibitietest (HI)
4. ELISA
3. Serum poolen – interpretatie?
4. Conclusies
15
Agglutinatietesten
• Algemeen principe:
Agglutinatie is een fenomeen gekenmerkt door een
massaal samenklitten van partikels in suspensie ten
gevolge van een As-Ag binding : er vormen zich
aggregaten die met het blote oog of microscopisch
zichtbaar zijn
• Partikels : bacteriën, RBC, Ag met diameter van 0.1 - 10
µm (> dan bij precipitatie testen) : hoe meer epitopen, hoe
betere agglutinerende capaciteit
• IgM antistoffen beter agglutinerend dan IgG: IgM meer
bindingsplaatsen
16
Agglutinatietesten
Agglutinatie testen gevoeliger dan precipitatietest omwille van
een toename in aviditeit en een betere detectie (AG is veel
groter en vooral beter te zien)
Agglutinatie: signaal vlugger optreden - langer waarneembaar
Conc immuuncompexen
Equivalentiepunt
= precipitatielijn
Y Y
YY Y
Y
YYYY
Y
Y
Y
Afnemende concentratie Ag
Afnemende concentratie As
17
Aggl. testen : snelle draagglas-agglutinatie
• Deze test laat toe As aan te tonen tegenover bacteriële Ag
of Ag gecoat op latex partikels
• In labo: Rose-Bengaal test (Brucellose) : aantonen IgG1 test met lage aviditeit
POS
NEG
Ag
Serum
18
Aggl. testen : snelle draagglas-agglutinatie
POS
NEG
19
Agglutinatietesten
• Voordelen
‐ Zeer snelle test (enkele minuten)
‐ Lage kostprijs
• Nadelen
‐ Lagere specificiteit door mogelijke interferentie met
andere agglutinerende elementen in serum
20
Serologie in routinediagnostiek: update
1. Inleiding
2. Serologische testen
1. Agar gel precipitatie test (AGPT)
2. Agglutinatietest (AG)
3. Hemagglutinatie-inhibitietest (HI)
4. ELISA
3. Serum poolen – interpretatie?
4. Conclusies
21
Hemagglutinatie-inhibitietest
Algemeen principe:
• Staaltype: SERUM
A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
B C
D
E
F
G
H
1/2
• Opeenvolgende tweevoudige
verdunningen van het serumstaal in de
cupjes
• Toevoegen van een constante
hoeveelheid virus (4 HAU) : virus die kan
binden aan receptoren op membraan van
RBC
• Incubatie 1h – 20°C
22
Hemagglutinatie-inhibitietest
Positief serum
Negatief serum
Y
Y
Y Y
Y
Antistof
Virus
RBC
Toevoegen RBC
Y
Y
Y Y
Incuberen
Y
Y
Y Y
23
Hemagglutinatie-inhibitietest
Interpretatie:
De HI-titer is het omgekeerde
van de serumverdunning die nog
juist inhibitie geeft van de
hemagglutinatie, rekening
houdend met de startverdunning
van serum
24
Hemagglutinatie-inhibitietest
Well n°
SIV - H1N1
SIV – H1N2 / H3N2
Parvovirus
1
2
20
8
2
4
40
16
3
8
80
32
4
16
160
64
5
32
320
128
6
64
640
256
7
128
1280
512
8
256
2560
1024
9
512
5120
2048
10
1024
10240
4096
25
Hemagglutinatie-inhibitietest
Klinische interpretatie SIV:
H1N2 / H3N2
interpretatie
H1N1
< 20
NEGATIEF
<4
≥ 20
POSITIEF
≥4
≥ 320
INFECTIETITER
≥ 64
• Seroconversie bij gepaarde sera:
‐ Titerstijging x4
‐ bv. H3N2: 40  160 of 160  640
26
Hemagglutinatie-inhibitietest
Klinische interpretatie Parvo
• Maternale immuniteit tot 5 mnd
• Negatief, vaccinatie of infectie
titer
resultaat
interpretatie
<8
NEGATIEF
Niet besmet
≥8
POSITIEF
Besmet/vaccinatie
> 512
POSITIEF
Infectietiter zeug
≥ 256
POSITIEF
Infectietiter foeti (>
70 d dracht)
27
Hemagglutinatie-inhibitietest
• Voordelen
‐ Goedkope test
‐ Duidelijke hoogte titer ~ hoeveelheid antistoffen serum
• Nadelen
‐ Zeer arbeidsintensief
‐ Aflezing vereist ervaring laborant
28
Serologie in routinediagnostiek: update
1. Inleiding
2. Serologische testen
1. Agar gel precipitatie test (AGPT)
2. Agglutinatietest (AG)
3. Hemagglutinatie-inhibitietest (HI)
4. ELISA
3. Serum poolen – interpretatie?
4. Conclusies
29
ELISA
• Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
• Algemeen principe:
Een Ag-As binding aantonen gebruikmakend van een
enzyme als merker en een vaste drager
ELISA detectie mogelijk van:
 antigeen
 antistoffen
ELISA-varianten:
 Direct/indirect
 Sandwich/competitieve/blocking
30
ELISA – directe antistof-ELISA: PRRSv
Stap 1
Bloed Serum
Stap 2
Stap 3
Stap 4
Stap 5
+
+ Wassen +
-
-
-
31
ELISA – directe antistof-ELISA: PRRSv
Stap 7
Stap 6
+
NEG
Incubatie
POS
+
32
ELISA – directe antistof-ELISA: PRRSv
33
ELISA – directe antistof-ELISA: PRRSv
34
ELISA – indirecte antistof-ELISA: Auj gE
Stap 1
Bloed Serum
Stap 2
Stap 3
Stap 4
Stap 5
+
+ Wassen +
-
-
-
35
ELISA – indirecte antistof-ELISA: Auj gE
Stap 6
Stap 7
POS
+
-
Stopoplosssing
NEG
+
-
36
ELISA – antigen-ELISA: rotavirus
Stap 1
Stap 2
Stap 3
+
Conjugaat
-
-
Stap 4
Mest
+
-
Detectie Ag
+
+
Wassen
-
37
ELISA – antigen-ELISA: rotavirus
Stap 5
+
-
Stap 6
Incubatie
NEG
POS
+
-
38
ELISA
•
Voordelen
‐ Snelle techniek en werken op vaste drager : grote aviditeit want veel
Ag op kleine oppervlakte : gevoelige testmethode
‐ Men kan richten op welke soort As men wil werken : IgG, IgM…
‐ Gebruik van een enzymatische reactie die een versterking van het
verkregen signaal veroorzaakt : er moet slechts weinig Ag-As
complexen gevormd worden om toch een sterk signaal te krijgen
‐ Standaardisatie (ringtesten)
‐ Automatisatie mogelijk
•
Nadelen
‐ Dure commerciële kits
‐ Het coaten van de platen moet met zorg gebeuren : zuiver Ag
noodzakelijk anders daling specificiteit van de test
39
Serologie in routinediagnostiek: update
1. Inleiding
2. Serologische testen
1. Agar gel precipitatie test (AGPT)
2. Agglutinatietest (AG)
3. Hemagglutinatie-inhibitietest (HI)
4. ELISA
3. Serum poolen – interpretatie?
4. Conclusies
40
Serum poolen – interpretatie?
• Objectief
‐ Bekijken of serum poolen een ‘kostenbesparende’ optie
is voor groepsdiagnostiek
‐ Interpretatie bij combinaties van negatieve en positieve
serumstalen
• Materiaal & Methoden
‐ Serumstalen met gekend PRRSv S/P-ratio
‐ Pools van 5 serumstalen
‐ Diverse combinaties van negatieve, zwak, matig en
hoog positieve PRRSv S/P-ratios
41
01333
11233
01332
11232
00233
01133
01322
11123
00133
01132
00223
11113
01222
11112
11122
00033
01113
00123
01122
00222
00023
00113
00122
01112
00013
00022
00112
01111
00003
00012
00111
00002
00011
00001
3
2
1
0
S/P-ratio
Serum poolen – interpretatie?
Serumpool combinaties
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Codes
42
Serum poolen – interpretatie?
• Duidelijk verband tussen aantal positieve dieren
en mate van positiviteit
• Poolen van serumstalen moet toch zeer
omzichtig geïnterpreteerd worden
‐ Slechts bij 5 negatieve stalen of 1 licht positief staal blijft
de pool negatief
‐ Van zodra een sterk positieve of meerdere licht
positieve dieren in de pool = positief!
‐ Indien infectiegraad (% positieve dieren of individuele
titers) van belang is, dan gaat een groot deel van de
informatie verloren!! ALTIJD POSITIEF
43
Serologie in routinediagnostiek: update
1. Inleiding
2. Serologische testen
1. Agar gel precipitatie test (AGPT)
2. Agglutinatietest (AG)
3. Hemagglutinatie-inhibitietest (HI)
4. ELISA
3. Serum poolen – interpretatie?
4. Conclusies
44
Conclusie
Wat hebben we vandaag geleerd?
1. HI-test vereist 4x titerstijging voor seroconversie
2. ELISA ruwe data gewenst: opvragen van S/P,
SN, blocking % en GEEN OD-waarden
3. Serum poolen leidt tot verlies van informatie
45
Dierengezondheidszorg Vlaanderen vzw
Dank u
46