Les 1
advertisement
DNA: een allesomvattend begrip voor het leven 1 INHOUD Inhoud ................................................................................................................................... 2 Les 1 Algemene informatie over DNA , TRANSCRIPTIE en TRANSLATIE ........................... 4 1.1 DNA ............................................................................................................................. 4 1.2 Transcriptie: Van DNA naar RNA ................................................................................. 6 1.3 Translatie: Van RNA naar eiwit .................................................................................... 9 1.4 tRNA ...........................................................................................................................10 1.5 ribosomen ...................................................................................................................10 1.6 Het translatieproces ....................................................................................................11 Opdrachten bij les 1 ......................................................................................................12 Les 2: Eiwitten: AMINOZUREN EN POSTTRANSLATIONELE MODIFICATIES ..................15 2.1 codons ........................................................................................................................15 2.2 aminozuren .................................................................................................................15 2.3 Peptidebindingen ........................................................................................................18 2.4 Posttranslationele modificaties ....................................................................................19 Opdrachten bij les 2 ......................................................................................................22 Les 3: Eiwitten: EIWITVOUWING en MUTATIES .................................................................24 3.1 Eiwitvouwing ...............................................................................................................24 3.2 Transport ....................................................................................................................25 3.3 Retinitis Pigmentosa ...................................................................................................27 3.4 Mutaties ......................................................................................................................27 3.4 Rhodopsine en retinal .................................................................................................28 Opdrachten bij les 3 ......................................................................................................29 BIOINFORMATICA-COMPUTERPRACTICUM ....................................................................30 algemene informatie bioinformatica ..................................................................................31 COMPUTERPRACTICUM MET YASARA ........................................................................31 Les 4 DNA REPLICATIE EN DNA ONDERZOEK.................................................................34 2 4.1 DNA replicatie .............................................................................................................34 4.2 Polymerase chain reaction (PCr) ................................................................................35 4.3 Sequencing .................................................................................................................37 Opdrachten bij les 4 ......................................................................................................39 Definitieblad .........................................................................................................................40 3 LES 1 ALGEMENE INFORMATIE OVER DNA , TRANSCRIPTIE EN TRANSLATIE Figuur 1.1: Plek in de cel. Het DNA bevindt zich in de celkern. Tijdens de ontwikkeling en groei van ons lichaam is de stof DNA betrokken. Dit DNA is belangrijk in alle processen van ons lichaam. Één van de belangrijkste processen om ons in leven te houden is de eiwitsynthese. Hierbij wordt DNA overgeschreven naar RNA, dat weer vertaald wordt naar een eiwit. Wanneer de eiwitten niet goed worden gesynthetiseerd kan ons lichaam niet goed functioneren en kan het zijn dat we ziek worden. De besturing van dit proces begint in de celkern met de chromosomen. Chromosomen bestaan uit een groot aantal genen en ieder gen codeert voor een eiwit (zie figuur op de voorpagina). 1.1 DNA Desoxyribonucleïnezuur (DNA) is de belangrijkste drager van erfelijke informatie. In 1953 ontdekten de onderzoekers James Watson en Francis Crick dat het DNA de vorm heeft van een spiraalvormige draad die met een andere DNA draad is verbonden en die gedraaid is om zijn lengteas. Dit wordt ook wel de dubbele helix genoemd. Een DNAmolecuul is dubbelstrengs en bestaat uit twee lange ketens van nucleotiden. Deze ketens zijn polyesters van afwisselend een fosfaat- en desoxyribosegroep (suikergroep). Naast de fosfaatgroep en de suikergroep bezit het DNA ook nog over base. De twee nucleotideketens worden met elkaar verbonden door middel van basenparen. De base waaruit het DNA bestaat zijn adenine (A), thymine (T), cytosine (C) en guanine (G). 4 Figuur 1.2: Structuur van het DNA. DNA bestaat uit twee ketens nucleotiden met verschillende basen, die met elkaar verbonden zijn met waterstofbruggen. De ketens liggen geordend in een dubbele helix. Er zijn vier verschillende basen: adenine, thymine, cytosine en guanine. De combinatie van een fosfaatgroep, een desoxyribosegroep en één van de vier basen heet een nucleotide. De twee nucleotideketens worden door de base gekoppeld op een specifieke manier. Er is alleen een koppeling mogelijk tussen adenine en thymine en tussen guanine en cytosine. Deze strengen worden bij elkaar gehouden door waterstofbruggen (H-bruggen). De binding tussen de basen gebeurt door middel van een waterstofbrug. Tussen G en C zitten drie waterstofbruggen en tussen A en T twee. Figuur 1.3: Waterstofbruggen tussen de basenparen. Basenparing is specifiek. Guanine en cytosine kunnen waterstofbruggen met elkaar vormen en adenine en thymine ook. Tussen guanine en cytosine kunnen er drie waterstofbruggen gevormd worden en tussen adenine en thymine maar twee. De binding tussen guanine en cytosine is dus sterker dan die tussen adenine en thymine. 5 De waterstofbruggen geven een zwakke, niet covalente binding tussen twee basenparen. Deze twee basenparen passen als puzzelstukjes in elkaar. Vanwege het aantal waterstofbruggen wordt het GC-basenpaar minder gemakkelijk verbroken dan het ATbasenpaar. Verbreking van de basenparen kan relatief makkelijk plaatsvinden door verhitting of door een mechanische kracht. Qua chemische structuur worden de basen onderverdeeld in twee soorten: guanine en adenine zijn purinebasen, ze hebben het skelet van purine, dat bestaat uit een 5-ring en een 6-ring. Cytosine en thymine zijn pyrimidinebasen, ze hebben het skelet van pyrimidine dat bestaat uit enkel een 6-ring. Zowel het purine- als het pyrimidineskelet bevatten meerdere stikstof-atomen, waarvan sommige participeren in de vorming van waterstofbruggen. Elk basenpaar bestaat uit een purine- en een pyrimidinebase. De nucleotideketen heeft een 3‟-uiteinde en een 5‟uiteinde. Dit betekent dat aan het 3‟-uiteinde van de nucleotideketen aan de suikergroep 2 –OH groepen gebonden zijn aan het 3e C-atoom. Het 5‟-uiteinde van de nucleotideketen is waar aan het suiker een fosfaatgroep gebonden zit aan het 5e C-atoom. De DNA strengen zijn zo aan elkaar gekoppeld dat ze in tegengestelde richting liggen, waarbij 1 streng van 5‟ naar 3‟ ligt en waarbij 1 streng van 3‟ naar 5‟ ligt. Hieronder zie je een voorbeeld van een stukje DNA: 5‟ -- A G T C C T G A A G G T T C T A G G 3‟ 3‟ T C A G G A C T T C C A A G A T C C -- 5‟ Wanneer de volgorde van één streng bekend is kan de volgorde van de andere streng worden afgeleid. De Figuur 1.4: Oriëntatie van nucleotideketens in DNA. De twee nucleotideketens liggen in tegengestelde richting tegenover elkaar. Dit betekent dat de ene keten van 3‟ naar 5‟ ligt en de andere keten van 5‟naar 3‟. strengen worden daarom ook wel complementair genoemd. De basen volgen elkaar op in één lange reeks, met elke keer een andere volgorde. Het aflezen van een DNA streng gebeurt altijd in de richting van 3‟ 5‟. Het aflezen gebeurt aan de hand van codons. Drie nucleotiden naast elkaar vormen een codon. De reeks van verschillende codons is de unieke code voor het ontwikkelen van eiwitten. 1.2 TRANSCRIPTIE: VAN DNA NAAR RNA Transcriptie is (in de genetica) het proces waarbij het DNA van een gen wordt gekopieerd naar ribonucleïnezuur (RNA) en is de eerste stap in de eiwitsynthese. Tijdens de transcriptie wordt de code van het DNA afgelezen en omgezet in een RNA code. Voordat we het gaan hebben over het proces gaan we eerst wat dieper in op de verschillende onderdelen van de transcriptie. 6 DNA en RNA verschillen in een aantal opzichten van elkaar: - De polyesterketen van het RNA bestaat uit ribose in plaats van desoxyribose. De moleculen van deoxyribose missen een zuurstofatoom ten opzichte van ribose. - RNA bevat het nucleotide uracil (U) in plaats van thymine. Uracil kan net als thymine alleen maar binden met adenine. - RNA moleculen zijn enkelstrengs en DNA dubbelstrengs. Figuur 1.5: Verschillen tussen DNA en RNA moleculen. RNA en DNA lijken erg op elkaar, maar verschillen op drie punten. RNA bestaat uit een riboseketen en DNA uit een desoxiriboseketen. Verder heeft RNA de base uracil in plaats van thymine bij DNA. En RNA bestaat niet uit een dubbele helix, maar uit een enkele helix. De transcriptie start met een stuk DNA dat geactiveerd wordt om afgelezen te worden. Hierbij bindt het enzym RNA polymerase op een specifieke plaats, herkenbaar aan de basenvolgorde TAC. De RNA polymerase bindt aan de DNA keten en vouwt zich eromheen. Het enzym ontwindt het DNA en verbreekt de waterstofbruggen waardoor het DNA nu enkelstrengs is geworden en tijdelijk toegankelijk is voor andere actieve componenten van het enzym. Als alle transcriptiefactoren gebonden zijn kan de transcriptie beginnen. Deze stap van de transcriptie noemen we de initiatie. Daarna moet de RNA streng verlengd worden. Dit noemen we elongatie. In de celkern zwerven losse RNA nucleotiden rond die gekoppeld kunnen worden aan de groeiende RNA streng. Welk nucleotide dit zal zijn wordt steeds bepaald door de tegenoverliggende DNA nucleotide.één van de DNA strengen fungeert dus als matrijs of template. Het RNA 7 polymerase beweegt zich in de zogenaamde 3‟ 5‟ richting over het DNA. De RNA streng groeit in de 5‟ 3‟ richting. Tegelijkertijd wordt het RNA aan de achterkant weer gescheiden van het DNA. Wanneer het hele gen gekopieerd is en de RNA polymerase weer een specifieke sequentie (stopcodon) tegenkomt stopt de RNA synthese. Dit is de terminatie. Initiatie Elongatie Terminatie Figuur 1.6: Transcriptie in drie stappen (RNAP is RNA polymerase). In de initiatie binden RNA Polymerase en andere transcriptiefactoren en start de transcriptie. Daarna wordt de mRNA strang verlengd. Dit is de elongatie. Als de RNA Polymerase een stopcoon tegenkomt wordt de transcriptie beëindigd en laten de transcriptiefactoren en het mRNA los. Dit is de terminatie. Het RNA dat nu gesynthetiseerd is wordt ook wel het pre-mRNA genoemd. Het bevat stukken die wel tot expressie komen (exonen) maar ook stukjes die niet tot expressie komen (intronen). Door middel van splicing (knippen) worden de intronen verwijderd. Enzymen plakken de exonen achter elkaar waardoor alleen het gedeelte overblijft dat wel tot expressie kan komen. Ook wordt de mRNA streng voorzien van een 5‟-methylcap en een poly-A staart. Een 5‟-methylcap is een methylgroep aan het eerste nucleotide, waaraan eiwitten kunnen binden. Een poly-A staart is een keten adenines aan het 3‟ uiteinde van het mRNA. Deze bewerkingen zorgen ervoor dat: de twee uiteinden van het mRNA kunnen worden onderscheiden het mRNA afgelezen kan worden transporteiwitten kunnen binden en het mRNA uit de kern kunnen transporteren het mRNA stabieler wordt er een controle is dat het mRNA molecuul af is 8 Figuur 1.7: splicing. Het bewerken van het RNA begint met toevoegen aan het 5‟-einde een cap wat bestaat uit een 7-methylguanosinetrifosfaat groep. Aan het 3‟-einde bevindt zich een knipsignaal. Hier zal het mRNA geknipt worden en tevens een poly(A)staart aan toegevoegd worden. Als laatste stap worden de intronen verwijderd uit het pre-mRNA. Alle exonen worden vervolgens aan elkaar geplakt zodat alleen de gedeelten die afgelezen moeten worden bij elkaar zitten. Splicing wordt gedaan om van DNA via mRNA naar een functioneel eiwit te komen. De bouwstenen van een eiwit noemen we aminozuren. Als laatste stap gaan we deze les kijken hoe een mRNA-streng vertaald kan worden in een reeks aminozuren, dit noemen we translatie. 1.3 TRANSLATIE: VAN RNA NAAR EIWIT Splicing wordt gedaan om van DNA via mRNA naar een functioneel eiwit te komen. De bouwstenen van een eiwit noemen we aminozuren en hier gaan we het volgende les over hebben. Als laatste stap gaan we deze les kijken hoe een mRNA-streng vertaald kan worden in een reeks aminozuren, dit noemen we translatie. Van DNA bestaat er maar een soort, terwijl er van RNA meerdere soorten zijn. Naast mRNA kennen we Transport / transfer RNA (tRNA). tRNA speelt tijdens de translatie een rol als drager van aminozuren. Er zijn 20 verschillende tRNA moleculen (omdat er 20 verschillende eiwit-bouwstenen zijn), elk gespecialiseerd in het vervoeren van een bepaald aminozuur. Ribosomen zijn vervolgens in staat tijdens de translatie mRNA af te lezen en de aminozuren van het eiwit aan elkaar te koppelen. 9 1.4 TRNA Door het translatieproces worden deze aminozuren aan elkaar gebonden. Het tRNA (in het nederlands „transport RNA‟ en in het engels „transfer RNA‟) speelt daar een belangrijke rol in. Het tRNA bindt aan een bepaald aminozuur. Wanneer de code van dit aminozuur overeenkomt met het mRNA zal deze tRNA het aminozuur naar de groeiende polypeptideketen brengen. Het tRNA molecuul heeft een aparte structuur. Anders dan andere RNA moleculen is het grotendeels dubbelstrengs, en bezit dus inwendige waterstofbruggen. Deze zorgen voor een typische secundaire structuur, die ook wel het klaverbladstructuur wordt genoemd. In werkelijkheid wordt deze structuur nog meer gevouwen waardoor het geheel een L-vorm krijgt. Een tRNA molecuul bezit 3 karakteristieke loops. De linkerarm is de D arm en de rechterarm is de T arm. De onderste arm wordt de anti-codon arm genoemd. Een anticodon is complementair aan een codon, bij een UAG codon zou bijvoorbeeld een AUC anti-codon horen. De anti-codon arm bevat een anti-codon en kan daarmee aan een codon van het mRNA binden. Dan is er nog de acceptor stam, waar een aminozuur aan gebonden kan worden (hij kan een aminozuur „accepteren‟). Dit is het aminozuur dat bij het mRNA-codon hoort. figuur 5.2: Het tRNA molecuul. tRNA heeft een klaverbladstructuur met drie „armen‟. De anti-codon arm bindt aan het mRNA, waarna de acceptor stam het nieuw gevormde aminozuur kan transporteren. Zo kan het tRNA controleren of de code van het aminozuur overeenkomt met het mRNA. Het translatieproces kan niet beginnen voordat een specifieke aminozuur gebonden wordt aan een tRNA molecuul. Het binden van zo‟n aminozuur aan het tRNA wordt laden genoemd. Dit proces kost energie, die verkregen wordt van ATP. Er zijn in totaal twintig enzymen die deze formatie mogelijk maken (één voor elk aminozuur). 1.5 RIBOSOMEN Naast tRNA moleculen spelen ook ribosomen een belangrijke rol bij het translatieproces. Nadat het mRNA de celkern verlaat wordt het gebonden aan de ribosomen. Ieder ribosoom kan maar één mRNA-streng binden, wel kunnen er meerdere ribosomen op één mRNA-streng actief zijn. Ribosomen bestaan uit twee subeenheden, een groot en een klein deel. Het ribosoom heeft vier bindingsplaatsen: 1 voor de mRNA-streng en 3 voor tRNA moleculen. Één tRNA molecuul zit in de wacht op de A-plaats (acceptorplaats) van het ribosoom. Daarnaast zit één tRNA-molecuul op de P-plaats (werkplaats), die zijn aminozuur aan de groeiende aminozuurketen koppelt. En achter de P-plaats zit de Eplaats (exitplaats), waar een tRNA molecuul weer wordt losgekoppeld van een ribosoom. 10 1.6 HET TRANSLATIEPROCES Het translatieproces omvat 3 stappen: initiatie (start), elongatie (verlenging) en terminatie (eind). Initiatie Translatie begint met het uiteenvallen van het ribosoom in twee subeenheden. Het mRNA bindt aan het 5‟ uiteinde van het kleine subdeel. Het mRNA verschuift totdat het bij het startcodon (AUG) aankomt (zie codontabel in les 4). Het tRNA molecuul met het anti-codon UAC bindt aan het mRNA. Vervolgens bindt het grote ribosoomdeel en kan de translatie beginnen. Elongatie Na binding van het grote subdeel kan de verlenging beginnen. Een verlengingsfactor brengt het juiste tRNA op plaats A naast het al aanwezige tRNA molecuul (op plaats P) in het ribosoom. Enzymen koppelen het eerste aminozuur los van het tRNA molecuul waardoor een polypeptide ontstaat. De peptidebinding tussen de aminozuren vindt plaats tussen de zuurgroep van het aminozuur op plaats P en de aminegroep van het aminozuur op plaats A. Een tweede verlengingsfactor verwijdert het “lege” tRNA molecuul waardoor het ribosoom drie nucleotiden in de richting van het mRNA opschuift (translocatie: verschuiving van het ribosoom over het mRNA door middel van een verlengingsfactor). Terminatie De translatie stopt wanneer het ribosoom één van de stopcodons (UAA, UAG of UGA) tegenkomt. Er bindt een ontkoppelingsfactor aan het Figuur 1.8: Translatie proces 11 mRNA. Waardoor achtereenvolgens de voltooide polypeptideketen, het laatste tRNA molecuul en het mRNA van het ribosoom worden ontkoppeld. Het ribosoom valt weer uiteen in twee subdelen waardoor het klaar is voor een nieuwe cyclus. OPDRACHTEN BIJ LES 1 1. Waaruit bestaat een DNA-molecuul? 2. DNA is een zuur. Door welk deel van het DNA komt dat? 3. Hieronder is een DNA-molecuul afgebeeld. Een DNA-molecuul is opgebouwd uit nucleotiden met onder andere vier verschillende basen: A, T, G, en C. Deze basen komen in het DNA-molecuul paarsgewijs voor. © Biodoen In welke afbeelding is een nucleotide weergegeven? En wat zie je in de andere afbeeldingen? (A) (B) (C) (D) 4. Wat zijn de belangrijkste verschillen tussen een RNA en een DNA molecuul? 12 5. Voordat de transcriptie van RNA begint, despiraliseren ongeveer de eerste 20 basenparen van het DNA-molecuul. Dit gebeurt met behulp van een `RNApolymerase`enzym dat zich aan één van de twee DNA-strengen hecht. De DNAstreng die met behulp van een `RNA-polymerase`enzym wordt gekopieerd, wordt de template streng genoemd. r = RNA-polymerase i = initiatieplaats t = terminatieplaats Kruis de juiste antwoorden aan: De leesrichting van de template streng van het DNA-molecuul loopt van 5‟ naar 3‟ 3‟ naar 5‟ en is de parallelle antiparallelle streng van het DNAmolecuul De leesrichting van de gekopieërde RNA-streng loopt van 3‟ naar 5‟ naar 3‟ en is parallel antiparallel aan die van de template DNA-streng. 5‟ 6. Hieronder zie je een stuk van een DNA fragment. Geef de nucleotidenvolgorde en de leesrichting aan van het stukje RNA dat ontstaat na transcriptie. 3‟ G A T C A T T C T A G 5‟ 5‟ C T A G T A A G A T C 3‟ 13 7. Label de armen van het tRNA molecuul 8. Hoeveel soorten tRNA moleculen zijn er? Waarom? 9. Door mutatie verandert een codon in het mRNA van 5‟ CAG 3‟ naar 5‟ GAG 3‟. Welke gevolgen heeft dit voor de eiwitsynthese? 10. Waar in de cel vindt transcriptie plaats? En waar translatie? Extra informatie over deze les: Wil je meer weten over één van de volgende onderwerpen bekijk dan de filmpjes! http://www.bioplek.org/animaties/moleculaire_genetica/transcriptie.html transcriptie http://www.youtube.com/watch?v=vJSmZ3DsntU transcriptie http://www.youtube.com/watch?v=YjWuVrzvZYA mRNA processing http://www.youtube.com/watch?v=FVuAwBGw_pQ mRNA splicing Wil je het translatieproces nog een rustig bekijken, ga dan naar deze filmpjes: http://www.youtube.com/watch?v=5bLEDd-PSTQ http://ihome.cuhk.edu.hk/~z045513/virtuallab/animation/Translation.html 14 LES 2: EIWITTEN: AMINOZUREN EN POSTTRANSLATIONELE MODIFICATIES 2.1 CODONS Zoals in les 1 is uitgelegd bestaat mRNA net als DNA uit nucleotiden. De basen van RNA zijn adenine (A), cytosine (C), guanine (G) en uracil (U). Een set van drie nucleotiden noemen we een codon, omdat het codeert voor één aminozuur van een eiwit. mRNA met de sequentie ACU-GGC-AUC staat bijvoorbeeld voor de aminozuurketen threonine-glycineisoleucine. Om zo‟n mRNA sequentie te vertalen naar een aminozuursequentie gebruik je een codontabel (zie figuur 4.2). Het eerste nucleotide van een codon lees je links af, de tweede boven en de derde rechts. Je kunt dan het bijbehorende aminozuur aflezen in de tabel. Er bestaan 64 verschillende codons. Er zijn namelijk 43 verschillende manieren om de 4 letters te combineren in een set van 3. Toch zijn er maar 20 verschillende aminozuren. Dat betekent dat er in sommige gevallen meerdere codons voor hetzelfde aminozuur coderen. Je ziet dan ook dat sommige aminozuren bij meerdere codons in te tabel voorkomen. Verder zie je drie keer STOP staan in de tabel. Dit staat voor stopcodon, de plaats waar de translatie translatie start namelijk altijd bij het codon dan ook altijd een methionine. Figuur 2.1: Codontabel. De basen worden afgelezen vanuit de 5‟ naar de 3‟ richting. Met deze tabel kunnen mRNA-codons vertaald worden naar aminozuren. De eerste base van het codon staat links in de tabel, de tweede boven en de derde rechts. Naast de 20 aminozuren zijn ook de start- en stopcodons weergegeven. AUG is de startcodon (waarbij de translatie start) en UAA/UGA/UAG zijn de stopcodons (waarbij de translatie stopt). stopt. Er bestaat ook een startcodon, de AUG. Het eerste aminozuur van een eiwit is 2.2 AMINOZUREN Elk aminozuur bestaat uit een koolstofatoom met een aminogroep, een waterstof, een zuurgroep en een restgroep. De restgroepen zijn voor ieder aminozuur anders en bepalen de vorm van het eiwit. Op basis van deze restgroepen, kun je de aminozuren indelen in 5 groepen: de positief geladen aminozuren, de negatief geladen aminozuren, de polaire aminozuren, de apolaire aminozuren en de aromatische aminozuren. Let op: de lading van de aminozuren hangt af van de pH van de omgeving! Bij een lage pH (zuur milieu) worden aminozuren meer positief geladen, omdat ze een H+ kunnen opnemen. Bij een hoge pH (basisch milieu) worden de aminozuren meer negatief geladen, omdat ze een H+ afstaan aan hun omgeving. De lading wordt gegeven voor pH=7, aangezien de pH op veel plekken in ons lichaam rond de 7 ligt. De polaire aminozuren zijn niet geladen, maar 15 hebben een ongelijke ladingsverdeling. Dat wil zeggen dat een deel van de restgroep de elektronen wat meer aantrekt en daardoor negatief geladen wordt. Automatisch zitten die elektronen dan wat minder in een ander deel van de restgroep en wordt die een beetje positief geladen. Apolaire aminozuren hebben geen lading en een gelijke ladingsverdeling. Die zullen dus niet onderhevig zijn aan krachten die met lading te maken hebben. Dan is er nog een laatste groep aminozuren, waarvan de restgroep een ringstructuur bevat. We noemen deze aminozuren „aromatisch‟. Hun restgroepen zijn erg groot en zijn daarom ook erg belangrijk voor de eiwitstructuur. 16 Polaire restgroepen Glycine Alanine Apolaire restgroepen Serine Valine Threonine Cysteïne Proline Leucine Isoleucine Asparagine Methionine Glutamine Positief geladen restgroepen Negatief geladen restgroepen Aparaginezuur Glutaminezuur Histidine Lysine Arginine Aromatische restgroepen Algemene notatie aminozuren zuurgroep Aminogroep Fenylalanine Tyrosine R Waterstofatoom Restgroep Tryptofaan 17 Figuur 2.2: Aminozuren. De 20 aminozuren zijn hier onderverdeeld op basis van hun restgroep. Er zijn aminozuren met een apolaire restgroep, met een polaire restgroep, met een aromatische restgroep, met een positief restgroep zijn en met geladen Naast geladen deze groepen er een ooknegatief nog een paarrestgroep. losse aminozuren die opvallen. Glycine valt bijvoorbeeld op, omdat hij de kleinste is. De restgroep bestaat uit alleen één waterstofatoom. Methionine en cysteine bevatten allebei een zwavelatoom. Deze kunnen zwavelbruggen vormen (hier komen we in les 6 op terug), die ook belangrijk zijn voor de eiwitstructuur. Zo‟n brug zorgt voor veel stevigheid, en kan alleen gevormd worden als de zwavelatomen dicht genoeg bij elkaar in de buurt liggen. Proline is ook een bijzonder aminozuur, want het zorgt voor een knik in de backbone van het eiwit. Normaal gesproken zitten de aminogroep en de zuurgroep op één lijn en wordt de backbone dus een lange rechte slinger. Bij proline is dat niet zo, en dat is handig als het eiwit in een bocht moet liggen. 2.3 PEPTIDEBINDINGEN Met de aminogroep en de zuurgroep kunnen ze peptidebingen maken met elkaar. Dit gaat door middel van een condensatiereactie. Hieronder zie je weergegeven hoe zo‟n reactie verloopt. Aan de linkerkant van de reactievergelijking staan twee alanine aminozuren. De zuurgeoep van het ene aminozuur wordt aan de aminogroep van het andere aminozuur gekoppeld. Hierbij wordt een watermolecuul afgesplitst. Dit watermolecuul bestaat uit OH- van de zuurgroep en een H+ van de aminogroep. Een reeks peptidebindingen vormt de backbone van het eiwit. De zuurgroepen en mainogroepen vormen een lange keten, waar de waterstofatomen (erg klein) en de restgroepen uitsteken. Figuur 2.3: Peptidebinding. De zuurgroep van het ene aminozuur wordt gekoppeld aan de aminogroep van het andere aminozuur. Hierbij komt een watermolecuul vrij. We noemen dit een condensatiereactie. 18 2.4 POSTTRANSLATIONELE M ODIFICATIES Als de complete aminozuursequentie van een eiwit is aangemaakt op een ribosoom, is het nog niet af. Om het eiwit functioneel te maken moeten er nog twee dingen gebeuren. Ten eerste moet het eiwit nog gevouwen worden. Daar gaan we het devolgende les nog uitgebreid over hebben. Maar voor of na het vouwen kunnen er nog wat kleine veranderingen plaats vinden. Er kan bijvoorbeeld nog een aantal groepen aan de aminozuren worden gebonden, of er kan een stukje uit de aminozuursequentie worden geknipt. Al deze dingen samen noem je posttranslationele modificaties. Een moeilijk woord, maar wel logisch: het zijn veranderingen (modificaties) nadat het eiwit gevormd is (na de translatie). Deze veranderingen zijn reversibel, en kunnen dus ook weer ongedaan gemaakt worden. Voorbeelden van groepen die aan de aminozuren worden gehangen zijn: fosfaatgroepen, suikergroepen, vetgroepen en andere organische stoffen. Om deze groepen aan een aminozuur te kunnen binden zijn er enzymen nodig. Enzymen zijn eiwitten die werken als een biologische katalysator. Zij zorgen ervoor dat de reactie tussen het aminozuur en de extra groep kan verlopen. Bij fosforylering van een eiwit wordt er een PO43- groep aan een bepaald aminozuur gebonden. Zo‟n fosfaatgroep is erg groot en hydrofiel, waardoor bindingen in en tussen eiwitten niet meer mogelijk zijn of er juist nieuwe gemaakt kunnen worden. Het eiwit verandert dan van vorm en daarmee verandert ook de werking. Meestal zorgen fosforyleringen voor een activering van het eiwit. Bij fosforyleringen zijn ook enzymen betrokken, zogenaamde kinases. Een fosfaatgroep kan weer worden verwijderd met behulp van fosfatases. Dan is het eiwit weer geïnactiveerd. Figuur 2.4: Fosfaatgroep. „R‟ staat voor „Rest‟ en is in dit geval het eiwit waar de fosfaatgroep aan gebonden is. De fosfaatgroep zelf bestaat ui één fosforatoom en vier zuurstofatomen. Fosfor is een vijfwaardig atoom en kan dus vijf bindingen aangaan. Er worden daarom drie enkele bindingen met zuurstofatomen gevormd en één dubbele binding. Zuurstof is een tweewaardig atoom. De zuurstofatomen die niet dubbel gebonden zijn en geen binding hebben met het eiwit (R) zijn daarom een beetje negatief geladen (polair). Deze zuurstofatomen binden daarom snel een waterstofatoom, die een beetje positief geladen is. Als er een suikergroep aan een eiwit gebonden wordt, noem je dat glycosylering. De meeste eiwitten worden direct na de translatie geglycosyleerd, aangezien dat vaak essentieel is voor een goede vouwing. Ze zorgen er dus voor dat het eiwit netjes gevouwen blijft, en niet weer terug valt in de ongevouwen vorm. Belangrijke suikergroepen bij mensen zijn bijvoorbeeld N-acetylglucosaminegroepen, mannosegroepen en glucosegroepen. Hieronder zijn deze groepen weergegeven. Valt jullie iets op aan de notatie? De notatie is in alle drie de gevallen anders. Je kunt zien dat het allemaal zeshoeken zijn. Op één van de hoeken zit een zuurstofatoom, maar op de andere vijf hoeken is er niets aangegeven. Voor deze notatie hebben we namelijk afgesproken dat we alle koolstofatomen in de ring niet weergeven. Elke hoek is dus een koolstofatoom, tenzij anders aangegeven. Ook de waterstofatomen worden niet 19 weergegeven in deze notatie. De verbindingen naar de zijgroepen hebben een bepaalde richting gekregen. Figuur 2.5: Een N-acetylglucosaminegroep (links), mannosegroep (midden) en een glucosegroep (rechts). De drie groepen zijn in verschillende notaties weergegeven. Het zijn allemaal zeshoeken met op één hoek een zuurstofatoom. Op de andere hoeken zitten koolstofatomen, maar die worden in deze notaties niet weergegeven (ook de gebonden waterstofatomen niet!). De oriëntatie van de groepen rondom de ring is in elke notatie anders weergegeven. (Bekijk ook tabel 67A1 van Binas) Meestal bestaat een glycosylering uit een keten van reacties, waarbij meerdere suikergroepen aan een aminozuur worden gebonden. De eerste suikergroep zit vast aan het aminozuur, en de volgende groepen worden dan aan die eerste vastgekoppeld. Dit gaat via een condensatiereactie, waarbij een watermolecuul wordt afgestoten (figuur 6.4). Twee gekoppelde suikergroepen heten een disaccharide en meer dan twee gekoppelde suikergroepen heten een polysaccharide. Om deze disaccharides en polysacharides weer af te breken tot losse suikergroepen moet water worden toegevoegd. We noemen deze reactie een hydrolysereactie (lees figuur 3 van rechts naar links). Een hydrolysereactie is in feite het omgekeerde van een condensatiereactie. s Figuur 2.6: Vorming van een disaccharide door middel van een condensatiereactie. Twee glucosegroepen tot maltose . Bij de condensatiereactie wordt er een watermolecuul afgesplitst. De glucosegrepen worden met een zuurstofatoom verbonden en vormen nu een disacharide. In deze notatie worden wel alle atomen weergegeven, vergelijk het maar eens met de glucosegroep uit figuur 2. 20 Sommige eiwitten hebben een functie op een membraan. Je kunt hierbij denken aan ionkanalen of receptoren. Het is dan vaak nodig om een eiwit wat hydrofober te maken, zodat het zich thuis voelt in het hydrofobe membraan. Dit wordt gedaan door een aantal vetgroepen aan het eiwit te binden. Vetgroepen zijn moleculen met een lange koolstofketen. Zo‟n keten kan geen waterstofbruggen vormen met water is daarom erg hydrofoob. Door deze koolstofketens te verankeren in het membraan blijft het eiwit op zijn plek zitten. Deze „lipoproteïnen‟ worden niet alleen gebruikt voor membranen, maar bijvoorbeeld ook voor vettransport. Figuur 2.7: Eiwit met suikergroepen en een vetgroep verankerd in het membraan. Links boven is het eiwit weergegeven . Er zitten meerdere groepen aan het eiwit gebonden, met aan het uiteinde een vetgroep. De vetgroep bevat twee koolstofketens die naar binnen in het membraan steken. Het membraan is aan de buitenkant hydrofiel (de bolletjes) en aan de binnenkant hydrofoob (de staarten). Met behulp van de koolstofketens zit het eiwit vast aan het membraan. Naast suikergroepen en vetgroepen zijn er ook andere organische stoffen die gebruikt kunnen worden voor posttranslationele modificaties. Acetylgroepen zijn bijvoorbeeld van Figuur 4: eiwit met vetgroepen, verankerd in een membraan (GPI anchor) groot belang voor histonen. Histonen zijn eiwitten waar het DNA in de kern omheen is gerold. DNA en histonen samen vormen uiteindelijk chromatine, het bestanddeel van chromosomen. Belangrijk in deze les is echten dat histonen normaalgesproken een beetje positief geladen zijn, waardoor ze binden aan de negatieve fosfaatgroepen van het DNA (les 1). De acetylgroepen zijn een beetje negatief geladen, dus als een histon geacetyleerd wordt dan wordt zijn positieve lading opgeheven. Hierdoor zal Figuur 2.8: Acetylgroep. In deze notatie zijn de Cde binding met het DNA minder sterk worden en laat het DNA atomen weggelaten. Eigenlijk dus een beetje los van het eiwit. Dit is erg belangrijk bij staat er CH3-CO-R, waarbij R transcriptie (les 2), want alleen dit lossere DNA kan in dit geval het eiwit is. overgeschreven worden naar RNA. 21 Figuur 2.9: Opbouw van chromosomen. Onderaan zie je de dubbele helix van het DNA. Deze dubbele helix wordt om histonen gerold. Acht histonen met DNA eromheen vormen een nucleosoom. Ook deze nucleosomen worden weer in een soort spiraalvorm opgerold. Deze spiraal wordt weer opgerold tot een chromosoom, die zich Figuur opbouw chromosomen in de celkern (nucleus) bevindt. Op 6: deze maniervan kunnen wij ongeveer 2 meter DNA per cel opslaan! Door posttranslationele modificaties kun je van dezelfde DNA-sequentie verschillende eiwitten maken. Ook kun je door middel van deze modificaties de transcriptie van DNA reguleren (denk aan de histonen, maar ook aan fosforylering en dus activatie van transcriptiefactoren). Dit verklaart waarom cellen verschillende functies kunnen hebben, terwijl ze allemaal hetzelfde DNA bevatten. OPDRACHTEN BIJ LES 2 1. Een DNA-sequentie kun je vertalen naar aminozuursequentie. Leg uit welke stappen je hiervoor moet ondernemen. 2. Kun je ook een aminozuursequentie van een eiwit terug vertalen naar de DNAsequentie? 3. Geef aan waarom elk gesynthetiseerd eiwit begint met het aminozuur `methionine`. 4. Hieronder is een DNA keten weergegeven. Vertaal deze sequentie naar een mRNAsequentie en vervolgens naar een aminozuursequentie. Vergeet hierbij niet de 3‟ en 5‟ uiteinden weer te geven. Gebruik voor deze opdracht onder andere de tabel met de genetische code (Binas 70E) 3‟ --- A G T C A G T C T A G C C T A T G A A C C C T T G A C T A T A T T T A G T --- 5‟ 22 5. Teken twee aminozuren die met een peptidebinding aan elkaar zitten. Geef de restgroepen aan met een „R‟. Deze twee aminozuren zitten in een langere keten, dus geef aan beide uiteinden aan dat de keten nog verder gaat. 6. Leg uit wat een posttranslationele modificatie is. En waar in de cel vinden posttranslationele modificaties plaats? 7. Hieronder ze je de structuurformule van sacharose (kristalsuiker). Geef de reactievergelijking van de hydrolyse van sacharose in structuurformules en molecuulformules. Krijg je twee dezelfde suikers? 8. Maakt een suikergroep het aminozuur hydrofieler of hydrofober? Hoe komt dat? 9. Zie de mannosegroep in figuur 2.3: 1 OH-groep zit iets verder van de ring af dan de andere. Welk atoom zit er nog tussen de OH-groep en de ring? En met welke atomen staat deze in verbinding? 10. Vetgroepen worden gebruikt om een eiwit hydrofober te maken. Waarom zijn de lange koolstofketens eigenlijk hydrofoob? 11. Als histonen geacetyleerd worden gaat het DNA iets losser om de histonen zitten. Verloopt de transcriptie makkelijker of moeilijker bij dit lossere DNA? En hoe komt dat? 23 LES 3: EIWITTEN: EIW ITVOUWING EN MUTATIES 3.1 EIWITVOUWING Een keten aminozuren is onderhevig aan veel krachten. Positieve ladingen trekken negatieve ladingen aan, hydrofobe delen zullen zich het liefst van het water afkeren en de hydrofiele delen willen zich juist in een waterige omgeving bevinden. Onder invloed van dit soort krachten zal het eiwit zich gaan vouwen. In les 2 heb je gezien dat er 20 verschillende aminozuren bestaan. Ze hebben allemaal een aminogroep en een zuurgroep, waarmee ze petidebindingen kunnen vormen. Een keten van peptidebindingen noemen we de „backbone‟ van het eiwit. Deze ervaart vooral de aantrekkingskrachten van waterstof- en zuurstofatomen. Dit resulteert in waterstofbruggen. De aminozuren hebben ook ieder een eigen restgroep. Sommige van deze restgroepen zijn geladen, hydrofiel of juist hydrofoob. Een aminozuur met een negatief geladen restgroep zal een aminozuur met een positief geladen restgroep aantrekken. De restgroepen kunnen dan zoutbruggen vormen. Hydrofiele restgroepen steken graag naar buiten en zullen ook graag in de omgeving van andere hydrofiele restgroepen zitten, zodat ze waterstofbruggen kunnen vormen. Hydrofobe restgroepen zullen zich proberen te clusteren, zodat ze zich een beetje kunnen afschermen tegen de waterige omgeving. Bij de hydrofiele en hydrofobe interacties zijn de posttranslationele modificaties natuurlijk ook van belang. Denk maar eens aan de vetgroepen en de acetylgroepen. Verder zijn er nog restgroepen die zwavel-atomen bevatten. Deze kunnen zwavelbruggen vormen wat een covalente binding is (-SH HS-, denk aan redoxreacties). In tabel 1 staat een overzicht van de belangrijkste interacties die een rol spelen bij de eiwitvouwing. Backbone Waterstofbruggen tussen H (op N) en O Restgroepen Waterstofbruggen Zoutbruggen Zwavelbruggen Hydrofobe interacties bij hydrofiele restgroepen bij geladen restgroepen bij restgroepen met zwavel Bij hydrofobe restgroepen Tabel 3.1: Aminozuurinteracties bij eiwitvouwing. In de backbone (keten peptidebindingen) kunnen waterstofbruggen gevormd worden tussen een zuurstofatoom van het ene aminozuur en een waterstofatoom van het andere aminozuur. Ook hydrofiele restgroepen kunnen waterstofbruggen vormen met elkaar. Verder kunnen geladen restgroepen zoutbruggen vormen, restgroepen van cysteïnes zwavelbruggen en kunnen hydrofobe restgroepen hydrofobe interacties met elkaar hebben. De belangrijkste factor voor de stabiliteit van een eiwit zijn de waterstofbruggen. Het eiwit zal daarom zo gevouwen worden dat deze bruggen optimaal gevormd kunnen worden. Deze waterstofbruggen worden voornamelijk gevormd tussen atomen van de backbone, en die is in ieder eiwit hetzelfde. Je ziet dan ook een aantal structuren die gunstig zijn voor de waterstofbruggen in alle eiwitten terugkomen. Ten eerste de α-helix, waarbij de backbone een soort slinger vormt. De restgroepen van de aminozuren steken allemaal naar buiten. In deze vorm kunnen alle zuurstofatomen van de backbone een waterstofbrug vormen. Dit doen ze met een waterstofatoom (van een stikstofatoom) één slinger lager. De tweede structuur is de β-sheet (heet ook wel β-plaat), waarbij de backbone heen en weer slingert tot een soort plaat. De restgroepen van de aminozuren zitten ongeveer in het vlak van de plaat en steken om en om naar rechts en naar links. Bij deze structuur kan de helft van de zuurstofatomen uit de backbone een waterstofbrug vormen. En om de α-helices en de β-sheets met elkaar te verbinden zijn er turns, een 24 soort kabels. De verschillen tussen eiwitten zitten vooral in de hoeveelheid van deze structuren en de manier waarop ze tegen elkaar aan liggen. A A B C Figuur 3.1: Secundaire structuren (α-helix en β-sheet) en tertiare structuur (rechts). Bij de α-helix ligt de backbone in een spiraalvorm en steken de restgroepen naar buiten (A). De β-sheet is een soort plaat, waarin de backbone zigzaggend heen en weer gaat. De restgroepen liggen in het oppervlak van de plaat (B). De tertiaire structuur aan de rechterkant bestaat uit α-helices, β-sheets en turns (C). Figuur 3.2: Waterstofbruggen in de α-helix (links) en β-sheet (rechts). Links is de α-helix weergegeven met alle atomen van de backbone. Ook zijn de waterstofbruggen getekend, die ervoor zorgend at de helix zijn vorm behoudt. De restgroepen steken allemaal naar buiten. In de β-sheet liggen de aminozuurketens naast elkaar. De Waterstofbruggen zorgen ook hier voor de stevigheid en de restgroepen steken in het vlak van de sheet. We noemen de keten aminozuren de primaire structuur van een eiwit, en de α-helices, βsheets en turns de secundaire structuren. Als je kijkt naar de ruimtelijke ordening van deze secundaire structuren ten opzichte van elkaar (figuur 6.8 rechts), noem je dat de tertiare structuur van een eiwit. En mocht het eiwit bestaan uit meerdere subunits, dan noem je de manier waarop deze subunits tegen elkaar aan liggen de quaternaire structuur. 3.2 TRANSPORT De translatie, dus de vorming van het eiwit, vindt plaats op een ribosoom op het ruwe Endoplasmatisch Reticulum (ER). Dit is een membranenstelsel in het cytoplasma, en de eiwitten zullen dan ook na hun synthese in het cytoplasma terecht komen. Veel eiwitten moeten daar hun functie uitoefenen, maar er zijn ook eiwitten die hun functie ergens anders in de cel of buiten de cel uitoefenen. Die eiwitten moeten dan eerst nog naar de 25 goede plaats getransporteerd worden. Maar hoe weet een eiwit nou waar hij heen moet? Daar kan zo‟n eiwit bijvoorbeeld een signaalsequentie voor gebruiken. Die bestaat meestal uit de eerste paar aminozuren van het eiwit, en kan herkend worden door transporteiwitten. Deze transporteiwitten zullen aan het nieuwe eiwit binden en hem meenemen naar de goede locatie. Je kunt die signaalsequentie dus zien als een soort treinkaartje, en de transporteiwitten als de trein. Een andere manier van transport is via posttranslationele modificaties. Glycosylering heeft bijvoorbeeld veel met transport te maken. De suikergroep aan het eiwit heeft dan dezelfde functie als een signaalsequentie. Hij kan herkend worden door andere (transport)eiwitten, die ervoor zorgen dat het eiwit op de goede plek terecht komt. De suikergroep van het eiwit wordt gebonden aan de transporteiwitten. De eerste stap in het transport van eiwitten is transport van het ER naar het golgisysteem. Ook het golgisysteem bestaat uit membranen en je kunt het zien als een soort postorderbedrijf. Hier worden de transportlabels (signaalsequenties of suikergroepen) herkend en worden de eiwitten in de goede transportblaasjes gestopt. Dan komt de tweede stap van het eiwittransport: transport van het golgisysteem naar een ander organel in de cel. Meestal wordt het eiwit dan naar zijn eindbestemming gebracht, waar het transportblaasje versmelt met het membraan van het betreffende organel. Zo komt het eiwit dan in dat organel terecht. Als het eiwit zijn functie buiten de cel uit moet oefenen zal het blaasje naar het celmembraan gaan, en daarmee versmelten. Dit proces noemen we exocytose. Bij het transport van eiwitten zijn veel enzymen betrokken. Er zitten bijvoorbeeld enzymen op het membraan van het golgisysteem die de transportlabels kunnen herkennen. Deze zorgen ervoor dat de eiwitten in de goede transportblaasjes terecht komen. Figuur 3.2: Transport van eiwitten. Het mRNA wordt naar het ruwe endoplasmatisch reticulum getransporteerd, waar het met behulp van een ribosoom vertaald wordt naar een eiwit. Na eventuele posttranslationele modificaties en eiwitvouwing wordt het eiwit naar het golgisysteem getransporteerd. Hier worden de transportlabels herkend en wordt elk eiwit naar de goede plaats in de cel gebracht in een transportblaasje. 26 3.3 RETINITIS PIGMENTOSA We hebben tot nu gezien hoe een DNA sequentie uiteindelijk resulteert in een functioneel eiwit. Het DNA wordt eerst afgeschreven naar RNA (transcriptie). Dan wordt het RNA vertaald naar een eiwit (translatie), en wordt dit eiwit gemodificeerd en gevouwen. Pas dan heeft een eiwit zijn functionele vorm. We hebben net ook gezien dat het eiwit na vouwing naar de goede plek in de cel wordt getransporteerd, zodat het eiwit daar zijn functie kan vervullen. Je kunt je voorstellen dat een foutje in het DNA grote gevolgen kan hebben voor het functioneren van een eiwit, en dus voor het functioneren van ons lichaam. Na gaan we een voorbeeld hiervan bekijken: de ziekte Retinitis Pigmentosa. Retinitis Pigmentosa (RP) is een verzamelnaam voor afwijkingen aan het netvlies (in het latijn retina). Het komt bij ongeveer 1 op de 4000 mensen voor. Patiënten met RP gaan steeds minder goed zien. Ze kunnen last krijgen van nachtblindheid, verblinding en een kokervisus. Bij nachtblindheid kun je in het donker alleen nog maar de lichtpunten zien. Verblinding houdt in dat je wanneer het licht is alleen contouren ziet. Retinitis betekent letterlijk ontsteking van het netvlies, maar dat is eigenlijk niet wat er bij de ziekte gebeurt. Bij RP worden er namelijk pigmentophopingen op het netvlies gevormd. Hierdoor raken de lichtgevoelige cellen (de kegeltjes en de staafjes) van het oog beschadigd. De meeste mensen met RP worden niet volledig blind, maar wel maatschappelijk blind. Dit houdt in dat het gezichtsvermogen kleiner is dan 10% of de gezichtshoek kleiner dan 10 graden. De leeftijd waarop de ziekte zich gaat uiten verschilt heel erg. Dat kan al vanaf de geboorte zijn, maar ook pas vanaf het zestigste jaar. Ook het verloop is niet te voorspellen, het kan erg snel gaan of het kan lang stabiel blijven. Wel is het zeker dat er geen spontane verbeteringen optreden. Figuur 3.3: Opbouw van het oog en zicht bij kokervisus. Links is de opbouw van het oog te zien, waarbij een stukje netvlies is uitvergroot. De lichtgevoelige cellen van het netvlies kunnen onderverdeeld worden in de staafjes en de kegeltjes 3.4 MUTATIES RP wordt veroorzaakt door een foutje in het DNA, een mutatie. Mutaties kun je overerven van je ouders of je kunt ze later krijgen. Ze kunnen dan ontstaan doordat bepaalde 27 processen in je lichaam niet meer zo goed werken of door externe factoren zoals straling. Als het DNA afgeschreven wordt kan zo‟n mutatie zorgen voor een verandering in de aminozuurvolgorde van het eiwit. Let op: dat is niet altijd zo! Denk maar eens terug aan de RNA-codons die coderen voor de aminozuren. Soms zijn er meerdere codons die coderen voor hetzelfde aminozuur. Het aminozuur Serine wordt bijvoorbeeld gevormd bij de codons: UCU, UCC, UCA, UCG, AGU en AGC. Als je dan een mutatie zou hebben in de laatste base van U naar C, dan heeft dat geen gevolgen voor de aminozuursequentie. Maar een mutatie wardoor UCU verandert in CCU maakt van de Serine een Proline en zorgt dus wel voor een aminozuurverandering. Als er een aminozuurverandering is in een eiwit, kan het anders gaan functioneren en kan er een ziekte ontstaan. Dit is ook wat er gebeurt bij RP. 3.4 RHODOPSINE EN RETINA L RP kan ontstaan door verschillende soorten mutaties. Deze mutaties kunnen ook nog op veel verschillende genen liggen. Één van de genen die betrokken zijn bij RP is het rhodopsine-gen, dat codeert voor rhodopsine. Rhodopsine bevindt zich op het membraan van lichtgevoelige cellen. Je ziet dat weergegeven in het figuur hieronder. Dat rhodopsine kan reageren op licht komt doordat het een klein molecuul „retinal‟ bindt. Dat molecuul is weergegeven in het midden van het linkerfiguur. De fotonen uit het licht kunnen een verandering veroorzaken van 11-cis-retinal naar trans-retinal. Hierdoor verandert ook het rhodopsine van vorm, en dit zet een reactie in gang. Uiteindelijk zullen hierdoor neuronen geactiveerd worden, die er in de hersenen voor zorgen dat je kunt zien. Figuur 3.4: Rhodopsine met retinal (links) en de structuurformule van retinal (rechts). Rhodopsine is een membraaneiwit. De helices steken dwars door het membraan heen en vormen een soort cilinder. Hier binnen in zit het retinal gebonden. Als retinal in de cisvorm aanwezig is, is het rhodopsine inactief. Maar onder invloed van licht gaat verandert retinal van cis naar trans en wordt rhodopsine actief. Je kunt je dus wel voorstellen dat de binding tussen rhodopsine en retinal erg belangrijk is voor het zien. RP kan dan ook veroorzaakt worden door mutaties van rhodopsine op plekken waar het retinal bindt. Hier gaan we nu naar kijken met een bioinformatica opdracht. 28 OPDRACHTEN BIJ LES 3 1. Welke verbindingen spelen de grootste rol bij eiwitvouwing? Welke secundaire structuur zal het meest stabiel zijn? 2. Kijk naar de α-helix en de β-sheet (bron 10 en 11 H-22). Wat valt je op aan de oriëntatie van de restgroepen? 3. We hebben het kort gehad over de rol van zwavelbruggen bij de eiwitvouwing. Onze haren zijn opgebouwd uit eiwitketens, waarbij zwavelbruggen een belangrijke rol spelen. Ze bepalen onder andere of je stijl haar hebt of krullen. Maak hierover opdracht 31 a-c van paragraaf 18.3 (scheikunde boek). Wanneer deze zwavelbruggen weer gevormd worden zit het haar om de krulspeld en zullen de zavelbruggen scheef gevormd worden. Daarom blijft het haar na deze behandeling nog in de krul zitten. 4. Noem twee soorten „treinkaartjes‟ die eiwitten kunnen hebben, zodat ze op de goede plek in terecht komen. 5. Beschrijf het transport van een membraaneiwit. Gebruik hierbij de termen: golgisysteem, exocytose, transportblaasje, endoplasmatisch reticulum. 6. Kijk in tabel 67D van je binas. Heeft hemoglobine een quarternaire structuur? 7. Noem drie manieren waarop je een mutatie kunt krijgen. 8. Hieronder staan de eerste 30 basen van het rhosopsinegen. Vertaal deze DNAsequentie naar een eiwitsequentie. atgaatggca cagaaggccc taacttctac 9. Welke mutaties zijn er allemaal mogelijk in de dertiende base? En welke aminozuren kunnen er dan ontstaan? Welke mutatie lijkt jou het meest erg? 10. Leg uit hoe een mutatie kan leiden tot een ziekte. Je mag voor je antwoord internet gebruiken, maar dat hoeft niet. Extra informatie over deze les: Soms zegt een filmpje meer dan een stapel papier, dus wie weet steek je nog iets op van hetvolgende filmpje: Glycosylatie en transport van eiwitten: http://www.youtube.com/watch?v=u38LjCOvDZU 29 BIOINFORMATICA-COMPUTERPRACTICUM celmembraan Figuur 9.1: Plek in de cel. Het eiwit rhodopsine bevindt zich op het celmembraan. Voorbereiding: Yasara downloaden: www.yasara.com >downloads >Yasara for new users >stage I >click here to download (inschrijven met het gegeven formulier) >order Je krijgt na 10 minuten een e-mail van [email protected] (wellicht gelabeld als spam). Bij puntje 2) van deze mail staat een link die je kunt openen in internet explorer: http://yasara3.cmbi.ru.nl/go/ER15Sp/DeployYASARA.exe Eenmaal geopend krijg je een schermpje met uivoeren/opslaan. Kies ‘opslaan’ en selecteer een map waar je het bestand in wilt zetten. Dit kan even duren. Daarna kun je het bestand deployYASARA.exe openen en klikken op ‘uitvoeren’. Yasara wordt nu geïnstalleerd en geopend. Site van het vak bioinformatica 2: http://swift.cmbi.ru.nl/teach/B2/index.html Site waarop je Opsin.pbd kunt dowloaden: http://www.cmbi.kun.nl/~vgelder/vwo/RP/index_origineel.html 30 ALGEMENE INFORMATIE BIOINFORMATICA Bioinformatica is een vakgebied waarbij informatica gebruikt wordt om biologische kennis te verkrijgen. Het is dus een subdomein van de biologie. Je kunt met bioinformatica bijvoorbeeld verschillende aminozuursequenties vergelijken. Als je de sequentie van een bepaald eiwit van meerdere diersoorten vergelijkt, kun je bijvoorbeeld iets zeggen over de evolutie van dat eiwit. De stukken die bij elke diersoort hetzelfde zijn noemen we geconserveerd. Deze stukken zijn meestal erg belangrijk voor het functioneren van het eiwit. Andere delen verschillen per diersoort en zijn meestal minder essentieel. Bij dit soort analyses gebruik je de computer om de sequenties zo goed mogelijk onder elkaar te zetten. De computer zoekt dus voor je uit welke gebieden van het eiwit sterk overeen komen. Een ander deel van de bioinformatica is gericht op het zichtbaar maken van eiwitten. Er zijn bijvoorbeeld computerprogramma‟s gemaakt die de krachten binnen zo‟n eiwitmolecuul kunnen berekenen. Je voert daar dan een aminozuursequentie in, en de computer laat je het optimaal gevouwen eiwit zien. Als er in een eiwit bijvoorbeeld geladen aminozuren voorkomen, dan zullen die krachten ondervinden. Gelijk geladen aminozuren stoten elkaar af en tegengesteld geladen aminozuren trekken elkaar aan. Als je al dit soort krachten meeneemt in een computermodel komt je voorspelling erg dicht bij de werkelijke vorm van het eiwit. Die zal immers ook altijd optimaal gevouwen zitten. Wij gaan zo met de computer kijken naar rhodopsine. De structuur van dit eiwit kun je downloaden van de Protein Data Bank (PDB). Dit is een site op internet waar alle eiwitstructuren, die tot nu toe bekend zijn, opgeslagen zijn. Dit hebben wij al voor jullie gedaan. Daarna kun je deze PDB-file openen met Yasara. Je krijgt dan een driedimensionaal beeld van het eiwit. Je kunt het eiwit ronddraaien en voor allerlei weergaven kiezen. Om te begrijpen hoe zo‟n eiwit in elkaar zit is het wel belangrijk dat je de verschillende aminozuren kent. We zullen dus eerst even aandacht besteden aan de verschillende aminozuren en hun eigenschappen. Figuur 3: structuurformules van de 20 aminozuren Figuur 9.2: Protein Data Bank (PDB) en Yasara. De Protein Data Bank is een site waarop je vele driedimensionale eiwitstructuren kunt downloaden. Deze kun je bijvoorbeeld openen in het programma Yasara. COMPUTERPRACTICUM MET YASARA Getting started… 31 Open Yasara (dubbelklik op het icoontje en kies „uitvoeren‟) om het opgeslagen bestand te bekijken. Het kan even duren, maar als het goed is zie je uiteindelijk een blauw scherm. Om een beetje wegwijs te worden in dit programma kun je het beste eerst een instructiefilmpje doorlopen. Die vind je bij >help >play help movie >1.1 working with Yasara. Dit duurt ongeveer 10 minuten. Snap je het een beetje? Open dan het eiwit rhodopsine door te klikken naar >file >load >pdb-file >... >opsin.pdb Druk op F6, zodat je de secundaire structuren overzichtelijk in beeld krijgt. The real thing… 1. Beschrijf het eiwit. Hoeveel helices heeft het? En hoeveel sheets? Hoe ziet de teriaire structuur eruit? Is er een quaternaire structuur? 2. Maak alle glycines en prolines zichtbaar: >view >show atoms >residue >name: gly, pro In welke secundaire structuren kom je deze het meest tegen? Hoe zou dat komen? (hint: vergelijk deze aminozuren met alle andere aminozuren) 3. Kijk naar alle ladingen in het molecuul: >view >show atoms >residue >name: arg, asp, glu, lys (houd CTRL ingedrukt om meerdere residuen te selecteren) Waar zitten de meeste ladingen in het molecuul? Kun je hier een verklaring voor geven? (hint: het is een membraaneiwit) 4. Je kunt ook alle waterstofbruggen zichtbaar maken, dit gaat als volgt: >edit >add >hydrogens to: all >view >show hydrogen bonds >all Zijn er ook waterstofbruggen tussen rhodopsine en retinal? 32 Kun je hier een verklaring voor geven? 5. We willen graag weten of er ook zwavelbruggen in dit molecuul voorkomen. Hiervoor maken we eerst alle cysteïne residuen zichtbaar: >view >show atoms >residue >name: cys Er kan alleen een zwavelbrug zitten als de zwavelatomen van twee cysteïnes tussen de 1.5 Å (Ångström) en de 2.5 Å van elkaar af zitten. Je kunt dit meten door twee zwavelatomen te selecteren (houd daarvoor CTRL ingedrukt). Dan staat linksonder bij „marked distance‟ de afstand tussen deze twee atomen. Zijn er zwavelbruggen in dit molecuul? 6. Kijk naar alle ringstructuren in het molecuul: >view >show atoms >residue >name: phe, trp, tyr Valt je iets op? Door welke soort binding blijft het retinal op zijn plaats? Waarom staat histidine eigenlijk niet in dit rijtje? 7. Mensen met Retinis Pigmentosa hebben een mutatie in het gen dat codeert voor rhodopsine. Deze mutaties kunnen een aminozuurverandering in het eiwit veroorzaken. Bekende aminozuurveranderingen bij RP patiënten zijn: Ser186Pro, Cys187Tyr, Met207Arg, Ala292Glu en Lys296Glu. Notatie: Bijvoorbeeld bij de eerste mutatie is aminozuur nummer 186 van een Serine over gegaan naar een Proline. Maak al deze aminozuren zichtbaar: >view >show atoms >residue >sequence: Ser186, Cys187, Met207, Ala292, Lys296 Kun je nu bedenken waarom bij mensen met een of meerdere van deze mutaties het proces van zien niet goed verloopt? Welk aminozuur is waarschijnlijk het belangrijkst voor de functie van rhodopsine? Maak een mooi plaatje van dit aminozuur. Sla het plaatje op met behulp van „Print Screen‟ en een tekenprogramma. 33 LES 4 DNA REPLICATIE EN DNA ONDERZOEK Figuur 4.1: Plek in de cel. DNA replicatie vindt plaats in de celkern. 4.1 DNA REPLICATIE Deze les zal gaan over natuurlijke DNA replicatie en hoe dit in zijn werk gaat in laboratoria. DNA replicatie is belangrijk voor onze celdelingen. Voorafgaand aan de celdeling wordt het DNA verdubbeld. Deze replicatie gebeurd in de S-fase van de celcyclus. Replicatie is het proces waarin DNA verdubbeld wordt. De replicatie begint op vaste plaatsen op het DNA, de zogenaamde „origin of replication‟ (ORI). Dit gedeelte van het DNA (sequentie) is AT-basenrijk, er komen dus veel adenine en thymine basen in voor en is ongeveer 250 basenparen lang. Het enzym helicase ontwindt de DNA dubbele helix en laat door het verbreken van de waterstofbruggen de twee strengen een stukje uit elkaar gaan. Het enzym DNA polymerase kan op deze manier een stukje van het enkelvoudige DNA aflezen. Op de plaats waar de twee strengen een stukje uit elkaar zijn, hecht zich op de ORI plaats een RNA primer. Deze binding noem je het begin van de DNA synthese. Het DNA-polymerase zorgt ervoor dat een rondzwevend nucleotide, die complementair is aan de oude DNA streng, gebonden wordt aan de RNA-primer. Bij iedere stap wordt een volgend nucleotide hieraan vastgemaakt tot de hele streng is afgelezen. Het DNA heeft in normale toestand de vorm van een dubbele helix. Bij DNA replicatie is het DNA in twee strengen verdeeld en is dus tweemaal enkelstrengs. De replicatie gebeurt dan ook bij beide strengen maar wel op verschillende wijzen. Het DNA wordt afgelezen vanuit de 3‟ richting naar de 5‟ richting en het opbouwen van het DNA 34 gebeurt altijd in de 5‟ 3‟ richting. Het DNA is maar een klein gedeelte opengeritst en zijn de DNA replicatie gebeurt in kleine gedeeltes van ongeveer 100 tot 200 nucleotiden lang omdat de DNA polymerase niet meer nucleotiden aan elkaar kan koppelen. Na deze streng hecht zich op nieuw een RNA-primer aan de oude DNA streng. Daarna vindt een koppeling tussen nucleotide en DNA polymerase plaats en zo wordt weer een nieuw stukje DNA gemaakt. Het stukje RNA (RNA primer) en het DNA samen wordt het Okazaki-fragment genoemd. Je hebt nu te maken met allemaal losse stukjes DNA (verschillende fragmenten van 100 – 200 nucleotiden lang). Als laatste fase in de DNA replicatie worden de verschillende fragmenten aan elkaar gebonden dor het enzym DNAligase. Figuur 4.2: DNA Replicatie DNA replicatie gebeurt onder invloed van helicase, RNA primer, DNA polymerase en DNA ligase. Het okasaki fragment is de RNA primer en het geproduceerde DNA keten. Het hele proces van DNA replicatie staat onder invloed van de energie die wordt verkregen uit de hydrolyse van guanosinetrifosfaat (GTP) in ATP (adenosinetrifosfaat). Niet alleen in het lichaam wordt DNA replicatie gedaan. Ook in het onderzoek aan DNA is het nodig om grote hoeveelheden van hetzelfde DNA te gebruiken. Hiervoor is een nieuwe techniek bedacht namelijk de Polymerase Ketting Reactie (PCR). 4.2 POLYMERASE CHAIN REA CTION (PCR) De volgorde van nucleotiden in het DNA is van groot belang dat wij normaal functioneren. Daarom worden de specifieke volgordes van nucleotiden in het DNA (de sequentie)in laboratoria bepaald, met diverse technieken waar de Polymerase ketting reactie (PCR) er één van is. Omdat één DNA molecuul erg klein is, is het erg moeilijk om deze te bestuderen. De analyse kan worden vergemakkelijkt met het vermenigvuldigen van het DNA. De PCR is een techniek om vele kopieën te maken van een kleine hoeveelheid specifiek DNA. Vaak kun je maar een klein beetje DNA uit weefsel isoleren wat niet genoeg is voor het analyseren. De PCR reactie is begin jaren 80 uitgevonden en heeft tot nu toe al veel bijgedragen aan de vooruitgang van de moleculaire biologie. Het principe van de PCR techniek is gebaseerd op de manier waarop DNA in de natuur wordt vermenigvuldigd als de cel zich deelt. Bij de PCR techniek wordt het DNA verwarmd, waardoor de twee strengen uit elkaar gaan en fungeren als mal voor de nieuw te vormen DNA strengen. 35 De PCR reactie kan kortweg gezegd ingedeeld worden in drie stappen. De eerste stap is een temperatuursverhoging naar 94°C, waardoor het DNA denatureert (DENATURATIE). Dat wil zeggen dat de waterstofbruggen tussen de DNA-strengen worden verbroken. Daardoor valt de dubbele helix van het DNA uit elkaar. De tweede stap houdt in dat er primers worden toegevoegd. Primers zijn kleine stukjes chemisch gemaakt DNA, waarvan de basenvolgorde complementair (dus tegenovergesteld) is met die van de uiteinden van het te vermeerderen DNA fragment. De primers zorgen ervoor dat aan de enkelstrengs DNA weer nieuwe basen gekoppeld kunnen worden (T=72°C) (ELONGATIE). De laatste stap gebeurt onder invloed van het enzym polymerase. Polymerase zorgt ervoor dat de primers worden verlengd tot een compleet nieuw stuk DNA. Deze verlenging kan gebeuren omdat je in de mix lossen nucleotiden toevoegd die door de polymerase op de juiste plaats gekoppeld wordt. Tegen beide strengen ontstaat zo een nieuwe streng van DNA en zo wordt de hoeveelheid DNA verdubbeld. Deze stappen kun je meerdere keren herhalen binnen één PCR reactie. Het nieuwe stukje DNA is identiek aan het origineel. Als je de cycli 30 keer herhaalt heb je al meer dan één miljard kopieën gemaakt. De gevoeligheid van de PCR-techniek is zo groot dat DNA-diagnostiek uitgaande van een enkel DNA-molecuul mogelijk is. Toepassingen liggen op verschillende gebieden, zoals de genetica, microbiologie, virologie en het kankeronderzoek. Figuur 4.3: Polymerase Ketting reactie De PCR begint met het denatureren van het DNA door verhitting. Primers hechten zich aan het DNA door de afkoeling. Door het opwarmen naar 72°C worden de primers verlengd en ontstaat een identiek DNA molecuul als het originele. 36 4.3 SEQUENCING Na de PCR reactie is het gebruikelijk om het DNA te controleren op lengte en op foutjes. Om de sequentie te bepalen moeten we nu de lengte vaststellen van de nieuwgevormde fragmenten. Deze eerste stap wordt gedaan door elektroforese. De DNA fragmenten worden op een gel geplaatst en over deze gel loopt een elektrisch veld. Het DNA zal naar de pluspool gaan bewegen. De snelheid waarmee de moleculen zich verplaatsen in de gel is afhankelijk van de lengte van de fragmenten. Korte moleculen zullen zich sneller bewegen dan de lange fragmenten en zullen dus onderin de gel te vinden zijn. De DNA fragmenten worden op deze manier van elkaar gescheiden in hun lengte. De volgende stap in het gebruik van DNA in het onderzoek is het controleren op mutaties en wordt gedaan door het DNA te sequencen. Sequencen is een techniek waarbij de basenvolgorde van een DNAstreng wordt bepaald. Deze techniek is in 1975 ontwikkeld en in de loop van de jaren steeds beter en sneller geworden. In 2001 werd de sequentie van het menselijk genoom (3 miljard basenparen lang) gepubliceerd. In de meeste laboratoria wordt gebruik gemaakt van de Sanger methode. Sequencen heeft hetzelfde verloop als de PCR reactie alleen worden er nu enkele dideoxynucleotiden en het meeste van de gewone nucleotiden aan de reactie toegevoegd. Dideoxynucleotiden zijn moleculen die lijken op normale nucleotiden alleen hebben zij geen OH-groep aan de 3-uiteinde van het DNA. Hierdoor stopt de replicatie wanneer er een dideoxynucleotide wordt ingebouwd. Elk van de vier dideoxynycleotides (ddA, ddC, ddG en ddT) heeft een apart fluorescerend label. Daardoor is na het sequencen in één opslag te zien waar de vier verschillende dideoxybasen zich bevinden. Als de PCR reactie op gang gekomen is, zullen op een gegeven moment alle kopieën worden afgesloten met een bepaalde dideoxynucleotide. Het punt waar het enzym een dideoxynucleotide inbouwt en dus de plaats waar de keten stopt, is geheel willekeurig. De ene keer zal een korte keten gemaakt worden, de volgende keer een lange. Uiteindelijk komen dus alle mogelijke eindpunten aan de beurt. Je krijgt dan een verzameling van stukjes DNA van alle mogelijke verschillende lengtes met ieder een dideoxynucleotide op het eind. Om er achter te komen waar alle verschillende dideoxynucleotides in de keten Figuur 4.4: Sanger Sequencing 37 zich bevinden, moeten we weten wat de verschillende lengtes zijn van al onze afgebroken ketens. Dit wordt gedaan door middel van gelelektroforese. Als de kortste keten eindigt met een ddA, weet je dus dat de volgorde van het DNA begint met een A. Zo kun je voor iedere positie in de DNA volgorde achterhalen welke nucleotide (A, C, G of T) er zit. Het aflezen van de gel gebeurt automatisch. Met sequentieanalyse kunnen ook eenvoudige mutaties opgespoord worden door het DNA van een patiënt te vergelijken met dat van een controlepersoon. 38 OPDRACHTEN BIJ LES 4 In de les 1) In het kernplasma zijn eenentwintig nucleotiden met de volgende stikstofbasen aanwezig: 6 x adenine, 4 x thymine, 8 x cytosine en 3 x guanine. Hoeveel nieuwe basenparen kunnen tijdens de duplicatie van DNA maximaal gevormd worden met deze eenentwintig nucleotiden? 2) Een cel ondergaat 2 keer mitose. Hierbij ontstaan 4 dochtercellen. In hoeveel van deze dochtercellen zijn nog delen van het oorspronkelijke DNA-molecuul aanwezig? 3) DNA replicatie vindt na/voor/tijdens de celdeling plaats. 4) Geef aan waarom deze `Okazaki`-fragmenten noodzakelijk zijn voor de replicatie van de antiparallelle DNA-streng. 5) Wat doet een DNA polymerase? 6) Hoe werkt de PCR? Benoem hierbij de verschillende stappen en de functie ervan. 7) Stel dat je met één streng DNA begint. Hoeveel DNA-strengen heb je dan na dertig verdubbelingscycli? 8) Wat is gelelektroforese? 9) Als je een gelelektroforese uitvoert, naar welke kant zal het DNA bewegen en waarom? 10) Waarom gebruik je na de PCR de sequencing methode? Extra informatie over deze les: Duidelijke weergave van een PCR reactie http://www.youtube.com/watch?v=eEcy9k_KsDI DNA sequencing http://www.youtube.com/watch?v=oYpllbI0qF8 39 DEFINITIEBLAD Acetylgroep: klein polair molecuul dat als het gebonden zit aan een histon zorgt voor een open DNAstructuur (euchromatine) Adenine: base die samen met desoxyribose een DNA nucleotide vormt en samen met een ribose een RNA nucleotide; basenparing met thymine en uracil Alfahelix: spiraalvormige keten van aminozuren Aminogroep: deel van een aminozuur (NH2) Aminozuur: bouwsteen van eiwitten Anti-codon: specifieke sequentie van drie nucleotiden in het tRNA, complementair aan een codon voor een aminozuur in het mRNA Apolair: niet polair, dus zonder electronegatieve atomen zoals N en O; slecht oplosbaar in water Backbone: keten peptidebindingen van een eiwit; het eiwit exclusief de restgroepen van de aminozuren Basenpaar: Twee nucleotide die gepaard zijn via waterstofbruggen tussen hun basen, bijvoorbeeld A met T of U en C met G Bètasheet: aminozuurketen in een zigzagstructuur Bioinformatica: vakgebied waarin de informatica wordt gebruikt om biologische verschijnselen te bekijken en analyseren Zuurgroep: deel van een aminozuur (COOH) Celmembraan: membraan (vettige structuur) rondom een cel Chromatine: bouwstof van chromosome, bestaande uit DNA, hstonen en andere eiwitten Chromosoom: een groot DNA molecuul met eiwitten die eraan gebonden zijn; bevat vele genen Codon: sequentie van drie opeenvolgende nucleotiden in DNA of mRNA dat codeert voor een aminozuur Condensatiereactie: reactie waarbij een (peptide)binding gevormd wordt en er water vrij komt Cytoplasma: celinhoud buiten de celkern, bevat organellen zoals mitochondriën Cytosine: base die samen met desoxyribose een DNA nucleotide vormt en samen met een ribose een RNA nucleotide; basenparing met guanine 40 Denaturatie: ontvouwing van een eiwit of verbreking DNA dubbele helix Desoxyribose: suikergroep die samen met een fosfaatgroep en een base (A, C, T, G)een DNA nucleotide (bouwsteen) vormt Dideoxynucleotiden: is een molecuul dat lijkt op een normaal nucleotide maar het heeft geen OH- groep aan het 3‟-uiteinde. Hiermee zorgt dit molecuul ervoor dat de replicatie gestopt wordt in het sequencing proces. Disaccharide: Twee gebonden monosachariden (suikergroepen) DNA: desoxyribonucleic acid, een keten van nucleotiden waarin genetische informatie is opgeslagen DNA ligase: is een speciaal enzym dat DNA strengen, die verbroken zijn tijdens de DNA replicatie weer aan elkaar kan maken. DNA-methylering: het plaatsen van een methylgroep op een nucleotide van het DNA; DNA-methylering voorkomt dat histonen geacetyleerd worden en zorgt er zo voor dat de chromatinestructur compact blijft (heretochromatine). Daarnaast zorgt het ervoor dat transcriptie factoren belemmerd worden in het aflezen van genen. Dubbele helix: zitten spiraalvormige conformatie waarin twee complementaire DNA ketens Eiwit: groot molecuul dat bestaat uit één of meerdere keten(s) aminozuren Eiwitregulatie: zorgen dat het aantal eiwitten op peil blijft door het de synthese, afbraak, opslag en denaturatie van eiwitten te controleren Elongatie: verlenging van bijvoorbeeld een mRNA of DNA streng; dit vindt pas plaats nadat de transcriptie of translatie gestart is (initiatie) Endoplasmatisch reticulum: stelsel van dubbele membranen in het cytoplasma van een cel, het ruwe endoplasmatisch reticulum bevat vele ribosomen die nodig zijn voor eiwitsynthese Enzym: eiwit of RNA molecuul dat actief is als katalysator (een reactie makkelijker laat verlopen) Essentieel aminozuur: aminozuur dat niet zelf aangemaakt kan worden door mensen en dus verkregen moet worden uit voedsel Euchromatine: open vorm van chromatine; genen in dit gebied kunnen makkelijk afgeschreven worden aangezien RNA polymerase en andere belangrijke eiwitten er goed bij kunnen Exon: stuk DNA (in een gen) dat codeert voor het uiteindelijke eiwit en in het RNA aanwezig blijft (zie intron) Fosfaatgroep: PO4; polaire groep die gebonden aan een aminozuur vaak zorgt voor activatie van het eiwit 41 Fosfatase: enzym dat de binding van een fosfaatgroep aan een eiwit helpt te verbreken Fosforylering: het binden van een fosfaatgroep aan een ander molecuul zoals een eiwit (de fosfaatgroep is afkomstig van ATP) Gen: een stuk DNA met de genetische informatie voor en bepaalde eigenschap; er liggen vele genen op een chromosoom Gelelektroforese: is een scheidingstechniek waarbij DNA moleculen onder invloed van een elektrisch veld bewegen over een gel. Het negatief geladen DNA beweegt naar de positieve pool. Hoe groter de moleculen hoe trager ze door de gel bewegen en daarmee dus de kortste afstand afleggen. Genregulatie: is het proces waarbij genen onder invloed staan van verschillende factoren om tot expressie te komen. Glucosegroep: suikergroep C6H12O6; kan gebonden worden aan een aminozuur en een rol spelen bij eiwitvouwing, eiwittransport of eiwitstabiliteit Glycosylering: het proces waarbij er een suikergroep (bijvoorbeeld glucose, mannose, n-acetylglucosamine) aan een aminozuur wordt gebonden Golgisysteem: membranenstelsel in het cytoplasma van een cel, waarin postranslationele modificaties aan eiwitten plaatsvinden en waar de eiwitten gesorteerd worden voor transport Guanine: base die samen met desoxyribose een DNA nucleotide vormt en samen met een ribose een RNA nucleotide; basenparing met cytosine Helicase: is een groep enzymen die de dubbele DNA helix ontwindt door de waterstofbruggen te verbreken. Heterochromatine: open chromatinestructuur, waardoor het DNA toegankelijk is en overgeschreven kan worden; histonacetylering bevordert deze structuur Histon: eiwit dat bindt aan DNA en zo mee helpt aan de pakking van DNA Histon modificatie: histonen zijn eiwitten die het DNA helpen met opvouwen. Veranderingen aan deze histonen worden histon modificaties genoemd. Hydrofiel: polair of geladen, kan waterstofbruggen vormen met water en lost daarom goed op in water Hydrofobe interactie: meerdere hydrofobe groepen die samenkomen om afgeschermd te zijn van het water Hydrofoob: apolair (zonder lading), kan geen waterstofbruggen vormen met water en is daarom slecht oplosbaar in water Hydrolyse: verbreken van een (peptide)binding, waarvoor water nodig is Initiatie: start van transcriptie of translatie 42 Intron: stuk DNA (in een gen) dat niet codeert voor het uiteindelijke eiwit en door middel van splicing uit het RNA verwijderd wordt (zie exon) Ionkanaal: eiwit dat transport van een specifiek ion over een membraan faciliteert Kinase: enzymen die fosforyleringsreacties helpen te verlopen Kokervisus: symptoom van retinitis pigmentosa; de staafjes op de rand van het netvlies zijn beschadigd, waardoor er alleen in het midden van het blikveld scherp zicht is Lipoproteïne: eiwit waaraan een vetgroep gebonden zit Mannosegroep: suikergroep C6H12O6; kan gebonden worden aan een aminozuur en een rol spelen bij eiwitvouwing, eiwittransport of eiwitstabiliteit Monosaccharide: eenvoudigste groep van koolhydraten die niet meer verder te hydrolyseren is. mRNA: messenger RNA, RNA molecuul dat complementair is aan een DNA streng, draagt de genetische code van een chromosoom naar een ribosoom waar het wordt vertaald naar een eiwit Mutatie: een verandering in de DNA sequentie N-aceltylglucosaminegroep: suikergroep C8H15NO6; kan gebonden worden aan een aminozuur en een rol spelen bij eiwitvouwing, eiwittransport of eiwitstabiliteit Nachtblindheid: symptoom van retinitis pigmentosa; zicht is erg beperkt bij weinig licht Nucleosoom: bolstructuur bestaande uit acht histonen en DNA;bouwstof van chromatine Nucleotide: bouwsteen van DNA of RNA, bestaande uit een fofaatgroep, een suikergroep (desoxyribose in DNA en ribose in RNA) en een base Okazaki fragment: is een kort antiparallelle DNA fragment die bestaat uit de RNA primer en een stukje, door DNA polymerase, nieuw ontwikkelde DNA streng. Operator: een DNA sequentie waar genen aan of uit geschakeld kunnen worden. Operon: Een operon bestaat uit op het DNA bij elkaar liggende genen, die bij elkaar horen voor het tegelijk uitvoeren van één transcriptie van meerdere enzymen voor één celproces. Origin of replication: is het begin punt van de DNA replicatie waar de RNA primer zich hecht. PCR: is een manier om uit zeer kleine hoeveelheden DNA specifiek één of meer gedeeltes te vermenigvuldigen tot er genoeg van is om het te analyseren Peptidebinding: binding tusen de aminogroep van het ene aminozuur en de zuurgroep van het andere aminozuur, bij de vorming van de binding komt water vrij 43 Polair: met ongelijk verdeelde lading; een molecuul wordt polair doordat een elektronegatief atoom de elektronen naar zich toe trekt en een beetje negatief geladen wordt, andere atomen worden dan een beetje positief geladen Polymerase: het verdubbelt het DNA in de 5‟ 3‟ richting Polypeptideketen: keten aminozuren die met een peptidebinding aan elkaar gekoppeld zijn; eiwitten bestaan uit één of meerdere peptideketens Polysacharide: meer dan twee gebonden suikergroepen Posttranslationele modificatie: verandering aan een eiwit na de translatie Primaire structuur: volgorde van aminozuren in een eiwit Primer: is een stukje DNA of RNA dat gebruikt wordt als startpunt van de PCR. Er zijn steeds twee primers nodig, één voor de 5‟-streng en één voor de 3‟-streng Polyadenylatie signaal: is een specifiek RNA sequentie (AAUAAA) die ervoor zorgt dat bij RNA processing de poly(A)staart eraan wordt gezet Promoter: is een DNA sequentie voor één gen of meerdere genen dat de expressie van de genen reguleert. Protease: enzym dat betrokken is bij eiwitafbraak, katalyseert de hydrolysereactie van een peptidebinding Proteasoom: groot complex van afbraakmoleculen dat ervoor zorgt dat onnodige of beschadigde eiwitten afgebroken worden (bevat onder andere proteases) Protein Data Bank: site op internet waar je driedimensionale eiwitstructuren kunt downloaden (www.pdb.org) Purine: ringstructuur die voorkomt in de basen adenine en guanine Pyrimidine: ringstructuur die voorkomt in de basen thymine, cytosine en uracil Quaternaire structuur: driedimensionale structuur van een eiwit dat uit meerdere aminozuurketens bestaat, vooral de manier waarop deze ketens ten opzichte van elkaar liggen Replicatie: synthese van een stuk DNA, identiek aan een ander stuk Repressoreiwit: eiwit dat voor de startplaats van de transcriptie bindt aan het DNA en de transcriptie van een gen remt Restgroep: deel van een aminozuur dat verschilt per aminozuur, kan polair / apolair / negatief geladen / positief geladen of aromatisch (met ringstructuur) zijn Retinal: klein molecuul dat verandert van cis naar trans onder invloed van licht; bindt aan het eiwit rhodopsine, waardoor deze ook lichtgevoelig wordt Retinitis Pigmentosa: erfelijke aandoening aan het oog, waarbij (delen van) het netvlies beschadigd zijn door pigmentophopingen 44 Rhodopsine: membraaneiwit dat zich bevindt in lichtgvoelige cellen van het oog; bindt het molecuul retinal en is kan daardoor op licht reageren Ribose: suikergroep die samen met een fosfaatgroep en een base (A, C, G, U) een RNA nucleotide (bouwsteen) vormt Ribosoom: complex van rRNA‟s en eiwitten op het ruwe endoplasmatisch reticulum, dat betrokken is bij de translatie (eiwitsynthese) RNA: ribonucleic acid, een keten van nucleotiden die is afgeschreven van het DNA RNA polymerase: enzym die de transcriptie (het afschrijven den RNA van DNA) helpt te verlopen RNA primer: is een stukje RNA dat gebruikt wordt als startpunt van de PCR. Er zijn steeds twee primers nodig, één voor de 5‟-streng en één voor de 3‟-streng RNA processing: is de bewerking van het pre-mRNA streng naar het mRNA waaronder capping, toevoeging van de poly(A)-staart en intronen splicing rRNA: ribosomaal RNA, onderdeel van ribosoom Secundaire structuur: de ruimtelijke structuur van de aminozuurketen (s) van een eiwit, voorbeelden zijn de alfahelix en de bètasheet Sequencing: is het bepalen van de nucleïnezuur van een DNA/RNA sequentie Signaalsequentie: aminozuursequentie (meestal eerste paar aminozuren) die herkend wordt door transporteiwitten en er zo voor zorgt dat het eiwit op de goede plek terecht komt Splicing: verwijdering van intronen uit een mRNA sequentie en koppeling van de exonen Startcodon: AUG, codeert voor het eerste aminozuur van een aminozuurketen (methionine) Stopcodon: UAA, UAG of UGA, signaal voor de terminatie van een aminozuurketen Synthese: aanmaak (van bv eiwitten) Template: DNA keten die bij de transcriptie wordt gebruikt om een complementaire keten te genereren Terminatie: beëindigen; transcriptie en translatie stoppen bij een stopcodon, het eiwitcomplex en de nieuw aangemaakte keten laten los Tertiaire structuur: manier waarop de bètasheets) ten opzichte van elkaar liggen secundaire structuren (alfahelices en Thymine: base die samen met desoxyribose een DNA nucleotide vormt; basenparing met adenine Transcriptie: het proces waarbij de genetische informatie van een DNA keten wordt afgeschreven naar mRNA 45 Transcriptie factoren: zijn eiwitten die binden aan de promoter van een DNA sequentie. Translatie: proces waarin de genetische informatie van een RNA keten wordt vertaald naar een eiwit Transportblaasje: blaasjes met transporteiwitten die ervoor zorgen dat andere eiwitten op de goede plek in de cel terecht komen Transportlabel: een sequentie of posttranslationele modificatie van een eiwit, die herkend wordt door een transporteiwit en er zo voor zorg dat het eiwit op de goed plek in de cel terecht komt tRNA: in het nederlands „transport RNA‟ en in het engels „transfer RNA‟, RNA moleculen met een gebonden aminozuur en een anticodon, die aan een mRNA codon kan binden; faciliteert de translatie (eiwitsynthese) Turn: flexibele secundaire eiwitstructuur die de α-helices en de β-sheets met elkaar verbindt Ubiquitinegroep: klein eiwit dat dient als signaal voor eiwitafbraak door het proteasoom; er kunnen meerdere ubiquitinegroepen aan een eiwit worden gebonden Uracil: base die samen met een ribose een RNA nucleotide vormt; basenparing met adenine Vetgroep: een molecuul met een apolair gedeelte, meestal een paar lange koolstofketens; als een vetgroep aan een aminozuur bindt kan het eiwit zich bijvoorbeeld beter in een membraan nestelen Waterstofbrug: aantrekkingskracht tussen een electronegatief atoom (zoals N of O) en een waterstofatoom Yasara: programma waarmee je driedimensionale eiwitstructuren kunt bekijken en analyseren Zoutbrug: een binding tussen twee (tegengesteld) geladen aminozuren Zwavelbrug: binding tussen twee zwavelatomen; komt in eiwitten allen voor tussen twee cysteïnes 46
