BELANG VAN HET USUTU VIRUS IN EUROPA

UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2012 -2013
BELANG VAN HET USUTU VIRUS IN EUROPA
door
Rosanne LAMMERS
Promotoren: Prof. dr. Kristien van Reeth
Dr. Karen van der Meulen
Literatuurstudie in het kader
van de Masterproef
© 2013 Rosanne Lammers
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of
volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk
uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor
enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig
vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2012 -2013
BELANG VAN HET USUTU VIRUS IN EUROPA
door
Rosanne LAMMERS
Promotoren: Prof. dr. Kristien van Reeth
Dr. Karen van der Meulen
Literatuurstudie in het kader
van de Masterproef
© 2013 Rosanne Lammers
VOORWOORD
Na het eerste gesprek met mijn promotor, professor van Reeth, stelde zij mij voor om als onderwerp
voor mijn literatuurstudie ‘het Usutu virus’ te kiezen. Aangezien ik hier afgelopen maanden het één en
ander over had gehoord leek mij dit een interessante keuze. Al snel bleek dat dit geen gemakkelijk
onderwerp was vanwege de relatieve onbekendheid van dit virus. Dit zorgde er echter niet voor dat
mijn interesse in het onderwerp verminderde.
Ik wil dan ook prof. van Reeth bij deze hartelijk bedanken voor haar moeite, aanwijzingen, tips en fijne
samenwerking. Zonder deze hulp was het niet gelukt!
Ook mijn tweede promotor, dr. Karen van der Meulen wil ik bedanken voor het doornemen van deze
literatuurstudie.
Verder wil ik mijn ouders, Toni en Anneke bedanken voor hun steun. Zij proberen altijd in alle
opzichten te helpen. Dit zowel financieel, mentaal als inhoudelijk. Ook wil ik mijn zus Marte vernoemen
aangezien zij er ook altijd voor mij is en de passie voor diergeneeskunde met mij deelt. Als laatste
maar natuurlijk niet de minste wil ik mijn vriend Baltus bedanken voor het verbeteren van deze
literatuurstudie en alle positieve afleiding.
INHOUDSOPGAVE
SAMENVATTING................................................................................................................................ 1
INLEIDING.......................................................................................................................................... 2
LITERATUURSTUDIE ........................................................................................................................ 3
1. Virusbeschrijving ......................................................................................................................... 3
1.1. Flaviviridae ........................................................................................................................... 3
1.2. Het Usutu virus ..................................................................................................................... 4
1.3. Het West Nijl virus ................................................................................................................ 4
2. Epidemiologie ............................................................................................................................. 5
2.1. Voorkomen in Afrika ............................................................................................................. 5
2.2. Voorkomen in Europa ........................................................................................................... 5
3. Pathogenese en symptomen ....................................................................................................... 7
3.1. De mug als biologische vector .............................................................................................. 7
3.2. Wilde vogels ......................................................................................................................... 9
3.3. Experimentele infecties ....................................................................................................... 10
4. De mens als (accidentele) gastheer........................................................................................... 10
5. Diagnostiek ............................................................................................................................... 12
5.1. Virusdetectie ...................................................................................................................... 12
5.1.1. RT-PCR....................................................................................................................... 12
5.1.2. Immunohistochemie ..................................................................................................... 12
5.1.3. In situ hybridisatie ........................................................................................................ 13
5.2. Serologie ............................................................................................................................ 13
5.2.1. Hemagglutinatie inhibitie .............................................................................................. 13
5.2.2. IgM capture ELISA ....................................................................................................... 13
BESPREKING .................................................................................................................................. 14
REFERENTIELIJST .......................................................................................................................... 16
SAMENVATTING
Het Usutu virus is een arthropod-borne, enkelstrengig RNA virus dat behoort tot het Japanse
encefalitis complex, in het genus Flavivirus en de familie Flaviviridae. Virussen die behoren tot dit
Japanse encefalitis serocomplex hebben grote antigenische overeenkomsten.
Dit van oorsprong Afrikaanse virus werd in 1996 voor het eerst gesignaleerd in Europa, in Italië.
Sindsdien heeft dit virus zich verspreid over verschillende Europese landen en hebben vooral merels
hier de nadelige gevolgen van ondervonden. Waarschijnlijk is het Usutu virus door trekvogels vanuit
Afrika naar Italië gebracht en heeft het zich vanuit Italië verspreid over verschillende Europese landen.
Het Usutu virus, dat overgedragen wordt via bloedzuigende muggen, heeft als voornaamste en
gevoeligste eindgastheer wilde vogels, waarbij het zenuwsymptomen en peracute sterfte veroorzaakt.
Bij de mens zijn tot nu toe twee Europese gevallen bekend waarbij het Usutu virus zenuwsymptomen
heeft veroorzaakt bij twee immunosupressieve patiënten.
Tot nu toe lijkt het er niet op dat het Usutu virus een bedreiging voor de gezonde mens vormt. De
betekenis van milde of subklinische infecties bij de mens moet beter onderzocht worden.
Bij de detectie van het Usutu virus kan gebruik worden gemaakt van testen om het virus zelf aan te
tonen of van serologische testen waarbij er antistoffen aangetoond kunnen worden. De voorkeur gaat
uit naar het aantonen van het virus zelf maar dit is lastig. Het grote probleem met serologische testen
is dat er tot nu toe geen goed onderscheid gemaakt kan worden tussen virussen van het Japanse
encefalitis serocomplex.
Door de onbekendheid van het Usutu virus en de moeilijke detectie is het waarschijnlijk dat de
distributie van het Usutu virus vele malen groter is dan de gerapporteerde circulatie.
Surveillance- en controleprogramma’s zijn nodig zodat West-Europese landen voorbereid zijn op
mogelijke infecties met flavivirussen en deze beter kunnen bestrijden. Dit is een diagnostisch
probleem.
INLEIDING
Het Usutu virus is een Flavivirus dat nauw verwant is aan het West Nijl virus en werd in 1959 ontdekt
in Zuid-Afrika door isolatie uit een mug. Dit virus kreeg in eerste instantie weinig aandacht omdat het
geen ernstige ziekte veroorzaakte bij zowel mens als dier.
Op dit moment staat het Usutu virus in de belangstelling van veel vogelliefhebbers en vogelkenners.
Dit vanwege de grote merelsterfte die in verschillende Europese landen door dit virus wordt
veroorzaakt. Dit relatief onbekende virus vormt een potentieel gevaar voor wilde vogels in België en
Nederland.
Over het Usutu virus is weinig bekend. In deze literatuurstudie wordt er getracht een beschrijving te
geven van het Usutu virus en een antwoord te geven op verschillende vragen als: waar komt het virus
voor? Hoe is dit virus in Europa terecht gekomen en is dit virus een bedreiging voor de mens?
2
LITERATUURSTUDIE
1. Virusbeschrijving
1.1. Flaviviridae
Het Usutu virus behoort tot de familie Flaviviridae. Dit is een grote familie van virussen die
verantwoordelijk zijn voor verschillende ziekten en sterfte bij mens en dier. Deze familie bestaat uit
drie genera, het genus Flavivirus (van het Latijnse flavus, wat ‘geel’ betekent), Pestivirus en
Hepacivirus. Viruspartikels behorende tot de Flaviviridae zijn klein, gemiddeld 50 nm in diameter. Ze
bevatten een elektronendense kern van ongeveer 30 nm, omgeven door een lipiden envelop.
De organisatie van het genoom is gelijk voor alle genera. Virale proteïnen worden geproduceerd als
deel van een enkel, lang, polyproteïne van meer dan 3000 aminozuren die worden gesplitst door een
combinatie van gastheer- en virale proteasen.
De Flaviviridae vertonen verschillende biologische eigenschappen en tussen de genera zijn er geen
serologische kruisreacties.
Het Flavivirus genus bevat meer dan zeventig virussen. Velen hiervan zijn arthropod-borne, humane
pathogenen. Wereldwijde belangrijke en bekende virussen uit dit genus zijn onder andere het Dengue
virus, het Japanse encefalitis virus, het West Nijl virus en het Gele koorts virus. Ook het Usutu virus
behoort tot dit genus (Lindenbach et al, 2007).
Flavivirussen kunnen direct worden overgedragen van vertebraat naar vertebraat of via vectoren. Het
virus wordt uitgescheiden via feces, urine en speeksel. Overdracht vindt plaats door voedsel en drank
opname, onderling contact, of via colostrum. Ook verticale transmissie naar de volgende generatie
komt voor. Vectoren zijn vooral hematofage muggen of teken (Gubler et al., 2007).
Bij het genus Hepacivirus is het bekendste virus het Hepatitis C virus bij de mens. Dit virus
veroorzaakt een ontsteking van de lever en wordt overgedragen via bloedcontact.
Pestivirussen zijn dierlijke pathogenen die grote economische gevolgen hebben voor de vee-industrie.
Onder andere het bovine virale diarree virus (BVDV) en border disease virus (BDV) behoren tot het
genus Pestivirus.
De replicatiecyclus van de Flaviviridae wordt voorgesteld in Figuur 1 en verloopt als volgt. Virions
bezitten een envelop die een nucleocapside omgeven. Het nucleocapside bevat een positief- en
enkelstrengig RNA genoom. Binding en opname door een cel worden vermoedelijk veroorzaakt door
receptor-gemedieerde endocytose via cellulaire receptoren die specifiek zijn voor virale envelop
proteïnen. Een lage pH induceert fusie van de virion envelop met cellulaire membranen. Vervolgens
komt het RNA vrij in het cytoplasma.
Het virale genoom heeft meerdere functies. Zo dient het als messenger RNA (mRNA) voor de
translatie van virale eiwitten, als template tijdens RNA replicatie en om nieuwe viruspartikels van
genetisch materiaal te voorzien.
Nieuw ontstane virions worden door ‘budding’ omgeven door een intracellulaire membraan
component, waarschijnlijk in het endoplasmatisch reticulum (ER). Vervolgens worden de virions
getransporteerd door de cel heen en komen vrij aan het celoppervlak (Lindenbach et al., 2007).
3
Figuur 1: replicatiecylus Flaviviridae (uit Lindenbach et al., 2007).
1.2. Het Usutu virus
Het Usutu virus is een arthropod-borne, enkelstrengig RNA virus dat behoort tot het Japanse
encefalitis complex, in het genus Flavivirus en de familie Flaviviridae (Becker et al., 2012). Virussen
die behoren tot dit Japanse encefalitis serocomplex hebben grote antigenische overeenkomsten
(Hobson-Peters, 2012). Als vector voor het Usutu virus fungeert de bloedzuigende mug. Vogels zijn de
primaire eindgastheer maar andere zoogdieren en ook de mens kunnen geïnfecteerd worden als
incidentele gastheer (Vázquez et al., 2011). Het Usutu virus was relatief onbekend en werd tot enkele
jaren geleden onbelangrijk geacht. Maar hier kwam verandering in toen dit virus de oorzaak bleek te
zijn van epidemische vogelsterfte in verschillende Europese landen (Bakonyi et al., 2004; Horton et
al., 2013).
1.3. Het West Nijl virus
Het West Nijl virus is fylogenetisch en serologisch sterk verwant aan het Usutu virus. Beide behoren
tot het Japanse encefalitis serocomplex. Zowel bij het West Nijl virus als bij het Usutu virus is de mug
de belangrijkste vector en zijn vogels de voornaamste eindgastheer (Becker et al., 2012).
Het West Nijl virus wordt gezien als belangrijk zoönotisch pathogeen wat ziekte en sterfte kan
veroorzaken bij mensen, paarden en vogels. Op dit moment is het West Nijl virus het meest
verspreide arbovirus ter wereld (Del Amo et al., 2013).
Vogels geïnfecteerd met het West Nijl virus vertonen over het algemeen weinig symptomen maar zijn
hoog viremisch. Bij de eindgastheer worden als symptomen koorts, encefalitis en meningitis gezien
(Suthar et al., 2013).
4
De detectiemethoden voor het West Nijl virus het Usutu virus komen overeen. Vaak worden controles
op deze virussen gecombineerd door middel van serologische testen. De vraag is echter of er met
serologie een goed specifiek onderscheid gemaakt kan worden tussen de virussen van het Japanse
encefalitis serocomplex. Er vinden serologische kruisreacties plaats waardoor diagnose van deze
virussen wordt bemoeilijkt (Hobson-Peters, 2012).
2. Epidemiologie
2.1. Voorkomen in Afrika
In januari 1959 werd in Natal, Zuid-Afrika, het Usutu virus ontdekt door isolatie uit een vrouwelijke,
adulte mug (Culex neavei). Het virus werd vernoemd naar de Usutu rivier in Swaziland.
Decennia daaropvolgend werd het virus sporadisch geïsoleerd uit verschillende muggen- en
vogelsoorten in verschillende Afrikaanse landen zoals Senegal, de Centraal-Afrikaanse Republiek,
Nigeria, Uganda, Burkina Faso, Ivoorkust en Marokko. Antistoffen tegen het virus werden gevonden
bij wilde vogels in Marokko.
Het is opvallend dat er maar in een beperkt aantal Afrikaanse landen controleprogramma’s op
insecten zijn uitgevoerd. In veel landen werd niet naar het virus gezocht en hebben dus geen isolaties
plaatsgevonden.
Tot 2003 werd het virus maar zeven keer aangetoond en met minimale infectiepercentages (aantal
Usutu virus isolaties/aantal muggen verzameld per species) van 0,06 - 1,35%. Hierdoor werd weinig
aandacht aan de virusisolaties besteed.
Vanaf 2003 werd in Senegal een plotse toename van het aantal isolaties vastgesteld. Tussen oktober
en december werd het virus 141 maal aangetoond. Ook het minimale infectiepercentage was
beduidend hoger (2,31%). De reden voor dit aantal hogere isolaties blijft onduidelijk maar het is
opmerkelijk dat, in dezelfde periode, het Usutu virus in Ivoorkust, Burkina Faso en in verschillende
Europese landen werd geïsoleerd (Nikolay et al., 2011).
In Afrika zijn bij de mens tot nu toe slechts twee isolaties bekend. Over deze gevallen is weinig
bekend.
Het virus is in Afrika nooit geassocieerd met hevige of fatale ziekten bij mens of dier en is tot 1996
buiten Afrika nooit gesignaleerd (Weissenböck et al., 2002; Nikolay et al., 2011; Weissenböck et al.,
2013).
2.2. Voorkomen in Europa
Waarschijnlijk werd het Usutu virus voor het eerst in Europa geïntroduceerd in 1996 in Italië. Dit kwam
recent aan het licht toen bleek dat er in 1996, in Toscane (Italië), een aanzienlijke vogelsterfte werd
gerapporteerd (Fig. 2). Voornamelijk merels (Turdus merula) werden onderzocht. Op autopsie werden
necrotische organen gevonden. Bacteriologisch, virologisch en toxicologische onderzoeken waren
negatief. Weefsels werden in formaline en paraffine opgeslagen. Deze bevindingen werden alleen
gemeld in een lokaal Italiaans veterinair tijdschrift en kregen weinig aandacht. Na de detectie van het
Usutu virus in andere Europese landen werden recent de opgeslagen weefsels opnieuw onderzocht.
Hierbij werd via RT-PCR het Usutu virus gedetecteerd. Via sequenering werd grote analogie
gevonden met het virus in Oostenrijk. Voor zover bekend was dit de eerste keer dat het Afikaanse
Flavivirus zich liet zien in Europa (Weissenböck et al., 2013).
5
Figuur 2: Europese landen waar het Usutu virus en/of antistoffen werden gerapporteerd in muggen
en/of wilde vogels, samen met het jaar waarin het virus en/of antistoffen voor het eerst werden
aangetoond (naar Vázquez et al, 2011).
Vanaf begin augustus tot midden september 2001 werd in de omgeving van Wenen, Oostenrijk, een
aanzienlijke sterfte van merels gezien. Ook werden duidelijk zieke merels gesignaleerd met tekenen
van apathie en een slecht verenkleed. In de dierentuin van Wenen stierven in augustus 2001 in vijf
dagen tijd vijf laplanduilen (Strix nebulosa). Vele dode boerenzwaluwen (Hirundo rustica) werden 200
km ten westen van Wenen gevonden. Met behulp van immunohistochemie en RT-PCR werd bij de
dode vogels het Usutu virus als oorzakelijk agens aangetoond (Weissenböck et al., 2002).
In het daarop volgende jaar werd in dezelfde regio opnieuw een uitbraak gezien waarbij voornamelijk
merels werden getroffen. Het virus kon de winter in Oostenrijk overleven en wist zich aan te passen
aan de lokale vogel-mug levenscyclus. Een surveillance programma werd in Oostenrijk
geïntroduceerd om het voorkomen en verspreiding van de infectie te monitoren. Seizoensgebonden
Usutu geïnduceerde encefalitis uitbraken bij de wilde vogelpopulatie werden geobserveerd in vijf
achtereenvolgende jaren in het oosten van Oostenrijk. Het grootste aantal gevallen werd
gerapporteerd in 2003. Sindsdien is het aantal gevallen opmerkelijk verminderd. Tegelijkertijd nam het
aantal vogels dat antistoffen tegen het virus bezat significant toe (<10 % in 2003 en 2004, >50% in
2005 en 2006) (Weissenböck et al., 2003; Bakonyi et al., 2007; Meister et al., 2008).
Naar aanleiding van het voorkomen van het virus in Oostenrijk werden ook in Hongarije
onderzoeksprogramma’s opgesteld. Tussen 2003 en 2006 werden dode vogels, behorende tot 52
verschillende species getest op een Usutu virus infectie. In de eerste twee jaren waren alle geteste
vogels negatief. Echter, in augustus 2005 werd bij een in Boedapest gevonden dode merel, het virus
gedetecteerd via RT-PCR en sequenering. In juli en augustus 2006 testen opnieuw zes merels positief
voor het Usutu virus. Ook deze vogels werden in Boedapest gevonden. De genomische structuur van
6
het circulerende virus uit Oostenrijk in 2001 en de genomische structuur van het virus in Hongarije
bleken voor 99,9% identiek te zijn (Bakonyi et al., 2007).
Tussen 2003 en 2006 werd in Spanje een onderzoek naar het voorkomen van antistoffen tegen het
West Nijl virus bij vogels uitgevoerd. Hier werden ook neutraliserende antistoffen tegen het Usutu virus
gevonden (Figuerola et al., 2007).
In 2006 werd voor het eerst in Catalonië, Spanje, het Usutu virus door middel van RT-PCR in een
zwerm van Culex pipiens muggen aangetoond. Deze variant vertoonde een grotere homologie met de
Afrikaanse isolaten dan met de centraal Europese. Ook in 2009 werd in het zuiden van Spanje het
Usutu virus gedetecteerd in zwermen van Culex perexiguus muggen (Vázquez et al., 2011).
In de daaropvolgende jaren werd het virus aangetoond bij dode vogels en/of bij muggen in Zwitserland
(2006), Italië (2009), Duitsland (2010) en Tsjechië (2011).
Ook werden antistoffen gevonden in het bloed van wilde vogels in het Verenigd Koninkrijk (2002),
Duitsland (2002-2005), Tsjechië (2005), Polen (2006), Zwitserland (2006) en Italië (2007) (Fig. 2). In
het Verenigd Koninkrijk en in Polen zijn antistoffen tegen het Usutu virus aangetoond zonder dat het
virus zelf daadwerkelijk aangetoond werd (Vázquez et al., 2011).
In België werden vanaf 2010 controleprogramma`s opgezet om het West Nijl Virus en het Usutu virus
te detecteren bij wilde vogels. Tot op heden zijn er nog geen positieve gevallen waargenomen
(www.natuurbericht.be, 2012; www.coda-cerva.be, 2012).
In oktober 2012 was het Usutu virus opgerukt tot aan de grens tussen Duitsland en Nederland. Het
leek dus een kwestie van tijd eer het virus ook in Nederland gedetecteerd zou worden.
Ruim zeventig dode vogels, die het best voldeden aan de symptomen die het virus veroorzaakt,
werden door de Nederlandse vogelbescherming en het DWHC (Dutch Wildlife Health Centre)
onderzocht. Bij geen van deze vogels (merels en zanglijsters) werd het Usutu virus aangetroffen.
Tot op heden zijn er dus geen aanwijzingen gevonden voor aanwezigheid van het virus in Nederland.
De verwachting is dat het virus Nederland zal bereiken. In het voorjaar van 2013, als het
muggenseizoen aanvangt, zal er extra gecontroleerd worden op het virus (www.vogelbescherming.nl,
2012; www.dwhc.nl, 2012).
In andere continenten behalve Afrika en Europa werd het Usutu virus niet gerapporteerd.
3. Pathogenese en symptomen
Gevoelige gastheren voor het Usutu virus zijn de mug, wilde vogels en occasioneel de mens.
In Italië werden ook bij paarden en kippen neutraliserende antistoffen tegen het Usutu virus gevonden.
Bij deze dieren werd er echter geen ziekte gezien (Vázquez et al., 2011).
3.1. De mug als biologische vector
Het Usutu virus wordt voornamelijk overgedragen via vectoren. Vectoren van het Usutu virus zijn
hematofage muggen. Dit zijn muggen van de genera Culex, Coquillettidia, Mansonia, Aedes en
Culiseta. De belangrijkste vector voor het Usutu virus is de Culex mug. Muggen van dit genus komen
wereldwijd voor. Vaak leven de muggen in de buurt van water aangezien de larven hierin opgroeien.
Het genus Culex bevat voornamelijk ornithofiele species maar vele species hebben een groot
gastherenspectrum. Zo voeden vele Culex muggen zich niet alleen op vogels maar ook op amfibieën,
reptielen, de mens en andere zoogdieren. De Culex muggen staan bekend als vectoren van
verschillende arbovirussen zoals het West Nijl virus of het Gele-koortsvirus. De vrouwelijke muggen
bijten ’s nachts en bevinden zich vooral in de omgeving van vogels en hun broedplaatsen (Nikolay et
al., 2011).
De mug heeft de meeste kans om geïnfecteerd te raken wanneer er een grote viremie bij de gastheer
7
aanwezig is. Deze gastheer is zo goed als altijd een wilde vogel. Deze infectiecyclus wordt in Figuur 3
weergegeven. De bloedzuigende muggen worden geïnfecteerd met het virus bij opname van een
bloedmaal bij een wilde vogel. Het virus vermeerdert en verspreidt zich in de mug. Ook de
speekselklieren worden geïnfecteerd. Hierdoor kan bij opname van een volgend bloedmaal een
volgend vertebraat individu geïnfecteerd worden. Dit zijn in de meeste gevallen opnieuw vogels.
Incidenteel kunnen gastheren zoals de mens of het paard geïnfecteerd worden (Gubler et al., 2007).
Figuur 3: Infectiecyclus van het Usutu virus (uit www.mayoclinic.com, 2012).
De tijd tussen infectie van een mug via een viremische vertebraat gastheer tot wanneer de
speekselklieren van de mug geïnfecteerd zijn wordt de ‘excentrieke incubatie periode’ genoemd (Fig.
4). Deze periode duurt acht tot veertien dagen, afhankelijk van de omgevingstemperatuur, de exacte
virus stam en de soort mug (Gubler et al., 2007).
8
Figuur 4: Voedings- en transmissie cyclus van mosquito-borne flavivirussen (uit Gubler et al., 2007).
Het is niet bekend welke symptomen het Usutu virus mogelijk veroorzaakt bij de mug. Voor het
overleven van het virus is het van belang dat de vector zelf niet (ernstig) ziek wordt wanneer deze
besmet is met het virus. Anders zal het overbrengen van het virus naar een nieuwe gastheer niet
frequent genoeg plaatsvinden.
3.2. Wilde vogels
In Europa werd het Usutu virus ontdekt doordat er een grote vogelsterfte bij wilde vogels werd
gesignaleerd. De meest gevoelige vogelsoorten zijn zangvogels (Passeriformen) en uilen
(Stringiformen). Sterfte werd vooral gezien bij de merel (Turdus merula). Maar ook bij andere
vogelsoorten zoals de laplanduil (Strix nebulosa), pimpelmees (Parus coeruleus), huismus (Passer
domesticus), koolmees (Parus major), boomklever (Sitta europaea), roodborst (Erithacus rubecula) en
de zanglijster (Turdus philomeus) (Nikolay et al., 2011).
Vogels die geïnfecteerd waren met het Usutu virus zagen er vaak verzwakt uit. Ze hadden een slecht
verenkleed en een slechte nutritionele status. Ook vertoonden de vogels apathie en incoördinatie
waardoor ze niet konden vliegen. Na het vertonen van deze symptomen werd peracute dood gezien
(Steinmetz et al., 2011; Becker et al., 2012). Op autopsie werden hepatosplenomegalie, leverstuwing,
een vergrote galblaas, necrotische veranderingen van lever, milt en hart, vergrote en verkleurde
nieren, hyperemische meningen en hersenen en neuronale necrose gezien (Nikolay et al., 2011;
Savini et al., 2011).
De reden waarom vogels, met merels in het bijzonder, zo gevoelig zijn voor het Usutu virus is lastig te
achterhalen. Er zijn meerdere theorieën die de grote merelsterfte zoude kunnen verklaren.
De merel als gastheer is extreem gevoelig voor het Usutu virus;
De merel als gastheer is naïef in nieuwe epidemische zones, dit betekent dat er geen
immuniteit tegen het virus aanwezig is bij de merel en deze dus extreem gevoelig is
(Savini et al., 2011).
9
Het is belangrijk dat er uitgemaakt wordt of merels feitelijk een hogere gevoeligheid hebben voor het
virus of dat er andere verklaringen mogelijk zijn. Experimentele infecties bij wilde vogels zouden meer
duidelijkheid kunnen geven.
3.3. Experimentele infecties
Experimentele infecties met het Usutu virus werden voor zover bekend enkel uitgevoerd bij muizen,
kippen en ganzen.
Intraperitoneale inoculatie van het Usutu virus bij één week oude SPF (specified pathogen free)
muizen leidde tot infectie van het centraal zenuwstelsel. Klinische tekenen zoals depressie,
desoriëntatie, paraplegie, paralyse en coma werden gezien bij 40% van de muizen. Maar dit enkel bij
dieren die bij inoculatie niet ouder waren dan een week (Weissenböck et al., 2004).
Bij een volgend experiment werd de pathogeniciteit van het Usutu virus op kippen (Gallus domesticus)
getest. Tien kippen van twee weken oud werden intraveneus geïnjecteerd met het Usutu virus. Drie
kippen werden in contact gebracht met de geïnjecteerde kippen. Op autopsie werd bij alle
geïnjecteerde kippen een splenomegalie gevonden. Histopathologisch werden er bij de meeste dieren
folliculaire infiltraties in de lever gezien en bij één kip een milde encefalitis. Bij zes van de tien was RTPCR op inwendige organen positief terwijl immunohistochemie negatief was bij alle dieren. Bij drie
kippen werd virus RNA aangetoond in cloacale en faryngeale swabs, bij maar twee kippen werd een
viremie gedetecteerd en maar één van de geïnoculeerde dieren ontwikkelde een antistoffenrespons.
Dieren die in contact gehouden werden met de geïnoculeerde dieren ontwikkelden geen specifieke
antistoffen tegen het virus. Klinische tekenen werden niet gezien bij zowel de geïnjecteerde als de in
contact dieren.
Deze gegevens suggereren dat kippen niet gevoelig zijn voor het ontwikkelen van klinische ziekte na
Usutu virus infectie (Chvala et al., 2005).
Bij elf gedomesticeerde ganzen (Anser anser f. domestica) van twee weken oud werd een
intramusculaire injectie met het Usutu virus toegediend. Een groep van vijf ganzen werd in contact met
de geïnjecteerde dieren gebracht. In organen van de geïnjecteerde ganzen werd bij de meerderheid
het Usutu virus wel gedetecteerd door middel van RT-PCR maar niet door middel van
immunohistochemie. Bij één gans werd een viremie gevonden en drie ganzen toonden antistoffen
tegen het virus. Bij ganzen die in contact waren geweest met geïnoculeerde dieren werden geen virus
of antistoffen gevonden. Er werden bij geen van de dieren klinische tekenen gezien.
Dit experiment laat zien dat het Usutu virus zich kan repliceren in ganzen. Het induceert echter geen
ziekte, veroorzaakt waarschijnlijk geen mortaliteit en alleen in zeldzame gevallen leidt Usutu virus
infectie tot viremie (Chvala et al., 2006).
Deze experimentele infecties wijzen erop dat het Usutu virus alleen in zeldzame gevallen ziekte kan
veroorzaken bij de gebruikte dieren. Normaal worden geen klinische tekenen gezien. Er werd geen
overdracht van het virus naar contact dieren gevonden.
Deze experimentele studies kunnen er op wijzen dat het virus niet goed aangepast is aan
gedomesticeerde vogels, dit in tegenstelling tot wilde vogels.
4. De mens als (accidentele) gastheer
Er zijn in totaal vier humane gevallen bekend.
Tot nu toe zijn in Afrika slechts twee isolaties bij de mens bekend, met weinig informatie en klinische
beschrijving. Het eerste geval was in 1981 in de Centraal-Afrikaanse Republiek. Het betrof een patiënt
met koorts en uitslag. Het tweede geval was in 2004, een tien jaar oude patiënt in Burkina Faso met
koorts en geelzucht (Weissenböck et al., 2002; Nikolay et al., 2011).
10
Aan het einde van de zomer van 2009 werd het virus geassocieerd met neurologische stoornissen bij
twee immunosuppressieve patiënten in Italië. Beiden hadden een bloedtransfusie ontvangen
(Vázquez et al., 2011).
Het eerste Italiaanse geval was een vrouw van in de zestig waarbij een hemicolectomie werd
uitgevoerd (dit is het gedeeltelijke wegnemen van het colon) vanwege een diffuus B cel lymfoom.
Symptomen die werden gezien waren koorts, tremor en neurologische symptomen zoals zwakte op
vier ledematen. Een meningoencefalitis werd vastgesteld. Via RT-PCR op het cerebrospinaal vocht
werd het Usutu virus geïdentificeerd. Het feit dat het virus gedetecteerd werd in de acute fase van de
ziekte bewees dat het virus meningoencefalitis veroorzaakte bij de patiënt (Pecorari et al., 2009).
Het tweede geval betrof een Italiaanse vrouw van in de veertig die een trombotische
trombocytopenische purpura (TTP) ontwikkelde (dit is een aandoening in de bloedstolling). Kort na het
ontvangen van plasmafereses ontwikkelde de patiënt koorts, hoofdpijn, uitslag en een periodieke
verhoging van lever enzymes. In een paar dagen ontwikkelde zich een ernstige hepatitis en aantasting
van neurologische functies. Dit evolueerde snel tot een coma. Twee weken na een levertransplantatie
vertoonde de patiënt terug lichte vorm van bewustzijn en een aantal motorische functies van de
craniale zenuwen en ledematen. Via RT-PCR werd plasma van de patiënt voor en na de operatie
positief bevonden voor het Usutu virus (Cavrini et al., 2009).
De twee bovenstaande beschreven gevallen konden geïnfecteerd worden door ofwel directe
transmissie via een muggensteek ofwel indirect door een geïnfecteerde donor. Verdere onderzoeken
zouden moeten uitwijzen welke infectieroutes er plaats hebben gevonden.
Beide patiënten hadden gemeen dat ze immunosuppressief waren en in dezelfde periode (augustus
2009) bloedtransfusies hebben ontvangen. Deze twee patiënten zijn de eerste en enige beschreven
humane gevallen van neuroinvasieve ziekte door het Usutu virus over de gehele wereld. De
voorkomende klinische symptomen waren een persisterende koorts, hoofdpijn en het uitvallen van
verschillende neurologische functies. Bij beide patiënten was het klinisch beeld gelijk, met een
duidelijke betrokkenheid van het centrale zenuwstelsel.
De partiële sequenties verkregen uit cerebrospinaal vocht- en plasma stalen van deze patiënten
waren meer dan 98% identiek met de sequenties die in Wenen en Boedapest voorkwamen (in
respectievelijk 2001 en 2005). In een fylogenetische studie van sequenties van Usutu virus stalen
verkregen in Italië in 2009 uit muggen, vogels en mensen, werden de verkregen sequenties
vergeleken. De sequenties van de menselijke gastheren kwamen overeen met de sequenties
verkregen van vogels. Dit geeft een endemische verspreiding van het virus in Europa aan (Vázquez et
al., 2011).
Onderzoek naar 359 gezonde bloeddonoren in Italië wees uit dat er bij vier donoren antistoffen tegen
het Usutu virus in het bloed aanwezig waren. Echter, bij geen enkele van de positief bevonden
donoren werden symptomen gezien. Hierdoor lijkt het dat het Usutu virus een asymptomatische
viremie kan veroorzaken (Gaibani et al., 2012). Het is echter wel de vraag in hoeverre het zeker is dat
deze antistoffen specifiek zijn voor het Usutu virus.
Door deze humane gevallen en het vinden van antistoffen tegen het Usutu virus bij bloeddonoren kan
de vraag gesteld worden of het verstandig is transfusiebloed te screenen op aanwezigheid van het
virus. Vervolgens blijft de vraag in hoeverre deze serologische screening dan betrouwbaar zal zijn in
verband met kruisreacties.
11
5. Diagnostiek
Alhoewel het aantonen van het virus zelf wordt geprefereerd boven het serologisch aantonen van
neutraliserende antistoffen (omdat kruisreacties met andere flavivirussen voorkomen), is er het
probleem dat het virus enkel aangetoond kan worden gedurende de korte tijd dat er een viremie bij de
gastheer aanwezig is. Antistoffen daarentegen blijven tot meerdere maanden na infectie aanwezig in
het serum van de gastheer (Vázquez et al., 2011).
Er zijn verschillende manieren om virussen aan te tonen. Daarvoor zijn verschillende technieken die in
vier groepen onderverdeeld kunnen worden.
detectie van virions (elektronen microscopie);
detectie van infectieus virus (door inoculatie van een celcultuur of een gevoelige gastheer);
detectie van virale antigenen (met behulp van virus-specifieke antisera of monoclonale
antistoffen);
detectie van virale nucleïnezuren (nucleïnezuur hybridisatie of PCR)
(Carter et al., 2007).
5.1. Virusdetectie
De meest gebruikte testen voor het aantonen van het Usutu virus zijn RT-PCR, immunohistochemie
en in situ hybridisatie.
5.1.1. RT-PCR
PCR kan onder andere gebruikt worden voor de detectie van viraal RNA. Ook wanneer er slechts zeer
kleine hoeveelheden genetisch materiaal aanwezig zijn van het virus. Bij RT-PCR (Reverse
Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) wordt van enkelstrengig RNA eerst een DNA streng
gemaakt. Het dubbelstrengig DNA fragment wordt gedenatureerd door te verhitten. Korte
oligonucleotide primers hechten aan de complementaire DNA strengen en met behulp van een DNA
polymerase wordt in aanwezigheid van nucleotiden, nieuw DNA gesynthetiseerd. Het nieuw
gesynthetiseerde DNA kan opnieuw gedenatureerd, geprimed en gesynthetiseerd worden. Deze
kettingreactie wordt herhaald totdat er bruikbare hoeveelheden genetisch materiaal bekomen worden
(Wagner et al, 2008).
Via gelelektroforese kan vervolgens detectie plaatsvinden (Carter et al., 2007). Hierbij wordt het
genetisch materiaal gescheiden door het doorheen een gel te laten lopen onder invloed van een
elektrisch veld. Hoe groter de DNA-fragmenten, hoe trager deze zullen migreren. Er ontstaan
bandenpatronen waardoor het genetische materiaal geïdentificeerd kan worden.
RT-PCR onder correcte condities kan erg gevoelig zijn en kan gebruikt worden voor differentiatie van
het oorzakelijk virus.
RT-PCR kan op bloed of op cerebrospinaal vocht gebeuren en is erg waardevol in combinatie met
serologie voornamelijk als in het begin van de infectie serologie negatief mocht zijn (Korsman et al.,
2012).
5.1.2. Immunohistochemie
Met deze test toont men virale antigenen in geïnfecteerde cellen aan. Na een biopsie wordt het
weefsel chemisch gefixeerd (vaak met formaldehyde), of er volgt cryosectie (dit is het invriezen en in
hele dunne plakjes snijden van het weefsel) om de staat van het monster zo natuurlijk mogelijk te
houden. Gelabelde antistoffen die specifiek zijn voor het virus worden gebruikt om zo het virus te
visualiseren (Wagner et al., 2008). De gefixeerde weefsels kunnen ook gebruikt worden voor
histopathologie. De ernst van de letsels en de plaats waar de letsels gelokaliseerd zijn in verhouding
tot het virus worden met de lichtmicroscoop bekeken.
12
5.1.3. In situ hybridisatie
Deze test vertoont gelijkenissen met de immunohistochemie, maar in plaats van virale antigenen
wordt viraal nucleïnezuur aangetoond met behulp van specifieke RNA proben. Dit zijn complementaire
RNA strengen die een specifieke RNA sequentie kunnen lokaliseren in een weefsel, zonder verlies
van morfologie (Wagner et al, 2008). Een in vitro gelabeld nucleïnezuur (probe) gaat hybridiseren met
complementair RNA van het virus. Vervolgens worden de stalen met de lichtmicroscoop bekeken.
5.2. Serologie
Er bestaan meerdere serologische testen om antistoffen tegenover flavivirussen aan te tonen. De
traditionele methoden zoals hemagglutinatie inhibitie zijn nu grotendeels vervangen door de IgM
capture ELISA. Hieronder wordt het principe uitgelegd.
5.2.1. Hemagglutinatie inhibitie
Bij de hemagglutinatie inhibitie test (Fig. 5) kunnen specifieke antistof hoeveelheden in serum worden
bepaald. Een constante hoeveelheid antigenen van het Usutu virus wordt in iedere well van een
microtiterplaat geplaatst. Het te testen serum wordt systematisch verdund en in de verschillende
wellen bijgevoegd. Daarna worden rode bloedcellen toegevoegd. Na incubatie wordt de microtiterplaat
afgelezen. Als het serum geen antistoffen tegen het Usutu virus bevat wordt er hemagglutinatie van
de rode bloedcellen gezien. Zijn antistoffen tegen het Usutu virus wel aanwezig dan is er inhibitie van
de hemagglutinatie. Zo kan aangetoond worden of een serum al dan niet antistoffen tegen het virus
bevat en tot welke antistoffen concentratie er reactie plaatsvindt. Het omgekeerde van de verdunning
is de antistoftiter (Hobson-Peters, 2012).
Figuur 5: De hemagglutinatie inhibitie test (naar intranet.tdmu.edu.ua).
5.2.2. IgM capture ELISA
IgM capture ELISA is de meest sensitieve serologische test in het begin stadium van de infectie
(Korsman et al, 2012).
Zoals getoond in Figuur 6 wordt na het coaten van anti-IgM antistoffen op een titerplaat, serum van de
te onderzoeken diersoort toegevoegd. Indien dit serum antistoffen tegen het Usutu virus bevat zullen
alleen deze antistoffen binden aan de anti-IgM antistoffen. Vervolgens worden Usutu specifieke
antigenen bijgevoegd. Deze zullen enkel binden aan de plaat indien het te testen serum antistoffen
tegen het Usutu virus bevat. Als laatste stap worden er gemerkte anti-Usutu antistoffen toegevoegd.
Deze gaan alleen binden als er een Usutu-antigen gebonden is. Indien er IgM antistoffen specifiek
voor het Usutu antigen aanwezig zijn zal er een kleurverandering te zien zijn.
13
Figuur 6. IgM capture ELISA (naar Wagner, 2007).
Een nadeel van serologie is dat IgM antistoffen negatief kunnen zijn in het beginstadium van de ziekte
en hierdoor mogelijk worden gemist. Ook is diagnose met hemagglutinatie inhibitie pas diagnostisch
als er een viervoudige stijging in de titers wordt gezien (Korsman et al., 2012).
Het grote probleem met serologie is dat er kruisreacties tussen de flavivirussen voorkomen. Er zijn
immers kruisreacties met andere flavivirussen mogelijk (met name met virussen van het Japanse
encefalitis serocomplex) die vals positieve resultaten kunnen geven.
BESPREKING
Het is waarschijnlijk dat de distributie van het Usutu virus vele malen groter is dat de gerapporteerde
circulatie.
In veel landen werden geen surveillance- en controleprogramma’s opgezet. In Afrika, waar het virus
voor zover bekend geen fatale ziekte veroorzaakt bij mens of dier, is in veel landen niet naar het virus
gezocht en hebben er geen isolaties plaatsgevonden (Nikolay et al., 2011). Ook hoeft een infectie met
het Usutu virus niet aantoonbaar ziekte te veroorzaken. Op vele plaatsen zou het virus al lang kunnen
circuleren zonder dat er een aantoonbaar verhoogde vogelsterfte werd gezien. Hierdoor is het
mogelijk dat geïnfecteerde trekvogels het virus over grote afstanden hebben verspreid (Horton et al.,
2013).
Muggen geïnfecteerd met het Usutu virus konden waarschijnlijk overwinteren in Europese landen.
Hierdoor was het virus in staat om na zijn introductie in deze landen aanwezig te blijven. Dit is meer
aannemelijk dan dat er ieder jaar opnieuw een herintroductie van het virus zou zijn geweest.
Toen het virus in 2001 Oostenrijk binnentrad, was het onzeker of het virus in staat zou zijn om zich in
dit klimaat zich staande te houden. Tien jaar later was het virus nog steeds aanwezig maar was de
vogelsterfte sterk gedaald. Wellicht werd er een vorm van immuniteit opgebouwd die de vogels kon
beschermen (Becker et al., 2012). Het virus kon zich aanpassen aan de lokale vogel-mug
levenscyclus. Naast Oostenrijk zijn er ook in Hongarije (2003-2006) en Italië (2006-2008) in
opeenvolgende jaren virusinfecties gedetecteerd (Bakonyi et al., 2007; Vázquez et al., 2011).
Vermoedelijk is het Usutu virus vanuit Afrika in Italië binnen geraakt en heeft het zich vanuit Italië
verspreid over verschillende Europese landen. Dit is waarschijnlijk aangezien virussen uit Italië,
Oostenrijk, Hongarije, Zwitserland, Tsjechië en Duitsland een sterke homologie vertonen op genetisch
vlak (Jöst et al., 2011; Vázquez et al., 2011).
Het virus dat gedetecteerd werd in Spanje vertoont dan weer meer homologie met Afrikaanse isolaten
14
dan met de centraal Europese. Waarschijnlijk zal hier het virus door trekvogels, afkomstig uit Afrika,
zijn getransporteerd naar Spanje (Vázquez et al., 2011).
Een hoge merelsterfte wijst niet per se op een infectie met het Usutu virus en omgekeerd kan een
infectie met het Usutu virus ook zeer mild of subklinisch verlopen. In Nederland sterft elk jaar de helft
van alle merels (http://nos.nl, 2012). In 2012 is in Duitsland 30% van de populatie gesneuveld. Op
sommige plaatsen liep het sterftepercentage zelfs op tot 70%. Dit was vermoedelijk door het Usutu
virus.
Er wordt verwacht dat vogels uiteindelijk, na een aantal jaar, immuniteit tegen het virus zullen
opbouwen. Zo nam in Oostenrijk, na introductie van het Usutu virus, het aantal vogels met antistoffen
tegen het virus significant toe (Weissenböck et al., 2003; Bakonyi et al., 2007).
Er is nood aan surveillance- en controleprogramma’s waardoor West-Europese landen voorbereid zijn
op mogelijke infecties met flavivirussen en deze beter kunnen bestrijden. Hiervoor moeten gevoelige
en specifieke diagnostische testen worden ontwikkeld om de circulatie van het virus vroegtijdig te
detecteren. Ook moet er een duidelijk onderscheid gemaakt kunnen worden tussen de verschillende
virussen van het Japanse encefalitis serocomplex.
Dit laatste is een probleem aangezien er tot nu toe geen testen zijn ontwikkeld die een dergelijk
onderscheid kunnen maken. Hierdoor is het niet mogelijk een goed zicht te krijgen op de prevalentie
van verschillende flavivirussen (Vázquez et al, 2011).
De toekomst zal uitwijzen of na het West Nijl virus en het Usutu virus andere, minder bekende
flavivirussen naar onze streken zullen oprukken en voor problemen zullen gaan zorgen. Er bestaan
immers tientallen andere flavivirussen die eveneens door muggen worden overgedragen en tot hiertoe
enkel in streken met een warm klimaat werden gerapporteerd. Verschillende daarvan behoren
eveneens tot het Japanse encefalitis serocomplex. Een voorbeeld is het Rabensberg virus, dat reeds
werd geïsoleerd uit muggen in Tsjechië (Aliota et al., 2012). Dit virus is sterk verwant aan het Usutu
virus maar wordt toch als een nieuw virus beschouwd gezien de genetische verschillen met het Usutu
virus. Een ander sterk verwant virus en lid van het Japanse encefalitis serocomplex is het Yaoundé
virus, dat tot nog toe enkel in Afrika werd gerapporteerd (Williams et al, 2012).
Tot nu toe lijkt het er niet op dat het Usutu virus een bedreiging voor de mens vormt. De beschreven
Europese gevallen waren ernstig immunosuppressief en dus niet representatief voor gezonde
mensen. Verder onderzoek moet uitwijzen wat het belang is van milde of subklinische infecties met
het Usutu virus bij de mens.
15
REFERENTIELIJST
1. Aliota M.T., Jones S.A., Dupuis II A.P., Ciota A.T., Hubalek Z., Krames L.D. (2012).
Characterization of Rabenburg Virus, a Flavivirus Closely Related to West Nile Virus of the
Japanese Encephalitis Antigenic Group. PLoS ONE 7(6): e39387.
2. Bakonyi T., Erdélyi K., Ursu K., Ferenczi E., Csörgõ T., Lussy H., Chvala S., Bukovsky C.,
Meister T., Weissenböck H., Nowotny N. (2007). Emergence of Usutu Virus in Hungary.
Journal of Clinical Microbiology 45(12), 3870-3874.
3. Bakonyi T., Gould E.A., Kolodziejek J., Weissenböck H., Nowotny N. (2004). Complete
genome analysis and molecular characterization of Usutu virus that emerged in Austria in
2001 Comparison with the South African Strain SAAR-1776 and other flaviviruses. Virology
328, 301-310.
4. Becker N., Jöst H., Ziegler U., Eiden M., Höper D., Emmerich P., Fichet-Calvet E., Ehichioya
D.U., Czajka C., Gabriel M., Hoffmann B., Beer M., Tenner-Racz K., Racz P., Günther S.,
Wink M., Bosch S., Konrad A., Pfeffer M., Groschup M.H., Schmidt-Chanasit J. (2012).
Epizootic Emergence of Usutu Virus in Wild and Captive Birds in Germany. PLoS ONE 7(2):
e32604.
5. Buckley A., Dawson A., Moss S.R., Hinsley S.A., Bellamy P.E., Gould E.A. (2003). Serological
evidence of West Nile virus, Usutu virus and Sindbis virus infection of birds in the UK. Journal
of General Virology 84, 2807-2817.
6. Carter J., Saunders V. (2007). Virology Principles and Applications. John Wiley & Sons Ltd,
Chichester, p.18-22.
7. Cavrini F., Gaeibani P., Longo G., Pierro A.M., Rossini G., Bonilauri P., Gerundi G.E., Di
Benedetto F., Pasetto A., Girardis M., Dottori M., Landini M.P., Sambri V. (2009). Usutu virus
infection in a patient who underwent orthotropic liver transplantation, Italy, August-September
2009. Euro Surveillance 2009: 14(50): pii=19448.
8. Chvala S., Bakonyi T., Hackl R., Hess M., Nowotny N., Weissenböck H. (2005). Limited
pathogenicity of Usutu virus for the domestic chicken (Gallus domesticus). Avian Pathology
34(5), 392-395.
9. Chvala S., Bakonyi T., Hackl R., Hess M., Nowotny N., Weissenböck H. (2006). Limited
pathogenicity of Usutu virus for the Domestic Goose (Anser anser f. domestica) Following
Experimental Inoculation. Journal of Veterinary Medicine 53, 171-175.
10. Del Amo J., Sotelo E., Fernández-Pinero J., Gallardo C., Llorente F., Agüero M., JiménezClavero M.A. (2013). A novel quantitative multiplex real-time RT-PCR for the simultaneous
detection and differentiation of West Nile virus lineages 1 and 2, and of Usutu virus. Journal of
Virological Methods 189, 321-327.
11. Figuerola J., Soriguer R., Rojo G., Tejedor C.G., Jimenez-Clavero M.A. (2007).
Seroconversion in Wild Birds and Local Circulation of West Nile Virus, Spain. Emerging
Infectious Diseases 13(12), 1915-1917.
12. Gaibani P., Pierro A., Alicino R., Rossini G., Cavrini F., Landini M.P., Sambri V. (2012).
Detection of Usutu-Virus-Specific IgG in Blood Donors from Northern Italy. Vector-Borne and
Zoonotic Diseases 12(5), 431-433.
13. Gubler D.J., Kuno G., Markoff L. (2007). Flaviviruses. In: Knipe D.M., Howley P.M., Griffin
D.E., Lamb R.A., Straus S.E., Martin M.A., Roizman B. (Editors) Field’s Virology, 5th edition,
Lippincott Williams & Wilkins, a Wolter Kluwer Business, Philadelphia, p.1155-1171.
14. Hobson-Peters J. (2012). Review Article. Approaches for the Development of Rapid
Serological Assays for Surveillance and Diagnosis of Infections Caused by Zoonotic
Flaviviruses of the Japanese Encephalitis Virus Serocomplex. Journal of Biomedicine and
Biotechnology 2012, 1-15.
15. Horton D.L., Lawson B., Egbetade A., Jeffries C., Johnson N., Cunningham A.A., Fooks A.R.
(2013). Targeted surveillance for Usutu virus in British birds (2005-2011). Veterinary Record
172(1):17.
16
16. Internetreferentie:
http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/micbio/classes_stud/en/med/lik/ptn/Microbiolo
gy,%20virology%20and%20immunology/2/07_The%20usage%20of%20immunological%20rea
ctions%20in%20diagnostics%20of%20infectious%20diseases.htm. Usage of immunological
test in diagnosis of infectious diseases. Reactions based on agglutination and precipitation
phenomenon lysis and complement fixation test (geconsulteerd op 7 mei 2013).
17. Internetreferentie: http://nos.nl/artikel/427158-massale-merelsterfte-door-virus.html (2012)
Massale merelsterfte door virus (geconsulteerd op 25 april 2013).
18. Internetreferentie: http://www.codacerva.be/index.php?option=com_content&view=article&id=448%3Aune-zoonose-emergenteou-silencieuse-linfection-par-le-virus-usutu-&catid=181%3Alatest-news&Itemid=264&lang=nl
(2012) Een plots opduikende zoonose of reeds lang sluimerend aanwezig? Besmettingen
door het USUTU virus (geconsulteerd op 25 april 2013).
19. Internetreferentie: http://www.dwhc.nl/Buitenlands/V_usutu.html (2012) Merels en Usutu virus
(geconsulteerd op 25 april 2013).
20. Internetreferentie: http://www.mayoclinic.com/health/medical/IM00836 (2012). West Nile virus
transmission cycle (geconsulteerd op 7 mei 2013).
21. Internetreferentie: http://www.natuurbericht.be/?id=9504 (2012) Merel bedreigd door Usutuvirus? (geconsulteerd op 25 april 2013).
22. Internetreferentie: http://www.vogelbescherming.nl/actueel/nieuws/q/ne_id/954/?&gclid=COKyPmz0rUCFaLHtAodUk8AeQ (2012) Geen Usutu-virus aangetroffen in Nederlandse merels
(geconsulteerd op 25 april 2013).
23. Jöst H., Bialonski A., Maus D., Sambri V., Eiden M., Groschup M.H., Günther S., Becker N.,
Schmidt-Chanasit J. (2011). Short Report: Isolation of Usutu Virus in Germany. American
Journal of Tropical Medicine and Hygiene 85(3), 551-553.
24. Korsman S.N.J., van Zyl G.U., Nutt L., Andersson M.I., Preiser W. (2012). Virology, an
illustrated colour text. Churchill Livingstone Elsevier, London, p. 96-97.
25. Lindenbach B.D, Thiel H-J, Rice C.M. (2007). Flaviviridae: The Viruses and Their Replication.
In: Knipe D.M., Howley P.M., Griffin D.E., Lamb R.A., Straus S.E., Martin M.A., Roizman B.
(Editors) Field’s Virology, 5th edition, Lippincott Williams & Wilkins, a Wolter Kluwer Business,
Philadelphia, p. 1102-1130.
26. Meister T., Lussy H., Bakonyi T., Šikutová S., Rudolf I., Vogl W., Winkler H., Frey H., Hubálek
Z., Nowotny N., Weissenböck H. (2008). Serological evidence of continuing high Usutu virus
(Flaviviridae) activity and establishment of herd immunity in wild birds in Austria. Veterinary
Microbiology 127, 237-248.
27. Mukhopadhyay S., Kuhn R.J., Rossmann M.G. (2005). A structural perspective of the
flavivirus life cycle. Nature 3, 12-22.
28. Nikolay B., Diallo M., Boye C.S.B, Sall A.A. (2011). Usutu virus in Afrika. Vector-borne and
zoonotic diseases 11, 1417-1423.
29. Odell I.D., Cook D. (2013). Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative
Dermatology 133, e4.
30. Pecorari M., Longo G., Gennari W., Grottola A., Sabbatini A.M., Tagliazucchi S., Savini G.,
Monaco F., Simone M.L., Lelli R., Rumpianesi F. (2009). First human case of Usutu virus
neuroinvasive infection, Italy, August-September 2009. Euro Surveillance 2009: 14(50):
pii=19446.
31. Savini G., Monaco F., Terregino C., Di Gennaro A., Bano L., Pinoni C., De Nardi R., Bonilauri
P., Pecorari M., Di Gialleonardo L., Bonfanti L., Polci A., Calistri P., Lelli R. (2011). Usutu virus
in ITALY: An emergent or a silent infection? Veterinary Microbiology 151, 264-274.
32. Steinmetz H.W., Bakonyi T., Weissenböck H., Hatt J-M., Eulenberger U., Robert N., Hoop R.,
Nowotny N. (2011). Emergence and establishment of Usutu virus infection in wild and captive
avian species in and around Zurich, Switserland – Genomic and pathologic comparison to
other central European outbreaks. Veterinary Microbiology 148, 207-212.
17
33. Suthar M.S., Diamond M.S., Gale Jr M. (2013). West Nile virus infection and immunity. Nature
Reviews Microbiology 11, 115-128.
34. Vázquez A., Jiménez-Clavero M.A., Franco L., Donoso-Mantke O., Sambri V., Niedrig M.,
Zeller H., Tenorio a. (2011). Usutu virus – potential risk of human disease in Europe. Euro
Surveill. 2011:16(31): pii=19935.
35. Vázquez A., Ruiz S., Herrero L., Moreno J., Molero F., Magallanes A., Sánchez-Seco M.P.,
Figuerola J., Tenorio A. (2011). Short Report: West Nile and Usutu Viruses in Mosquitoes in
Spain, 2008-2009. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 85(1), 178-181.
36. Wagner B. (2007). Equine Reagents. Internetreferentie:
http://courses2.cit.cornell.edu/wagnerlab/research/reagents.htm (geconsulteerd op 7 mei
2013).
37. Wagner E.K., Hewlett M.J., Bloom D.C., Camerini D. (2008). Basic Virology.3th edition.
Blackwell Publishing, Oxford, p.187-191, 470.
38. Weissenböck H., Kolodziejek J., Fragner K., Kuhn R., Pfeffer M., Nowotny N. (2003). Usutu
virus activity in Austria, 2001-2002. Microbes and Infection 5, 1132-1136.
39. Weissenböck H., Bakonyi T., Chvala S., Nowotny N. (2004). Experimental Usutu virus
infection of suckling mice causes neuronal and glial cell apoptosis and demyelination. Acta
Neuropathologica 108, 453-460.
40. Weissenböck H., Bakonyi T., Rossi G., Mani P., Nowotny N. (2013). Usutu Virus, Italy, 1996.
Emerging Infectious Diseases 19(2), 274-277.
41. Weissenböck H., Kolodziejek J., Url A., Lussy H., Rebel-Bauder B., Nowotny N. (2002).
Emergence of Usutu virus, an African Mosquito-Borne Flavivirus of the Japanese Encephalitis
Virus Group, Central Europe. Emerging Infectious Diseases 8, 652-656.
42. Williams R.A.J., Vázquez A., Asante I., Bonney K., Odoom S., Puplampu N., Ampofo W.,
Sánchez-Seco M.P., Tenorio A., Peterson A.T. (2012). Yaoundé-like virus in resident wild bird,
Ghana. African Journal of Microbiology Research 6(9), 1966-1969.
18