Cellulaire afweer tegen HIV: De CD8+ cel

Cellulaire afweer tegen HIV:
De CD8+ cel Antivirale Factor
(CAF)
Rinske Drost
Juni 2004
1
Cellulaire afweer tegen HIV:
De CD8+ cel Antivirale Factor
(CAF)
Rinske Drost
0152951
Begeleider: Adri Thomas
Ontwikkelingsbiologie
Faculteit Biologie
Universiteit Utrecht
Juni 2004
Plaatje van: www.nlm.nih.gov
2
Inhoudsopgave
Samenvatting
4
1. Inleiding
1.1. Het immuunsysteem
1.2. HIV infectie
1.2.1. Historische achtergrond HIV
1.2.2. Verloop HIV infectie
1.2.3. Moleculaire biologie HIV
1.3. Verantwoording onderzoek
5
5
8
8
10
12
14
2. De CD8+ cel Antivirale Factor (CAF)
2.1. Identificatie CNAR en CAF
2.2. Kenmerken CAF
2.3. Kandidaten CAF
2.3.1. Cytokines en chemokines
2.3.2. Defensines
2.3.3. Overige kandidaten
16
16
18
21
21
25
29
3. Discussie
32
4. Referenties
37
3
Samenvatting
De cellulaire immuunrespons vormt een belangrijk deel van de afweer van de gastheer
tegen virale infectie. CD8+ T-cellen spelen een belangrijke rol bij deze cellulaire immuniteit.
De CD8+ cel afweer tegen HIV heeft twee kanten: een cytotoxische en een noncytotoxische. Over de cytotoxische afweer tegen HIV is het meest bekend: geïnfecteerde
cellen worden opgeruimd door CD8+ T-cellen. Er bleek geen relatie te zijn tussen de
cytotoxische kant van de anti-HIV activiteit en de klinisch gezonde staat van ‘Long Term Non
Progressors’ (LTNP) en ‘Exposed-Uninfected’ (EU) personen. De hoogste CD8+ cel Noncytotoxische Antivirale Respons (CNAR) werd gevonden in LTNP en was afwezig in personen
met AIDS. Dit geeft een indicatie voor een correlatie tussen een sterke non-cytotoxische
CD8+ cel anti-HIV activiteit en de gezonde klinische staat van LTNP en EU personen. CNAR
blijkt gemedieerd te worden door een of meer oplosbare factoren, genaamd CD8+ cel
Antivirale Factor (CAF). Aangezien CAF slechts in zeer kleine hoeveelheden geproduceerd
wordt, is het zeer moeilijk om de identiteit van CAF te bepalen. Toch heeft men een aantal
eigenschappen van CAF weten te bepalen, die zeer nuttig kunnen zijn bij het achterhalen
van de identiteit van CAF. Een groot aantal interleukines, interferonen, chemokines,
groeifactoren en andere cytokines met anti-HIV activiteit zijn bekeken als kandidaten voor
CAF. Al deze kandidaten bleken niet alle kenmerken van CAF te vertonen, hetgeen
suggereert dat CAF uit meerdere componenten bestaat. Wel heeft de zoektocht naar CAF
een groot aantal nieuwe anti-HIV factoren aangetoond.
4
1. Inleiding
Wanneer het immuunsysteem gedeeltelijk of helemaal niet meer functioneert, spreken we
van immunodeficiëntie (Janeway et al., 2001). Zo’n 25 jaar geleden werd een nieuwe vorm
van immunodeficiëntie geconstateerd, het ‘Acquired Immunodeficiency Syndrome’ of AIDS
(Gallo & Montagnier, 1988). In deze inleiding zal eerst de algemene werking van het
immuunsysteem behandeld worden. Hierin wordt toegespitst op de afweer van het
immuunsysteem tegen infecties door virussen, aangezien AIDS veroorzaakt wordt door het
‘Human Immunodeficiency Virus’ of HIV (Gallo & Montagnier, 1988). Inmiddels is HIV het
meest intensief bestudeerde virus in de geschiedenis. Na de ontdekking van AIDS en HIV
heeft men heel veel onderzoek gedaan naar de werking van het virus, de moleculaire
biologie van het virus en de manier waarop het virus het immuunsysteem weet uit te
schakelen. Om duidelijk het kader van het uiteindelijke onderwerp van deze scriptie te
schetsen, is het noodzakelijk om ook eerst deze onderwerpen te behandelen.
1.1. Het immuunsysteem
Het immuunsysteem verdedigt de gastheer tegen infectie. De herkomst van alle cellen van
het immuunsysteem ligt in het beenmerg. Hier vindt ook de maturatie van veel van deze
cellen plaats. Vervolgens migreren deze cellen naar de perifere weefsels via het bloed en het
lymfatisch systeem. Alle bloedcellen stammen af van eenzelfde precursor, de
hematopoietische stamcel. Deze pluripotente stamcel differentieërt tot een lymfoïde
progenitor of een myeloïde progenitor. Uit de lymfoïde progenitor ontstaan later de B- en Tcellen, uit de myeloïde progenitor ontstaan onder andere rode bloedcellen en bloedplaatjes,
maar ook mestcellen, macrofagen, granulocyten en dendritische cellen (Janeway et al.,
2001) (figuur 1).
In het immuunsysteem maakt men onderscheid tussen de zogenaamde ‘innate
immunity’ en de ‘acquired/adaptive immunity’. De erfelijke innate immunity is altijd
aanwezig en neemt niet toe na blootstelling aan een pathogeen. De innate immunity is de
eerste fase van de gastheerrespons op een infectie. Het is, na de huid, de tweede
verdedigingslinie tegen pathogenen en is voornamelijk van belang bij de afweer tegen
bacteriën en virussen. De belangrijkste componenten van de innate immunity zijn
macrofagen en neutrofielen. Deze cellen reageren snel op een infectie door middel van
fagocytose van pathogenen en via het uitscheiden van cytokines en chemokines. Cytokines
zijn de boodschappermolekulen van de cellen van het immuunsysteem. Cytokines maken het
mogelijk voor cellen om op afstand te communiceren. Cytokines zijn eiwitten afgegeven
5
door cellen, bijvoorbeeld lymfocyten, die het gedrag van andere cellen met specifieke
cytokine-receptoren beïnvloeden. Chemokines zijn in staat cellen met chemokinereceptoren, zoals bijvoorbeeld neutrofielen en monocyten, aan te trekken naar de plaats van
infectie. Dit proces wordt ook wel chemotaxis genoemd (Janeway et al., 2001).
Figuur 1. Oorsprong van de cellen van het immuunsysteem (van:
www.biology.arizona.edu).
Uit de innate immunity heeft zich de acquired immunity ontwikkeld (Levy, 2001). De
adaptieve immuunrespons wordt voornamelijk verzorgd door lymfocyten. Er zijn twee
hoofdtypen lymfocyten: B-lymfocyten, die matureren in het beenmerg en T-lymfocyten, die
matureren in de thymus. Antilichamen zijn het specifieke product van de adaptieve
immuunrespons, ze worden gesecreteerd door B-cellen. Immuniteit gemedieerd door
antilichamen wordt ook wel de humorale immuniteit genoemd. Antilichamen reageren op
pathogenen in het bloed en de extracellulaire ruimten. Virussen repliceren echter in de cel
waar ze onopgemerkt blijven voor antilichamen. Het doden van deze indringers is de functie
van de T-cel (cell-mediated immune response).
De adaptieve immuunrespons ontstaat niet op de eerste plek waar een pathogeen
infectie veroorzaakt, maar vindt plaats in de perifere lymfoïde weefsels waar naïeve T-cellen
continu migreren. Pathogenen of hun produkten worden via de lymfe of soms via het bloed
naar het lymfoïde weefsel getransporteerd. Pathogenen die mucosale oppervlakken
6
geïnfecteerd hebben komen terecht in de tonsillen of in de ‘Peyer’s patches’, lymfeklieren
van de darm. De pathogenen in het bloed komen terecht in de milt. De pathogenen die
infectie veroorzaken op perifere plekken komen terecht in de dichtstbijzijnde lymfeknopen.
Al deze lymfoïde organen bevatten cellen die in staat zijn antigenen op te nemen en aan Tcellen te presenteren, zoals bijvoorbeeld dendritische cellen. Dit gebeurt met behulp van de
innate immuunrespons. Dendritische cellen, macrofagen en B-cellen brengen de
gespecialiseerde costimulatoire molekulen tot expressie die nodig zijn om naïeve T-cellen te
activeren. Dendritische cellen zijn in staat een grote variëteit aan pathogenen op te nemen
en te presenteren en zijn de belangrijkste activatoren van naïeve T-cellen. Macrofagen en Bcellen zijn gespecialiseerd in het presenteren van geëndocyteerde pathogenen en oplosbare
antigenen en zijn daarnaast de targetcellen van CD4+ T-cellen. Naïeve T-cellen circuleren
continu tussen lymfoïde organen en bloed en komen daarbij in contact met vele Antigeen
Presenterende Cellen (APCs). T-cellen die in contact komen met APCs en dus met specifieke
antigenen prolifereren en differentiëren tot effector T-cellen. Het genereren van effector
cellen uit naïeve T-cellen neemt enkele dagen in beslag. Daarna verlaten de effector T-cellen
het lymfoïde orgaan en migreren via het bloed naar de plek van infectie. Een adaptieve
immuunrespons wordt opgewekt wanneer een circulerende T-cel een specifiek antigen
herkent op het oppervlak van een lichaamseigen cel. Deze antigenen zijn afkomstig van
virussen die repliceren binnenin de cel of zijn binnengekomen via endocytose. T-cellen
herkennen stukjes kleine peptiden gebonden aan een ‘Major Histocompatibility Complex’ of
MHC-molekuul aan het oppervlak van de cel (Janeway et al., 2001).
Figuur 2. De twee klassen MHC met targetcellen en coreceptoren
(van: www.shmu.edu.cn).
7
De humane versie van dit molekuul wordt soms ook wel ‘Human Leukocyte Antigen’ ofwel
HLA genoemd, maar de term MHC wordt algemeen geaccepteerd (Engelhard, 1994). Er zijn
twee typen MHC-molekulen: MHC klasse I en MHC klasse II, die onder andere verschillen in
de peptiden die ze presenteren. MHC klasse I molekulen verzamelen peptiden uit het cytosol
en zijn dus in staat fragmenten van virale eiwitten op hun oppervlakte te presenteren. MHC
klasse II molekulen binden peptiden afkomstig uit intracellulaire vesicles en zijn dus in staat
antigenen van fagocytische en B-cellen te presenteren. MHC klasse I molekulen bevinden
zich op alle kernhoudende cellen, MHC klasse II molekulen alleen op antigeen presenterende
cellen (APCs). Er zijn drie typen antigeen presenterende cellen: dendritische cellen,
macrofagen en B-cellen. Er zijn twee hoofdtypen T-cellen die verschillen in het type MHC wat
ze herkennen: cytotoxische T-cellen (CTLs) en T-helper cellen. De antigenspecifieke activatie
van deze verschillende typen T-cellen is afhankelijk van co-receptoren. Cytotoxische T-cellen
brengen de CD8 coreceptor tot expressie, die aan MHC klasse I molekulen bindt. T-helper
cellen brengen de CD4 coreceptor met specificiteit voor MHC klasse II molekulen tot
expressie (Janeway et al., 2001) (figuur 2).
1.2. HIV infectie
1.2.1. Historische achtergrond HIV
Zo’n 20 jaar geleden was men ervan overtuigd dat infectieziekten geen probleem meer
zouden vormen in de westerse wereld. Men ging zich met name richten op non-infectieuze
ziekten als kanker en hart- en vaatziekten. Begin jaren ’80 verscheen plotseling het
‘Acquired Immunodeficiency Syndrome’ ofwel AIDS. Een paar jaar later werd het ‘Human
Immunodeficiency Virus’ ofwel HIV geïdentificeerd als de hoofdoorzaak van AIDS (Gallo &
Montagnier, 1988).
Er bleken twee verschillende typen HIV te bestaan, HIV1 en HIV2, die beiden lijken te
zijn overgesprongen van aap op mens. HIV1 komt het meest voor en blijkt virulenter te zijn
dan HIV2, dat met name in West-Afrika voorkomt (Gallo & Montagnier, 1988, Greene,
1993). Daarom richt men zich in het onderzoek naar HIV met name op HIV1 en dat zal in
deze scriptie ook het geval zijn.
Uit studies naar de divergentie tussen verschillende HIV stammen en mutatiesnelheid
heeft men bepaald dat HIV in mensen tussen de 20 en 100 jaar aanwezig is. De vraag die
hieruit voorkomt is waarom er dan nu pas sprake is van een epidemie. Men vermoedt dat
het virus aanwezig was in kleine, geïsoleerde groepen mensen in Centraal-Afrika. Doordat
8
de manier van leven veranderde (migratie naar steden), wist HIV zich te verspreiden (Gallo
& Montagnier, 1988).
HIV kan zich onder andere verspreiden via sexuele gemeenschap, intraveneus
drugsgebruik en bloedtransfusies (Gallo & Montagnier, 1988). HIV transmissie via
bloedtransfusies is in de westerse wereld door uitgebreide controle van bloed inmiddels
uitgesloten. In het westen zijn er remmers voor HIV progressie en HIV overdracht aanwezig,
zoals bijvoorbeeld azidothymidine (AZT). AZT is onder andere in staat de kans dat HIV
tijdens de zwangerschap wordt overgedragen van moeder op kind te verlagen. Bovendien
zijn westerse mensen goed voorgelicht over de manieren waarop zij hun persoonlijk risico op
infectie kunnen verlagen. Dit ontbreekt in de minder ontwikkelde landen. Daarom wordt
AIDS meer en meer een ziekte van de Derde Wereld (Gallo & Montagnier, 1988) (figuur 3).
Figuur 3. HIV-prevalentie in de wereld (van: www.developmentgoals.org).
Hoewel er meer mensen sterven aan andere ziekten, zoals bijvoorbeeld malaria, dan
aan AIDS, is AIDS toch de meest bestudeerde ziekte in de geschiedenis. Met name de snelle
verspreiding van HIV en het ontbreken van een behandeling of vaccin maken deze ziekte zo
alarmerend (Greene, 1993).
9
1.2.2. Verloop HIV infectie
Kenmerkend voor het verloop van de HIV infectie is de lange latente periode voordat AIDS
geconstateerd wordt. Deze lengte van deze periode verschilt van persoon tot persoon.
Meestal is de tijd tussen het begin van de asymptomatische fase en het verschijnen van
AIDS 3 tot 10 jaar (Haseltine & Wong-Staal, 1988). In de acute beginfase van de infectie
repliceert het virus vrijuit en bevinden zich veel vrije virusdeeltjes in het bloed en andere
lichaamsvloeistoffen (figuur 4).
Figuur 4. Het verloop van de HIV infectie (van: www.slic2.wsu.edu:82).
Voor details, zie tekst.
Het virus is in staat T-helper cellen en macrofagen te infecteren. Het lichaam reageert hierop
met een sterke immuunreactie. B-cellen produceren neutraliserende antilichamen tegen het
virus. Tegen de tijd dat er antilichamen geproduceerd worden is de infectie al permanent.
Dat wil zeggen dat integratie van het virale DNA in het gastheergenoom heeft
plaatsgevonden. Nu zal elke keer dat de cel deelt ook het virale DNA gedupliceerd worden,
waardoor de infectie permanent is. Geactiveerde CTLs zijn in staat veel virusgeïnfecteerde
cellen te doden. Dit is een van de voornaamste oorzaken voor de initiële daling van het
aantal T-helper cellen (figuur 4). Het vermogen van het lichaam om T-helper cellen te
produceren wordt niet door het virus aangetast. De eerste symptomen van het virus zijn
vaak griepachtig: koorts, spierpijn, gezwollen lymfeknopen, vaak gepaard met neurologische
klachten (Haseltine & Wong-Staal, 1988). Deze neurologische klachten lijken voort te komen
uit het feit dat het virus ook in staat is macrofagen te infecteren. Macrofagen zijn namelijk in
10
staat de ‘Blood-Brain barrier’ te passeren en zo kan het virus in de hersenen terechtkomen
(Gallo & Montagnier, 1988). De symptomen verdwijnen wanneer de virusconcentratie in het
bloed ofwel de ‘viral load’ daalt en het lichaam tijdelijk in staat is de hoeveelheid T-helper
cellen weer op peil te krijgen (Haseltine & Wong-Staal, 1988). Maar toch blijft het virus
latent aanwezig op plaatsen waar de infectie onzichtbaar is voor het immuunsysteem,
waarschijnlijk onder andere in de lymfeknopen. Het grootste HIV-reservoir is niet het bloed,
maar het lymfoïde weefsel, waar zich geïnfecteerde CD4+ T-cellen, monocyten, macrofagen
en dendritische cellen bevinden. Deze cellen zijn zelf niet geïnfecteerd, maar dienen als het
ware als een opslagplaats voor HIV-virusdeeltjes. Macrofagen en dendritische cellen kunnen
replicerend virus bevatten zonder dat ze noodzakelijkerwijs gedood moeten worden en
dienen zo als HIV-reservoir (Janeway et al., 2001). In de lymfeknopen komen T-cellen en
andere immuuncellen samen om te reageren op infectie. HIV is in staat de lymfeknopen
geleidelijk te beschadigen. Deze beschadiging van de lymfeknopen zou kunnen resulteren in
het afnemende aantal CD4+ T-cellen in het bloed. De uiteindelijke stijging van de
virusconcentratie in het bloed zou het gevolg kunnen zijn van de totaal niet meer
functionerende lymfeknopen. De lymfeknopen zijn nu niet meer in staat virus efficiënt op te
ruimen en het virus kan ontsnappen in de bloedsomloop (Greene, 1993). Tijdens de
chronische fase van de infectie blijft het immuunsysteem goed functioneren en is de
hoeveelheid aantoonbaar virus relatief laag (figuur 4). Tijdens deze fase van de infectie
heeft de patiënt vaak vrijwel geen klachten. Toch neemt de viral load geleidelijk aan toe,
terwijl de het aantal T-helper cellen geleidelijk afneemt. Zo’n 2 tot 10 jaar na het begin van
de asymptomatische fase neemt de replicatie weer sneller toe en gaat de infectie zijn laatste
fase in. Wanneer het aantal T-helper cellen onder de 200 komt, wordt de diagnose AIDS
gesteld. Tijdens de laatste fase van de infectie neemt de viral load weer sterk toe en
verdwijnt de immuunactiviteit vrijwel helemaal (figuur 4). Dit zorgt ervoor dat
opportunistische ziekten zich kunnen manifesteren (Nowak & McMichael, 1995). De twee
meest voorkomende opportunistische ziekten zijn Pneumocystis Carinii Pneunomia (PCP) en
Kaposi Sarcoma (KS). PCP is een door een schimmel veroorzaakte longontsteking waarbij de
interstitiële ruimtes van de longen zich vullen met vloeistof. KS is een vorm van vaatkanker
die zich het eerst manifesteert in de huid en mucosale membranen. Bij AIDS-patiënten kan
het zich verspreiden over het hele lichaam en zelfs interne organen beschadigen. In gezonde
individuen is het immuunsysteem in staat deze ziekten af te weren, maar vaak zijn deze
opportunistische ziekten de doodsoorzaak voor AIDS-patiënten (Greene, 1993).
11
1.2.3. Moleculaire biologie van HIV
De levenscyclus van HIV is die van een retrovirus. Er zijn drie families van retrovirussen:
oncovirussen, lentivirussen en spumavirussen. Oncovirussen veroorzaken, zoals de naam al
zegt, kanker. Kenmerkend voor lentivirussen is een zeer langzame progressie. HIV is een
lentivirus. Over spumavirussen is vooralsnog zeer weinig bekend. Er bestaan ook dierlijke
varianten van retrovirale infecties. Zo infecteert het Simian Immunodeficiency Virus’ (SIV)
niet-humane primaten, beïnvloedt het ‘Feline Immunodeficiency Virus’ (FIV) katten en
infecteert het Visna virus schapen. Net als alle andere virussen kunnen retrovirussen niet
repliceren zonder het systeem van de gastheercel over te nemen. Het genetisch materiaal
van een retrovirus is RNA. Dit moet eerst omgezet worden in DNA (Gallo & Montagnier,
1988). Wanneer een HIV partikel in het lichaam van de gastheer terecht is gekomen, bindt
het partikel aan een targetcel en injecteert zijn genetisch materiaal. Het viruspartikel bevat
twee identieke RNA-strengen en de benodigde structurele eiwitten en enzymen. Het enzym
reverse transcriptase, bestaande uit een DNA polymerase en een ribonuclease, is
verantwoordelijk voor het omzetten van RNA in DNA. Dit enzym maakt eerst een
enkelstrengs DNA-kopie van het virale DNA. Vervolgens wordt het oorspronkelijke RNA
afgebroken door de ribonuclease en een tweede DNA-kopie gemaakt met de eerste als
template (Haseltine & Wong-Staal, 1988) (figuur 6). Dan migreert het dubbelstrengs DNA
naar de celkern. Daar zorgt het enzym integrase voor integratie van het virale DNA in het
gastheergenoom (figuur 6). Nu zal elke keer dat de cel deelt ook het virale DNA
gedupliceerd worden, waardoor de infectie permanent is.
Figuur 5. Een HIV-viruspartikel (van: medfak.narod.ru).
12
De produktie van nieuwe virusdeeltjes begint wanneer de ‘Long Terminal Repeats’ of LTRs,
stukken DNA aan de uiteinden van het virale genoom, enzymen van de gastheer ertoe
aanzetten het virale DNA om te zetten in RNA. Een deel van het RNA zal dienen als
genetisch materiaal voor nieuwe virusdeeltjes, een ander deel zal bijdragen aan de
produktie van de structurele eiwitten en enzymen voor het nieuwe virusdeeltje (Haseltine &
Wong-Staal, 1988). Twee eiwitmolekulen migreren afzonderlijk naar de periferie van de cel,
binden aan elkaar en stulpen uit het celmembraan. Het ene eiwitmolekuul zal de matrix van
het virusdeeltje vormen, de ander de virale enzymen. Het zich vormende virusdeeltje trekt
twee strengen RNA aan, die vervolgens geïncorporeerd worden. Het virusdeeltje snoert zich,
ingesloten in een stukje membraan van de gastheer, af van de cel (figuur 6). Deze
zogenoemde envelop van het virusdeeltje bevat envelopeiwitten in de vorm van spikes, die
afzonderlijk van de andere eiwitten naar het celoppervlak getransporteerd worden. Elke
spike bestaat uit drie subeenheden die op hun beurt weer bestaan uit twee componenten:
gp120, een glycoprotein met een moleculaire massa van 120 kDa, en gp41. Gp120 bevindt
zich buiten de cel, gp41 ligt ingebed in het virusmembraan (figuur 5).
Figuur 6. De replicatiecyclus van HIV (van: research.bidmc.harvard.edu).
Voor details, zie tekst.
Gp120 en gp41 zijn essentieel voor het infecteren van nieuwe cellen (Haseltine & WongStaal, 1988). Het gp120 envelop eiwit kan binden aan CD4, een eiwit dat zich bevindt op het
membraan van verschillende type cellen van het immuunsysteem. Wanneer gp120 bindt aan
13
een cel met CD4 en een chemokinereceptor fuseren de membranen van het virus en de cel
onder invloed van het gp41 envelopeiwit. De chemokinereceptoren CCR5 en CXCR4 dienen
als coreceptoren voor de HIV binding aan de cel. Vervolgens komt de inhoud van het
virusdeeltje vrij in de cel. Cellen van het immuunsysteem met CD4 en chemokine receptoren
op hun membraan zijn dendritische cellen, macrofagen, monocyten en met name T-helper
lymfocyten. De laatste zijn dan ook de voornaamste targetcel van HIV. CCR5 bevindt zich op
dendritische cellen, macrofagen en CD4 T-cellen, CXCR4 bevindt zich vrijwel alleen op Tcellen. Het vermogen van HIV om verschillende celtypen te infecteren, het zogenaamde
tropisme van het virus, wordt bepaald door de aanwezigheid van deze specifieke receptoren
op het celoppervlak. Er bestaan verschillende HIV varianten en het celtype dat ze infecteren
wordt met name bepaald door het gebruik van de chemokinereceptor. De HIV varianten die
geassocieerd worden met de primaire infectie gebruiken CCR5 als coreceptor en vereisen
slechts een laag niveau van CD4 op het celoppervlak. Omdat vooral macrofagen CCR5 op
hun oppervlak hebben en dus in het begin van de infectie geïnfecteerd raken, wordt ook wel
gesproken van de ‘Macrophage-tropic’ of M-tropic variant. Deze HIV variant is niet in staat
om syncytia te induceren en wordt dan ook Non Syncytia Inducing genoemd (NSI). Syncytia
zijn grote cellen die zich vormen doordat meerdere cellen fuseren (Gallo & Montagnier,
1988). In tegenstelling tot de M-tropic variant van HIV infecteert de ‘Lymphocyte-tropic’ of
T-tropic variant alleen T-cellen met hoge concentratie CD4 en gebruikt hiervoor de CXCR4
coreceptor. Deze HIV variant is wel in staat syncytia-vorming te induceren en wordt dan ook
wel Syncytia Inducing (SI) genoemd. Het blijkt dat het M-tropic (NSI) fenotype van HIV
vooral gevonden wordt in recent geïnfecteerde individuen en dus betrokken is bij de
transmissie van HIV. Later in de infectie vindt de switch van CCR5 naar CXCR4 als
coreceptor plaats (en van NSI naar SI) en dit blijkt gepaard te gaan met afname van de
hoeveelheid CD4 T-cellen en progressie naar AIDS (Connor et al., 1997). Bewijs voor het
belang van chemokinereceptoren bij HIV infectie komt voort uit studies naar exposeduninfected (EU) individuen. Dit zijn personen die ondanks herhaaldelijke blootstelling aan
HIV niet geïnfecteerd raken. Eén reden van deze resistentie blijkt een mutatie in de CCR5
coreceptor te zijn.
1.3. Verantwoording onderzoek
Normaliter leidt 75% van de HIV infecties binnen 10 jaar tot AIDS. Zoals reeds gezegd zijn
een lage hoeveelheid CD4+ T-cellen en een hoge viral load kenmerkend voor deze
aandoening. Er bestaat echter een kleine groep individuen die na HIV infectie voor meer dan
10 jaar asymptomatisch blijven en een stabiel aantal CD4+ T-cellen hebben zonder
14
antivirale medicijnen te nemen. Het profiel van deze zogenaamde Long Term Non
Progressors (LTNP) of Long Term Survivors (LTS) lijkt sterk op dat van ongeïnfecteerde
individuen. Deze groep individuen is dan ook zeer interessant om te bestuderen, aangezien
zij wellicht unieke virologische en immunologische kenmerken hebben. Daarom is het nuttig
om een uitgebreide vergelijking te maken tussen LTNP en progressors. Normaliter hangt het
risico op infectie samen met het aantal blootstellingen aan het virus maar er bestaat ook een
groep mensen die herhaaldelijk blootgesteld is aan HIV, maar niet geïnfecteerd geraakt is
(Exposed-Uninfected; EU). Wellicht kan ook deze groep perspectief bieden voor nieuwe antiHIV therapieën. De huidige therapieën volstaan namelijk niet meer vanwege hun enorme
pillenlast, bijwerkingen en resistentie.
Om een goede vergelijking te kunnen maken tussen LTNP/EU en progressors is
natuurlijk geprobeerd invloeden van leeftijd, sexe, etniciteit en lengte van de HIV infectie uit
te schakelen door vergelijkbare klinische cohorten samen te stellen.
Er zijn al een paar parameters bekend die bij kunnen dragen aan de gezonde klinische staat
van LTNP en EU:
•
Lage viral load of replicatie-defect virus
•
Resistentie van targetcellen (vb CCR5 mutatie)
•
HIV-specifieke antilichamen of cellen die in staat zijn infectie of verspreiding
te voorkomen
Op deze parameters is uitvoerig getest en ze bleken in deze studies niet significant meer
voor te komen in de LTNP- en de EU-groep dan in de controlegroep (Barker et al., 1998b).
Aangezien de cellulaire immuunrespons een essentiële rol speelt in de afweer van de
gastheer tegen virale infectie veronderstelde men dat deze cel-gemedieerde kant van het
immuunsysteem wel eens verantwoordelijk zou kunnen zijn voor de klinisch gezonde staat
van LTNP en EU personen.
15
2. De CD8+ cel Antivirale Factor (CAF)
2.1. Identificatie CNAR en CAF
De cellulaire immuunrespons vormt een belangrijk deel van de afweer van de gastheer
tegen virale infectie. Halverwege jaren '80 werd voor het eerst een effectieve anti-HIV
cellulaire immuunrespons bij een HIV-geïnfecteerd individu waargenomen (Walker et al.,
1991). CD8+ T-cellen spelen een belangrijke rol bij deze cellulaire immuniteit. CD8+ Tcellen blijken in staat HIV replicatie in geïnfecteerde CD4+ T-cellen te onderdrukken
(Tsubota et al., 1989). Er is onderzoek gedaan naar het mechanisme waarop CD8+ cellen de
HIV replicatie in CD4+ cellen weten te onderdrukken. Aangezien contact tussen CD8+ cellen
en geïnfecteerde CD4+ cellen in eerste instantie noodzakelijk leek voor de inhibitie van
virusgroei, ging men aanvankelijk uit van een cytotoxisch mechansime (Tsubota et al.,
1989). De cytotoxische CD8+ T-cel afweer tegen HIV is al geruime tijd bekend en het
mechanisme van werking wordt dan ook goed begrepen. Cytotoxische T-cellen (CTLs) zijn in
staat virale antigenen gepresenteerd op het MHC van geïnfecteerde cellen te herkennen en
vervolgens de geïnfecteerde cel te doden via lysis of apoptose. Apoptose is
geprogrammeerde celdood. HIV kan CD4+ cellen ertoe aanzetten zelfmoord te plegen. Het
molekuul wat hierbij een belangrijke rol speelt is gp120. Apoptose wordt geïnduceerd
wanneer twee gp120-CD4 complexen ‘gecrosslinked’ worden door een antilichaam. Deze
‘crosslinking’ zet de CD4+ cel aan tot apoptose (Cohen, 1993). De antigenen van HIV die
CTLs herkennen zijn voornamelijk epitopen van virale eiwitten als pol, nef, gag en env. Deze
cytotoxische respons ontstaat vlak na de infectie, nog voordat er antilichamen aanwezig zijn,
en zorgt waarschijnlijk voor de initiële daling van het aantal CD4+ T-cellen. Uit onderzoek is
gebleken dat de cytotoxische T-cel reactie gedurende alle fasen van de HIV infectie
aanwezig blijft en niet afneemt naarmate de ziekte vordert. Hoge CTL concentraties blijken
niet in staat infectie te verhinderen (reviewed in Levy et al., 1996). Hieruit blijkt dat de
cytotoxische T-cel respons niet geheel verantwoordelijk kan zijn voor de gezonde klinische
staat van LTNP en EU.
Andere studies hebben aangetoond dat CD4+ cellen niet geëlimineerd worden in een
co-cultuur met CD8+ cellen (Walker et al., 1991). In deze studies is de cytotoxiciteit
onderzocht door te kijken naar het aantal HIV-geïnfecteerde CD4+ cellen voor en na cocultuur met antivirale CD8+ cellen. Hieruit bleek dat een co-cultuur van CD8+ cellen met
geïnfecteerde CD4+ cellen aanvankelijk zorgde voor een reductie van het aantal
geïnfecteerde CD4+ cellen, maar 7 dagen later voor een toename van geïnfecteerde CD4+
cellen. Deze resultaten bevestigen dat suppressie van de virale replicatie in geïnfecteerde
CD4+ cellen door CD8+ cellen niet veroorzaakt wordt door een cytotoxisch mechanisme.
16
CD8+ cellen blijken zelfs in staat een toename van HIV-geïnfecteerde cellen wel te kunnen
vertragen, naar niet te kunnen voorkomen (Walker et al., 1991).
Het bleek moeilijk om virus te isoleren uit T-celculturen van LTNP. Wanneer uit deze
LTNP culturen echter de CD8+ cellen verwijderd werden, was er binnen een aantal dagen
virusreplicatie te detecteren in de overgebleven cellen (Walker et al., 1991). Er blijkt dus wel
virus aanwezig te zijn in deze cellen, maar de virusreplicatie wordt in toom gehouden door
de CD8+ T-cellen. Deze in vitro bevindingen laten zien dat CD8+ cellen een rol spelen bij de
controle van HIV replicatie zonder de virusgeïnfecteerde cellen te doden.
Inmiddels hebben verscheidene groepen deze nieuwe activiteit van CD8+ cellen, de
CD8+ cel Non-cytotoxische Antivirale Respons of CNAR, laten zien (Levy et al., 1996). Er
zijn twee methoden gebruikt om deze CD8+ cel-specifieke activiteit aan te tonen: de
endogene assay en de acute infectie assay. Bij de endogene assay worden de op natuurlijke
wijze geïnfecteerde CD4+ cellen gekweekt in aanwezigheid van CD8+ cellen. Dit gebeurt
met verschillende CD8+:CD4+ ratio’s. In de acute infectie assay worden ongeïnfecteerde
CD4+ cellen geïnfecteerd met HIV, en opgekweekt met CD8+ cellen van LTNP, wederom
met verschillende CD8+:CD4+ ratio’s. Het antivirale effect wordt bepaald door de virale
replicatie bij verschillende CD8+:CD4+ ratio’s te vergelijken met de virale replicatie zonder
CD8+ cellen. CNAR is in vitro aangetoond door CD8+ cellen van een LTNP te mixen met
normale CD4+ cellen, die acuut geïnfecteerd waren met HIV. De virale replicatie bleek met
meer dan 90% gereduceerd te worden. CD8+ cellen van progressors lukt dit vrijwel niet.
Bovendien bleek dit ook veel efficiënter te gaan met CD8+ cellen van LTNP dan met CD8+
cellen van progressors: er waren ruim 3 keer zoveel CD8+ cellen van progressors dan van
LTNP nodig om tot een 90% suppressie van de virale replicatie te komen (Levy et al., 1996).
De resultaten van deze assays geven een indicatie voor een correlatie tussen een sterke
antivirale respons en een gezonde klinische staat. De grootste CNAR activiteit wordt
teruggevonden in LTNP en ontbreekt vrijwel geheel in mensen met AIDS. Deze antivirale
activiteit van CD8+ T-cellen wordt teruggevonden in bloed en lymfeknopen van HIVgeïnfecteerde individuen (Levy et al., 1996). Terwijl de CTL respons afhankelijk is van MHC1 blijkt de non-cytotoxische anti-HIV activiteit niet door het MHC bepaald te worden
(Mackewicz et al., 1998).
Gelijksoortige waarnemingen zijn gedaan bij HIV2 en ‘Simian Immunodeficiency
Virus’ of SIV. SIV replicatie in makaken bleek drastisch toe te nemen wanneer gebruikt
gemaakt werd van een antilichaam tegen CD8+ T-cellen (Zhang et al., 2002). CNAR blijkt
dus niet specifiek te zijn voor een bepaald type retrovirus: deze antivirale respons is in staat
replicatie van zowel HIV1, HIV2 als ‘Simian Immunodeficiency Virus’ of SIV te inhiberen
17
(Levy et al., 1996). Bovendien is CNAR activiteit inmiddels ook gevonden bij malaria en
hepatitis B infecties. Deze antivirale respons blijkt dus niet alleen voorbehouden aan HIV.
CNAR verschijnt vlak na de HIV infectie, nog voordat er antilichamen aanwezig zijn
(Mackewicz & Yang, 1994). CNAR lijkt samen met CTLs vlak na infectie het virus te
controleren. Het is aangetoond dat CNAR de HIV transcriptie onderdrukt en niet ingrijpt op
andere stappen in de virale replicatie (Mackewicz et al, 1995). Ook de CNAR die de EU
individuen bezat bleek voldoende om in vitro infectie van andere cellen te voorkomen
(Stranford et al., 1999). Dit zou kunnen betekenen dat CNAR ook bijdraagt aan het
beschermen tegen HIV infectie.
Het feit dat CD8+ cellen HIV replicatie niet via een cytotoxische reactie controleren,
zou kunnen betekenen dat direct contact tussen CD8+ en CD4+ cellen niet noodzakelijk is.
Om deze mogelijkheid te onderzoeken zijn HIV-geïnfecteerde CD4+ cellen ofwel direct in
contact met CD8+ cellen of gescheiden van CD8+ cellen door een semi-permeabel
membraan opgekweekt. Direct contact leidde zoals verwacht tot complete eliminatie van
detecteerbare virale replicatie. Bij gebruik van een semi-permeabel membraan tussen de
CD8+ en de CD4+ cellen bleek ook substantiële remming van de virale replicatie op te
treden. Deze resultaten laten zien dat CD8+ cellen een of andere oplosbare antivirale factor
produceren om HIV replicatie te onderdrukken. Deze factor staat nu bekend als de CD8+ cel
antivirale factor of CAF. Voor complete suppressie van de HIV replicatie is wel direct contact
tussen de twee celtypen nodig (Walker et al., 1991). CAF is ook aangetoond door
geïnfecteerde CD4+ cellen bloot te stellen aan gefilterde supernatanten van gekweekte
CD8+ cellen (reviewed in Levy et al., 1996).
2.2.
Kenmerken CAF
Deze non-cytotoxische antivirale CAF activiteit wordt slechts in zeer lage concentraties
gevonden in de vloeistoffen van CD8+ celculturen en gekloneerde CD8+ cellen (Levy, 2003).
Door deze zeer lage concentratie is het zuiveren van CAF vooralsnog niet gelukt, waardoor
de identiteit van CAF voorlopig nog onbekend blijft (Geiben-Lynn, 2002). Toch heeft men
enkele eigenschappen van deze factor weten te achterhalen, die wellicht kunnen bijdragen
aan het achterhalen van de identiteit van CAF.
CAF activiteit is waargenomen in de CD8+ T-cellen van SIV-geïnfecteerde makaken
en HIV-geïnfecteerde chimpansees (Zhang et al., 2002). Bovendien blijkt ook CAF
geproduceerd door CD8+ T-cellen van HIV2-geïnfecteerde bavianen de replicatie van HIV1
te onderdrukken (Locher et al., 1999) CAF blijkt in staat de replicatie van verschillende HIV
stammen, zowel M-tropic als T-tropic, te onderdrukken en wordt het meest geproduceerd in
18
asymptomatische personen. Proliferatie en activatie van CD4+ cellen worden niet beïnvloed
door de antivirale factor en wanneer geïnfecteerde CD4+ cellen verwijderd worden uit een
omgeving met CAF neemt de HIV replicatie toe (Levy et al., 1996). De door CD8+ cellen
gereduceerde HIV replicatie kan gemeten worden met behulp van drie parameters: Reverse
Transcriptase (RT) activiteit, HIV eiwitsynthese en HIV RNA expressie. CAF activiteit lijkt
virale transcriptie te inhiberen. Dit blijkt uit het feit dat de concentraties viraal RNA in
geïnfecteerde cellen opgekweekt met CD8+ cellen gereduceerd is. Op dag 0 van het
experiment bevatte 13% van de CD4+ cellen HIV RNA, maar na toevoeging van CD8+ cellen
werd deze hoeveelheid met maar liefst 94% gereduceerd (op dag 2). Dus binnen twee
dagen blijken CD8+ cellen in staat de produktie van viraal RNA en daarmee virale eiwitten in
CD4+ cellen te remmen.
Bovendien is aangetoond dat CAF-bevattend medium in staat is expressie van genen
van de HIV ‘Long Terminal Repeat’ of LTR te blokkeren (Mackewicz et al., 1995). Het
mechanisme van inhibitie van LTR activatie door CAF is nog niet bekend. Het is aangetoond
dat CAF inhibitie van de LTR-gereguleerde genexpressie gemedieerd kan worden door
cytokine-gestimuleerde activatie van ‘Nuclear Factor-κB’ ofwel NF-κB (reviewed in Chang et
al., 2002). In 2002 is door Chang et al. verder onderzoek gedaan naar de moleculaire
mechanismen van CAF-gemedieerde inhibitie van HIV. Zij hebben aangetoond dat dit
inhiberende effect van CAF op de LTR activatie van HIV wordt gemedieerd via ‘Signal
Transducers and Activators of Transcription’ ofwel STAT1 activatie. STATs zijn een familie
cytoplasmatische eiwitten die bijdragen aan controle van de genexpressie als cellen in
contact komen met hormonen, zoals cytokines (Darnell, 1997). STAT eiwitten zijn het eerst
geïdentificeerd als transcriptiefactoren in interferon signaaltransductie systemen (Chang et
al., 2002). Tot nu toe zijn er zeven STAT-genen in zoogdieren gevonden (Darnell, 1997).
STAT eiwitten kunnen geactiveerd worden door een groot aantal extracellulaire stimuli, zoals
cytokines, hormonen en groeifactoren. STAT eiwitten spelen een centrale rol in een groot
aantal biologische activiteiten, zoals celdifferentiatie en de controle van celgroei. STATs
hebben onder andere één enkele tyrosine fosforylatieplaats, een SH2-domein en een DNAbindingsplaats. STAT eiwitten worden geactiveerd door tyrosine fosforylatie, dimeriseren
vervolgens via een SH2-domein en gaan de kern binnen om daar genexpressie te reguleren
(Darnell, 1997). Er is geen bewijs dat zich een STAT bindingsplaats bevindt in de LTRs van
HIV. Wel is er een bindingsplaats aanwezig voor de eiwitten van ‘Interferon Regulatory
Factors 1 en 2’ ofwel IRF-1 en IRF-2. Het is bekend dat eiwitten van de IRF-familie
gereguleerd worden door STAT eiwitten en geïnduceerd worden door een groot aantal
stimuli. CAF is in staat STAT1 activatie en IRF-1 genexpressie te induceren. De activiteit van
19
CAF blijkt correlatie te vertonen met STAT1 activatie. Het inhiberende effect van CAF op HIV
replicatie en LTR activatie was verdwenen in STAT1-deficiënte cellen en cellen die een STAT1
dominant negatieve mutant tot expressie brachten. Wanneer er STAT1-eiwitten aan deze
STAT1-deficiënte cellen toegevoegd worden, bleek de inhiberende functie van CAF zich te
herstellen. Daarnaast werd aangetoond dat CAF in staat was de expressie van ‘Interferon
Regulatory Factor 1’ ofwel IRF-1 te induceren en dat de IRF-1 gen inductie STAT1afhankelijk was. Al deze resultaten laten zien dat CAF STAT1 activeert, wat vervolgens leidt
tot inductie van IRF-1 en inhibitie van LTR-gereguleerde genexpressie (Chang et al., 2002).
Deze studie helpt een van de moleculaire mechanismen van de gastheerafweer tegen HIV te
verduidelijken.
Aangezien andere antivirale effectormolekulen, zoals perforine en granzymes, in
exocytische granules van CD8+ T-cellen liggen, is de mogelijkheid onderzocht dat CAF zich
in granules bevindt. Naast deze effectormolekulen liggen ook ander immuunfactoren, zoals
granulysine en β-chemokines in granules. In naïeve T-cellen zijn geen granules
detecteerbaar, maar na activatie stijgt de granule-inhoud en bereikt zijn piek zo’n 5 tot 10
dagen later. Uit de resultaten van dit onderzoek is gebleken dat CAF niet in granules van
CD8+ T-cellen van HIV-geïnfecteerde individuen ligt. Daarentegen werd er wel anti-HIV
activiteit gedetecteerd in de cytoplasmatische fragmenten van deze CAF-producerende
CD8+ T-cellen. Deze bevindingen tonen aan dat CAF niet opgeslagen ligt in granules en
opnieuw gesynthetiseerd moet worden indien nodig (Mackewicz et al., 2003b).
In pogingen om de identiteit van CAF te achterhalen, die in de volgende paragraaf
uitgebreid behandeld zullen worden, werd ontdekt dat een aantal protease inhibitors in staat
is de anti-HIV activiteit van CD8+ T-cellen te inhiberen. Voornamelijk leupeptine bleek in
staat zowel de anti-HIV activiteit in CD8+ T-celculturen als CNAR dosisafhankelijk met meer
dan 95% te inhiberen. Vanwege de chemische kenmerken van leupeptine, zoals de positieve
lading, zal leupeptine CD8+ cellen niet binnengaan. Waarschijnlijk heeft leupeptine dus
invloed op een membraangeassocieërd eiwit. Ook leidde voorbehandeling van CD8+ cellen
met leupeptine tot een gereduceerde CNAR. Het inhiberende effect van protease inhibitors
heeft geen invloed op celgroei, expressie of activatie van antigenen of viabiliteit van CD8+
of geïnfecteerde CD4+ cellen. Deze resultaten tonen aan dat CNAR wellicht een protease of
een eiwit wat interacteert met een protease bevat. Het is mogelijk dat er proteolyse van
CD8+ celprodukten plaatsvindt. Waarschijnlijk produceren CD8+ cellen een protease die in
staat is een ander eiwit antiviraal te maken. In een derde van de gevallen heeft leupeptine
geen effect op CNAR/CAF. Dit zou te verklaren zijn doordat de antivirale factor in dat geval
al geactiveerd is en dus niet afhankelijk is van protease activiteit. Het is mogelijk dat CNAR
20
gemedieerd wordt door twee onafhankelijke CD8+ cel anti-HIV mechanismen: een waar een
protease en zijn substraat bij betrokken zijn en een ander ongevoelig voor protease
inhibitors. Aangezien de concentratie CAF aanwezig in CD8+ T-cellen erg laag is, is CAF dus
moeilijk te isoleren en identificeren. Wellicht zou leupeptine gebruikt kunnen worden als een
soort ‘probe’ of affiniteitsligand voor CAF. Het eiwit zou gelabeled en geïsoleerd kunnen
worden met leupeptine of een andere protease inhibitor (Mackewicz et al., 2003a).
Aangezien CAF gevoelig bleek te zijn voor proteases is vast komen te staan dat CAF
een eiwit is (Mackewicz et al., 2003a). CAF is een eiwit dat uitsluitend geproduceerd lijkt te
worden door geactiveerde CD8+ cellen, voornamelijk CD8+CD25+ cellen (Levy et al.,
1996). CAF heeft duidelijke biochemische en fysische eigenschappen die goed te gebruiken
zijn bij de identificatie. Uit onderzoeken blijkt de lengte van het eiwit vooralsnog te variëren
tussen de 10-50 kDa. Het eiwit blijkt resistent tegen hitte en blijft intact na 10 minuten bij
86°C (Mackewicz et al., niet-gepubliceerd, reviewed in Levy et al., 1996). Ook blijkt het eiwit
een lage pH te kunnen verdragen. De anti-HIV activiteit blijft gehandhaafd bij een pH van
2.0 (Cocchi et al., 1995). Aangezien CAF stabiel blijft bij extractie met ether bevat CAF geen
belangrijke lipid-component (Mackewicz et al., 2003a). Pre-incubatie van CD4+ cellen met
CAF heeft geen invloed op de vatbaarheid voor infectie. CD4+ cellen blijken CAF niet op te
nemen en dus bindt CAF waarschijnlijk niet irreversibel aan targetcellen (Mackewicz et al.,
niet-gepubliceerd, reviewed in Levy et al., 1996). CAF productie bereikt 5-9 dagen na de
activatie van CD8+ cellen een maximum (Levy et al., 1996).
2.3. Kandidaten CAF
Een groot aantal interleukines, interferonen, chemokines, groeifactoren en andere cytokines
met anti-HIV activiteit zijn bekeken als kandidaten voor CAF. De belangrijkste zullen
besproken worden. Al deze kandidaten bleken niet alle kenmerken van CAF te vertonen,
hetgeen suggereert dat CAF uit meerdere componenten bestaat. Wel heeft de zoektocht
naar CAF een groot aantal nieuwe anti-HIV factoren aangetoond.
2.3.1. Cytokines en chemokines
Aangezien cytokines belangrijke boodschappers binnen het immuunsysteem zijn, is als
eerste onderzocht of CAF misschien een cytokine was. Men heeft gekeken naar de
concentraties van bekende cytokines aanwezig in CAF-bevattende en niet CAF-bevattende
celculturen. Daarnaast is gekeken naar het effect van recombinante cytokines op HIV
21
replicatie en het effect van cytokine neutraliserende antilichamen op CAF activiteit. Men
heeft zich voornamelijk gericht op een groep van chemoattractieve cytokines, de
chemokines, die in staat blijken te interfereren met de binnenkomst van HIV in de cel
(Barker et al., 1998a). In 1995 werden de β-chemokines RANTES, ‘Macrophage
Inflammatory Protein 1α’ of MIP-1α en MIP-1β geïdentificeerd als de belangrijkste anti-HIV
factoren uitgescheiden door CD8+ T-cellen (Cocchi et al., 1995). Twee eiwitten gezuiverd uit
het supernatant van CD8+ T-celculturen bleken de sequentie te vertonen van RANTES, een
polypeptide van 8 kDa dat behoort tot de β-chemokine familie, en MIP-1α, wederom een 8
kDa polypeptide dat nauw verwant is aan RANTES. Alle drie de chemokines werden in
verschillende concentraties uitgescheiden door CD8+ T-cellen. Vervolgens werd de invloed
van neutraliserende antilichamen tegen RANTES, MIP-1α en MIP-1β bekeken op de anti-HIV
activiteit. Alleen het antilichaam tegen RANTES bleek de anti-HIV activiteit gedeeltelijk te
blokkeren. RANTES bleek dus de meest effectieve inhibitor van de drie. De anti-HIV activiteit
bleek echter geheel te worden uitgeschakeld door een combinatie van neutraliserende
antilichamen tegen RANTES, MIP-1α en MIP-1β. Dit betekent dat de anti-HIV activiteit niet
kan worden toegeschreven aan de werking van een enkele chemokine, maar een gevolg is
van gecombineerde werking van verschillende chemokines. Deze drie chemokines bleken in
staat verschillende HIV1, HIV2 en SIV stammen dosis-afhankelijk te inhiberen. Het
fenomeen bleek dus niet afhankelijk van de HIV stam die gebruikt werd. Uitgesloten werd
dat de antivirale activiteit van RANTES, MIP-1α en MIP-1β het gevolg was van een negatief
effect op de celproliferatie (Cocchi et al., 1995).
Er werd dus verondersteld dat de β-chemokines RANTES, MIP-1α en MIP-1β
verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor de antivirale activiteit van CD8+ cellen (Cocchi et
al., 1995). Maar hoewel deze chemokines in hoge concentraties (0.5-1.0 µg/ml) een zekere
anti-HIV activiteit vertonen in de endogene assay, doen ze dit niet in de acute infectie assay.
Bovendien is er geen correlatie tussen de aanwezigheid van deze cellulaire factoren en de
CAF activiteit en zorgen antilichamen tegen chemokines niet voor het verdwijnen van de CAF
activiteit (Levy et al., 1996).
Naast CD4+ T-cellen zijn monocyten en macrofagen belangrijke targetcellen van HIV.
Macrofagen zijn waarschijnlijk een van de eerste celtypen die door HIV geïnfecteerd worden
(Barker et al., 1998a). Deze cellen kunnen de infectie verspreiden naar CD4+ T-cellen.
Infectie van macrofagen leidt niet noodzakelijkerwijs direct tot cytolyse, maar resulteert in
latentie of persistente chronische infectie (Moriuchi et al., 1996). Infectie met HIV kan leiden
tot een verlaagde antigeen presentatie van macrofagen doordat hun vermogen om cytokines
te produceren veranderd wordt. Wellicht kan HIV infectie ook de effector functie van
22
macrofagen veranderen, zoals de antilichaam-afhankelijke cytotoxiteit en het doden van
intracellulaire organismen (Barker et al., 1998a). Antilichaam-afhankelijke cytotoxiciteit
(Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxity = ADCC) houdt in dat targetcellen bedekt
met antilichamen gedood worden door CTLs of ‘Natural Killer’ (NK) cellen. ADCC wordt
geïnduceerd wanneer een antilichaam op het oppervlak van een targetcel interacteert met
receptoren op de cytotoxische T-cel (Janeway et al., 2001). Verschillende HIV1 stammen
verschillen in hun vermogen om macrofagen te infecteren. HIV1 stammen lijken tijdens
progressie van de ziekte hun tropisme voor macrofagen te verliezen (Moriuchi et al., 1996).
Hieruit blijkt dat macrofagen een belangrijke rol spelen in de pathogenese van de HIV
infectie en dan voornamelijk tijdens de primaire infectie en de latente periode. Preventie van
de HIV infectie van macrofagen is dus belangrijk om het verspreiden van de infectie te
voorkomen en de cellulaire immuunrespons van het geïnfecteerde individu in stand te
houden (Barker et al., 1998a). Helaas worden de mechanismen betrokken bij deze virale
latentie en persistente infectie van macrofagen nog niet goed begrepen. Een aantal
cytokines, waaronder tumor necrosis factor α, IL-1 en IL-6, blijkt in staat HIV replicatie in
macrofagen te verhogen. Daarentegen blijken interferon α, β en γ, IL-10 en IL-13 HIV
replicatie in macrofagen juist te onderdrukken. Deze cytokines blijken echter weinig effect te
hebben op de HIV replicatie in T-lymfocyten. Hieruit valt op te maken dat regulatie van de
HIV replicatie door cytokines afhangt van het celtype (Moriuchi et al., 1996). Het is nog
onduidelijk of CAF activiteit in staat is de HIV replicatie in macrofagen te inhiberen. Om te
kijken naar de regulatie van de HIV replicatie in macrofagen zijn de supernatanten van
CD8+ T cellen getest op aanwezigheid van RANTES, MIP-1α, MIP-1β en nog een aantal
andere cytokines (Moriuchi et al., 1996). Aangetoond is dat de supernatanten van CD8+ Tcellen inderdaad in staat bleken HIV replicatie in macrofagen te onderdrukken. Er werd een
inhibitie van de virale replicatie van meer dan 90% waargenomen en deze suppressie was
dosis-afhankelijk. Nog een andere groep heeft suppressie van HIV replicatie in macrofagen
door CD8+ T-cellen laten zien (Barker et al., 1998a). Voor deze studie zijn co-culturen van
CD8+ T-cellen en acuut geïnfecteerde macrofagen in een 1:1 ratio gebruikt. Dit bleek te
resulteren in een 87% reductie van de reverse transcriptase activiteit (figuur 7). Om te
bepalen of het vermogen van de CD8+ cellen om HIV replicatie te onderdrukken het gevolg
was van een oplosbare factor werden de macrofagen van de CD8+ cellen gescheiden door
een permeabel membraan. Het bleek dat de CD8+ cellen in aanwezigheid van dit permeable
membraan nog steeds in staat waren virale replicatie te inhiberen en er dus inderdaad
sprake is van een oplosbare factor (figuur 7).
23
Figuur 7. Het vermogen van CD8+ T-cellen om HIV replicatie te onderdrukken na
scheiding van geïnfecteerde macrofagen door een semi-permeabel membraan
aangeduid met ‘transwell insert’ (uit: Barker et al., 1998a).
Na verwijderen van de CD8+ T-cellen bleek de reverse transcriptase activiteit weer toe te
nemen (figuur 8). Met celoverlevingsstudies werd aangetoond dat het zeer onwaarschijnlijk
was dat deze HIV suppressie veroorzaakt was door een cytotoxisch effect (Barker et al.,
1998a).
Figuur 8. Het effect van CD8+ T-cellen van HIV-geinfecteerde individuen op de
HIV replicatie in macrofagen (uit: Barker et al., 1998a). Na verwijdering van de
CD8+ T-cellen neemt de activiteit van het virale enzym reverse transcriptase
drastisch toe.
24
β-chemokines bleken HIV replicatie in macrofagen niet te kunnen onderdrukken
(Moriuchi et al., 1996). Antilichamen tegen RANTES, MIP-1α en MIP-1β waren niet in staat
de antivirale activiteit van CD8+ T-cellen in macrofagen te reduceren (Moriuchi et al., 1996).
Uit deze resultaten valt op te maken dat de β-chemokines, die wel in staat zijn HIV replicatie
te onderdrukken in CD4+ T-cellen, niet verantwoordelijk zijn voor de anti-HIV activiteit van
CD8+ T-cel supernatanten in macrofagen. Zoals gezegd zijn er enkele cytokines bekend,
onder andere IL-4, IL-10, IL-13, IFN-α, IFN-β en IFN-γ, die HIV infectie in macrofagen
kunnen inhiberen. Ook is bekend dat CD8+ T-cellen in staat zijn enige van deze cytokines,
IL-10, IL-13, IFN-α en IFN-γ, te produceren. Om te onderzoeken of het vermogen van CD8+
T-cellen om HIV replicatie te onderdrukken gerelateerd is aan de anti-HIV activiteit van deze
cytokines is wederom gebruik gemaakt van neutraliserende antilichamen tegen de
cytokines. Neutralisatie van elk van deze cytokines apart had vrijwel geen effect op de HIV
replicatie in macrofagen. Als alle neutraliserende antilichamen tegen de cytokines in
combinatie gebruikt werden, nam de HIV replicatie toe. De HIV replicatie bereikte echter
niet zijn maximum. Deze resultaten laten zien dat de anti-HIV activiteit van CD8+ T-cellen
het gevolg is van meerdere factoren en dat RANTES, MIP-1α en MIP-1β niet de enige antiHIV factoren zijn die geproduceerd worden door CD8+ T-cellen (Moriuchi et al., 1996).
Naast de β-chemokines is een andere chemokine, Interleukine 16 (IL-16),
voorgesteld als kandidaat voor CAF. IL-16 bleek echter niet detecteerbaar in CAF-bevattende
celculturen en is alleen in staat HIV replicatie te reduceren in hele hoge concentraties (> 1.0
µg/ml) Ook IL-16 heeft dus niet de identiteit van CAF (Levy et al., 1996).
2.3.2. Defensines
Defensines zijn kleine, cysteïne-rijke, kationische, antimicrobiële peptiden die door de
gastheer gecodeerd worden en deel uitmaken van de innate immunity. Defensines worden
geproduceerd als antwoord op microbiële produkten of proinflammatoire cytokines (Lehrer &
Ganz, 2002). Door gebruik te maken van de chemokine receptoren op dendritische en Tcellen zouden defensines ook bij kunnen dragen aan de acquired of adaptive immunity van
de gastheer (Yang et al., 2002). Defensines zijn in staat de membranen van een groot
spectrum van organismen, waaronder grampositieve en gramnegatieve bacteriën,
schimmels en virussen, permeabel te maken (Lehrer & Ganz, 2002). In hoge concentraties
zijn defensines toxisch voor zoogdiercellen. Defensines zijn slechts 2-6 kDa groot (figuur 9).
25
Figuur 9. Classificatie, grootte, structuur en activiteit van defensines in zoogdieren (uit: Yang et al.,
2002).
Ze lijken vanwege hun zwavelbruggen en clusters positief geladen aminozuren sterk op de
iets grotere (8-10 kDa) chemokines (Lehrer & Ganz, 2002). Op basis van hun grootte en
patroon van zwavelbruggen zijn defensines verdeeld in een α-, β- en θ-categorie (figuur 9).
Alle defensines zijn ontstaan uit een voorouderlijk gen wat bestond voordat de reptielen en
de vogels divergeerden. Alle typen defensines bevatten 6 cysteïnes en hebben grote βsheets, die gestabiliseerd worden door drie zwavelbruggen (figuur 9). Hoewel α- en βdefensines verschillen wat betreft de cysteïnes hebben ze dezelfde topologie. α-defensines,
die geïdentificeerd zijn in mensen, apen en enkele knaagdiersoorten, worden met name
geproduceerd door neutrofielen en macrofagen (Lehrer & Ganz, 2002). In elke onderzochte
zoogdiersoort zijn tot nu toe β-defensines aangetroffen. Hoewel in neutrofielen van koeien
meer dan 13 β-defensines zijn gevonden, worden in de meeste andere zoogdiersoorten βdefensines voornamelijk geproduceerd door epitheelcellen rondom verscheidene organen.
Vrij recentelijk is een nieuw type defensine, de θ-defensine, aangetroffen in het beenmerg
van de rhesusmakaak. Deze defensine bleek circulair te zijn door de fusie van twee
getrunceerde α-defensine precursors. Vervolgens zijn nog twee andere circulaire θdefensines gevonden in de rhesusmakaak (Cole et al., 2002).
Naast hun directe antimicrobiële effecten vertonen defensines ook
immunostimulatoire activiteiten zoals inductie van cytokine produktie en een chemotactisch
effect op T-lymfocyten, monocyten en dendritische cellen (Lehrer & Ganz, 2002, Yang et al.,
2002) (figuur 9).
26
In 1993 werd voor het eerst inhibitie van HIV replicatie door α-defensines
waargenomen (Nakashima et al., 1993). In 2002 werd met behulp van een protein-chip
technology een cluster eiwitten, die uitgescheiden wordt door geactiveerde CD8+ T-cellen
van LTNP, geïdentificeerd (Zhang et al., 2002). Deze kleine eiwitten bleken allemaal drie
intramoleculaire zwavelbruggen te bevatten, suggererend dat de eiwitten zeer nauw aan
elkaar gerelateerd zijn. Met behulp van specifieke antilichaamherkenning en bepaling van de
aminozuurvolgorde is vastgesteld dat deze eiwitten inderdaad α-defensines 1, 2 en 3 zijn.
De voornaamste bron van α-defensines is de neutrofiel (Lehrer & Ganz, 2002). Daarnaast
zijn er nog additionele producerende cellen bekend zoals B-cellen, NK cellen, macrofagen en
epitheelcellen. Aangezien α-defensines met name door cellen van het immuunsysteem
geproduceerd worden, is het niet zo verrassend dat α-defensines ook geproduceerd zouden
kunnen worden door CD8+ T-cellen. Daarmee zouden defensines interessante kandidaten
voor CAF zijn. Om de relatieve bijdrage van α-defensines 1, 2 en 3 aan de activiteit van CAF
te onderzoeken heeft men met behulp van antilichamen de α-defensines 1, 2 en 3
verwijderd uit de supernatanten van gekweekte CD8+ T-cellen van LTNP. Zowel de replicatie
van X4-virussen als van R5-virussen bleek hierdoor aanzienlijk gestimuleerd te worden. Dit
effect bleek dosis-afhankelijk te zijn: de anti-HIV activiteit van de CD8+ T-cel supernatanten
van LTNP nam af als de concentratie antilichaam tegen α-defensines 1, 2 en 3 toenam. Bij
een antilichaamconcentratie van 25 µg/ml was de anti-HIV activiteit tegen X4-virussen
vrijwel helemaal verdwenen. Ook de remmende activiteit tegen R5-virussen bleek
gereduceerd te worden, maar niet helemaal te verdwijnen. Dit zou verklaard kunnen worden
door een mogelijke activiteit van β-chemokines tegen R5-virussen (Cocchi et al., 1995).
Synthetische en gezuiverde α-defensines bleken ook, zonder cytotoxiciteit, in staat de
replicatie van HIV in vitro te inhiberen. Echter wanneer een α-defensine individueel getest
werd, bleek de remmende activiteit veel lager dan in combinatie met de andere αdefensines. Deze resultaten laten zien dat α-defensines 1, 2 en 3 wellicht gezamenlijk
bijdragen aan de anti-HIV activiteit van CAF. Het is mogelijk dat de anti-HIV activiteit
veroorzaakt wordt doordat verschillende defensines met elkaar interacteren, wellicht door de
vorming van heterodimeren. Helaas is het precieze mechanisme van werking nog niet
bekend (Zhang et al., 2002).
In 2004 werd de identiteit van defensines als actieve component van CAF echter
betwijfeld, en nog wel door dezelfde groep (Zhang et al., 2004). Aan de antivirale activiteit
van α-defensines werd niet getwijfeld, maar wel aan de cellulaire oorsprong van deze αdefensines. In een poging te bepalen welke specifieke CD8+ cel subpopulaties deze αdefensines produceren, kwam men tot de ontdekking dat de CD8+ T-cel supernatanten in
27
afwezigheid van ‘Peripheral Blood Mononuclear Cells’ (PBMCs) geen α-defensines bevatten.
Dit zou kunnen betekenen dat de α-defensines geproduceerd worden door een populatie
cellen binnen deze PBMCs. Om dit te bevestigen zijn de PBMCs behandeld met antilichamen
om neutrofielen te elimineren. Nu waren er geen α-defensines te detecteren in de
supernatanten van de gestimuleerde CD8+ T-cellen. Bovendien bleek met behulp van een
PCR-assay dat geen α-defensine mRNA kon worden aangetoond in CD8+ T-cellen (Zhang et
al., 2004). Waarschijnlijk lekken er tijdens het fixatieproces α-defensines vanuit neutrofielen
in andere cellen, zoals CD8+ T-cellen. Deze nieuwe bevindingen tonen aan dat α-defensines
niet geproduceerd worden door CD8+ T-cellen. Dit zou betekenen dat ze niet
verantwoordelijk zijn voor de CD8+ cel antivirale activiteit en dus geen kandidaat meer zijn
voor CAF. Het is ook mogelijk dat de naam CAF incorrect is en veranderd moet worden,
aangezien de CD8+ T-cel wellicht niet de enige producent is van de non-cytotoxische antiHIV activiteit. Na eliminatie van α-defensines en β-chemokines blijft er slechts zeer geringe
anti-HIV activiteit over. Er bestaat dus geen twijfel over de anti-HIV activiteit van αdefensines; het mechanisme van hun antivirale werking verdient verdere bestudering.
In 2003 is onderzoek gedaan naar de effecten van α-defensines, en dan met name αdefensine 1, op de verschillende fasen van de HIV infectie en de bijdrage aan de CAF
activiteit tegen HIV (Chang et al., 2003). α-defensine 1 bleek de HIV infectie na de
binnenkomst van het virus te beïnvloeden en HIV genexpressie te onderdrukken.
Antilichamen tegen de α-defensines bleken echter niet in staat het inhiberende effect van
CAF op de HIV genexpressie te onderdrukken. De bijdrage van α-defensine 1 aan CAF
activiteit werd verder uitgezocht door te kijken naar activatie van STAT1 tyrosine
fosforylatie. α-defensine 1 bleek uit deze resultaten niet verantwoordelijk voor de anti-HIV
activiteit van CAF. CAF en α-defensine 1 hebben verschillende eigenschappen. Hoewel ze
beiden in staat zijn de HIV infectie en de genexpressie te inhiberen, werkt alleen CAF door
STAT1 te activeren. α-defensine 1 is in staat HIV infectie te remmen via een STAT1onafhankelijke signaaltransductie (Chang et al., 2003).
Men heeft in het humane beenmerg mRNA gevonden dat homoloog is aan de
precursors van de circulaire defensines in de rhesusmakaak. Vanwege een stopcodon in de
signaalsequentie is er hier waarschijnlijk sprake van een pseudogen. De sterke conservering
van het rhesus en humane mRNA suggereert dat deze mutatie in mensen vrij recentelijk in
de evolutie is ontstaan. Toch is de sequentie gebruikt om retrocycline, de voorouderlijke
vorm van humane circulaire defensines, te synthetiseren. Retrocycline is voor 88,9%
identiek aan de precursor van de rhesus circulaire defensines. Retrocycline bleek humane
CD4+ T-cellen in vitro te kunnen beschermen tegen HIV infectie met zowel T- als M-tropic
28
stammen. Retrocycline is veelbelovend voor de ontwikkeling van een middel dat HIV infectie
kan voorkomen (Cole et al., 2002).
2.3.3. Overige kandidaten
CD8+ T-cellen scheiden oplosbare factor(en) uit die in staat zijn zowel R5- als X4-tropic
stammen van HIV te remmen. Het is reeds bekend dat CCR5 chemokine liganden,
uitgescheiden door geactiveerde CD8+ T-cellen, bijdragen aan de antivirale activiteit van
deze cellen. Deze chemokines zijn echter niet de enige CD8+ T-cel antivirale factoren. Dit
blijkt met name uit het feit dat de chemokines niet in staat zijn de replicatie van X4-tropic
stammen, die CXCR4 als alternatieve coreceptor gebruiken, te remmen, terwijl CAF in staat
is zowel R5- als X4-tropic stammen te remmen. Recentelijk zijn bij verdere pogingen om de
identiteit van CAF te bepalen twee produkten van CD8+ T-cellen geïdentificeerd die in staat
zijn X4-Tropic stammen van HIV te remmen (Geiben-Lynn, 2002b). Deze twee componenten
verschillen in massa en in het vermogen om aan heparine te binden. Het grotere heparinebindende eiwit blijkt een gemodificeerde vorm van anti-thrombine III (ATIII) te zijn.
Normaal gesproken is ATIII 53 kDa groot, maar in gemodificeerde vorm 43 kDa. Het is nog
niet bekend of deze reductie in grootte het gevolg is van een proteolytisch proces of van
deglycosylering. Onder fysiologische omstandigheden bestaat ATIII in verschillende vormen.
ATIII circuleert in een inactieve L-vorm, waarbij de reactieve COOH-terminale loop wordt
afgeschermd en niet aan targeteiwitten kan binden. Wanneer ATIII echter heparine bindt,
ontstaat een andere conformatie, de zogenaamde S-vorm. De COOH-terminale loop komt
bloot te liggen en de bindingsaffiniteit voor thrombine neem enorm toe. Vervolgens
dissocieert het thrombine-ATIII complex langzaam en wordt de reactieve loop van ATIII
gekliefd door het vrijgekomen thrombine. Deze nieuwe ‘Relaxed’ (R) vorm van ATIII is niet
in staat targeteiwitten te binden. De R-vorm van ATIII blijkt anti-angiogene activiteit te
hebben en in staat te zijn tumorgroei te remmen. Om te bepalen welke vorm van ATIII in
staat is HIV te remmen, zijn de R- en de L-vorm gemaakt uit de commercieel verkrijgbare
S-vorm. Zowel de R- als de S-vorm waren in staat de replicatie van X4-tropic stammen van
HIV te remmen. De L-vorm vertoonde geen anti-HIV activiteit. De S-vorm bleek het X4-virus
het efficiëntst te remmen. Bovendien bleek de S-vorm ook SIV replicatie aanzienlijk te
remmen. Zowel de R- als de S-vorm bleken stabiel te zijn bij hoge temperatuur en gevoelig
voor proteases. V8 protease was in staat de heparine bindingsplaats te klieven en zo de
activiteit van de S-vorm te verlagen. Dit suggereert dat deze heparine bindingsplaats van
belang is voor de inhibitie van HIV. Alle ATIII vormen bleken niet toxisch voor CD4+ T-cellen
en hadden geen invloed op de celoverleving of celgroei. Vervolgens is men de CD8+ T-cellen
29
van HIV-seropositieve individuen gaan vergelijken met de CD8+ T-cellen van HIVseronegatieve individuen. In tegenstelling tot de CD8+ T-cellen van HIV-seropositieve
individuen bleken ongestimuleerde CD8+ T-cellen HIV replicatie niet substantieel te
remmen, ook niet in aanwezigheid van heparine. De 43 kDa vorm van ATIII was hier niet te
detecteren. Hieruit blijkt dat alleen geactiveerde CD8+ T-cellen van HIV-geïnfecteerde
personen in staat zijn ATIII te modificeren tot een vorm met anti-HIV activiteit.
Seronegatieve CD8+ T-cellen produceren deze antivirale activiteit niet of in mindere mate
omdat de CD8+ T-cellen minder geactiveerd worden, wat resulteert in minder factor om
ATIII te modificeren. Tot nu toe heeft de zoektocht naar CAF zich gericht op factoren die
uitgescheiden worden door CD8+ T-cellen. Voor het eerst is nu aangetoond dat CD8+ Tcellen een serumeiwit kunnen activeren om HIV te remmen. Dit maakt het aannemelijk dat
een deel van CAF een protease is. Waarschijnlijk remt ATIII HIV niet als competitieve
agonist van CXCR4. Er is namelijk niet waargenomen dat het eiwit CXCR4 downreguleert
(Geiben-Lynn, 2002b). Een andere groep heeft aangetoond dat ATIII inderdaad antivirale
activiteit heeft bij concentraties van 25-50 µg/ml, maar dit effect is niet consistent
teruggevonden bij HIV-geïnfecteerde CD4+ cellen. Bovendien kunnen CAF en CNAR gewoon
worden aangetoond in afwezigheid van serumeiwitten, waaronder ATIII (Mackewicz et al.,
niet gepubliceerd, reviewed in Levy et al., 2003). Toch zijn de bevindingen op het gebied
van ATIII relevant voor het onderzoek dat liet zien dat CAF een protease-gevoelig eiwit is
(Levy et al., 1996). Bepaalde protease inhibitors, zoals leupeptine, waren in staat CAF en
CNAR activiteit in 70% van de gevallen te blokkeren (Mackewicz et al., 2003a) (zie
kenmerken CAF). Het mechanisme van deze reactie is nog niet bekend, maar zou de
activiteit van een protease op een of ander produkt van CD8+ cellen kunnen inhouden. In
30% van de gevallen heeft leupeptine geen invloed op de antivirale activiteit van CAF. De
oorzaak hiervan zou kunnen zijn dat het precursor eiwit al gekliefd is of dat er nog
onbekende anti-HIV eiwitten actief zijn (Levy et al., 2003). De identiteit van de eiwitten die
beïnvloed worden door de protease inhibitor is nog niet bekend, maar zou wel eens hetzelfde
kunnen zijn als het hypothetische eiwit dat ATIII modificeert.
CD8+ T-cellen zijn de belangrijkste bron voor de produktie van non-cytotoxische
factoren die in staat HIV replicatie te remmen. In een poging om deze factoren verder te
karakteriseren heeft men de genexpressie profielen van geactiveerde CD8+ T-cellen
bekeken. Hieruit bleek dat de ‘Natural Killer Enhancing Factor A’ ofwel NKEF-A en NKEF-B,
meer geproduceerd werden door CD8+ T-cellen van HIV-seropositieve dan door CD8+ Tcellen van HIV-seronegatieve personen. In het genexpressie profiel van geactiveerde CD8+
T-cellen bleken deze componenten meer geproduceerd te worden. Normaliter worden NKEF-
30
A en –B geproduceerd bij oxidatieve stress. Wanneer T-cellen getransfecteerd werden met
NKEF-A en –B cDNA bleek HIV replicatie in vitro te worden geremd. De NKEFs bleken ook in
staat replicatie van SIV te remmen. Het bloedplasma van LTNP bleek significant meer NKEFB te bevatten dan het plasma van symptomatische individuen. Dit significante verschil
tussen LTNP en symptomatische patiënten is echter waarschijnlijk het gevolg van een
grotere cytotoxische activiteit van CD8+ T-cellen van LTNP. In vitro bleek HIV replicatie
afgenomen wanneer NKEF eiwitten in CD4+ T-cellen tot overexpressie waren gebracht. Deze
resultaten laten zien dat NKEF-A en –B, leden van de peroxiredoxine familie (uitleg), meer
geproduceerd worden door geactiveerde CD8+ T-cellen bij HIV infectie. Wellicht dragen deze
antioxidante eiwitten bij aan de antivirale activiteit van CD8+ T-cellen. Hoewel deze
eiwitfamilie enkele chemokine-achtige eigenschappen heeft, zoals heparine-binding en
chemotaxis, is het antivirale mechanisme van de NKEFs waarschijnlijk heel anders. Dit
maakt onderzoek naar de antivirale werking van NKEFs natuurlijk erg interessant. De NKEFs
hebben wellicht het vermogen om te dienen als een soort synergistische therapie als het
antivirale mechanisme inderdaad verschilt van dat van chemokines (Geiben-Lynn et al.,
2003b).
Daarnaast is recentelijk een mogelijke rol voor ribonuclease ofwel RNase in de antiHIV activiteit voorgesteld. Al een aantal jaren geleden is aangetoond dat onconase en bovine
seminal RNase, twee leden van de RNase A superfamilie, in staat zijn HIV replicatie te
remmen. Twee leden van dezelfde familie blijken dit niet te kunnen. Dit laat zien dat er
tussen homologe RNases een selectieve antivirale activiteit is (Youle et al., 1994).
Onderzocht is of RNase betrokken zou kunnen zijn bij CNAR. Antilichamen tegen RNase
bleken niet in staat CNAR en CAF activiteit te kunnen blokkeren. Bovendien werd er geen
mRNA voor RNase gedetecteerd in CD8+ cellen en is de cellulaire herkomst van RNase nog
niet bekend (Mackewicz et al., niet-gepubliceerd, reviewed in Levy et al., 2003).
31
3. Discussie
Er bestaat een kleine groep individuen die na HIV infectie voor meer dan 10 jaar
asymptomatisch blijven en een stabiel aantal CD4+ T-cellen hebben. Het profiel van deze
zogenaamde Long Term Non Progressors (LTNP) lijkt sterk op dat van ongeïnfecteerde
individuen. Deze groep individuen is zeer interessant om te bestuderen, aangezien zij
wellicht unieke virologische en immunologische kenmerken hebben. Normaliter hangt de
kans op infectie samen met het aantal blootstellingen aan het virus maar er bestaat een
groep mensen die herhaaldelijk blootgesteld werd aan HIV, zonder geïnfecteerd te raken
(Exposed-Uninfected; EU). Wellicht kan ook deze groep perspectief bieden voor nieuwe antiHIV therapieën.
CD8+ T-cellen spelen een belangrijke rol bij de cellulaire immuunrespons tegen virale
infectie. De CD8+ cel afweer tegen HIV heeft twee kanten: een cytotoxische en een noncytotoxische. Er bleek geen relatie te zijn tussen de cytotoxische kant van de anti-HIV
activiteit en de klinisch gezonde staat van LTNP en EU personen. De hoogste CD8+ cel Noncytotoxische Antivirale Respons (CNAR) werd gevonden in LTNP en was afwezig in personen
met AIDS. Dit geeft een indicatie voor een correlatie tussen een sterke non-cytotoxische
CD8+ cel anti-HIV activiteit en de gezonde klinische staat van LTNP en EU personen (Levy et
al., 1996, Stranford et al., 1999).
De non-cytotoxische CD8+ afweer tegen HIV blijkt niet bepaald te worden door het
type MHC (Mackewicz et al., 1998) en niet alleen voorbehouden te zijn aan HIV (Levy et al.,
1996). CNAR verschijnt vlak na de HIV infectie, nog voordat er antilichamen aanwezig zijn
(Mackewicz et al., 1994) en lijkt dan samen met CTLs het virus te controleren. CNAR blijkt
gemedieerd te worden door een of meer oplosbare factoren, die gezamenlijk de CD8+ cel
Antivirale Factor (CAF) genoemd worden.
Aangezien CAF gevoelig bleek voor proteases is vastgesteld dat CAF een eiwit of
groep van eiwitten is (Mackewicz et al., 2003a). CAF is een eiwit dat uitsluitend
geproduceerd lijkt te worden door geactiveerde CD8+ cellen (Levy et al., 1996). Aangezien
CAF slechts in zeer kleine hoeveelheden geproduceerd wordt, is het zeer moeilijk om de
identiteit van CAF te bepalen. Zuiveren en bepalen van de aminozuurvolgorde van CAF is tot
op heden nog niet gelukt. Aangezien protease inhibitors in staat zijn de werking van CAF te
blokkeren is het mogelijk dat CAF zelf een protease is of een eiwit dat een interactie met een
protease aangaat (Mackewicz et al., 2003a). Het is mogelijk dat antivirale CD8+ cellen een
protease en een precursor van CAF produceren. Deze precursor wordt pas actief na klieving.
Dit antivirale eiwit reageert vervolgens met het celmembraan van een HIV-geïnfecteerde
CD4+ cel en zorgt voor een soort van anti-HIV staat (figuur 10). In de gevallen dat CAF niet
32
geblokkeerd wordt door een protease inhibitor is het mogelijk dat de CAF precursor al
gekliefd is of dat er nog onbekende anti-HIV factoren een rol spelen (Levy, 2003).
Figuur 10. Hypothetisch model voor de produktie van
de CD8+ cel Antivirale Factor (CAF) (uit: Levy, 2003).
CAF productie bereikt 5-9 dagen na de activatie van CD8+ cellen een maximum. CAF heeft
duidelijke biochemische en fysische eigenschappen die goed te gebruiken zijn bij de
identificatie van CAF. Zo blijkt de lengte van het eiwit te variëren tussen de 10-50 kDa. Het
eiwit blijkt resistent tegen hitte en een lage pH (Cocchi et al., 1995). Aangezien CAF stabiel
blijft tijdens extractie met ether blijkt het eiwit geen essentiële lipid-component te bevatten
(tabel 1).
Tabel 1. Kenmerken van CAF (aangepast uit Levy, 2003)
•
Geproduceerd door CD8+ T-cellen
•
Niet gevonden in granules
•
Gevoelig voor protease
•
Grootte van 10-50 kDa
•
Stabiel bij hoge temperatuur en lage pH
•
Stabiel tijdens extractie met ether: geen essentiële lipid-component
•
Actief tegen HIV-1, HIV-2, SIV
•
Blokkeert HIV replicatie door LTR-gedreven transcriptie te remmen
•
Heeft geen invloed op CD4+ cel activatie of proliferatie
33
CAF blijkt in staat de replicatie van verschillende HIV stammen te onderdrukken en wordt
het meest geproduceerd in asymptomatische personen (Levy et al., 1996, Stranford et al.,
1999) (tabel 1). CAF is in staat expressie van genen van de HIV ‘Long Terminal Repeats’ of
LTRs te blokkeren (Mackewicz et al., 1995). Aangetoond is dat dit inhiberende effect van
CAF op de LTR activatie van HIV wordt gemedieerd via STAT1 activatie. Het is bekend dat
eiwitten van de IRF-familie gereguleerd worden door STAT eiwitten. CAF is in staat STAT1 te
activeren, wat vervolgens leidt tot inductie van IRF-1 en inhibitie van LTR-gereguleerde
genexpressie (Chang et al., 2002).
Een groot aantal interleukines, interferonen, chemokines, groeifactoren en andere
cytokines met anti-HIV activiteit bleken sommige maar niet alle kenmerken van CAF te
vertonen, hetgeen suggereert dat CAF uit meerdere componenten bestaat.
Is CAF een cytokine? Er is met name gekeken naar een groep van
chemoattractieve cytokines, de chemokines, die in staat blijken te interfereren met de
binnenkomst van HIV in de cel (Barker et al., 1998a). Cocchi et al. hebben in 1995 de βchemokines RANTES, MIP-1α en MIP-1β geïdentificeerd als de belangrijkste anti-HIV
factoren uitgescheiden door CD8+ T-cellen. De antivirale activiteit van de β-chemokines,
liganden van de CCR5 receptor, werd wel waargenomen tegen M-tropic stammen, maar niet
tegen T-tropic stammen (Cocchi et al., 1995). Dit werd later verklaard door de ontdekking
van de CCR5 receptor als coreceptor voor de binnenkomst van HIV in CD4+ T-cellen. βchemokines zijn in staat de zogenaamde R5-virussen die CCR5 als coreceptor gebruiken
competitief te blokkeren, maar niet de zogenaamde X4-virussen die CXCR4 als alternatieve
coreceptor gebruiken. β-chemokines bleken in staat HIV replicatie in CD4+ T-cellen en
PBMCs in vitro te onderdrukken (Cocchi et al., 1995). In macrofagen bleek de HIV replicatie
door β-chemokines niet geremd te worden (Barker et al., 1998a). Ofschoon de β-chemokines
wel degelijk anti-HIV activiteit hebben, voldoen ze niet aan alle kenmerken van CAF. CAF is
in staat de replicatie van beide typen HIV, zowel X4- als R5-virussen, te remmen. De βchemokines dragen dus wel bij aan de CD8+ cel anti-HIV activiteit, maar er moeten nog
andere componenten bij betrokken zijn (figuur 11).
Zijn defensines een mogelijke kandidaat voor CAF? Hoewel er meerdere klassen
defensines zijn, heeft men tot nu toe de aandacht vooral gericht op de α-defensines. De
verschillende α-defensines bleken gezamenlijk in staat zowel de replicatie van R5- als X4virussen te remmen. Wanneer gebruik gemaakt werd van antilichamen tegen de αdefensines werd de replicatie van X4-virussen geheel niet meer geremd. De inhibitie van de
replicatie van R5-virussen verdween gedeeltelijk, maar nooit helemaal. Dit zou verklaard
kunnen worden door een mogelijke activiteit van β-chemokines tegen R5-virussen (Cocchi et
34
al., 1995). De cellulaire oorsprong van de α-defensines bleek echter niet de CD8+ T-cel te
zijn, maar de neutrofiel. Een van de kenmerken van CAF is dat het eiwit uitsluitend
geproduceerd wordt door geactiveerde CD8+ cellen (Levy et al., 1996), vandaar de naam
CD8+ cel Antivirale Factor ofwel CAF. Aangezien α-defensines niet geproduceerd worden
door CD8+ T-cellen zou dit betekenen dat α-defensines niet de identiteit van CAF kunnen
hebben. Het is echter mogelijk dat er naast de CD8+ T-cel nog andere producenten van CAF
bestaan en dat dus de term CAF incorrect is (figuur 11).
Figuur 11. Hypothetisch model samenstelling en werking CAF.
Aangezien na eliminatie van α-defensines en β-chemokines slechts zeer geringe antiHIV activiteit overblijft, is het mogelijk dat ze in combinatie bijdragen aan de werking van
CAF. Het is dus nuttig om verder onderzoek te verrichten aan het precieze mechanisme van
hun antivirale werking. CAF is in staat STAT1 te activeren, wat vervolgens leidt tot inductie
van IRF-1 en inhibitie van LTR-gereguleerde genexpressie (Chang et al., 2002). α-defensine
1 blijkt daarentegen STAT1-onafhankelijk te werken (Chang et al., 2003). β-chemokines
vertonen anti-HIV activiteit door te interfereren met de binnenkomst van HIV. Vooralsnog is
niet bekend of β-chemokines daarnaast een STAT1-afhankelijke werking hebben om HIV
replicatie te remmen.
Bij verdere pogingen om de identiteit van CAF te bepalen is een produkt van CD8+ Tcellen geïdentificeerd dat in staat is X4-Tropic stammen van HIV te remmen (Geiben-Lynn et
al., 2002b). Dit heparine-bindende eiwit blijkt een gemodificeerde vorm van ATIII te zijn. Uit
35
vergelijking van de CD8+ T-cellen van HIV-seropositieve individuen met de CD8+ T-cellen
van HIV-seronegatieve individuen bleek dat ongestimuleerde CD8+ T-cellen niet in staat
waren HIV replicatie te remmen, ook niet in aanwezigheid van heparine. Alleen geactiveerde
CD8+ T-cellen van HIV-geïnfecteerde personen zijn dus in staat ATIII te modificeren tot een
vorm met anti-HIV activiteit. Seronegatieve CD8+ T-cellen produceren deze antivirale
activiteit niet of in mindere mate omdat de CD8+ T-cellen minder geactiveerd worden en er
dus minder factor geproduceerd wordt om ATIII te kunnen modificeren. Tot dan toe was de
zoektocht naar CAF vooral gericht op factoren die uitgescheiden werden door CD8+ T-cellen.
Maar nu blijkt dat CD8+ T-cellen ook een serumeiwit kunnen activeren om HIV te gaan
remmen. Dit maakt het aannemelijk dat een deel van CAF een protease is (figuur 11).
Waarschijnlijk remt ATIII HIV niet als competitieve agonist van CXCR4. Er is namelijk niet
waargenomen dat het eiwit CXCR4 downreguleert (Geiben-Lynn et al., 2002b).
NKEF-A en –B bleken meer geproduceerd te worden door CD8+ T-cellen van HIVseropositieve dan door CD8+ T-cellen van HIV-seronegatieve personen. Wanneer T-cellen
getransfecteerd werden met NKEF-A en –B cDNA bleek HIV replicatie in vitro te worden
geremd. De NKEFs bleken ook in staat replicatie van SIV te remmen. In vitro bleek HIV
replicatie afgenomen wanneer NKEF eiwitten in CD4+ T-cellen tot overexpressie waren
gebracht. Wellicht dragen deze antioxidante eiwitten bij aan de antivirale activiteit van CD8+
T-cellen (figuur 11). Hoewel deze eiwitfamilie enkele chemokine-achtige eigenschappen
heeft, zoals heparine-binding en chemotaxis, is het antivirale mechanisme van de NKEFs
waarschijnlijk heel anders. Dit maakt onderzoek naar de antivirale werking van NKEFs
natuurlijk erg interessant. De NKEFs hebben wellicht het vermogen om te dienen als een
soort synergistische therapie (Geiben-Lynn et al., 2003).
De precieze identiteit van CAF is vooralsnog niet bekend. Dit kan betekenen dat één
nog onbekende factor voor de totale CAF activiteit zorgt of dat meerdere componenten door
met elkaar te interacteren deze activiteit veroorzaken. In een hypothetisch model is de
mogelijke interactie tussen verschillende componenten weergegeven. Er zijn nog vele
andere kandidaten bekeken die bij zouden kunnen dragen aan de activiteit van CAF, maar
vooralsnog is de precieze samenstelling van CAF niet bekend. In het model is weergegeven
wat er tot nu toe bekend is over de werking en samenstelling van CAF (figuur 11). Wanneer
de precieze werking van CAF bekend is, zal dit begrip bij kunnen dragen aan de ontwikkeling
van nieuwe therapieën tegen HIV.
36
4. Referenties
Balter, M. (1997) HIV survives drug onslaught by hiding out in T-cells. Science 278, 1227
Barker, E., Bossart, K.N., Levy, J.A. (1998a) Primary CD8+ cells from HIV-infected
individuals can suppress productive infection of macrophages independent of β-chemokines.
Immunology 95, 1725-1729
Barker, E., Mackewicz, C.E., Reyes-Terán, G., Sato, A., Stranford, S.A., Fujimora, S.H.,
Christopherson, C., Chang, S., Levy, J.A. (1998b) Virological and immunological features of
Long-Term Human Immunodeficiency Virus-infected individuals who have remained
asymptomatic compared with those who have progressed to Acquired Immunodeficiency
Syndrome. Blood 92, 3105-3114
Chang, T.L., Francois, F., Mosoian, A., Klotman, M.E. (2003) CAF-mediated Human
Immunodeficiency Virus (HIV) type 1 transcriptional inhibition in distinct from α-defensin-1
HIV inhibition. Journal of Virology 77, 6777-6784
Chang, T.L., Mosoian, A., Pine, R., Klotman, M.E., Moore, J.P. (2002) A soluble factor(s)
secreted from CD8+ T lymphocytes inhibits HIV-1 replication through STAT activation.
Journal of Virology 76, 569-581
Cocchi, F., Devico, A.L., Garzino-Demo, A., Arya, S.K., Gallo, R.C., Lusso, P. (1995)
Identification of RANTES, MIP-1α d MIP-1β as the major HIV-suppressive factors produced
by CD8+ T-cells. Science 270, 1811-1815
Cohen, J. (1993) AIDS research: the mood is uncertain. Science 260, 1254-1265
Cole, A.M., Hong, T., Boo, L.M., Nguyen, T., Zhao, C., Bristol, G., Zack, J.A., Waring, A.J.,
Yang, O.O., Leher, R.I. (2002) Retrocyclin : a primate peptide that protects cells from
infection by T-and M-tropic strains of HIV-1. PNAS 99, 1813-1818
Connor, R.I., Sheridan, K.E., Ceradini, D., Choe, S., Landau, N.R. (1997) Change in
coreceptor use correlates with disease progression in HIV-1-infected individuals. Journal of
Experimental Medicine 185, 621-628
37
Darnell, J.E. (1997) STATs and gene regulation. Science 277, 1630-1635
Engelhard, V.H. (1994) How cells process antigens. Scientific American august, 42-51
Gallo, R.C. and Montagnier, L. (1988) AIDS in 1988. Scientific American october, 25-32
Geiben-Lynn, R. (2002a) Anti-human immunodeficiency virus noncytolytic CD8+ T-cell
response: a review. AIDS Patient Care and STDS 16, 471-475
Geiben-Lynn, R., Brown, N., Walker, B.D., Luster, A.D. (2002b) Purification of a modified
form of bovine Antithrombin III as an HIV-1 CD8+ T-cell Antiviral Factor. Journal of
Biological Chemistry 277, 42352-42357
Geiben-Lynn, R., Kursar, M., Brown, N.V., Addo, M.M., Shau, H., Lieberman, J., Luster, A.D.,
Walker, B.D. (2003) HIV-1 antiviral activity of recombinant Natural Killer Cell Enhancing
Factors, NKEF-A and NKEF-B, members of the peroxiredoxin family. Journal of Biological
Chemistry 278, 1569-1574
Greene, W.C. (1993) AIDS and the immune system. Scientific American september, 67-73
Haseltine W.A. and Wong-Staal, F. (1988) The molecular biology of the AIDS virus. Scientific
American october, 34-42
Janeway, C.A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. (2001) Immunobiology (5th ed.): the
immune system in health and disease. Garland Publishing, New York
Lehrer, R.I. and Ganz, T. (2002) Defensins of vertebrate animals. Current opinion in
Immunology 14, 96-102
Levy, J.A. (2001) The importance of the innate immune system in controlling HIV infection
and disease. Trends in Immunology 22, 312-315
Levy, J.A. (2003) The search for the CD8+ cell anti-HIV factor (CAF). Trends in Immunology
24, 628-632
38
Levy, J.A., Mackewicz, C.E., Barker, E. (1996) Controlling HIV pathogenesis: the role of the
noncytotoxic anti-HIV response of CD8+ T-cells. Immunology Today 17, 217-224
Locher, C.P., Blackbourne, D.J., Levy, J.A. (1999) Suppression of HIV-1 replication by a
soluble factor produced by CD8+ lymphocytes from HIV-2-infected baboons. Immunology
66, 151-157
Mackewicz, C.E., Blackbourne, D.J., Levy, J.A. (1995) CD8+ T-cells suppress HIV replication
by inhibiting viral transcription. Immunology 92, 2308-2312
Mackewicz, C.E., Craik, C.S., Levy, J.A. (2003a) The CD8+ cell noncytotoxic anti-HIV
response can be blocked by protease inhibitors. PNAS 100, 3433-3438
Mackewicz, C.E., Garovoy, M.R., Levy, J.A. (1998) HLA compatibility requirements for CD8+
T-cell-mediated suppression of HIV replication. Journal of Virology 72, 10165-10170
Mackewicz, C.E., Wang, B., Metkar, S., Richey, M., Froelich, C.J., Levy, J.A. (2003b) Lack of
the CD8+ cell anti-HIV factor in CD8+ cell granules. Blood 102, 180-183
Mackewicz, C.E. and Yang, L.C. (1994) Non-cytolytic CD8 T-cell anti-HIV responses in
primary HIV-1 infection. Lancet 344, 1671-1673
Moriuchi, H., Moriuchi, M., Combadiere, C., Murphy, P.M., Fauci, A.S. (1996) CD8+ T-cellderived soluble factor(s), but not β-chemokines RANTES, MIP-1α d MIP-1β suppress HIV-1
replication. Medical Sciences 93, 15341-15345
Nakashima, H., Yamamoto, N., Masuda, M., Fujii, N. (1993) Defensins inhibit HIV replication
in vitro. AIDS 7, 1129
Nowak, M.A. and McMichael, A.J. (1995) How HIV defeats the immune system. Scientific
American august, 42-49
39
Stranford, S.A., Skurnick, J., Louria, D., Osmond, D., Chang, S., Sninsky, J., Ferrari, G.,
Weinhold, K., Lindquist, C., Levy, J.A. (1999) Lack of infection in HIV-exposed individuals is
associated with a strong CD8+ cell noncytotoxic anti-HIV respons. Immunology 96, 10301035
Tomaras, G.D., Lacey, S.F., McDanal, C.B., Ferrari, G., Weinhold, K.J., Greenberg, M.L.
(2000) CD8+ T-cell-mediated suppressive activity inhibits HIV-1 after virus entry with
kinetics indicating effects on virus gene expression. PNAS 97, 3503-3508
Tsubota, H., Lord, C.I., Watkins, D.I., Morimoto, C., Letvin, N.L. (1989) A cytotoxic T
lymphocyte inhibits acquired immunodeficiency syndrome virus replication in peripheral
blood lymphocytes. Journal of Experimental Medicine 169, 1421-1434
Walker, C.M, Erickson, A.L., Hsueh, F.C., Levy, J.A. (1991) Inhibition of Human
Immunodeficiency Virus replication in acutely infected CD4+ cells by CD8+ cells involves a
noncytotoxic mechanism. Journal of Virology 65, 5921-5929
Yang, D., Biragyn, A., Kwak, L.W., Oppenheim, J.J. (2002) Mammalian defensins in
immunity: more than just microbicidal. Trends in Immunology 23, 291-295
Youle, R.J., Wu, Y., Mikulski, S.M., Shogen, K., Hamilton, R.S., Newton, D., Alessio, G.D.,
Gravell, M. (1994) RNase inhibition of Human Immunodeficiency Virus infection of H9 cells.
Medical Sciences 91, 6012-6016
Zhang, L., Yu, W., He, T., Yu, J., Caffrey, R.E., Dalmasso, E.A., Fu, S., Pham, T., Mei, J., Ho,
J.J., Zhang, W., Lopez, P., Ho, D.D. (2002) Contribution of human α-defensin 1, 2 and 3 to
the anti-HIV activity of the CD8 Antiviral Factor. Science 298, 995-999
Zhang, L., Lopez, P., He, T., Yu, W., Ho, D.D. (2004) Retraction of an interpretation. Science
303, 467
40