Polymerization of the bacterial cell division protein FtsZ

Samenvatting
Inleiding
Het delen van cellen ligt ten grondslag aan
de meest fundamentele processen in de natuur:
groei en ontwikkeling. Het belang van een goed
geregelde celdeling blijkt wel uit het feit dat
alle levende organismen, van de kleinste
bacterie tot de grootste boom, beschikken over
een protocol voor de deling van hun cel(len).
Waar een cel zich deelt, wanneer een cel zich
deelt, hoe een cel zich deelt, dit alles staat onder
strenge controle van de cel zelf (en soms ook
nog onder controle van andere cellen in een
organisme). Als er iets met die controle misgaat
kunnen er de vreselijkste dingen gebeuren.
Kanker is bijvoorbeeld een ziekte die het gevolg
is van een ongebreideld delen van cellen die de
controle over zichzelf kwijt zijn. Celdeling is
dan ook altijd een belangrijk onderzoeksgebied
van biologen geweest. Dit proefschrift gaat over
een onderdeel van de celdeling in bacteriën.
Bacteriën zijn (een enkele uitzondering
daargelaten) eencellige organismen, en daarom
bijzonder geschikt voor het bestuderen van
celdeling.
Wat is er zo interessant aan bacteriën?
Bacteriën
hebben
als
ziekteverwekkers
(Salmonella,
veteranenziekte,
tuberculose
etc…) vooral een slechte pers. Dat is jammer,
want er zijn bijzonder veel bacteriën waar we
profijt van hebben. Zo zijn bacteriën nodig om
te helpen bij de vertering van voedsel in onze
darmen. Veel voedingsmiddelen worden
gemaakt met hulp van bacteriën zoals yoghurt,
kaas of zuurkool. Ook zijn bacteriën zo’n beetje
de eerste levensvormen die onze wereld
bevolkten toen deze nog woest en ledig was,
een belangrijke stap in de evolutie. Voor de
bestrijding van schadelijke bacteriën of de
nuttige inzet van bacteriën, en voor een goed
begrip van de natuur in het algemeen, is het
66
handig om over kennis van bacteriën te
beschikken. Maar er zijn meer redenen om
bacteriën te bestuderen. Veel biochemische
processen zijn in “primitieve” bacteriën
nauwelijks anders dan in “hogere” organismen.
Zo breekt een bacterie de suikers die zij als
voedsel opneemt op eenzelfde wijze af als,
bijvoorbeeld, een menselijke cel. Aangezien het
veel gemakkelijker is om een bacterie in het
laboratorium te bestuderen dan een menselijke
cel, kunnen wij bacteriën gebruiken om op een
relatief eenvoudige manier veel te leren over
processen die ook in andere organismen
plaatsvinden. Bacteriën vertonen bovendien een
gedrag dat onderzoekers aanstaat: ze planten
zich ontzettend snel voort en doen dit meestal
zonder iets aan hun erfelijk materiaal te
veranderen (het zijn allemaal kloontjes). Dit
voorkomt nare verrassingen tijdens het
onderzoek. Inmiddels is van een aantal
bacteriën de hele genetische code bekend, wat
een enorme vooruitgang in onze kennis over
deze bacteriën betekent. Tenslotte is het relatief
eenvoudig om veranderingen in de genetische
code van bacteriën aan te brengen. De gevolgen
van
dergelijke
veranderingen
kunnen
gemakkelijk worden bestudeerd in het
laboratorium (voor planten- en zoogdiercellen is
dit technisch veel moeilijker).
Omdat het ondoenlijk is voor elke
bacteriesoort het delingsproces tot in detail te
bestuderen, is het in de biologie gebruikelijk om
een paar bacteriën te kiezen die als model voor
een bepaalde “klasse” van organismen dienen.
Deze “modelbacteriën” worden bestudeerd, en
de conclusies zijn (in grote lijnen) geldig voor
alle bacteriën uit dezelfde klasse. Verreweg het
meeste is bekend over de celdeling in de, ook in
dit proefschrift bestudeerde, modelbacterie
Escherichia coli (een onschuldige darmbacterie
waarvan ook een ziekteverwekkende variant
bekend is, die regelmatig de krant haalt).
Samenvatting
KADER 1. De bacteriecel
De cel is de basiseenheid van al wat leeft. Iedere cel staat op zichzelf en is van andere cellen
gescheiden door een membraan, en soms een celwand. De bacterie Escherichia coli bevat twee
membranen met daartussenin een celwand. Een membraan bestaat uit een vetlaag die
ondoordringbaar is voor vloeistoffen en alles wat daarin is opgelost. Een membraan zorgt dus voor
de fysieke afscheiding van de buitenwereld. Om toch contact met de buitenwereld te hebben zitten
er in de membraan selectieve transportsystemen waardoor bijvoorbeeld voedingstoffen kunnen
worden opgenomen en afval kan worden uitgescheiden. De celwand is een rigide structuur die de
bacterie haar vorm geeft. Binnenin de bacteriecel bevindt zich de “nucleoide” die het
chromosoom, dus de genetische informatie (DNA) van de bacterie bevat. De nucleoide bevindt
zich in het cytoplasma (de celvloeistof) waarin ook de machinerie voor vrijwel alle processen in de
cel (zoals voedselverwerking en groei) is gehuisvest. Alle processen in de cel, zoals afbraak van
voedsel, of aanmaak van nieuw celmateriaal om te kunnen groeien, worden uitgevoerd en
gereguleerd door eiwitten, ook wel enzymen, genaamd. Deze eiwitten worden gemaakt op basis
van de genetische informatie op het DNA van de bacterie. Simpel gezegd kan ieder gen op het
DNA door de bacterie (inderdaad, middels eiwitten) vertaald worden in een eiwit dat vervolgens
een functie heeft. Bij alle processen in de cel zijn gespecialiseerde eiwitten betrokken.
Escherichia coli is een staafvormige bacterie,
die bestaat uit een omhulsel (twee membranen
en een celwand) gevuld met genetisch
materiaal, eiwitten, water, zout etc… (figuur 1,
kader). Als deze bacterie zich in een
voedselrijke omgeving bevindt kan zij zich
volvreten en daardoor groeien. Deze groei heeft
een grens: als de bacterie een bepaalde kritische
lengte/omvang heeft bereikt wordt het tijd om te
delen. De bacterie weet precies wanneer dit
tijdstip is aangebroken, maar biologen zijn er
nog niet achter hoe zij dit weet. Voordat de
bacterie zich gaat delen moeten er wel een paar
dingen gedaan zijn: zo moet er van het
genetisch materiaal een kopie gemaakt zijn, die
meegegeven kan worden aan de nieuwe
bacterie. Bovendien, omdat de bacterie zich
precies in het midden gaat delen, moeten de
twee DNA-kopieën netjes over de twee helften
van de bacteriecel verdeeld worden. Als dit
gedaan is, kan de deling plaatsvinden. Dit doet
de bacterie door zich in te snoeren en af te
splitsen, waardoor er twee bacteriecellen
ontstaan (in de literatuur “moeder- en
dochtercel” genoemd). Het insnoeringsproces
wordt beschouwd als de daadwerkelijke
celdeling (zie figuur 1).
De celdelingsring
Het delen van bacteriecellen ziet er in
het schema van figuur 1 eenvoudig uit, maar in
werkelijkheid is het een complex proces
waarvan wij nog maar weinig weten. Zo moet
de membraan die de cel omvat naar binnen
worden getrokken en moet de celwand die de
bacterie haar structuur verleent (het materiaal is
vergelijkbaar
met
dat
waarvan
een
67
Samenvatting
Figuur 1. A: Schematische weergave van het celdelingsproces in Escherichia coli. B: Escherichia coli in
verschillende stadia van groei door de microscoop bekeken. De pijlen wijzen naar cellen die aan het delen zijn
(midden) en net gedeelde cellen (linksboven). C: Cellen die geremd zijn in deling doordat één van de
celdelingseiwitten niet functioneert vormen lange, ongedeelde cellen (in het midden is een “oude” delingsplek te
zien). De cellen zijn aanmerkelijk langer dan die in figuur 1B. (foto’s: Tanneke den Blaauwen)
insectenpantser is gemaakt) naar binnen
groeien. Om dit te regelen gebruikt onze
modelbacterie Escherichia coli een “machine”
die uit negen verschillende eiwitten bestaat. Al
deze eiwitten zijn noodzakelijk voor een
ordentelijk verloop van de deling. Wanneer er
iets niet klopt aan één van deze negen eiwitten
geeft dit meestal aanleiding tot een blokkering
van de celdeling. Hierdoor gaan de bacteriën er
als lange slierten, filamenten, uitzien (en
uiteindelijk gaan ze dood, figuur 1C). Afgezien
van hun noodzakelijkheid voor celdeling, weten
we van de meeste van deze eiwitten niet wat
hun eigenlijke rol in het proces is. Wat we wel
weten, is dat al deze eiwitten in het midden van
de cel, op de plek van deling terecht moeten
komen om hun werk te doen. Hiervoor is het
celdelingseiwit FtsZ1 verantwoordelijk. FtsZ
vormt een ring (de FtsZ-ring) in het midden van
een cel die gaat delen, en alle andere
celdelingseiwitten gebruiken deze ring om hun
plaats van handelen te vinden (figuur 2). De
FtsZ-ring wordt gevormd door een paar duizend
afzonderlijke FtsZ moleculen die aan elkaar
gekoppeld zijn in een keten (zoals in een
schakelketting). Dat FtsZ moleculen een keten
kunnen vormen weten we door proeven met
gezuiverd FtsZ (FtsZ dat uit de cel is gehaald
waarbij alle andere eiwitten zijn verwijderd). In
de reageerbuis kan gezuiverd FtsZ ketens
vormen die onder de electronenmicroscoop te
zien zijn (figuur 3).
Voor het maken van deze ketens is energie
nodig. Nu heten ketens van identieke moleculen
ook wel polymeren, en het vormen van ketens
heet polymeriseren. Dat brengt ons bij het
eigenlijke onderwerp van dit proefschrift.
1
FtsZ staat voor Filamentation Temperature Sensitive
gene Z. Als een verandering in een bacteriegen leidt tot
“sliertgroei” (“filamentation”) bij hogere temperatuur
(temperature sensitive) krijgt het verantwoordelijke gen
de naam “fts”. FtsZ is dus gen “Z” dat bij een bepaalde
verandering geblokkeerde deling tot gevolg heeft.
Overigens: er zijn geen 26 “fts” genen, de letterkeuze is
enigszins willekeurig.
68
Polymerisatie van FtsZ
Dit proefschrift gaat vooral over de
hoeveelheid energie die voor polymerisatie van
FtsZ nodig is. Ongeveer tien jaar geleden werd
Samenvatting
Figuur 2. A: Escherichia coli cellen gezien door de microscoop. De licht ingesnoerde cellen zijn zich aan het delen
(beste voorbeeld linksboven). B: Dezelfde cellen als in A, maar in deze cellen wordt FtsZ met behulp van een
fluorescentietechniek belicht. FtsZ is nu zichtbaar in de cellen, en cellen die zich (gaan) delen bevatten nu een band
in het midden, de FtsZ ring. (foto’s: Tanneke den Blaauwen)
voor het eerst beschreven dat FtsZ ketens kan
vormen. Dit gebeurt zodra er aan een oplossing
van FtsZ (in een reageerbuis) energie wordt
toegevoegd in de vorm van GTP. GTP is een
energierijke verbinding, die door een molecuul
FtsZ kan worden gebonden en omgezet in een
minder energierijke verbinding, GDP2. Het
verschil in energie komt vrij en wordt gebruikt
om bepaalde reacties te laten verlopen. In dit
geval is dat het aan elkaar koppelen van FtsZ
moleculen (zie figuur 4). De ketens die door
FtsZ worden gevormd, en de manier waarop
FtsZ daarvoor energie gebruikt, lijken erg sterk
op de ketens die gevormd worden door het eiwit
tubuline. Dit eiwit komt niet voor in bacteriën,
maar wel in andere organismen, zoals
schimmels, planten en dieren. De ketens van
tubuline spelen een belangrijke rol in deze
organismen. Zij zorgen bijvoorbeeld voor het
uit elkaar trekken van DNA-kopieën als cellen
van deze organismen gaan delen. Omdat
tubuline al sinds de jaren zeventig in de
belangstelling van biologen en biochemici staat,
is over de ketenvorming van tubuline veel meer
bekend dan over de ketenvorming van FtsZ.
Deze kennis is onder andere bij de in dit
proefschrift beschreven experimenten gebruikt
om resultaten te verklaren, en modellen voor de
FtsZ ketenvorming op te stellen.
Figuur 3. FtsZ ketens, gezien door de electronenmicroscoop. De schaal is af te lezen aan het streepje
rechts onderin de foto. De lengte van het streepje komt
overeen met 0,0001 millimeter.
2
GTP en GDP zijn afkortingen voor guanosine-TRIfosfaat en guanosine-DI-fosfaat. De energie komt vrij bij
het afsplitsen van de derde fosfaat van de tri-fosfaat
groep, vandaar dat je van TRI naar DI gaat.
69
Samenvatting
Studies naar het contact tussen FtsZ
moleculen in de keten
Een grote doorbraak in het onderzoek naar
FtsZ en tubuline was de gelijktijdige
opheldering van de structuren van FtsZ en
tubuline3. Dit houdt in dat van (vrijwel) alle
atomen waaruit het eiwitmolecuul is
opgebouwd, de precieze plek is bepaald (denk
aan het Atomium in Brussel, maar dan met
tienduizenden bollen). In de structuur van FtsZ
viel bijvoorbeeld te zien hoe het energierijke
molecuul GTP aan het eiwit wordt gebonden.
De structuren van FtsZ en tubuline werden
vervolgens gebruikt om modellen te maken van
de ketens die door FtsZ en tubuline worden
gevormd. Dit gaf belangrijke aanwijzingen over
het gebruik van de energie van GTP bij het
vormen van ketens. Het leek erop dat voor de
omzetting van GTP twee individuele FtsZ
moleculen nodig waren, die zo op elkaar
passen, dat op de contactplaats precies een GTP
en een metaalatoom4 passen (dit metaalatoom is
nodig voor de omzetting van GTP en zit in de
praktijk al aan GTP gebonden) (figuur 4). Dit
betekent dat de “active site”, de plaats van
activiteit van het eiwit, in feite door twee
eiwitmoleculen
wordt gevormd. In dit
proefschrift wordt biochemisch bewijs voor dit
model beschreven (hoofdstuk 4 en 5).
Door de structuur van één van de twee
contactvlakken op een FtsZ molecuul te
veranderen kon de rol van dit contactoppervlak
bestudeerd worden. Een verandering van het
contactoppervlak remde de omzetting van GTP
sterk (figuur 4C). Vaak zorgde de verandering
van het contactoppervlak er bovendien voor dat
Figuur 4. Schematische weergave van FtsZ
ketenvorming en het FtsZ-FtsZ contact.
A: Schematische weergave van een FtsZ molecuul,
GTP en GDP (let op het verschil in grijswaarden! Het
lichtgrijze driehoekje symboliseert een metaalatoom).
Eén FtsZ molecuul bevat twee contactvlakken voor
GTP en GDP. GTP en GDP worden door het FtsZ
molecuul gebonden op contactvlak 2. Contactvlak 1
kan geen GTP of GDP binden, maar kan er wel contact
mee maken als GTP of GDP op een ander FtsZ
molecuul op zijn plaats wordt gehouden. Het past
precies, zoals hier schematisch is weergegeven!
B: Ketenvorming. FtsZ moleculen met gebonden GTP
maken contact via contactvlak 1. Dit zorgt voor een
stabiele verbinding tussen de FtsZ moleculen, waarbij
het GTP op het nu complete contactvlak wordt
omgezet naar GDP. Deze reactie kan doorgaan zolang
er GTP is, dus er kunnen hele lange ketens gevormd
worden.
C: Als contactoppervlak 1 veranderd is, passen de FtsZ
moleculen niet meer goed op elkaar. GTP wordt niet
meer omgezet en ketens worden niet meer gevormd.
3
Dit is geen vanzelfsprekend iets in de biologie: van veel
eiwitten is de structuur nog onbekend.
70
4
Het gaat hier eigenlijk om metaalionen. Voor het gemak
van de lezer spreek ik over metaalatomen.
Samenvatting
er geen FtsZ ketens meer gevormd konden
worden. Veranderingen op één hele belangrijke
plek op het contactvlak hadden drastische,
onverwachte gevolgen. Waar FtsZ normaliter
wordt gezuiverd uit de cel met aan
contactoppervlak 2 een gebonden GDP
molecuul, bleek er na zuivering nu GTP
aanwezig te zijn. Na toevoeging van
metaalatomen bleken deze veranderde FtsZ
moleculen ketens te vormen. Omdat alleen
metaalatomen moesten worden toegevoegd om
een goed contact tussen twee FtsZ moleculen te
vormen, lijkt het erop dat de verandering de
normale metaalbinding van FtsZ verstoort (dit
is niet direct aangetoond). Dit heeft tot gevolg
dat het energierijke GTP niet efficiënt wordt
omgezet. Wanneer metaalatomen in grote
hoeveelheden worden toegevoegd, wordt het
contactoppervlak weer hersteld, en vormen zich
ketens, al blijft het omzetten van GTP sterk
geremd.
Deze proeven toonden aan dat voor het
omzetten van één molecuul GTP ten minste
twee moleculen FtsZ nodig zijn, en dat het
contactoppervlak tussen deze twee FtsZ
moleculen zorgt voor een correcte binding van
GTP en een metaalatoom.
Studies naar de energieomzetting in de FtsZ
keten
Zoals gezegd is voor het vormen van FtsZ
ketens in de reageerbuis energie in de vorm van
GTP nodig. Deze energie wordt vervolgens
gebruikt. Dit heeft tot gevolg dat op een
gegeven moment al het GTP in de reageerbuis
op is. Op ditzelfde moment, zo is bekend uit
eerder werk, vallen de ketens van FtsZ weer uit
elkaar. Er is dus een constante aanvoer van
energie nodig om de ketens in stand te houden.
Er zijn twee verklaringen mogelijk voor dit
energiegebruik door FtsZ ketens (figuur 5):
GTP wordt in de keten omgewisseld en de
keten blijft bestaan. GTP wordt in de keten
omgezet waarna het gevormde GDP
onmiddelijk wordt uitgewisseld voor vers GTP.
GTP wordt buiten de keten omgewisseld.
Een keten met FtsZ-GDP is minder stabiel, dus
na omzetting van alle GTP valt de keten uit
elkaar. De losse FtsZ componenten binden vers
GTP en vormen een nieuwe keten. Dit laatste
model gaat dus uit van een constante vorming
en afbraak van ketens.
Om onderscheid tussen deze twee
verklaringen te maken is een methode
ontwikkeld die het mogelijk maakt hele kleine
hoeveelheden
GTP
te
gebruiken
in
experimenten (hoofdstuk 2). Normaliter zouden
dergelijke hoeveelheden GTP door het omzetten
van het GTP binnen 10 seconden op zijn, zodat
het onmogelijk is om de FtsZ ketens te
bestuderen (ze vallen immers direct uit elkaar).
De methode maakt het mogelijk om als het
ware in “slow-motion” naar ketenvorming en –
afbraak te kijken. De slow-motion techniek
werd gebruikt om te kijken wat er gebeurt als je
op het moment dat de GTP bijna op is, een
remmende stof5 toevoegt die op GTP lijkt
(hoofdstuk 3). Deze remmer lijkt sprekend op
GTP, maar er zijn twee belangrijke verschillen:
(1) De remmer wordt niet omgezet door FtsZ,
en (2) FtsZ vormt geen ketens als de remmer
wordt toegevoegd. Het bleek dat ketens, die op
het punt stonden uit elkaar te vallen omdat het
GTP op raakte, bleven bestaan als de remmer
werd toegevoegd. Andere proeven lieten zien
dat het GTP in de ketens weliswaar heel snel
werd omgezet naar GDP, maar dat dit GDP niet
werd uitgewisseld voor de toegevoegde
remmer.
Deze resultaten wijzen sterk in de richting
van de tweede van de hierboven beschreven
verklaringen. Als een FtsZ molecuul vastklikt
aan de keten wordt GTP op het
contactoppervlak omgezet, zoals hierboven al is
beschreven. Aan een eind van de keten zal dus
altijd een FtsZ molecuul met GTP zitten. Dit
blijft zo zolang er voldoende aanvoer van FtsZ
moleculen met vers GTP is. Als dit niet zo is,
valt op een gegeven moment de keten uit elkaar,
behalve wanneer er aan het eind van de keten
een FtsZ molecuul met de remmer zit. Omdat
de remmer niet wordt afgebroken blijft de keten
5
De remmer is de stof “GTP-γ-S” uit de titel van
hoofdstuk 3.
71
Samenvatting
Figuur 5. De twee modellen
voor energiegebruik door
FtsZ ketens. Model 1 is
“statisch”,
model
2
“dynamisch”. FtsZ moleculen
met gebonden GTP worden
als grijze rondjes met een “T”
weergegeven, FtsZ moleculen
met gebonden GDP als open
rondjes met een “D”.
intact. Dit model lijkt heel erg sterk op het
model dat is ontwikkeld voor de vorming van
ketens van tubuline, het eiwit dat lijkt op FtsZ.
Tot slot
Het onderzoek dat beschreven wordt in dit
proefschrift draagt bij aan een beter begrip over
de manier waarop FtsZ ketens vormen en weer
uit elkaar vallen. Het vormt op zichzelf maar
een heel klein bouwsteentje in de
voortschrijdende kennis over de celdeling in
bacteriën. Wetenschap gaat nu eenmaal meestal
met maar hele kleine stapjes vooruit. Grote
sprongen zijn zeldzaam. Aan de ketenvorming
valt nog heel wat werk te doen. Het is
bijvoorbeeld nog steeds niet duidelijk welk van
de processen (aan elkaar klikken, GTP omzetten
enz.) bepalend is voor de snelheid van de
reacties die optreden. Nog belangrijker is het
om de uit de reageerbuis verkregen inzichten
72
naar de bacteriecel te vertalen. De precieze rol
van de FtsZ ring is nog grotendeels onbekend,
en ook de invloed van andere celdelingseiwitten
op de stabiliteit van FtsZ ketens is pas sinds de
laatste jaren onderwerp van studie. Vaak wordt
gesuggereerd dat de FtsZ ketens in staat zijn om
kracht op het omhulsel van de cel uit te
oefenen, waardoor de cellen gaan insnoeren.
Tot nu toe is er geen enkel bewijs voor deze
theorie aangedragen. Ook de rol van de andere
celdelingseiwitten die essentieel zijn voor het
verloop van deling is nog grotendeels
onbekend.
Het uiteindelijke doel van al dit onderzoek is
het begrijpen van het delingsproces van
bacteriën. Inzicht in celdeling biedt ons
bovendien de mogelijkheid om nieuwe
medicijnen te ontwikkelen waarmee bacteriën
bestreden kunnen worden waarvan we liever
niet hebben dat ze zich in ons lichaam
vermenigvuldigen.