Screenen van modulatoren voor invasie en viabiliteit in het MCF
advertisement
Faculteit GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar 2008 - 2009 Screenen van modulatoren voor invasie en viabiliteit in het MCF-7/WISP-2 borstkankermodel Dieter BERWOUTS Promotor: Dr. Olivier De Wever Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot ARTS Faculteit GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar 2008 - 2009 Screenen van modulatoren voor invasie en viabiliteit in het MCF-7/WISP-2 borstkankermodel Dieter BERWOUTS Promotor: Dr. Olivier De Wever Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot ARTS “De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.” Datum handtekening student handtekening promotor Naam student Naam promotor Voorwoord “We schrijven mei 2006-2007, … de thesisonderwerpen voor derde bachelor geneeskunde komen ter beschikking. Bijna tweehonderd mogelijke onderwerpen worden op ons losgelaten. Een brede waaier van literatuurstudies en onderzoekprojecten proberen onze interesse te capteren. Plotseling valt mijn oog op een project van Dr. Apr. O. De Wever op de afdeling “experimenteel kankeronderzoek”. Interessant, laten we maar es een mailtje sturen… Reeds van bij het eerste gesprek werd ik geïnspireerd door de gedrevenheid en het enthousiasme van mijn promotor. Ik kon niet wachten om ook mijn duit in het zakje te doen…“ Nu, twee jaar later, bleek dat mailtje het begin van een boeiende en enorm leerrijke samenwerking met mijn promotor. Arts zijn in de hedendaagse wereld veronderstelt naast een sterke en sociale persoonlijkheid, ook een sterke wetenschappelijke basis te hebben. Het absolute orgelpunt in deze tocht naar kennis, is ongetwijfeld het eindwerk. Na jaren anatomie, fysiologie en nog veel meer, wordt er nu een actief explorerende houding van de student verwacht om zo zélf een steentje bij te dragen. De wetenschappelijke kennis neemt exponentieel toe. Waar de artsen die 30 jaar geleden afstudeerden nauwelijks bekend waren met DNA-helices en cellulaire kanalen, wordt er van een eerstejaars student geneeskunde tegenwoordig verwacht dat hij het volledige biochemisch en fysiologisch model van de cel begrijpt en kan verklaren. Of de moeilijkheidgraad hoger ligt dan vroeger, laat ik in het midden. Het enige wat we met zekerheid kunnen vaststellen is dat de graad van kennis veel detaillistischer is dan toendertijd. In het kader van dit toenemend specialistisch karakter van de geneeskunde en de wetenschap in het algemeen, probeer ik in deze scriptie mijn druppeltje bij te dragen aan de steeds expanderende oceaan van kennis. Onderzoek verrichten is geen soloactiviteit. Zonder de steun van mijn immer hulpvaardige promotor, van An, George , Arlette en de rest van het laboteam, zou er weinig in huis zijn gekomen van deze scriptie. Zij hebben mij allen, ten allen tijde met raad en daad bijgestaan en hebben een plaatsje veroverd in het hart van deze thesisstudent. 1. Inhoudsopgave 2. Abstract…………………………………………………………………………………………..p.1 3. Literatuurstudie…………………………………………………………………………………p.2 3.1.Kanker…...………………………………………………………………………...……p.2 3.2.Invasie…………………………………………………………………………………..p.3 3.3.WISP-2………………………………………………………………………………...p.6 4. Materiaal en methodes……………………………………………………………………….p.7 4.1 Algemeen……………………………………………………………………………...p.7 4.1.1. Cellijnen……………………………………………………………………p.7 4.1.2. Buffers……………………………………………………………………..p.8 4.1.2.1. ‘Dulbecco’s Modified Eagle Medium…………………………p.8 4.1.2.2. Ca2+ en Mg2+ free Hank’s buffered salt solution (CMFHBSS)……………………………………………………………………..p.8 4.1.2.3. Minimum essential medium…………………………………...p.8 4.1.3. Toestellen………………………………………………………………….p.9 4.1.4. Reagentia………………………………………………………………….p.9 4.1.4.1. Matrixproteïnen…………………………………………………p.9 4.1.4.1.1. Collageen type I……………………………………..p.9 4.1.4.1.2. Fibronectine…………………………………………p.10 4.1.4.1.3. Tenascine……………………………………………p.11 4.1.4.1.4. Decorine……………………………………………..p.12 4.1.4.1.5. Collageen IV…………………………………………p.12 4.1.4.1.6. Entactine……………………………………………..p.13 4.1.4.1.7. Laminine……………………………………………..p.13 4.1.4.2. Farmacologische inhibitoren………………………………….p.13 4.1.4.2.1. CNF…………………………………………………..p.13 4.1.4.2.2. C3T……………………………………………………p.14 4.1.4.2.3. Y27632……………………………………………….p.14 4.1.4.3. Klinische inhibitoren……………………………………………p.14 4.1.4.3.1 EGFR………………………………………………….p.14 4.1.4.3.2. BIM-46174……………………………………………p.15 4.1.4.3.3. Gleevec®…………………………………………….p.16 4.1.4.3.4. M475271…………………………………………….p.17 4.2. Cellulair niveau………………………………………………………………………p.18 4.2.1. Celcultuur………………………………………………………………….p.18 4.3. Funktionele testen…………………………………………………………………..p.20 4.3.1. Invasie……………………………………………………………………..p.20 4.3.1.1. Collageenmatrix……………………………………….p.21 4.3.1.2. Afbeeldingsverwerking………………………………..p.21 4.3.2. Immunohistochemie………………………………………………………p.23 4.3.3. MAPK Array.………………………………………………………………p.24 4.3.4. MTT-test……………………………………………………………………p.25 4.3.5. Statistische analyse………………………………………………………p.26 5. Resultaten…………………………………………………………………………………….p.27 5.1. Immunohistochemie…………………………………………………………………p.27 5.2. CI Assay………………………………………………………………………………p.28 5.3. Matrix screening……………………………………………………………………..p.31 5.4. Array…………………………………………………………………………………..p.34 5.5. Farmacologische inhibitoren………………………………………………………..p.37 5.6. Klinische inhibitoren…………………………………………………………………p.39 5.7. MTT……………………………………………………………………………………p.41 6. Discussie……………………………………………………………………………………….p.42 7. Referentielijst……………………………………………………………………………….....p.46 2. Abstract Invasie is een essentieel kenmerk van kankerprogressie. Immunohistochemische screening toonde ons aan dat WISP-2 expressie afneemt bij invasieve, weinig gedifferentieerde borsttumoren. In het labo is een borstkankercellijn (MCF7) aanwezig die zodanig gemanipuleerd is dat WISP-2 expressie onderdrukt is (MCF-7 shWISP-2). Voor het onderzoek naar invasie was een goed te reproduceren test nodig die de 3Dweefselomgeving nabootst. Sferoïden, of cellulaire aggregaten, werden bereid en in een collageen-type-I-matrix gebracht. In een eerste stap toonden we dat MCF-7 cellen waarbij WISP-2 expressie onderdrukt is een sterkere invasie vertoonden dan cellen waarin WISP-2 niet onderdrukt is. Niet alleen waren de invasieve cellen talrijker, ook vonden we ze verder verwijderd van hun basissferoïde. Daarna hebben we de rol van bepaalde matrix proteïnes en signalisatiewegen onderzocht. Proteïnes van de extracellulaire matrix en basale membraan, werden in verschillende concentraties in de collageenmatrix gebracht. We konden hierbij vaststellen dat een concentratie van 10 µg/ml laminine een sterk inhibitorisch effect had op de invasie van de MCF-7sh2 cellen. Deze bevindingen werden nog eens extra gestaafd doordat ook Matrigel, welke bestaat uit een grote hoeveelheid laminine, een opvallende inhibitie gaf. Andere matricellulaire proteïnes, zoals fibronectine en tenascine-C, en elementen van de basale membraan bleken geen significante invloed te hebben op de invasie. Nu we aangetoond hadden dat laminine een dergelijk effect had op de invasie, stelden we ons de vraag welke pathways hierin betrokken waren. Via een assay waarmee we een 40-tal MAPK konden screenen, toonden we aan dat JNK, p42/44 MAPK en p38 MAPK pathway minder gefosforyleerd worden, in aanwezigheid van laminine. Op basis van deze bevindingen konden we dus doelgericht enkele farmacologisch inhibitoren toevoegen aan de sferoïden en hun effect bestuderen. In overeenstemming met onze biochemische resultaten, stellen we vast dat vooral de JNK-inhibitor, SP600125, invasiviteit van WISP-2 onderdrukte cellen inhibeert. Regulatie van het actine cytoskelet is essentieel tijdens invasie. RhoGTPases spelen hier een belangrijke rol in. De Rho-inhibitor exoenzyme C3 transferase, maar niet de Rho-activator CNF, toonde ons een significante vermindering van invasie. Downstream RhoA zorgt de ROCK-inhibitor, Y27632, voor een verminderd invasief patroon. We kunnen dus stellen dat onderdrukking van WISP-2 aanleiding geeft tot invasie. Aanwezigheid van laminine in de basale membraan zorgt voor een niet-invasief fenotype. De Rho/ROCK/JNK pathway is essentieel voor verlies van WISP-2-geïnduceerde invasie. 1 3. Literatuurstudie 3.1. Kanker Het woord kanker vindt zijn oorsprong in het latijn (“cancer” = kreeft). Het dankt zijn naam aan de gezwollen bloedvaten in de buurt van tumoren die lijken op een kreeft. Pathofysiologie van kanker Kanker ontstaat door mutaties in het DNA. Deze mutaties kunnen zowel erfelijk als verworven zijn. Er is een samenspel tussen endogene en exogene factoren die veranderingen in het DNA induceren en/of repareren (Chu en Lu, 2008). Om nu daadwerkelijk een ontwikkeling tot kanker te zien optreden, moeten we mutaties hebben in genen die betrokken zijn in de regulatie en controle van de celdeling. Hierin onderscheiden wij vier belangrijke actoren: de proto-oncogenen, de tumorsuppressorgenen, genen betrokken in de apoptose en genen betrokken bij de DNA-herstel mechanismen (Ricketts, 1990). *Proto-oncogen Deze genen spelen een rol bij de normale celdelingen (groeistimulerende factoren, celmembraan receptoren, intracellulaire groeisignalen en celdelingstimulatoren). Wanneer een mutatie optreedt in deze genen, worden zij oncogenen genoemd. Deze zorgen voor ongelimiteerde celdeling. Deze proto-oncogenen werken in de tumorigenese op basis van het principe van „gain-of-function‟. *tumorsuppressorgenen Deze genen zijn een moleculaire rem op ongebreidelde celgroei. Mutaties en hypermethylering van de promotorregio van het gen zorgt voor verlies van controle op de celdeling. Deze genen werken in op de tumorigenese op basis van „loss-of-function‟. Het uitschakelen van tumorsuppressorgenen vereist echter nog een extra conditie. Beide allelen dienen gemuteerd te zijn (recessief). Wanneer iemand dus reeds heterozygoot is voor een bepaald gen en er is een bijkomende mutaties, zal de tumor zich reeds vroegtijdig (= tijdens de kinderjaren) ontwikkelen. Dit is een typisch kenmerk van erfelijke tumoren. *apoptosegenen Wanneer de normale functie van een cel danig verstoord is, wordt er een cascade van apoptose in gang gezet. Het is een profylactische beveiliging voor het organisme in zijn totaliteit. *DNA-repairgenen Er zijn verschillende mechanismen die zorgen voor herstel van mutaties. Er is 1 foute baseparing per 10000 synthesestappen. Een eerste systeem zorgt voor de proofreading (DNA polymerase I) waarbij via hydrolyse de foutieve eiwitten worden verwijderd. Dit eerste 2 mechanisme zorgt ervoor dat er nog steeds een foutmarge van 1 op 107 is. Een tweede systeem is het “mismatch-repair” systeem (G_T baseparingfouten). Via methylatie wordt nogmaals een foutreductie bekomen, zodat er slechts 1 fout op 1010 overblijft. Bij elke celdeling wordt er over het volledige genoom gemiddeld minder dan 1 fout gemaakt. In het proces van kankerontwikkeling is er echter meer nodig dan enkel deze mutaties. Elke levende cel heeft voeding nodig en mogelijkheid tot afvoer van zijn afbraakproducten. Er is dus angiogenese nodig om dit circuit te onderhouden. Verder moeten de cellen ook in staat zijn om het omringende weefsel te invaderen. De volgende stap is het zich losmaken uit de moederomgeving en zich verspreiden via lymfogene en hematogene weg. Als laatste voorwaarde dient ook een telomeraseactiviteit gestoord te zijn, zodat de cellen onsterfelijk worden (ipv van de normale 60 delingen – Hayflicklimiet). Als verschillende stadia onderscheiden we achtereenvolgens: hyperplasie, de hyperplasie met atypie, het carcinoma in situ en de invasieve kanker. Het eerste deel gebeurt door mutaties in oncogenen en tumorsuppressorgenen, terwijl de overgang van carcinoma in situ naar invasieve kanker gebeurt door veranderingen in de invasiepromotor- en/of invasiesuppressorgenen. Deze indeling is echter niet strikt, en variaties op dit thema worden niet zelden gezien. We kunnen vijf grote categorieën maligne tumoren onderscheiden. De carcinomen van het epitheel, de sarcomen van het steunweefsel, de maligne lymfomen, de blastomen van het embryonaal stelsel en de kiemceltumoren. Samenvattend kunnen we dus stellen dat een cel een dysfunctie moet hebben in zes verschillende domeinen. Er moet een zelfonderhoudende groeistimulus zijn, terwijl er een ongevoeligheid is voor anti-groeifactoren en voor apoptotische functies. De cellen hebben een ongelimiteerd potentieel om te delen en de mogelijkheid om omringende weefsels te invaderen en metastasen te veroorzaken. Dit alles gecombineerd met een goede angiogenese. We zien dus dat tumorcellen veel gemeen hebben met normale somatische stamcellen. Verschillende pathways spelen dan ook bij beide een sleutelrol. 3.2 Invasie Het ontstaan van invasief gedrag bij kankerprogressie is een kritisch element van maligniteit. Door het multifactoriële karakter van de maligne transformatie, is het algemeen aanvaard dat kankerinvasie het gevolg is van een complexe interactie tussen kankercellen en gastheercellen/milieu in solide tumoren. Echter, moleculaire en cellulaire onderzoeken die 3 gericht zijn op kankercellen zelf, blijken niet afdoende te zijn aangezien verschillende tumorcelpopulaties zoals myofibroblasten, beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen, immuun en endotheliale cellen deel uitmaken van klinische tumoren. In vitro modellering wordt gebruikt om sommige mechanismen te ontleden die betrokken zijn bij kankercelinvasie en stromale celinfiltratie omdat het tegelijkertijd en kwantitatief de complexe interacties kan integreren tussen verschillende factoren en tumorcelpopulaties. De optimale assay laat makkelijke manipulatie, kwantificatie door digitale analyse, morfotypische en morfometrische analyse, verdere downstream biochemische analyse en gedetailleerde recapitulatie van de in vivo situatie toe. De gebruikte assay is gebaseerd op een collageen type I gebaseerde gel, de hoofdcomponent van de interstitiële matrix in de solide tumoren, waarbij we cellulaire sferoïde aggregaten in het collageen toevoegen. Gedurende de onderzoekstijd van de assay blijven de cellen in de matrix, welke toelaat morfometrische en biomechanische analyses uit te voeren om belangrijke inzichten in de basiseigenschappen van het invasieve migratieproces te verkrijgen. Er is voldoende bewijs dat intratumorale en peritumorale stromale myofibroblasten in solide tumoren actief communiceren met kankercellen om de invasieve groei te beïnvloeden. Er worden hiervoor modellen van invasie gebruikt, waarin zowel kankercellen in een 3D-conformatie worden gebracht om de in vivo situatie van invasieve groei na te bootsen. Op deze manier zou er klinisch relevante informatie verworven kunnen worden. In een volgende stap wordt via computergegenereerde binaire afbeeldingen een berekening gemaakt van de gemakkelijk reproduceerbare en operatoronafhankelijke data zoals de invasieomgeving en de morfometrie. We vinden deze techniek een waardevolle manier voor de moleculaire ontrafeling van kankerinvasie en zorgt voor een robuust modelsysteem voor preklinische validatie van smallmolecule inhibitors die pro-invasieve pathways als doel hebben. In navolging van deze veronderstelling, is het doel van deze huidige studie een vergelijkend model te ontwikkelen om kankercelinvasie te onderzoeken door verschillende experimentele opstellingen en om dit proces te kwantificeren door computergeassisteerde binaire afbeeldingverwerking. Ook morfometrie en biochemische analyses worden uitgevoerd. Een voorbeeld van signaaltransductie wegen die aanleiding geven tot invasie wordt voorgesteld in de figuur hieronder. Zij geeft een representatie van alle pathways die relevant zijn voor het onderzoek. We kunnen zien dat de Rho-pathway een zeer belangrijke rol inneemt. Enkele belangrijke farmacologische inhibitoren zijn specifiek gericht op deze pathway. Een andere belangrijke pathway is de RTK pathway. De tyrosine kinasen zijn enzymen die de fosfaat groep van ATP naar een tyrosine residu in een proteïne overbrengen. Er bestaan 4 2 klassen. De enen zijn cytoplasmatische proteïnen, en de andere zijn transmembranair receptorgelinkte kinases. Deze laatste groep wordt hier als target gebruikt. Er zijn 58 receptor tyrosine kinasen bekend in 20 subfamilies. Ze zorgen voor oa. groei, differentiatie, metabolisme, adhesie, mobiliteit en celdood. Ze bestaan uit een extracellulair domein, welke in staat is om een specifieke ligand te binden, een transmembranair domein en een intracellulair domein. Vele RTK‟s zijn betrokken in oncogenese door genmutatie, chromosoom translocatie of gewoon door overexpressie. Het resultaat blijft gelijk: er ontstaat een hyperactief kinase, dat een ligand-onafhankelijke, niet gereguleerde groeistimulus aan de kankercellen geeft. Tyrosine kinasen worden heden ten dage gebruikt in de behandeling van kanker. Mutaties die bepaalde tyrosine kinasen constitutief activeren, zijn geassocieerd met bepaalde kanker. Imatinib(Gleevec®) is een drug die kan binden in de katalytische holte van deze tyrosine kinasen, en zo de activiteit inhibeert. Novartis maakt dit product (Gleevec®=USA,Glivec®=Eu/Aus) als een mesylate zout, imatinib INN. Het is origineel gecodeerd als CGP57148B of STI-571 en wordt gebruikt bij CLM, GIST en andere maligniteiten. Vandaar dat wij het ook als klinische inhibitor hebben gebruikt in deze thesis. Een andere pathway die we nader bekijken, is de MAPK pathway. MAP kinase: Mitogenactivated kinase: is een Seine/threonine-specifiek proteïnekinase dat antwoord geeft op extracellulaire stimuli (mitogene stimuli) en verschillende cellulaire activiteiten regelt zoals genexpressie, mitose, differentiatie en cel overleving/apoptose. MAPK is betrokken bij de meeste non-nucleaire oncogenen. Het is verantwoordelijk voor het celantwoord op groeifactoren. De MAPK-pathway bestaat uit MAPK, MAPKK en MAPKKK. MAP3K wordt geactiveerd door extracellulaire stimuli, fosforyleert MAP2K op zijn serine en threonine residues, en hetzelfde geldt op zijn beurt voor MAP2K naar MAPK. Deze pathway vinden we reeds terug bij de gisten. Van de in totaal 6 soorten MAPK pathways, zijn de eerste 2 voor ons relevant: ERK1 en ERK2 behoren tot de eerste familie (extracellulair signaalgereguleerde kinasen). Zij reageren typisch op groeifactoren en reguleren celproliferatie en celdifferentiatie. Hierop hebben we twee inhibitoren getest (SB20 en PD98). Zij werken beide via een iets verschillende pathway. Als tweede lid van de familie vinden we de JNK‟s c-Jun N-terminale kinasen. Deze c-JUN Nterminal kinases, origineel ontdekt als kinases die c-JUN binden en fosforyleren op Ser63 en Ser73 in het transscriptionele activatiedomein. Het zijn mitogen-geactiveerde proteïne kinasen. Deze reageren op stress stimuli zoals cytokines, UV, straling, warmte en 5 osmotische shock en zijn betrokken in T-cel differentiatie en apotosis. Er bestaan 3 genen : JNK1, JNK2, JNK3: JNK1 en JNK2 vinden we in alle cellen en weefsels, JNK3 vinden we vooral in de hersenen en ook in het hart en testis. Door fosforylatie verandert JNK de activiteit van verschillende proteïnen die zich bevinden in het mitochondriën of in de nucleus. Zo regelt JNK verschillende cellulaire functies. Inflammatie, verandering in reactieve zuurstof, UV, proteïne synthese inhibitors en verschillende stressstimuli kunnen JNK activeren. Als inhibitor hebben wij hier SP60 gebruikt. Figuur I3.2. Enkele belangrijke cascades betrokken bij invasie 3.3 WISP-2 WISP-2 of CCN5, een element van de CCN-familie, is een gesecreteerd proteïne, element van de familie van CCN. Deze proteïnen bestaan normaliter uit 4 structurele modules met 6 sequentie homologie van insuline-like groei factor, von Willebrand factor, thrombospondine en cysteïne knoop (CT). WISP-2 heeft echter geen cysteïne knoop. Deze knoop is een proliferatiemodule. Er zou verder een andere functie aan deze WISP-2 worden toegeschreven dan aan de andere elementen van de familie. Oestrogeen receptor–a reguleert direct het WISP-2 gen. Het verminderen van de WISP-2-expressie vergroot het proliferatieve potentieel van MCF-7 cellen en induceert oestrogeenonafhankelijke proliferatie van deze cellen. Wanneer WISP-2 echter gestimuleerd wordt, wordt de proliferatie geremd. WISP-2 zou ook een rol spelen in de transitie van epitheel naar mesenchymale cel. De expressie van WISP-2 is bifasisch, zodat in normale weefselstukken de expressie quasi niet detecteerbaar is, terwijl de expressie verhoogd is bij niet-invasieve borstlesies, waaronder ook atypisch ductale en ductale carcinomen in situ (Banerjee et al, 2008). Verder daalt de expressie (mRNA en eiwitten) sterk wanneer de kanker voortschrijdt van niet-invasief naar invasief (zie figuur IHC). Verder werd aangetoond dat in weinig gedifferentieerd weefsel de expressie bijna niet te merken was. Ook is de lymfeknoop metastasering omgekeerd evenredig gecorreleerd met de WISP-2-expressie. We kunnen dus reeds besluiten dat aan WISP-2-expressie een protectieve functie kan toegeschreven worden in niet-invasieve borsttumorcellen. Het is een negatieve regulator van migratie en invasie bij borstkankercellen. Dit zou gebeuren via het uitblijven van expressie van genen die verantwoordelijk zijn voor invasie. (Dit zijn snail-E-Cadherine en MMP‟s 9/2). Deze bevindingen zetten ons ertoe aan om de invloed van WISP-2 verder te onderzoeken. We richten ons hierbij op het verschil in nucleaire en cytoplasmatische activiteit. De expressie van WISP-2 zou ons dus veel kunnen leren over de invasiviteit van de borsttumorcellen, wat het een aantrekkelijk target maakt en een prognostische waarde kan geven bij borsttumoren. 1 4. Materiaal en methoden 4.1. Algemeen 4.1.1. Cellijnen MCF7 - De MCF7 borstkankercellijn is afkomstig van een 69-jaar oude Kaukasische vrouw die 2 mastectomieën op 5 jaar tijd heeft ondergaan. Weefsel verwijderd tijdens de eerste mastectomie was benigne. De 2de operatie toonde echter maligne adenocarcinoom. Deze MCF7-cellijn werd uit het pleuravocht geïsoleerd in 1970. a. MCF7-shCON 7 o Deze gemodificeerde lijn van MCF7 heeft een short hairpin die dient als onafhankelijke controle. b. MCF7-shWISP-2 o Deze specifieke vorm van borstkankercellen heeft een short hairpin, waardoor het gen WISP-2 onderdrukt wordt (verhinderen van expressie). Deze cellen worden in een cultuurmedium gebracht (DMEM gesupplementeerd met 10% FCS), 100U/ml penicilline en 100 µg/ml streptomycine (Life Technologies, Ghent, Belgium) 4.1.2. Buffers 4.1.2.1. “Dulbecco‟ s Modified Eagle Medium” Dit medium -DMEM- is een groeimedium dat frequent gebruikt wordt bij experimenten met borstweefsel. Het bevat essentiële groeifactoren voor onze borstkankercellijn. De gebruikte formule komt van Invitrogen (41965) en bevat fenolrood met 4.5g/l D-glucose, 1% (wt/vol) Lglutamine en zonder natriumpyruvaat. Hieraan werd 100U/ml penicilline, 100mg/ml streptomycine en 10% FBS toegevoegd. Dit is het standaard medium voor routine cel-, en sferoïdculturen evenals de basis voor de collageengels. Dit medium kan gedurende twee weken bewaard worden bij 4°C. 4.1.2.2. Ca2+ en MG2+ free Hank‟ s buffered salt solution (CMF-HBSS) Samenstelling als volgt: KCL: 0,400g KH2PO4: 0,060g NaCl: 8,00g NaHCO3: 0,35g Na2HPO4.12H2O:0,112g 900ml gedistilleerd water Deze bovenstaande oplossing tot pH 7,4 met NaOH (2M) aanlengen (tot 1 liter). Steriliseer door filtratie en bewaren bij 4°C. 4.1.2.3. Minimum Essential Medium MEM (Eagle‟s Minimum Essential Medium) is een eveneens een groeimedium dat essentiële bouwstenen bevat voor de in cultuur gebrachte cellen. 8 4.1.3. Toestellen - Incubator: NuAire US Autoflow (NuAire, Plymouth, USA) - Centrifuge: Sorvall RT 600D - Meyvis - Lichtmicroscoop: Leica DMI3000B (Wetzlar, Duitsland) met digitale camera DFC 340FX WILD-Heerburgg (Duitsland) - Laminaire air flow: Gelair Laminar AirFlow Class 100 - Warmwaterbad: GFL (Vel, Leuven, België) - Gyrotoryshaker (New Brunswick Scientific Company cat. No. G-33) - Diepvries: Leibherr Comfort - CO2-oven: Life Sciences International, Forma Scientific 3111. - Falcons (T25 en T75) (Griener Bio-One Gmbh cat. Nos. 690175 en 658175) - Bürker celteller - Micropipetten met variabel volume (Finnpipette Thermo Scientific 0,5-10µl, cat.no. 450010. 10-100µl, cat.no. 4500110; 100-1000µl, cat.no. 4500120; 1000-5000µl, cat.no. 4500060) - Pipettips: (Finnpipette Thermo Scientific 1-10μl, cat. no. 9400310; 0.5-250μl, cat.no. 9400250; 100-1000μl, cat.no. 9401 030; 1000-5000μl, cat. no. 9402010) 4.1.4. Reagentia 4.1.4.1. Matrixproteïnen 4.1.4.1.1 Collageen type I Het collageen type I is een sleutelproteïne in deze thesis om verschillende redenen. De verschillende types collageen vormen samen het belangrijkste deel van alle proteïnes in het menselijke lichaam, nl. 25% à 35% (Di Lullo et al., 2002). Het collageen is een lang, fibreus structureel proteïne, welke andere functies heeft dan zijn globulaire tegenhanger, het enzyme. De bundels die de collageenvezels vormen, zijn de belangrijkste component van de extracellulaire matrix, welke steun geeft aan de celstructuren. Het collageen type I vinden we voornamelijk terug in de huid, de pezen, het vaatstelsel, organen en in de organische delen van bot. Afwijkingen in de synthese van collageen type I liggen aan de basis van verschillende ernstige aandoeningen waaronder het Ehler-Danlos syndroom en de osteogenesis imperfecta. Het tropocollageen, de effectieve collageenmolecule, is onderdeel van fibrillen. Drie linksdraaiende polypeptideketens vormen een rechtsdraaiende super helix van ongeveer 300 nm lang en 1,5 nm in diameter welke gestabiliseerd wordt door waterstofbruggen. Deze 9 superhelices associëren dan weer tot een rechtsdraaiende super-super-helix, aangeduid als collageen microfibril. Door hun onderlinge interactie verkrijgen ze hun stabiliteit. Specifiek voor collageen is de aminozuursequentie. Deze volgt het patroon van Gly-Pro-X of Gly-YHYP, waarbij X en Y willekeurige aminozuren zijn. De hoge concentratie van glycine, proline en hydroxyproline zorgt voor een spontane opvouwing tot linksdraaiende helices. Dankzij beter microscopische technieken en X-ray diffractie, krijgen we meer en meer inzicht in de rol van collageen in de cel-cel en cel-matrix communicatie, de groei en het herstel van weefsels (Sweeney et al., 2008). Omdat collageen type I zo sterk vertegenwoordigd is in het extracellulair milieu, dient het als basis voor onze 3D-matrix waarin de experimenten zullen uitgevoerd worden. 4.1.4.1.2. Fibronectine. Fibronectine is een hoogmoleculair gewicht extracellulair matrix glycoproteïne dat bindt aan membraangebonden receptor proteïnen en integrines. Het bindt eveneens aan collageen, fibrine en heparansulfaat proteoglycanen. Het bestaat uit een dimeer, gevormd door 2 quasi identieke monomeren, verbonden door disulfidebruggen. Er bestaan twee grote vormen fibronectine, namelijk een oplosbare en een onoplosbare vorm. De oplosbare vorm vinden we vooral terug in het bloedplasma. Dit proteïne wordt gevormd door de hepatocyten in de lever. De niet-oplosbare vorm, de cellulaire vorm, is een belangrijke component van de extracellulaire matrix en wordt vooral gesecreteerd door fibroblasten als een oplosbaar dimeer dat dan ingebed wordt in een onoplosbare matrix. Fibronectine komt tussen in de celadhesie, groei, migratie en differentiatie. We vinden het ook betrokken in processen bij de wondheling en de embryonale ontwikkeling. Ook is er een associatie met kanker en fibrose. - structuur Zoals reeds gezegd bestaat fibronectine uit twee bijna identieke polypeptideketens die bij elkaar gehouden worden door een C-terminaal disulfidebrug. Elk fibronectine monomeer heeft een moleculair gewicht van 230-250kDa en bestaat uit 3 verschillende modules: type I, II en III. Deze hebben als gemeenschappelijk kenmerk dat ze allen bestaan uit 2 antiparallele -sheets. Type I en II hebben nog een disulfidebrug intern, wat type III ontbeert. Deze laatste ontvouwt dus bij gebruik van kracht. Er bestaan drie regio‟ s waar variabele splicing mogelijk is. Eén of beide van de type III molecules kunnen aanwezig zijn in cellulair fibronectine, maar nooit in het plasma fibronectine. De modules liggen zo geschikt dat er verschillende mogelijkheden zijn voor functionele en proteïne bindingsdomeinen. Er bestaan vier van dergelijke domeinen. Het eerste deel zorgt voor de initiatie van de fibronectinematrixvorming, een ander deel zorgt voor het celbindingsdomein. 10 - functie Onder de verschillende functies onderscheiden wij celadhesie, groei, migratie en differentiatie. Cellulair fibronectine wordt in de extracellulaire matrix gevormd en zorgt zo voor een onoplosbaar netwerk dat de organen en weefsel in een organisme van elkaar scheidt. We herhalen hier ook het belang in de wondheling en embryogenese. Ook in speeksel komt fibronectine voor, waar het de mondholte en farynx helpt beschermen tegen ziekteverwekkers. - vorming De vorming van het cellulair fibronectine is een complex celgemedieerd proces. Fibroblasten zorgen voor de secretie van dit fibronectine. Het bindt daarna aan integrine receptoren op het celoppervlak en helpt om de integrines met elkaar te verbinden. De concentratie van gebonden integrine stijgt, wat ervoor zorgt dat fibronectine molecules sneller met elkaar kunnen reageren. Zo worden de initieel oplosbare fibrillen omgezet in grotere, onoplosbare fibrillen die in de extracellulaire matrix resideren. - rol in kanker Verschillende morfologische veranderingen die gezien worden in tumoren en van tumoren afgeleide cellijnen, leiden tot verminderde fibronectine expressie, verhoogde fibronectine degradatie en verminderde expressie van fibronectine bindende receptoren zoals α5β1 integrines. Fibronectine is betrokken bij carcinoom ontwikkeling. In longcarcinomen is de fibronectine expressie verhoogd, vooral in het niet-kleincellig longcarcinoom (Nanki et al., 2001). De adhesie van longcarcinoomcellen aan fibronectine verhoogt de tumorigeniciteit en verhoogt de resistentie aan apoptose-inducerende chemotherapeutica. Ze zijn ook betrokken in een pathway die de expressie van cycline D controleert, en bijgevolg dus de celcyclus controleert. Op basis van deze gegevens lijkt het zeker nuttig om dit proteïne te laten participeren in dit onderzoek bij borsttumoren. 4.1.4.1.3 Tenascine Tenascine is eveneens een extracellulair matrix glycoproteïne. Ze zijn overvloedig aanwezig in de extracellulaire matrix van ontwikkelende vertebraten embryo‟ s en verschijnen ook bij helende wonden en in het stroma van sommige tumoren (Araujo et al., 2008). We kennen vier types tenascines. De eerste is Tenascine-C. Dit is het belangrijkste lid van de familie. Tijdens de embryonale ontwikkeling is het gemaakt van migrerende cellen van de neurale buis. Het is ook aanwezig in ontwikkelde pezen, beenderen en kraakbeen. De tweede vorm is Tenascine-R, welke gevonden wordt in het ontwikkelende en mature zenuwstelsel. Teanscine-X wordt voornamelijk aangetroffen in bindweefsel. Mutaties in dit 11 gen zorgen bijvoorbeeld voor het Ehler-Danlos Syndroom. Als laatste kennen we TenascineW dat we in de nieren en het ontwikkelend beendergestel vinden. Als basis hebben we veertien EGF-achtige repeats naar de N-terminus gericht en acht of meer fibronectine-III domeinen (zie hierboven) welke variabel zijn per soort. De best bestudeerde vorm is het de Tenascine-C isovorm. Het heeft anti-adhesieve eigenschappen, welke zorgen voor ronding van de cellen in cultuurmedium. Deze eigenschap wordt waarschijnlijk in samenspel met fibronectine verkregen. Wanneer Tenascine-C wordt gevonden in het stroma van tumoren, verwachten wij een slechte prognose (Emoto et al., 2001). 4.1.4.1.4 Decorine Decorine is een klein cellulair proteoglycaan van gemiddeld 90-140 kDa. Het behoort tot de SLRP-familie (small leucine-rich proteoglycanen) en bestaat uit een eiwitkern met daarin leucine ketens met een glycosaminoglycaanketen, welke bestaat uit ofwel chondroitinesulfaat of dermatansulfaat. Decorines worden gevormd door genduplicaties. Ze zijn een onderdeel van het bindweefsel en binden aan collageen type I om zo een rol te spelen in de matrixopbouw (Fiedler et al., 2008). De naam komt ook hiervandaan: het „decoreert‟ collageen I. Decorine speelt verder ook een rol in de fibrillogenese en interageert met fibronectine, thrombospondine, complement C1q, EGFR e, TGF- . Het zou de werking van TGF- beïnvloeden (zowel negatief als positief). Hierdoor wordt aangenomen dat decorine een rol speelt bij bepaalde aspecten van de regulatie van de celcyclus. Het is aangetoond dat decorine anti-tumorigene eigenschappen heeft in een experimenteel murinetumormodel (Shintani et al., 2008). Het is in staat om verschillende tumorcellijnen te onderdrukken. Vandaar de keuze voor dit proteoglycaan in dit researchproject. Mutaties in het decorinegen zijn geassocieerd met congenitale stromale corneale dystrofie (Rodahl et al., 2006). 4.1.4.1.5 Collageen IV Dit is een type collageen dat voorkomt in de basale membraan, de lens van het oog en ook een deel vormt van het filtratiesysteem van de capillairen en glomeruli in de nieren (ListovSaabye et al., 2009). Mutaties kunnen leiden tot het Alport syndroom (terminale glomerulonefritis en gehoorsverlies). Bij dit type collageen is de C-terminus niet verwijderd bij de post-translationele verwerking. De fibrillen staan hier kop aan kop in plaats van parallel. Ook het normaal aanwezige glycine 12 residu ontbreekt in elk derde residu, en dus ontbeert het de dichte collageenhelix die andere vormen wel hebben. Dit zorgt voor de vorm van de basale membraan (sheet-vorm). 4.1.4.1.6 Entactine Entactine, of ook nidogen, is een component van de basale membraan, samen met het hierboven besproken collageen type IV. Het zou een rol spelen in de celinteracties met de extracellulaire matrix. Entactines zouden klassieke linkers zijn voor collageen type IV en laminine (Nischt R, J Invest Dermatol. 2007 Mar). 4.1.4.1.7 Laminine Laminine is een extracellulair matrixproteïne. Dit proteïne is essentieel voor de basale membraan van alle interne organen. Het is het belangrijkste niet-collageneuze bestanddeel van de basale membraan waarop we de epitheliale cellen vinden. De molecule heeft 4 armen die kunnen binden aan de andere lamininemoleculen. De drie kortere armen zijn vooral bedoeld om andere lamininemoleculen te binden. Deze eigenschap zorgt voor het goede bladvormend vermogen (Coopman et al., 1991). De vierde arm zorgt voor de binding aan cellen, zodat de organen verankerd blijven aan de membraan. Het laminineproteïne bestaat uit drie polypeptide ketens: alfa, bèta en gamma, zodat we dus 6 eindjes krijgen die op die manier flexibel zijn in hun binding met andere moleculen. Laminine wordt gesecreteerd en opgenomen in de celgeassocieerde extracellulaire matrix. Laminine is noodzakelijk om alle structuren in het lichaam bij elkaar te houden, zo kunnen fouten in de expressie leiden tot musculaire dystrofie. Laminine vormt netwerken die geassocieerd zijn met collageen type IV via entactine en perlecan. Ook vinden wij hen in integrine receptoren en andere plasmamembraanmolecules. Zij spelen hierdoor een rol bij de vasthechting, differentiatie, vorm en beweging van de cel en zijn bijgevolg essentieel voor de overleving van het organisme. 4.1.4.2. Farmacologische inhibitoren 4.1.4.2.1. CNF Cytotoxic necrotizing factor is een exotoxine, dat geproduceerd wordt door Escherichia Coli. We vinden deze types E. Coli bij acute cystitis of colitis, waar het ernstige diarree veroorzaakt (Brest P., Infecti Immun., 2003). CNF-1 medieert zijn effect op epitheliale cellen of fagocyten via de permanente activatie van small GTP-bindende proteïnen, veroorzaakt 13 door de toxinegeïnduceerde deaminatie van Glu(63) van p21Rho (Essler et al., 2003). Het activeert op deze manier de RhoGTPasen Rho, Rac en CDC42. 4.1.4.2.2. C3T Exo-enzyme C3 transferase is een ADP ribosyltransferase, ook door E. Coli geproduceerd, dat selectief RhoA, RhoB en RhoC ribosyleert op asparagine residu 41 zodat zij inactief worden (Lasko en McKerracher, 2006). De affiniteit voor andere leden van de Rho familie zoals Cdc42 en Rac1 is uitermate laag. Het is een zeer potent agens om specifiek RhoA te blokkeren en zorgt voor een reorganisatie van het actine cytoskelet. Verder zou het RhoB opreguleren (Huelsenbeck et al., 2007). 4.1.4.2.3. Y27632 [(+)-®-trans-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride] is een specifieke inhibitor van ROCK (Kuwahara et al., 1999). Dit is op zijn beurt een Rhogeassocieerd “coiled-coil”-vormend proteïne van de serine/threonine kinase familie (Freitas et al., 2009) en bevindt zich downstream van Rho in de cascade. 4.1.4.3. Klinische inhibitoren In dit derde luik worden de klinische inhibitoren getest bij de MCF-7shWISP-2 kankercellijn. Zes verschillende inhibitoren worden getitreerd in het collageeninvasiemodel. De sferoïdinvasie worden vervolgens gekwantificeerd zoals reeds beschreven bij materiaal en methodes. 4.1.4.3.1. EGFR 14 Figuur I.4.1.4.3.1. Formatie van EGFR van http://www.wikipedia.org Als eerste inhibitor hebben we EGFR (epidermale groeifactorreceptor) – ErbB1;HER1 bij mensen. Dit is een celoppervlakte receptor voor leden van de epidermale groeifactorfamilie van extracellulaire proteïneliganden. We komen hem ook tegen onder de naam Iressa® of Gefitinib®. De epidermale groeifactorreceptor is een lid van ERbB familie van receptoren, een subfamilie van vier sterk gerelateerde receptor tyrosine kinasen. EGFR (ErbB-1); Her2/c-neu (ERbB-2) – typisch gerelateerd bij genetische borstkankers -; Her 3 (ErbB-3) en Her 4 (ErbB-4). Mutaties die de EGFR expressie of activiteit beïnvloeden kunnen leiden tot kanker (Do et al., 2009). C-terminus= rood; N-terminus= blauw EGFR wordt geactiveerd door binding met specifieke liganden zoals epidermale groeifactor en transforming growth factor (TGF-alfa). Bij de activatie door zijn liganden, ondergaat EGFR een transitie van een inactieve monomerische vorm naar een actieve homodimeer. Daarbij kan EGFR met andere leden van de familie binden zoals ErbB/her2/neu om een actieve heterodimeer te vormen. Er bestaat ook bewijs dat er zich clusters vormen van EGFRs. Dimerisatie stimuleert de intrinsieke intracellulaire proteïne-tyrosine kinase activiteit. Als gevolg hiervan ontstaat er autofosforylatie van verschillende tyrosine(Y) residues in het C-terminaal domein van EGFR. Deze autofosforylatie zorgt voor downstream activatie en signalisatie door verschillende andere proteïnen die associëren met het gefosforyleerde tyrosine door fosfotyrosinebinding van hun eigen SH2-domeinen. Deze downstream signaalproteïnes initiëren verschillende signaaltransductiecascades, vooral MAPK, Akt en JNK-pathways, welke leiden tot DNA-synthese en celproliferatie. 4.1.4.3.2. BIM-46174 BIM-46174 is een inhibitor van het heterotrimere G-proteïne complex. Het is een imidazopyrazine inhibitor. Het inhibeert kankercelinvasie die gecontroleerd wordt door verschillende GPCR agonisten en inhibeert celproliferatie in een serie chemoresistente humane kankercellijnen door caspase-3-dependente apoptose. Daarboven zorgt BIM-46174 voor 15 antitumorale activeit en potentieert de activiteit van verschillende klassieke antikanker agentia in muismodellen (Prevost et al., 2006). 4.1.4.3.3. Gleevec® Figuur II 4.1.4.3 uit: http://www.watisgenomics.nl/s ites/genomics/contents/i00066 7/translocatie-web.jpg, Sebastiaan Donders Door de uitwisseling van stukken DNA tussen de chromosomen 9 en 22 kan een fusiegen ontstaan van de genen Bcr en Abl* Gleevec® (Imatinib) is een medicijn dat gebruikt wordt in de behandeling van kanker. Momenteel is het op de markt door Novartis(USA) onder de naam Gleevec® of als Glivec® (Europa/Australië) als een mesylaatzout, imatinib mesilate. Het werd origineel gecodeerd vanuit ST-571 (CGP57148B). Het wordt gebruikt bij de behandeling van chronische myeloïde leukemie (CML), gastrointestinale stromale tumoren (GIST) ea. 16 Figuur III.4.3.4.3.3. Werking Gleevec http://images.goshdawni t.com/uploaded_images /432pxMechanism_imatinib_sv g-750799.png Author of original image was Sodium at en.wikipedia.org, free GPU License Het was het eerste lid van een nieuwe klasse agentia die werken door het inhiberen van specifieke tyrosine kinase enzymen, in plaats van niet-specifieke inhibitie van snel-delende cellen. Het is een 2-phenylaminopyrimidine derivaat dat functioneert als een specifieke inhibitor van een aantal tyrosine kinase enzymen. Het zet zich op de TK-actieve positie, wat leidt tot een vermindering van activiteit. Er is een enorme verscheidenheid van TK-enzymen in het lichaam. Imatinib is specifiek voor het TK-domein in abl (abelson proto-oncogen), c-kit en PDGF-R (platelet derived growth factor receptor). In CML leidt het Philadelphiachromosoom tot een fusieproteïne van abl en bcr (breakpoint cluster region). Dit is een continu actief tyrosine kinase en imatinib wordt gebruikt om die activiteit te verminderen. De actieve sites van de tyrosine kinasen hebben elk een bindingsplaats voor ATP. De enzymale activiteit gekatalyseerd door het tyrosine kinase is een transfer van het terminale fosfaat van ATP naar het tyrosine kinase. Dit proces is gekend als fosforylatie. Imatinib is vrij selectief voor bcr-abl, maar het inhibeert ook andere targets zoals hierboven vermeld. 4.1.4.1.4. M475271 Src, een proto-oncogen, is sterk betrokken bij de groei, progressie en de metastasering van een aantal menselijke kankers. M475271 is een src tyrosine kinase inhibitor die de pathway tussen de integrinereceptor en src blokkeert. Het reduceert de fosforylatie en de invasiviteit van kankercellen. Het is voornamelijk werkzaam op de VEGF – vascularisatie van tumoren. 17 Hier werkt het op de endotheel cadherines en β-catenine fosforylatie. Het behoort tot de klasse van de anilinoquinazolinederivaten (Ali et al., 2006). 4.2. Cellulair niveau 4.2.1. Celcultuur Om te voorzien in alle voor overleving en proliferatie benodigde nutriënten, waaronder eenvoudige suikers, essentiële aminozuren, anorganische zouten en vitaminen, groeien de cellen in een cultuurmedium. Onder invloed van deze componenten is de overleving van de cel weliswaar verzekerd, maar in vele gevallen zal de proliferatie zich slechts minimaal manifesteren. Om hieraan te verhelpen, wordt het cultuurmedium vaak aangerijkt met foetaal kalfserum (FCS), dat groeifactoren, hormonen en ongedefinieerde componenten bevat die de groei stimuleren. Decultivatie van de hier gebruikte cellijnen gebeurt in de “Dulbecco‟ s Modified Eagle Medium” (Kim et al., 2009), dat naast de reeds genoemde noodzakelijke componenten ook fenolrood, een pH-indicator, bevat. Een pH van 6,8 of kleiner levert een gele kleur, terwijl de pH van 7,4 of hoger een paarse kleur geeft. Het medium wordt oranje bij de optimale zuurtegraad, die tussen de twee bovengenoemde waarden ligt en tot stand komt door de cultuurflessen in een atmosfeer met 10% CO2 te plaatsen. De cellen worden uitgezaaid in een lage densiteit en zullen, afhankelijk van de proliferatiecapaciteit, na verloop van tijd een confluente monolaag vormen, waarin contactinhibitie de cellen gebiedt de celcyclus te verlaten. Om verdere groei toe te laten, dient de populatie opnieuw in een lage densiteit verdeeld te worden. Het verbreken van de cel-cel contacten gebeurt in twee stappen. In eerste instantie worden de cellen behandeld met Moscona, een fysiologische zoutoplossing zonder Ca2+ . De integriteit van de extracellulaire domeinen van een aantal belangrijke proteïnen die instaan voor de cel-cel adhesie wordt immers bestendigd door het gebruik van Ca2+ als cofactor. Behandeling van de cellen met Moscona zorgt ervoor dat Ca2+ uit deze eiwitten gedreven wordt en dit resulteert bijgevolg in een verzwakking van de cel-cel adhesie. In de tweede stap wordt een oplossing van trypsine/EDTA, een protease, op de cellen gebracht, met als gevolg de terminatie van cel-cel en cel-matrix contacten door afbraak van de extracellulaire domeinen van de adhesieproteïnen. Daar een te lange trypsinebehandeling schadelijk is voor de cellen, wordt na 10-15 minuten serumhoudend medium toegevoegd, waarin intrinsieke factoren aanwezig zijn die de proteasewerking inhiberen. MATERIAAL - Groeimedium 18 DMEM (Invitrogen, Merelbeke, België), aangevuld met 10% foetaal kalfserum (FCS), 2mM L-glutamine, 100 IU/ml penicilline en 100 µM streptomycine. - Plastic cultuurflessen - Moscona Bereiding van 1 l Moscona: Los de volgende producten op in 950ml gedestilleerd water: NaCl: 8,00g; KCl: 0,30g; Na2HPO4.H2O: 0,050g; KH2PO4: 0,025g; NaHCO3: 1,00g; Dextrose (glucose): 2,00g Breng de oplossing op pH 7-7,4 met HCL. Voeg gedestilleerd water toe tot een eindvolume van 1 l. Steriliseer de oplossing door filtratie door een filter met een poriëndiameter van 0,2 µm. Verdeel de oplossing in flesjes met een volume van 6 ml en bewaar bij -20°C. - Trypsine/EDTA (Invitrogen, Merelbeke, België) Los de volgende producten op in 950 ml gedestilleerd water voor de bereiding van 1 l trypsine/EDTA: Trypsine: 0,5g; Na4-EDTA: 0,2g Los deze componenten op in 1 l CMF-HBSS - Gyrotoryshaker (New Brunswick scientific company Cat.no 3111) - Gesteriliseerde erlenmeyer 50 ml (Sigma cat.no. Z723045) - Bürker telkamer (Feinoptik, Bad Blankenburg, Duitsland) Methode Groei van cellen - Breng een hoeveelheid celsuspensie in een plastieken cultuur fles (Falcon®) van 25 cm2 of 75 cm2 oppervlakte. - Leng aan tot 5 ml, respectievelijk 15 ml, met groeimedium. - Incubeer de cellen bij 37°C in een waterdampverzadigde 10% CO2 incubator. - Het groeimedium wordt ververst bij gele kleuromslag, wat wijst op uitputting van het medium. - Laat de cellen groeien tot de gewenste confluentie bereikt wordt. Bekijk de cellen geregeld met een lichtmicroscoop. Bereiden van een celsuspensie - Laat cellen groeien in een plastieken cultuurfles van 25 cm2 (of 75 cm2) oppervlakte. - Verwijder het groeimedium door aspiratie met een pasteurpipet gekoppeld aan een waterstraalpomp. 19 - Was de monolaag met 6 ml Moscona en verwijder door aspiratie. - Behandel de monolaag met 5 ml (of 10 ml) trypsine/EDTA gedurende 10s. Verwijder ongeveer 80% van het trypsine/EDTA door aspiratie met een waterstraalpomp. - Incubeer de monolaag in de resterende hoeveelheid trypsine/EDTA gedurende maximaal 10 min. (tot ook de celsubstraat contacten verbroken zijn) bij 37°C. - Maak de cellen los van de bodem door de cultuurfles enkele malen op de tafel te kloppen. - Voeg 5 ml (of 15 ml) groeimedium toe. - Suspendeer de cellen tot een homogene celsuspensie bekomen wordt. Bereiden van sferoïden - Breng 1 ml celsuspensie, bekomen uit de confluentie cultuurfles van 75cm2, in een erlenmeyer van 50ml. - Voeg 5 ml groeimedium toe. - Plaats de erlenmeyer voor minimaal 72 uur op de shaker (bij 37°C en 70 rpm in vochtige atmosfeer) en zorg voor de doorstroming van 10% CO2. - Na 72 uur kunnen de sferoïden bekeken worden onder de macroscoop. Opm. Er zijn voldoende cellen nodig om deze sferoïden te kunnen maken. Via macroscopische evaluatie werden empirische de celconcentratie vastgelegd op 5x104 tot 5x105 cellen/ml. Tellen van cellen - Bereid de Bürker telkamer: bevochtig een dekglaasje en breng het aan op de telkamer. Het verschijnen van Newtonringen betekent dat het dekglaasje correct is aangebracht. - Verdeel +- 20 µl celsuspensie over de 2 compartimenten van de telkamer. - Tel het aantal cellen onder een lichtmicroscoop met een objectieflens 20x in 50 telvakken. Doe dit voor de twee compartimenten van de telkamer. - Bereken het gemiddelde en vermenigvuldig dit aantal met 5000. Dit geeft het aantal cellen per ml. 4.3. Functionele testen 4.3.1. Invasie 20 Het kenmerk voor kwaadaardige tumoren is invasie en metastasering. Bij het verlaten van de weefselgrenzen dienen de tumorcellen de barrière van de extracellulaire matrix te overbruggen. Invasie kan in vitro bestudeerd worden door gesuspendeerde cellen of sferoïden in te bedden in een matrix van collageen type I, een belangrijke component van de ECM. Bij 4°C is de collageenmatrix vloeibaar, wat toelaat de cellen of sferoïden hierin makkelijk te suspenderen. Om uitzakken van de cellen tot op de bodem te verhinderen, wordt eerst een bodemlaagje van de collageenmatrix gegoten (1,25 ml). Dit laat men stollen bij 37°C gedurende minstens 1 uur en vervolgens wordt de tweede laag aangebracht waarin de cellen gesuspendeerd zijn. Eens deze laag dan gestold is, wordt aan het geheel medium (1 ml) toegevoegd. Dit medium is aangerijkt met de verschillende componenten waarvan het effect op de cellen of sferoïden bestudeerd wordt. Soms is het echter nodig om de componenten reeds in de collageenmatrix te verwerken, zodat er enkel zuiver medium op de collageenmatrix wordt gebracht. 4.3.1.1. Collageenmatrix Deze collageengel vormt de basis van onze invasietest. Collageen type I, afgeleid van rattenstaarten, werd bij BD Biosciences verkregen. De collageen type I oplossing van 1 ml met finale concentratie van 1mg/ml collageen type I werd gemaakt dor het samenvoegen van volgende componenten die op een temperatuur van 4°C werden bewaard. 0.286 ml collageen type I (stock is 4.37 mg/ml ), 0.350 ml CMF-HBSS, 0.072 ml MEM (10x), 0.072 ml 0.25M NaHCO3, 0.200 ml cultuurmedium. We voegen daarna 0.020 l van 1M NaOH toe om het zure karakter te neutraliseren. Belangrijk is om de oplossing te bewaren op ijs en om belletjes te vermijden in de oplossing daar deze artefacten geven bij het digitaliseren. Daarna voegen we de benodigde hoeveelheid collageenoplossing (1.25 ml voor elk welletje) in de 6-wellplaat en laten we ze opstijven op een vlak oppervlak bij 37°C in een met water verzadigde atmosfeer van 10% CO2lucht voor minstens 30 min. Deze zorgt voor een collageengel met een 250 µm centrale dikte. 4.3.1.2. Afbeeldingverwerking Foto‟s, gemaakt met een digitale camera (Leica, DFC 340FX), lieten ons toe de invasie in het single cell en sferoïdinvasiemodel te analyseren. Idealiter moeten staalvoorbereiding, optische microscopische observaties en condities voor afbeeldingcaptaties zorgvuldig worden uitgevoerd om optimale beeldkwaliteit te bekomen. We beogen een maximum aan contrast tussen het staal en de achtergrond. Helaas verhinderen de experimentele 21 condities in sommige gevallen dat deze ideale situatie bereikt wordt. Als voorbeeld kunnen we bijvoorbeeld cellen hebben aan de rand van de well. Ongelijkmatige belichting kan een donkere rand geven aan beide zijden van het beeld. Na captatie, werd het digitale beeld gekwantificeerd met behulp van Adobe Photoshop CS2 (Adobe) en ImageJ software (NIH). De afbeelding werd omgezet in een 8-bit type. Door het gebruik van de threshold functie, werden de gebieden van interesse geconverteerd op een uniforme manier naar verzadigde zwartwaarden om zo een binair beeld te geven (zwart/wit dus). Deze beelden ondergingen dan twee „clean-up‟ procedures. Eerst werden alle partikels kleiner dan drie pixels geëlimineerd. Daarna werd het binaire beeld vergeleken met de fasecontrastfoto en de overgebleven artefacten verwijderd. De set „measurements dialog box‟ werd gebruikt om de oppervlakte, de perimeter, en de Feret diameter (de langste afstand tussen 2 punten) te analyseren. De „analyze particle box‟ werd daarna gebruikt om alle partikels te meten en om een „particle report‟ voor elke afbeelding te maken in welke het gebied, perimeter en Feret‟ s diameter en de oppervlakte van de som van de individuele partikels werd gedocumenteerd. Het gebied berekend als vierkante pixels werd gedefinieerd als invasiegebied in het single cell en sferoïdinvasiemodel. Hieronder wordt een systematische workflow gegeven van de invasietest: Materiaal - Shaker - Erlenmeyer (50ml) - Groeimedium Dmem (Invitrogen, Merelbeke, België), aangevuld met 10% Foetaal kalfserum (FCS), 2mM L-glutamine, 100 IU/ml penicilline en 100 µg/ml streptomycine. - Groeifactoren - Collageenoplossing Bereiding voor 1 6-wellplaat: 6-well platen (Nunc, Rochester, USA) - “ImageJ 1.42b” Methode Invasietest - Maak collageenoplossing aan voor het aantal benodigde wells van de 6-well plaat en bewaar op ijs of bij 4°C om stolling te verhinderen. - Voeg per well van de 6-well plaat 1,25 ml collageenoplossing toe. - Plaats de 6-well plaat voor 1 uur bij 37°C zodat de grondlaag kan stollen. 22 - Voeg aan de nog niet gestolde collageenoplossing de benodigde sferoïden toe (minimaal 6 per conditie). - Voeg indien nodig de groeifactoren toe aan dit collageenmengsel. - Voeg per well van de 6-well plaat 1,25 ml van de collageenoplossing met sferoïden toe na voorzichtig suspenderen. - Laat het geheel gedurende 1 uur stollen bij 37°C. - Voeg per wel 1 ml groeimedium toe, al dan niet aangerijkt met groeifactoren of inhibitoren. - Incubeer voor 24 uur bij 37°C. Kwantificatie - Open de foto in “ImageJ 1,42b”. - Dupliceer de foto zodat bij verdere bewerkingen het origineel bewaard blijft en werk verder met één van de twee kopieën. (Image ->Duplicate). - Converteer naar 8-bit (Image -> Type ->8-bit). - Stel threshold in (zodanig dat de verdeling wit/zwart overeenkomt met de weergave op opname). - Bereken het aantal pixels (Analyze -> Analyze particles). In het menu dat verschijnt wordt bij “Minimum size (pixels)” 10 pixels ingevuld. Alle partikeltjes die bestaan uit 10 pixels of minder, wat onzuiverheden zijn, worden dan niet bij de oppervlakte gerekend. Vink “Summarize” aan. 4.3.2 Immunohistochemie Immunohistochemie (of IHC) (Lobo et al., 2009) is een techniek waarbij antilichamen gebruikt worden om specifieke antigenen te binden in biologische weefsels. De naamgeving „immuno‟ refereert naar de antilichamen, en „histo‟ refereert naar het weefsel. Deze techniek wordt gebruikt ter diagnose van abnormale cellen zoals bijvoorbeeld tumoren. Specifieke moleculaire merkers zijn specifiek voor cellulaire gebeurtenissen zoals proliferatie en apoptose. De techniek wordt ook gebruikt voor basisresearch om de distributie en de lokalisatie van biomarkers en eiwitexpressie in kaart te brengen. Visualisatie van de antilichaam-antigen interactie kan op verschillende manieren. Meestal wordt het antilichaam aan een enzym vastgehecht (bijvoorbeeld peroxidase) welke een kleurproducerende reactie katalyseert. Dit enzym kan ook vervangen worden door een fluorofoor (zoals bij FITC). De antilichamen kunnen polyclonaal of monoclonaal zijn. Deze laatste hebben over het algemeen een hogere specificiteit. We kunnen hier ook een onderscheid maken tussen primaire en secundaire antilichamen. Primaire antilichamen worden tegen specifieke 23 antigenen gemaakt, terwijl de secundaire antilichamen tegen primaire antilichamen worden gemaakt. De immunohistochemische detectie van antigenen in weefsel kan op twee manieren gebeuren: de directe en de indirecte methode. Over het algemeen wordt de indirecte methode verkozen omwille van sterkere signaalamplificatie door hogere sensitiviteit. Het is ook een ideale manier om eiwitexpressie te screenen en is belangrijk bij tumortypering. Zo is het mogelijk om via E-cadherine expressie een verschil te maken tussen DCIS (ductaal carcinoma in situ +) en LCIS ( lobulair carcinoma in situ -) en verschillende differentiatiegraden van DCIS (Gupta et al., 1997). 4.3.3. MAPK Array De MAPK array werd uitgevoerd in een Phospho-MAPK Array (R&D Systems, Inc., USA). Door de fosforylatiestatus van verschillende MAPK-families te bekijken, krijgen we informatie over de onderliggende mechanismen van de celfunctie. Materiaal - Phospho-MAPK array (R&D Systems, Inc.) - Array Buffers (1, 2, 3, 6) - Wasbuffer (R&D Systems, Inc.) - Anti-Phospho-MAPK Detectie Antilichaam Cocktail (R&D Systems) - Streptavidine-HRP - 4-well Multi-Dish (R&D Systems) - PBS (Invitrogen, België) Methode - Was de cellen met PBS en voeg daarna Lysis Buffer 6 en Array Buffer 1 toe. - Pipetteer 1,5 ml Array Buffer 1 in de wells. - Maak de arrays vrij uit hun beschermende folie en voeg ze toe aan de wells. - Incubeer 1 uur in de shaker. - Voeg lysaat toe aan 1,25 ml Array Buffer 1 en leng aan met Lysis Buffer 8 tot 1,5 ml (maximaal 250 µl per array). - Verwijder Array Buffer 1 van de 4-well Multi-dish en voeg lysaten toe. - Incubeer voor 24u op shaker. 24 - Verwijder arrays en voeg 20 ml wasbuffer toe en was gedurende 10 minuten op de shaker, herhaal 2 maal om 3 wasbeurten te krijgen. - Voeg 1,5 ml Detection Antilichaam Cocktail Concentraat (verdunning 1:100 in Array Buffer 2 en 3) toe aan elk van de 4 wells. - Voeg de array terug toe aan de wells en incubeer gedurende 2 uur. - Voer hierna opnieuw de wasprocedure uit zoals hierboven beschreven. - Verdun de Sptreptavidin-HRP 1:20000 met Array Buffer 2 en 3 en pipetteer 1,5 ml in elke well. - Haal de array uit zijn wascontainer en voeg terug toe aan de wells. - Incubeer gedurende 30 minuten en herhaal de wasprocedure. - Verwijder de arrays terug uit de wascontainer en breng ze in contact met chemieluminescent reagentia. - Laat de arrays daarna gedurende 1 à 10 minuten inwerken op een X-stralen film. 4.3.4. MTT-test Geel gekleurd MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-defenyltetrazolium bromide) wordt in viabele cellen door mitochondriale reductasen gereduceerd tot paarse formazankristallen, die vervolgens neerslaan. Permeabiliseren van het celmembraan met dimethylsulfoxie (DMSO) laat toe de kristallen op te lossen, waardoor de op de cellen aanwezige MTToplossing paars wordt. De intensiteit van de ontstane kleur staat in lineair verband met het aantal viabele cellen en wordt gemeten met de multiwell spectrofotometer bij 490nm. Materiaal - 96-well platen (Nunc, Rochester, USA) - Groeimedium Dmem (Invitrogen, Merelbeke, België), aangevuld met 10% Foetaal kalfserum (FCS), 2mM L-glutamine, 100 IU/ml penicilline en 100 µg/ml streptomycine. - Geconditioneerd medium - MTT-kleurstof (Sigma-Aldrich, Bornem, België) - DMSO (Sigma-Aldrich, Bornem, België) - Multiwell scanning spectrophotometer (ELISA reader) (Sopar Biochem, Brussel, België) Methode 25 - Bereid een celsuspensie (4.2.1) en breng de cellen over in serumhoudend groeimedium. - Zaai de cellen uit in een 96-well plaat in een volume van 200 µl per „well‟. Van iedere conditie worden 5 herhalingen in de test meegenomen. - Incubeer de 96-well plaat 24 uur bij 37°C in een waterdampverzadigde 10% CO2 incubator. - Aspireer het medium en voeg nieuw, serumvrij medium toe, aangerijkt met groeifactoren of geconditioneerd medium. - Incubeer 48 uur bij 37°C in een waterdampverzadigde 10% CO2 incubator. - Verwijder uit iedere „well‟ 100 µl medium en voeg 20 µl MTT-kleurstof toe. Incubeer de 96-well plaat, gewikkeld in aluminiumfolie, gedurende 2 uur bij 37°C in een waterdampverzadigde 10% CO2 incubator. - Aspireer de vloeistof weg en voeg 100 µl DMSO toe aan iedere „well‟. Suspendeer totdat de neergeslagen kristallen in oplossing gaan. - Meet de absorbantie bij 490 nm en verwerk de gegevens statistisch via een ongepaarde, eenzijdige T-test. 4.3.5. Statistische analyse Alle assays werden minstens in drievoud uitgevoerd tenzij anders aangegeven. Al de waarden worden meegegeven als gemiddelde +- standaard gemiddelde fout (s.e.m.). In het sferoïd model werden vergelijkingen uitgevoerd door het gebruik van een ongepaarde Student-test. De P < 0.05 werd beschouwd als een significant verschil vergeleken met de controle condities (aangeduid met *). 26 5. Resultaten 5.1. Immunohistochemie Figuur I.5.1. Immunohistochemie van DCIS en invasief weinig gedifferentieerd ductaal carcinoma Ductaal borstcarcinoom is het meest bekende type borstkanker bij vrouwen. Het bestaat in twee vormen: het infiltrerend ductaal carcinoom (IDC), een invasief, maligne en abnormale proliferatie van neoplastische cellen in het borstweefsel en het ductaal carcinoma in situ (DCIS), een niet-invasief, mogelijks maligne neoplasma dat nog beperkt is tot de ducti lactiferi, waar de borstkanker het vaak ontstaat. Deze figuur toont ons de immunohistochemie van borstkankercellen bij goed gedifferentieerde en matig tot weinig gedifferentieerde borstcarcinomen. Immunohistochemie of IHC is het proces waarbij proteïnes gelokaliseerd worden in cellen van een weefselstuk. Hierbij wordt gebruik gemaakt van de specificiteit van antilichamen die binden met antigenen in het biologische weefsel. De „C‟ in de figuur staat voor cellulaire aanwezigheid van WISP-2, terwijl de „N‟ staat voor nucleaire aanwezigheid van WISP-2. We zien bij het DCIS (ductaal carcinoma in situ) een duidelijke nucleus met een goede differentiatie. Zoals gezegd, was de bedoeling om WISP-2 aan te tonen in het 27 borstkankerweefsel. WISP-2 functioneert namelijk als een inhibitor van snail, hetgeen een EMT-transciptiefactor is (cfr. Infra). Wanneer we geen WISP-2 meer terugvinden in de kern, kunnen we bijgevolg verwachten dat er expressie van snail zal plaatsvinden en we een invasief beeld krijgen. De afwezigheid van nucleair WISP-2 zien we dan ook bij het weinig gedifferentieerde (en dus kwaadaardige) ductaal carcinoma. Ook zien we dat de cellulaire aanwezigheid van WISP-2 hier een mindere rol speelt. Snail is een zinkvinger transcriptiefactor die epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) geeft door directe suppressie van E-cadherine expressie (Fendrich et al., 2009). Snail is nodig voor mesodermale en neurale buis vorming bij de embryonale ontwikkeling en is betrokken bij tumorprogressie. Snail expressie correleert omgekeerd met de graad van differentiatie van de infiltrerende ductale carcinomen met lymfeknoop metastasen. Snail is dus betrokken bij de inductie van invasief en migrerend fenotype in epitheliale cellen (De Craene et al., 2005) en borstkankercellen. Bij deze laatste kan het als een merker van metastaserend vermogen gezien worden. 5.2. CI assay De cellijn die gebruikt wordt in deze scriptie, is de MCF-7 borstkankercel. Onder normale omstandigheden is deze cel niet tot weinig invasief in een bereide collageengel. Wanneer we echter het WISP-2-gen onderdrukken, wordt deze cellijn invasief. Er wordt gewerkt met een sferoïdinvasietest (zie inleiding). Dit laat ons toe om een nauwkeurige kwantificatie te maken van de invasie en migratiecapaciteit van deze cellen. De kwantificatie kan op verschillende manieren gebeuren zoals in de figuur duidelijk is. Via lichtmicroscopie kunnen er foto‟ s worden gemaakt waarbij het aantal invasieve cellen visueel geteld worden of die daarna bewerkt worden en via het programma ImageJ® gekwantificeerd kunnen worden. Phalloïdine kleuring laat ons toe het filamenteus actine cytoskelet te onderzoeken via immunofluorescentiemicroscopie. We kunnen verschillende zaken besluiten: Invasieve cellen in de matrix zijn licht in tegenstelling tot de cellen in de sferoïde en de collageenmatrix (A). Dit aantal invasieve cellen is driemaal hoger wanneer WISP-2 onderdrukt is in MCF-7 cellen (B). Computergestuurde kwantificatie kan helpen bij deze celtelling. Hiervoor werden tweedimensionale fasecontrastbeelden geïnverteerd en binair gemaakt onder identieke condities (C). Het gemiddelde invasiegebied is veel groter wanneer WISP-2-expressie onderdrukt is (D). Nog een andere methode is een invadogram waarin het totaal aantal pixels uitgezet wordt over de afstand van de sferoïde (E). Na binair maken van 28 de beelden, hebben we een aantal concentrische cirkels vanaf de sferoïdgrens geconstrueerd, door opeenvolgende vergrotingen met een vast interval vanaf de sferoïdgrenzen te maken (E, links). Dit invadogram toont ons dat de MCF-7shWISP-2 cellen de matrix infiltreren in groter aantal en over een grotere afstand. Door een analyse te maken van het F-actinecytoskelet werd er via confocale microscopie een morfometrische analyse gemaakt. Uitschakelen van WISP-2 stimuleert de invasie van MCF-7 cellen die uit de sferoïdstructuur komen. Soms zien we groepen cellen met een leidercel waaraan een ketting cellen hangt in groepen (F). 29 Figuur I.5.2. Verschillende visualisatie en kwantificatietechnieken van invasie bij MCF-7 cellen 30 5.3. Matrix screening Figuur I.5.3. Invloed van elementen van de extracellulaire matrix en basale membraan op invasie van MCF-7 cellen in collageen-type-I matrix. 31 We hebben deze screening uitgevoerd om het effect van verschillende elementen van de extracellulaire matrix en basale membraan op invasie te bestuderen. Zoals uit deze figuur blijkt, zien wij uiterst links boven de controle situatie. *FN staat voor fibronectine. We zien dat er geen inhibitie te zien is bij toevoeging aan de gelmatrix. Fibronectine is een hoogmoleculair gewicht extracellulair matrix glycoproteïne. Het bindt aan membraangebonden receptorproteïnen; de integrines. Fibronectine bindt eveneens aan extracellulaire matrixcomponenten zoals collageen, fibrine en heparansulfaat proteoglycanen. Het bestaat als een dimeer dat bestaat uit twee vrijwel identieke monomeren, verbonden door disulfidebruggen. Er bestaat een oplosbare vorm (gevonden in bloedplasma) en een onoplosbare vorm (een element van de extracellulaire matrix) (Ohashi en Erickson, 2009). Fibronectine speelt een belangrijke rol in de celadhesie, groei, migratie en differentiatie. Het is ook betrokken in processen zoals wondheling en embryonale ontwikkeling. Verstoorde fibronectine expressie, degradatie en organisatie hangt samen met kanker en fibrose. *TNC staat voor tenascin-C. Ook hier zien we geen invloed op de invasie. Tenascines zijn extracellulaire matrix proteïnes. Ze worden frequent gevonden in de extracellulaire matrix van vertebratenembryo in ontwikkeling en verschijnen rond helende wonden en in het stroma van verschillende tumoren. Tenascine-C is de belangrijkste van de 4 Tenascinegenenfamilie (-R –X –W) (Ueda et al., 2009). Tenascine-C wordt gevonden in het embryo en wordt gemaakt in de neurale zenuwlijst. Het is ook aanwezig bij ontwikkelende pezen, bot en kraakbeen. Het heeft verder anti-adhesieve eigenschappen, wat ervoor zorgt dat de cellen ronder worden bij additie in medium. Dit kan verklaard worden door de mogelijkheid om te binden aan het ECMP Fibronectine, en zo wordt verhinderd dat deze binden aan specifieke syndecans. Wanneer Tenascine-C gevonden wordt in tumoren, is er een slechte prognose (Emoto et al., 2001). *DEC staat voor Decorine. Hier zien we geen invloed op de invasie. Decorine is een proteoglycaan dat behoort tot de „small leucine-rich proteoglycan family‟. Het bestaat uit een proteïnekern met glycosaminoglycanen, bestaand uit chondroitinesulfaat of dermatansulfaat. Decorine is een klein (peri-)cellulair matrixproteoglycaan. Het is een component van het bindweefsel, bindt aan collageen I fibrillen en speelt een rol in de matrixassemblage. 32 Decorine speelt een rol in de fibrillogenese (Fiedler en Eble, 2009). Er is interactie met fibronectine, thrombospondine, complementfactor C1q, EGFR en TGF-β. In de publicatie wordt aangetoond dat het de activiteit van TGF-β1 kan veranderen (stimuleren of inhiberen). Hieruit kan besloten worden dat de primaire functie van decorine zich bevindt ter hoogte van de celcyclus. Het zou anti-tumorigene eigenschappen hebben. Mutaties in het decorinegen zijn geassocieerd aan congenitaal stromaal corneale dystrofie. *MAT staat voor Matrigel. Een combinatie van verschillende componenten die deel uitmaken van de basale membraan. We zien dat hier ook een sterke inhibitie te zien valt. Dit kan verklaard worden door het grote aandeel van laminine in Matrigel en strookt met de bevindingen bij laminine. Matrigel is de naam van een gelatineus proteïnemengsel, gesecreteerd door muizentumorcellen en op de markt gebracht door BD Biosciences. Dit mengsel lijkt op het complexe extracellulaire milieu dat gevonden wordt in vele weefsels. De hoofdcomponenten van Matrigel zijn laminine en collageen. Zij vertegenwoordigen de adhesieve peptidensequenties die in natuurlijke omgeving worden gevonden. *LAM staat voor laminine. Hier zien we een sterke vermindering van invasie. Laminine is een proteïne dat gevonden wordt in de extracellulaire matrix. Het is het belangrijkste niet-collageneuze element in de basale membraan waarop de cellen van een epitheel liggen. Het heeft 4 armen waarop 4 andere molecules kunnen binden. De 3 kortere armen zijn vooral bedoeld om andere lamininemoleculen te binden. Dit is de reden waarom laminine dergelijke sterke sheets vormt. De lange arm kan binden aan cellen, zodat het als anker dient in het membraan. Laminine is noodzakelijk om alle lichaamsstructuren samen te houden. Foutieve productie kan bijvoorbeeld spierdystrofie geven. Elke lamininemolecule is een heterotrimeer bestaande uit alfa-, bèta, en gammaketens. Reeds 15 lamininetrimeren zijn geïdentificeerd (Carpenter et al., 2009). Laminine vormt onafhankelijke netwerken en is geassocieerd met type IV collageen netwerken via entactine en perlecan. Het bindt ook aan celmembranen via integrinereceptoren en andere plasmamembraan moleculen. Door deze interacties vervult laminine een kritische rol in de celvasthechting en differentiatie, celvorm en beweging, onderhoud van het weefselfenotype en celoverleving. (Een specifieke sequentie van laminine, op de alfa-ketting, zorgt voor de adhesie van endotheliale cellen) 33 *COL IV staat voor collageen IV, een component van de basale membraan. Ook hier zien we geen inhibitie van de migratie. Type IV collageen is een type collageen dat vooral in de basale membraan wordt gevonden. De C-terminus is niet verwijderd bij het post-translationele proces en de vezels liggen kopaan-kop in plaats van parallel. Het heeft ook niet het typische glycineresidu dat zorgt voor de strakke collageenhelix. *ENT staat voor Entactine. Dit is een component van laminine. Deze blijkt echter niet voldoende te zijn om de invasie te inhiberen. Entactine of nidogen is een component van de basale membraan. Dit gen codeert voor een lid van de nidogenfamilie en zou een rol spelen in de interactie met andere basale membraancomponenten en extracellulaire matrix. 5.4. Array Nadat we de matrixscreening hebben gedaan, wilden we enkele MAPK-pathways onderzoeken op hun activiteit met en zonder laminine in een collageenmatrix. Figuur I.5.4. Array in collageen ter screening van MAPK-kinase pathways 34 Hieronder wordt een tabel weergegeven met alle coördinaten. Pathways die een positief signaal geven zijn belangrijk, maar ook degene die geen signaal geven zijn van betekenis. Figuur II.5.4. Posities van kinasen in array A1, A2 A21, A22 B3, B4 B5, B6 B7, B8 B9, B10 B11, B12 B13, B14 B15, B16 B17, B18 B19, B20 C3, C4 C5, C6 C9, C10 C11, C12 C13, C14 C15, C16 C17, C18 C19, C20 D5, D6 D7, D8 D15, D16 D17, D18 E3, E4 E5, E6 E7, E8 E9, E10 E11, E12 E13, E14 F1, F2 Positieve Controle Positieve Controle p44 MAPK JNK1 JNK pan p38 MAPK12 p38 MAPK13 RSK1 MAPKAPK1 GSK-3 Akt1 Akt2 p42 MAPK JNK2 p38 MAPK14 p38 MAPK11 RSK2 ISPK-1 GSK-3 GSK3B Akt3 Akt pan JNK3 MAPK10 MSK2 HSP27 p70 S6 Rabbit IgG Mouse IgG1 Mouse IgG2A Mouse IgG2B Goat IgG PBS Positieve Controle Control (+) Control (+) Control (-) Control (-) Control (-) Control (-) Control (-) Control (-) Control (+) De fosforylatiestatus van drie grote families van mitogen-geactiveerde proteïne kinasen (MAPKs), het extracellulaire signaalgereguleerde kinase (ERK1/2), c-Jun N-terminaal kinase (JNK1-3) en verschillende p38 isovormen (alfa/bèta/gamma/delta), zijn essentieel om de rol van deze signaalmolecules in de celfunctie te begrijpen. De „Human Phospho-MAPK Array‟ is een snel en gevoelig instrument om verschillende niveaus van fosforylatie van de 9 MAPKs en 9 andere Serine/Threonine kinasen te detecteren zonder verschillende immunoprecipitaties en/of Western blots te gebruiken. Elk antilichaam werd zorgvuldig geselecteerd door middel van lysaten van behandelde cellijnen die het doelproteïne tot expressie brengen. Het principe van de assay bestaat erin dat antilichamen (capture en control) gedupliceerd voorkomen in een nitrocellulose membraan. Cellysaten worden verdund en geïncubeerd in de Human Phospho-MAPK Array. Na binding met zowel de gefosforyleerde en niet- 35 gefosforyleerde kinasen, wordt het ongebonden materiaal weggewassen. Een oplossing van antilichamen, specifiek voor de fosfo-bindingplaats worden dan gebruikt om te gefosforyleerde kinasen via Streptavidin-HRP en chemieluminescentie te detecteren. In onze array zien we dat JNK2 en p38 sterk oplichten in de collageenmatrix, we kunnen dus besluiten dat deze pathways een rol spelen in dit celmodel. Wanneer we nu laminine toevoegen aan de collageenmatrix, zien we dat deze pathways geïnhibeerd worden. 36 5.5. Farmacologische inhibitoren Figuur I.5.5. Invloed van farmacologisch inhibitoren op invasie van MCF-7 cellen in collageen-type-I matrix. 37 Deze figuur toont de inhibitoren van de signaalpathways. Uiterst linksboven zien we weer een controlesituatie met een collageengel van 1mg/ml. We wilden enkele farmacologische inhibitoren testen nu we verschillende pathways hadden ontdekt met behulp van de MAPKarray. *CNF is een Rho activator *C3T is een Rho-inhibitor *Y27632 is een ROCK inhibitor *Bleb is een MLCK inhibitor *SB216763 is een PI3K/GSK3b pathway inhibitor *PD98059 is een p44-p42 MAPK inhibitor *SP600125 is een JNK inhibitor We zien dat C3T (Rho-inhibitor) de sterkste inhibitie geeft van de invasie (zie figuur Rho cascade). Ook Y27632, een downstream ROCK inhibitor heeft een inhiberend effect. Verder hebben ook Bleb (myosine light chain kinase) en SP600125 een inhiberend effect. Jun N-terminaal kinase (JNK) is een stress-geactiveerd proteïne kinase dat geïnduceerd kan worden door inflammatoire cytokines, bacteriële endotoxines, osmotische shock en UVstraling of nog hypoxie. SP600125 behoort tot de anthrapyrazolonen die inhibitie geven aan JNK1, -2 en -3. Het is een reversibele ATP-competitieve inhibitor met een >20-voudige specificiteit. Er is een dosisafhankelijke inhibitie van de fosforylatie van c-Jun, de expressie van inflammatoire genen COX-2, IL-2, IFN-gamma, TNF-alfa. CNF geeft geen relevante stimulatie, noch inhibitie. We kunnen dus stellen dat deze Rhoactivator geen invloed heeft op het invasieproces en we reeds aan een maximale invasie zitten. De PI3K/GSK3b inhibitor SB216763 is onvoldoende om de invasie tegen te gaan. De PI3k/Akt pathway is reeds bekend als majeure regulator van de cellulaire proliferatie, differentiatie en dood in verschillende celtypes. Glycogeen synthase kinase 3 (GSK3) is een serine/threonine proteïne kinase dat geïnhibeerd wordt door een waaier van extracellulaire stimuli waaronder insuline, groeifactoren, celspecifieke factoren en cel adhesie. SB216763 is een potent en selectief celpermeabel ATP-competitieve inhibitor van GSK3 . 38 De p44/p42 MAPK pathway wordt ook wel de ERK signaalpathway genoemd. Deze is een belangrijke determinant in de controle van celgroei, celdifferentiatie en celoverleving. Deze pathway, welke downstream staat van Ras, is vaak opgereguleerd in menselijke tumoren en presenteert zich dus als een mogelijk doel voor antikanker therapie. PD98059 is een heel selectieve MEK1-inhibitor. MEK zorgt voor de activatie van de p44/p42 pathway. MEK1 en MEK2 zijn duaal-specifieke proteïne kinasen die functioneren in een mitogen geactiveerd proteïnekinasecascade die celgroei en differentiatie geeft. De activatie van MEK1 en MEK2 gebeurt door fosforylatie van twee serineresidus op positie 217 en 221 door raf-like moleculen. Ze worden geactiveerd door een grote variëteit aan groeifactoren en cytokines en ook door membraan depolarisatie en calcium influx. MEK activeert p44 en p42 MAP kinase door fosforylatie van zowel een threonine als een tyrosine residu. PD98059 bindt aan het inactieve deel van MEK1 en voorkomt de activatie van upstream activators zoals c-Raf. 5.6. Klinische inhibitoren Bij de klinische inhibitoren vinden we een sterke inhibitie bij het anilinoquinazoline derivaat m475271. Deze tyrosine kinase inhibitor inhibeert Src (afkomstig van de naam sarcoma) (zoals te zien in figuur 1). Src is reeds lange tijd gekend en speelt een rol in de embryologie en celproliferatie. Onze experimenten tonen zeer belovende resultaten op gebied van invasie wanneer we kijken naar de sterke inhibitie. Ook inhibitie van de EGF-receptor door Iressa® toont een verminderde invasie, zij het wel veel minder sterk dan m475271. Dit ligt in de lijn van de verwachtingen, aangezien MCF-7 behoort tot de genetische borstkankers, welke positief zijn voor ErbB1 en/of Her2/neu. Als derde inhibitor vinden we nog BIM-46174 welke inwerkt op de trimere G-proteïnecomplexen. Deze is bekend om via de Wnt-2 pathways (Prevost et al., 2006) inhibitie te geven. Provoost et al. toonde reeds aan dat dit zeker een potentiële inhibitor voor therapieresistente menselijke tumoren kan zijn. Ons onderzoek toont dit voor de MCF-7cellijn inderdaad aan. Als vierde inhibitor hebben we Gleevec®. Deze inhibitor wordt al een hele tijd gebruikt in de behandeling van chronische myeloïde leukemie. Deze inhibitor oefent zijn werking ook uit via inhibitie van tyrosine kinasen. Zoals hierboven beschreven is vooral de c-kit (CD117), een proto-oncogen, als doel bij ons onderzoek. Ook PDGF (Crawford et al., 2009), welke belangrijk is bij de angiogenese, kan als target dienen in de toekomst. De inhibitie is voor alle inhibitoren significant (p<0,01). 39 Figuur I.5.6. Invloed van klinische inhibitoren op invasie van MCF-7 cellen in collageen-type-I matrix. 40 5.7. MTT SP60 GLEEVEC® M475 BIM46 EGFR SB21 PD98 SB20 Controle Gemiddelde 0,2316 0,268 0,2774 0,2732 0,776 0,8084 0,7438 0,7796 0,622 Relatief 37,234727 43,0868 44,598071 43,9228 124,759 129,968 119,582 125,338 100 SD 0,052060542 0,09173876 0,030253925 0,045800655 0,107821612 0,097715403 0,102709299 0,119422778 0,048456166 Relatieve 8,3698621 14,749 4,8639751 7,36345 17,3347 15,7099 16,5127 19,1998 7,79038 SE 0,023282182 0,04102682 0,013529967 0,020482676 0,048219291 0,043699657 0,045932995 0,05340749 0,021670256 Relatieve 3,7431161 6,59595 2,1752359 3,29303 7,7523 7,02567 7,38473 8,58641 3,48396 1,8855E-06 0,000249913 4,15723E-06 2,6726E-06 0,029406485 0,00916164 0,055628532 0,038760697 Gemiddelde SD SE P-waardes Figuur I.5.7. MTT test ter controle van viabiliteit bij gebruik van verschillende inhibitoren in het MCF-7 borstkankermodel met tabel. SD = standaard deviatie; SE = standaard fout 41 We hebben deze MTT uitgevoerd om de viabiliteit te kunnen testen van de cellen nadat ze behandeld werden met de inhibitoren. Door de vorming van de formazankristallen krijgen we een beeld van de hoeveelheid mitochondriale activiteit. De grafiek toont een duidelijke verdeling. We hebben de waarden uitgewerkt ten opzichte van de controlelijn zodat we een relatieve vergelijking kunnen maken. Zoals we reeds vermoeden, is er inhibitie aanwezig van SP600125, Gleevec®, M475271 en BIM-46174. Deze inhibitoren hadden bij voorgaande tests ook de meeste invloed op de invasie. We hebben ook enkele andere inhibitoren getest, maar we zien dat deze geen verminderde invloed hebben op de viabiliteit. De concentraties waarin we de inhibitoren gebruiken, zorgen dus niet voor het afsterven van de cellen. Dit is een belangrijke vaststelling in verband met het gebruik in vivo. We hebben een tweezijdige student t-test uitgevoerd om de significantie kunnen te kunnen bepalen. Waar onze p-waarde <0,05 is, is de test significant (*) te noemen. Enkel PD98 is dus niet als significant te beschouwen. We hebben geopteerd om de resultaten voor de WISP-2-cellijn hier te tonen. Deze cellen werden in concentraties van 10000 cellen per well bekomen. 6. Discussie Er werd gekozen voor de MCF-7 borstkankercellijn, omdat het een vaak gebruikte cellijn is om farmacologische en klinische inhibitoren te testen. In dit werkstuk werd er gebruikt gemaakt van twee afgeleide vormen van deze cellijn. Om nu de eigenschappen van deze cellen optimaal te kunnen screenen, werd er een onderdrukking van het WISP-2 gen uitgevoerd door middel van een short hairpin. Er wordt een vector ingebracht in de cellen gekoppeld aan een promotor die zo de expressie onderdrukt. Deze modificatie dient overerfbaar te zijn. Door het inbrengen van deze promotor wordt er een stukje RNA gefabriceerd dat bindt op het RNA dat normaal tot expressie gebracht wordt en zo wordt de expressie uitgeschakeld. Het WISP-2-gen (CCN5) is gekend om te functioneren als transcriptieregulator van genen die celproliferatie en motiliteit controleren in epitheliaal borstweefsel. Door de immunohistochemie konden we vaststellen dat het CCN5/WISP-2-proteïne vooral in het cytoplasma gelokaliseerd is. De lokalisatie is echter niet beperkt tot het cytoplasma, want ook in de nucleus vinden we dit proteïne terug. Deze nucleaire activiteit vinden we terug bij het niet-invasieve fenotype en we kunnen dus veronderstellen dat verlies van nucleaire 42 expressie van WISP-2 een rol speelt bij invasie. De cytoplasmatische WISP-2 expressie was eveneens sterker bij het niet-invasieve fenotype, maar was niet specifiek voor invasie. We hebben dus gezien dat uitschakelen van het WISP-2-gen bijdraagt aan maligne transformatie. Het mechanisme hierachter kunnen we als volgt proberen verklaren. Door de onderdrukking van WISP-2, werd er een verhoogde expressie van Snail gezien, maar een verminderde expressie van E-cadherine. Deze verminderde expressie van E-cadherine zorgt voor een slechtere prognose, omdat verlies van E-cadherine de cellen van elkaar losmaakt, zodat er invasie kan optreden (Gould Rothberg en Bracken, 2006). Na het bepalen van de cellijn, was de volgende stap het vinden van een goed protocol om het invasief gedrag van deze cellen te bestuderen. Er werd gekozen voor sferoïden die in een 3D-collageenmatrix werden geplaatst. Deze collageenmatrix dient het extracellulair milieu in vivo zo goed mogelijk na te bootsen. Allereerst werd de meeste optimale concentratie collageen bepaald, welke werd vastgesteld op 1mg/ml. Dit houdt in dat er een evenwicht moet zijn tussen de stabiliteit van het milieu en toch mogelijkheden laat tot invasie. Deze celmatrix laat ons toe een mooi 3D-model te bekomen van de bestudeerde sferoïden en leent zich ideaal om foto‟ s te maken ter kwantificatie van de invasie. Eén van de voorwaarden voor initiatie van invasie is het verzwakken van de cel-cel contacten. Zoals hierboven beschreven is een van de mechanismen die hiertoe bijdraagt, de verminderde expressie van E(pitheliaal)-cadherine. Collageen type I zorgt voor een verminderde expressie van E-cadherine (Menke et al., 2001). Als eerste luik in deze thesis hebben we verschillende matrixproteïnes onder de loep genomen. Zo konden we laminine identificeren als een sterke inhibitor van invasie in het sferoïdinvasiemodel. Andere extracellulaire matrixproteïnes en delen van de basale membraan bleken een niet significante rol te spelen bij de invasie. Bij de introductie van groeifactoren (EGF en TGF-β) zagen we ook geen significantie inhibitie of activatie van de invasie (data niet getoond), zodat we konden concluderen dat het invasiepotentieel reeds optimaal benut werd bij de WISP-2-onderdrukte cellen. Deze screening naar betrokken matrixproteïnen is uitermate belangrijk indien we terugkoppelen naar de in vivo omstandigheden omdat deze componenten een doel kunnen vormen voor toekomstige therapieën. Al de testen werden in drievoud uitgevoerd om toevallige variaties zoveel mogelijk uit te sluiten. Naast laminine vermelden we ook Matrigel. Een substantie die qua samenstelling heel sterk aanleunt bij het weefsel in vivo. Zoals in de lijn van de verwachtingen ligt, gezien de grote concentratie laminine in Matrigel, vinden we ook hier een sterke inhibitie terug. Belangrijk is om de mechanismen die bij de epithelialemesenchymale overgang (EMT) een rol spelen, te ontrafelen. De epitheliale-mesenchymale 43 transitie (EMT) zorgt voor gewijzigde eigenschappen van de cel. In dit proces vinden we een verlies van celadhesies, repressie van de E-cadherine-expressie en verhoogde celmobiliteit (Voulgari en Pintzas, 2009). Er zijn verschillende oncogene pathways gekend waardoor EMT geïnduceerd wordt. In het bijzonder de Ras-MAPK pathway. Hieraan zijn twee transciptiefactoren gerelateerd, nl Snail en Slug. Zij zijn beide inhibitoren van E-Cadherine (welke zorgt voor stevige celcontacten) (Fritah et al., 2008), (Yilmaz en Christofori, 2009). Deze EMT is zo belangrijk omdat ze een eerste stap is in de initiatie van de metastasering. Het verlies van cel-cel contacten is gemediëerd door E-Cadherine repressie en een verhoging van de cel mobiliteit. Dit is een karakteristieke eigenschap van cellen die prolifereren (De Wever et al., 2008). Nadat we onze matrixproteïnen hebben gescreend, hebben we een manier gezocht om de verschillende pathways te onderzoeken. We hebben hiervoor dan een MAPK array gebruikt samen met een collageenmatrix waaraan al dan niet laminine werd toegevoegd. Deze MAPK array doet vermoeden dat JNK fosforylatie essentieel is in WISP-2 onderdrukte invasie. Nu de pathways blootgelegd zijn, gaan we over naar een tweede belangrijke luik van deze thesis: de farmacologische inhibitoren. We bespreken hier het effect van JNK inhibitoren, Rho inhibitoren, ROCK inhibitoren. SP600125, welke een JNK inhibitor is, zorgt voor significante inhibitie van de invasie. Zoals we reeds hoger hebben beschreven, was deze pathway actief in de MAPK array die we hebben uitgevoerd. Deze inhibitor zorgt dus voor een concentratiegerelateerde inhibitie van invasie. Verder hebben we ook enkele Rho-modulatoren getest. Ook hier hebben we enkele inhibitoren geïdentificeerd die een vermindering van invasie tot gevolg hebben. C3T is een Rho-inhibitor, Y27632 is een ROCK inhibitor en CNF geeft ons Rho-activatie. Deze laatste activator toont een lichte, doch niet significante verhoging van de invasie. Het exo-enzyme C3T geeft inhibitie, net zoals de verder downstream werkende ROCK inhibitor Y27632. Een derde luik zijn de klinische inhibitoren. We hebben deze getest om toch ook enkele in de praktijk gebruikte te testen. Deze medicatie werkt via bepaalde pathways, waarvan sommige nog niet bekend zijn in een bepaald type tumor. Het is dus zeker nuttig om een screening van dergelijke producten uit te voeren. Gleevec®, M475271, Iressa (EGFR-inhibitor) en BIM46174 werden getest in onze collageenmatrix. Hierbij is het interessant om te zien dat M475271 voor een zeer sterke inhibitie zorgt van invasie. Deze inhibitor werkt op een integrine receptor complex. Dit zijn celoppervlaktereceptoren die interageren met de extracellulaire matrix en intracellulaire 44 signalen mediëren. Ze zorgen voor de cellulaire vorm, mobiliteit en reguleren de celcyclus. Integrines spelen vooral een rol in de cel-matrix contacten. Daarnaast spelen ze ook een rol in de signaaltransductie, wat inhoudt dat een signaal omgezet wordt door de cel in een ander signaal. De integrines hebben een heterodimere vorm bestaande uit α en β subunits. In relatie met onze bestudeerde matrixproteïnes vinden we bij de liganden onder andere fibronectine, collageen en laminine. Ze zorgen vooral voor de trekvastheid. Men kan ze eigenlijk vergelijken met een soort gesofisticeerde haken waarmee de cel zich vasthecht aan zijn omgeving via complexen. M475271 werkt specifiek op de Src kinase, een van de twee kinasesystemen (naast focal adhesion kinase) dat zo substraten fosforyleert en op die manier nieuwe signalen produceert. Integrines blijken enorm belangrijk te zijn voor verschillende processen zoals celgroei, celdeling, celoverleving, cellulaire differentiatie en apoptose. Het feit dat M475271 een dergelijke sterke inhibitie geeft, schept zeker mogelijkheden voor verdere trials met deze specifieke inhibitor bij borstkanker (De Wever et al., 2008). Gleevec® en BIM-46174 geven een minder sterke inhibitie, doch hun effect is zeker waarneembaar. Verdere trials dienen zich aan. Iressa aan de andere kant toonde ons geen effect. Iressa is echter zeker bruikbaar in de behandeling van borstkanker, gezien recente studies pathways aangeven die bij borsttumoren kunnen gebruikt worden (McGovern et al., 2009). Het werk in deze thesis toont aan dat matrixproteïnen een enorme rol spelen in het MCF-7 shWISP-2 model. Laminine, een belangrijke component van de basale membraan, heeft een inhiberend effect op de RhoA-ROCK-JNK pathway die op zijn beurt essentieel is voor invasie. 45 7. Referentielijst ALI N., YOSHIZUMI M., YANO S., SONE S., OHNISHI H., ISHIZAWA K., KANEMATSU Y., TSUCHIYA K.,TAMAKI T.: The novel Src kinase inhibitor M475271 inhibits VEGF-induced vascular endothelial-cadherin and beta-catenin phosphorylation but increases their association. J Pharmacol Sci, 2006, 102 (1), 112-20. ARAUJO V. C., FURUSE C., CURY P. R., ALTEMANI A., ALVES V. A.,DE ARAUJO N. S.: Tenascin and fibronectin expression in carcinoma ex pleomorphic adenoma. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2008, 16 (1), 48-53. CARPENTER P. M., DAO A. V., ARAIN Z. S., CHANG M. K., NGUYEN H. P., ARAIN S., WANG-RODRIGUEZ J., KWON S. Y.,WILCZYNSKI S. P.: Motility induction in breast carcinoma by mammary epithelial laminin 332 (laminin 5). Mol Cancer Res, 2009, 7 (4), 462-75. CHU D.,LU J.: Novel therapies in breast cancer: what is new from ASCO 2008. J Hematol Oncol, 2008, 1 16. COOPMAN P., VERHASSELT B., BRACKE M., DE BRUYNE G., CASTRONOVO V., SOBEL M., FOIDART J. M., VAN ROY F.,MAREEL M.: Arrest of MCF-7 cell migration by laminin in vitro: possible mechanisms. Clin Exp Metastasis, 1991, 9 (5), 469-84. CRAWFORD Y., KASMAN I., YU L., ZHONG C., WU X., MODRUSAN Z., KAMINKER J.,FERRARA N.: PDGFC mediates the angiogenic and tumorigenic properties of fibroblasts associated with tumors refractory to anti-VEGF treatment. Cancer Cell, 2009, 15 (1), 21-34. DE CRAENE B., GILBERT B., STOVE C., BRUYNEEL E., VAN ROY F.,BERX G.: The transcription factor snail induces tumor cell invasion through modulation of the epithelial cell differentiation program. Cancer Res, 2005, 65 (14), 6237-44. DE WEVER O., PAUWELS P., DE CRAENE B., SABBAH M., EMAMI S., REDEUILH G., GESPACH C., BRACKE M.,BERX G.: Molecular and pathological signatures of epithelial-mesenchymal transitions at the cancer invasion front. Histochem Cell Biol, 2008, 130 (3), 481-94. DI LULLO G. A., SWEENEY S. M., KORKKO J., ALA-KOKKO L.,SAN ANTONIO J. D.: Mapping the ligandbinding sites and disease-associated mutations on the most abundant protein in the human, type I collagen. J Biol Chem, 2002, 277 (6), 4223-31. DO S. I., JUNG W. W., KIM H. S.,PARK Y. K.: The expression of epidermal growth factor receptor and its downstream signaling molecules in osteosarcoma. Int J Oncol, 2009, 34 (3), 797-803. EMOTO K., YAMADA Y., SAWADA H., FUJIMOTO H., UENO M., TAKAYAMA T., KAMADA K., NAITO A., HIRAO S.,NAKAJIMA Y.: Annexin II overexpression correlates with stromal tenascin-C overexpression: a prognostic marker in colorectal carcinoma. Cancer, 2001, 92 (6), 1419-26. ESSLER M., LINDER S., SCHELL B., HUFNER K., WIEDEMANN A., RANDHAHN K., STADDON J. M.,AEPFELBACHER M.: Cytotoxic necrotizing factor 1 of Escherichia coli stimulates Rho/Rhokinase-dependent myosin light-chain phosphorylation without inactivating myosin light-chain phosphatase in endothelial cells. Infect Immun, 2003, 71 (9), 5188-93. FENDRICH V., WALDMANN J., FELDMANN G., SCHLOSSER K., KONIG A., RAMASWAMY A., BARTSCH D. K.,KARAKAS E.: Unique expression pattern of the EMT markers Snail, Twist and E-cadherin in benign and malignant parathyroid neoplasia. Eur J Endocrinol, 2009, 160 (4), 695-703. FIEDLER L. R.,EBLE J. A.: Decorin regulates endothelial cell-matrix interactions during angiogenesis. Cell Adh Migr, 2009, 3 (1), FIEDLER L. R., SCHONHERR E., WADDINGTON R., NILAND S., SEIDLER D. G., AESCHLIMANN D.,EBLE J. A.: Decorin regulates endothelial cell motility on collagen I through activation of insulin-like growth factor I receptor and modulation of alpha2beta1 integrin activity. J Biol Chem, 2008, 283 (25), 17406-15. 46 FREITAS M. R., ETO M., KIRKBRIDE J. A., SCHOTT C., SASSARD J.,STOCLET J. C.: Y27632, a Rhoactivated kinase inhibitor, normalizes dysregulation in alpha1-adrenergic receptor-induced contraction of Lyon hypertensive rat artery smooth muscle. Fundam Clin Pharmacol, 2009, FRITAH A., SAUCIER C., DE WEVER O., BRACKE M., BIECHE I., LIDEREAU R., GESPACH C., DROUOT S., REDEUILH G.,SABBAH M.: Role of WISP-2/CCN5 in the maintenance of a differentiated and noninvasive phenotype in human breast cancer cells. Mol Cell Biol, 2008, 28 (3), 1114-23. GOULD ROTHBERG B. E.,BRACKEN M. B.: E-cadherin immunohistochemical expression as a prognostic factor in infiltrating ductal carcinoma of the breast: a systematic review and meta-analysis. Breast Cancer Res Treat, 2006, 100 (2), 139-48. GUPTA S. K., DOUGLAS-JONES A. G., JASANI B., MORGAN J. M., PIGNATELLI M.,MANSEL R. E.: Ecadherin (E-cad) expression in duct carcinoma in situ (DCIS) of the breast. Virchows Arch, 1997, 430 (1), 23-8. HUELSENBECK J., DREGER S. C., GERHARD R., FRITZ G., JUST I.,GENTH H.: Upregulation of the immediate early gene product RhoB by exoenzyme C3 from Clostridium limosum and toxin B from Clostridium difficile. Biochemistry, 2007, 46 (16), 4923-31. KIM C., AMANO T., PARK J., CARTER M. G., TIAN X.,YANG X.: Improvement of embryonic stem cell line derivation efficiency with novel medium, glucose concentration, and epigenetic modifications. Cloning Stem Cells, 2009, 11 (1), 89-100. KUWAHARA K., SAITO Y., NAKAGAWA O., KISHIMOTO I., HARADA M., OGAWA E., MIYAMOTO Y., HAMANAKA I., KAJIYAMA N., TAKAHASHI N., IZUMI T., KAWAKAMI R., TAMURA N., OGAWA Y.,NAKAO K.: The effects of the selective ROCK inhibitor, Y27632, on ET-1-induced hypertrophic response in neonatal rat cardiac myocytes--possible involvement of Rho/ROCK pathway in cardiac muscle cell hypertrophy. FEBS Lett, 1999, 452 (3), 314-8. LASKO D.,MCKERRACHER L.: Fluorescent assay of cell-permeable C3 transferase activity. Methods Enzymol, 2006, 406 512-20. LISTOV-SAABYE N., JENSEN M. B., KIEHR B., HANSEN E. W., SVENDSEN J. E., LUNDBY A., HOLM G. M.,OLEKSIEWICZ M. B.: MCF-7 human mammary adenocarcinoma cells exhibit augmented responses to human insulin on a collagen IV surface. J Appl Toxicol, 2009, LOBO M. V., HUERTA L., ARENAS M. I., BUSTO R., LASUNCION M. A.,MARTIN-HIDALGO A.: Hormonesensitive lipase expression and IHC localization in the rat ovary, oviduct, and uterus. J Histochem Cytochem, 2009, 57 (1), 51-60. MCGOVERN U. B., FRANCIS R. E., PECK B., GUEST S. K., WANG J., MYATT S. S., KROL J., KWOK J. M., POLYCHRONIS A., COOMBES R. C.,LAM E. W.: Gefitinib (Iressa) represses FOXM1 expression via FOXO3a in breast cancer. Mol Cancer Ther, 2009, 8 (3), 582-91. MENKE A., PHILIPPI C., VOGELMANN R., SEIDEL B., LUTZ M. P., ADLER G.,WEDLICH D.: Downregulation of E-cadherin gene expression by collagen type I and type III in pancreatic cancer cell lines. Cancer Res, 2001, 61 (8), 3508-17. NANKI N., FUJITA J., YANG Y., HOJO S., BANDOH S., YAMAJI Y.,ISHIDA T.: Expression of oncofetal fibronectin and syndecan-1 mRNA in 18 human lung cancer cell lines. Tumour Biol, 2001, 22 (6), 390-6. OHASHI T.,ERICKSON H. P.: Revisiting the mystery of fibronectin multimers: The fibronectin matrix is composed of fibronectin dimers cross-linked by non-covalent bonds. Matrix Biol, 2009, PREVOST G. P., LONCHAMPT M. O., HOLBECK S., ATTOUB S., ZAHAREVITZ D., ALLEY M., WRIGHT J., BREZAK M. C., COULOMB H., SAVOLA A., HUCHET M., CHAUMERON S., NGUYEN Q. D., FORGEZ P., BRUYNEEL E., BRACKE M., FERRANDIS E., ROUBERT P., DEMARQUAY D., GESPACH C.,KASPRZYK P. G.: Anticancer activity of BIM-46174, a new inhibitor of the heterotrimeric Galpha/Gbetagamma protein complex. Cancer Res, 2006, 66 (18), 9227-34. RICKETTS M. H.: Cancer--approaching a universal molecular mechanism? S Afr Med J, 1990, 77 (7), 351-3. RODAHL E., VAN GINDERDEUREN R., KNAPPSKOG P. M., BREDRUP C.,BOMAN H.: A second decorin frame shift mutation in a family with congenital stromal corneal dystrophy. Am J Ophthalmol, 2006, 142 (3), 520-1. 47 SHINTANI K., MATSUMINE A., KUSUZAKI K., MORIKAWA J., MATSUBARA T., WAKABAYASHI T., ARAKI K., SATONAKA H., WAKABAYASHI H., IINO T.,UCHIDA A.: Decorin suppresses lung metastases of murine osteosarcoma. Oncol Rep, 2008, 19 (6), 1533-9. SWEENEY S. M., ORGEL J. P., FERTALA A., MCAULIFFE J. D., TURNER K. R., DI LULLO G. A., CHEN S., ANTIPOVA O., PERUMAL S., ALA-KOKKO L., FORLINO A., CABRAL W. A., BARNES A. M., MARINI J. C.,SAN ANTONIO J. D.: Candidate cell and matrix interaction domains on the collagen fibril, the predominant protein of vertebrates. J Biol Chem, 2008, 283 (30), 2118797. UEDA K., SHIMIZU O., OKA S., SAITO M., HIDE M.,MATSUMOTO M.: Distribution of tenascin-C, fibronectin and collagen types III and IV during regeneration of rat submandibular gland. Int J Oral Maxillofac Surg, 2009, 38 (1), 79-84. VOULGARI A.,PINTZAS A.: Epithelial-mesenchymal transition in cancer metastasis: Mechanisms, markers and strategies to overcome drug resistance in the clinic. Biochim Biophys Acta, 2009, YILMAZ M.,CHRISTOFORI G.: EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer Metastasis Rev, 2009, 28 (1-2), 15-33. 48 49
