Implementatie van RT-PCR in het FLVVT in het kader van het

Implementatie van RT-PCR in het
FLVVT in het kader van het TSE
stappenplan
J. Vancutsem, R. Vanhoof en M. Lekens (FLVVT, Tervuren)
In het tweede stappenplan voor TSE (overdraagbare spongioforme encefalopathie) dat op 16 juli 2010 gepubliceerd werd, werd het kader geschetst van mogelijke wijzigingen van TSE-maatregelen in de EU voor de periode
2010-2015. De meeste geplande maatregelen van het eerste TSE-stappenplan voor de korte en middellange
termijn zijn intussen verwezenlijkt en de positieve trend die in 2005 werd waargenomen, heeft zich verder doorgezet. Eén van de actiedoelstellingen in het tweede stappenplan is een verdere versoepeling van het voederverbod uit 2001 omdat verwerkte dierlijke eiwitten (VDE) een belangrijke bron van hoogwaardige eiwitten zijn. Op
dit ogenblik is het gebruik van VDE, met uitzondering van vismeel, verboden voor landbouwhuisdieren volgens
Verordening 999/2001. Voor de versoepeling wordt gedacht aan het instellen van een tolerantieniveau voor VDE
in diervoeders mits de ontwikkeling van voldoende betrouwbare kwantitatieve analyses en aan het opheffen van
het voederverbod voor niet-herkauwers.
In een eerste stap voor het versoepelen van het voederverbod werd een voorstel tot het toelaten van VDE van
niet-herkauwers in visvoer ondersteund door de Europese lidstaten tijdens de stemming op 18 juli 2012 in het
“Standing Committee on the Food Chain and Animal Health” (verslag beschikbaar op http://ec.europa.eu/food/
committees/regulatory/scfcah/biosafety/sum_18072012_en.pdf ). Merk hierbij op dat het voorlopig enkel om
vismeel gaat, maar dat het toelaten van VDE voor niet-herkauwers wel expliciet omschreven is in het stappenplan.
Deze versoepeling is slechts mogelijk wanneer er gevalideerde analysemethoden beschikbaar zijn om vast te stellen van welke diersoort de VDE afkomstig zijn (herkauwers, varkens, pluimvee). Ook zal de industrie investeringen
moeten doen voor de gescheiden verwerking van de VDE van verschillende oorsprong.
Analysemethoden
Omdat het met microscopie niet mogelijk is om van de meeste aanwezige dierlijke bestanddelen zoals spiervezels en botfragmenten de diersoort vast te stellen, kan voor de identificatie overgegaan worden op PCR. In 2010
werd de beslissing genomen om deze PCR-analyses te laten doorgaan in het FLVVT. Omdat deze analysetechniek
nieuw was, nam het FLVVT in december 2010 deel aan een intensieve training georganiseerd door het EURL-AP.
In 2011 werden voor deze analyse door het CODA twee extra analyseruimtes ter beschikking gesteld en werden
een RT-PCR (real-time polymerase chain reaction)-toestel (Lightcycler 480 II) en een opzuiveringsrobot (MagMAX)
aangekocht.
8
2010 deel aan een intensieve training georganiseerd door het EURL-AP. In 2011 werden voor
deze analyse door het CODA twee extra analyseruimtes ter beschikking gesteld en werden een
RT-PCR (real-time polymerase chain reaction)-toestel (Lightcycler 480 II) en een opzuiveringsrobot
(MagMAX) aangekocht.
Afbeelding 1 en 2: RT-PCR-toestel (Lightcycler 480 II, links) en een opzuiveringsrobot (MagMAX,
rechts)
Afbeelding 1 en 2: RT-PCR-toestel (Lightcycler 480 II, links) en een opzuiveringsrobot (MagMAX, rechts)
In eerste instantie wordt gefocust op de detectie van DNA van herkauwers. Op dit moment zijn de methoden
voor het opsporen van DNA van varkens en pluimvee nog in ontwikkeling. Het EURL-AP organiseerde in de
periode december 2011 - februari 2012 een validatiestudie en in maart - mei 2012 een implementatietest voor de
detectie van DNA van herkauwers waar het FLVVT aan deelnam. Deze test omvatte 10 monsters: 6 DNA-extracten
en 4 diervoeders. Intussen werden in het FLVVT ook de eerste klantenmonsters geanalyseerd.
De PCR-analyse
De belangrijkste maatregel bij PCR-analyses is het vermijden van contaminatie. Tijdens de amplificatie wordt het
DNA-materiaal miljoenen keren vermenigvuldigd en als dat DNA vrijkomt, kunnen monsters, laboruimtes,... onbedoeld gecontamineerd worden met de doelsequenties. Daarom is er voor gezorgd dat alle stappen van de analyse in verschillende afgesloten ruimtes plaatsvinden: het malen van het monster, het afwegen van het monster,
extractie en opzuivering van het DNA, de plaatvoorbereiding en PCR. Bovendien worden werktafel en materiaal
zowel voor als na de analyse grondig gereinigd met detergenten om DNA af te breken.
Na het malen en afwegen van het monster wordt het DNA geëxtraheerd en opgezuiverd met een specifieke kit.
Deze kit maakt gebruik van paramagnetische partikels waar het DNA aan bindt. Door een microcentrifugeerbuisje
op een magnetische houder te plaatsen wordt in verschillende stappen met verschillende reagentia het DNA
opgezuiverd en uiteindelijk geëlueerd. Dit kan ook geautomatiseerd met de robot gebeuren. Het opgezuiverde
DNA is daarna klaar om op een PCR-plaat gezet te worden.
9
Afbeelding 3: Schematisch verloop monstervoorbereiding voor PCR
Om het DNA te amplificeren worden primers, de probe en de mastermix met de nucleotiden en polymerase toegevoegd. Na toevoegen van de monsterextracten wordt de plaat in het PCR toestel gebracht en start de eigenlijke reactie die 50 cycli omvat.
De software berekent vervolgens de Cp (Crossing point)-waarde als het maximum van de tweede afgeleide van de
amplificatiecurve, wat het punt is waarop de curve het sterkst stijgt. De bekomen Cp-waarde wordt dan vergeleken met de cut-off waarde. Deze waarde is het aantal cycli, uitgedrukt als Cp-waarde, waarboven een signaal
beschouwd wordt als een vals positief monster. De cut-off is specifiek voor het platform en kan zelfs niet zomaar
naar een ander toestel binnen hetzelfde laboratorium worden overgedragen.
Om te beoordelen of een analysereeks correct is uitgevoerd worden er extra monsters als kwaliteitscontrole mee
geanalyseerd in dezelfde run. Het gaat hierbij in de eerste plaats om een positieve en een negatieve extractiecontrole welke tot doel hebben de kwaliteit (contaminatie) van de extractiereagentia na te gaan. Daarnaast worden
er ook een positieve DNA controle en een NTC (no template controle) mee geanalyseerd om de kwaliteit van de
PCR-reagentia na te gaan. Tenslotte wordt ook het mogelijk effect van de aanwezigheid van inhiberende componenten op de PCR nagegaan door van elk monster een 10-voudige verdunning te analyseren. Indien er geen
inhibitie is, zal het signaal in principe 3,3 (log2(10)) cycli later verschijnen.
10
NTC (no template controle) mee geanalyseerd om de kwaliteit van de PCR-reagentia na te gaan.
Tenslotte wordt ook het mogelijk effect van de aanwezigheid van inhiberende componenten op de
PCR nagegaan door van elk monster een 10-voudige verdunning te analyseren. Indien er geen
inhibitie is, zal het signaal in principe 3,3 (log2(10)) cycli later verschijnen.
Afbeelding 3: RT-PCR curves: vlakke lijn bij negatieve monsters, stijgende curve bij positieve
Afbeelding 4: RT-PCR curves: vlakke lijn bij negatieve monsters, stijgende curve bij positieve monsters
monsters
In de toekomst zullen meer monsters met PCR geanalyseerd worden als het gebruik van VDE
In de toekomst zullen meer monsters met PCR geanalyseerd worden als het gebruik van VDE opnieuw geautoriseerd is en
opnieuw geautoriseerd is en vermoedelijk zal de publieke opinie zich ook niet of slechts beperkt keren
vermoedelijk
zal de publieke
opinie van
zich VDE
ook niet
of slechts
beperkt keren
tegen het opnieuw
introducerenzoals
van VDE in de
tegen
het opnieuw
introduceren
in de
voedselketen.
De benodigde
analysemethoden,
voedselketen.
De benodigde
voor het
van VDE vanzullen
varkens
en pluimvee
met PCR-techvoor
het opsporen
van VDEanalysemethoden,
van varkens en zoals
pluimvee
metopsporen
PCR-technieken,
hiertoe
nog verder
worden
ontwikkeld.
nieken, zullen hiertoe nog verder worden ontwikkeld.
Literatuur:
Literatuur:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Het TSE-stappenplan 2: Een beleidsnota betreffende overdraagbare spongiforme
encefalopathieën
voor
de periode
2010-2015
(16/07/2010)
Het TSE-stappenplan
2: Een
beleidsnota
betreffende
overdraagbare
spongiforme encefalopathieën voor de periode 2010-2015 (16/07/2010)
Verordening (EG) nr. 999/2001 van het Europees Parlement en de Raad van 22 mei 2001 houdende vaststelling van
voorschriften inzake preventie, bestrijding en uitroeiing van bepaalde overdraagbare spongiforme encefalopathieën, Official Journal of the European Union, L 147, p1–40
Verordening (EG) nr. 152/2009 van de Commissie van 27 januari 2009 tot vaststelling van de bemonsterings- en
analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders (Voor de EER relevante tekst), Official Journal of the
European Union, L 54, p1–130
Fumière O., Marien A., Berben G. (2012) EURL-AP PCR Implementation Test 2012
Fumière O., Marien A., Berben G. (2012) Validation study of a real-time PCR method developed by TNO Triskelion bv for the detection of ruminant DNA in feedingstuffs (Draft)
Veys P. & Baeten V. (2007) CRL-AP Interlaboratory Study 2007 Final report
Summary report of the standing committee on the food chain and animal health held in Brussels on 18 July 2012
ISO 84276 (draft): Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products - General requirements and definitions
Scientific Opinion on the revision of the quantitative risk assessment (QRA) of the BSE risk posed by processed animal proteins (PAPs). EFSA Journal 2011;9(1):1947
[email protected]
11