Proefschrift

NEDERLANDSE SAMENVATTING
Het plaveiselcelcarcinoom van de mondholte en van de orofarynx (OOSCC) zijn twee van de
meest voorkomende hoofd-hals plaveiselcelcarcinomen (HNSCC) met ongeveer 400.000
nieuwe gevallen per jaar wereldwijd. In Nederland worden er ongeveer 1500 nieuwe
gevallen per jaar gediagnosticeerd. De belangrijkste prognostische factor is het aan- of
afwezig zijn van metastasen (uitzaaiingen) in de lymfklieren in de hals (lymfklierstatus).
Metastasen in de hals komen voor in gemiddeld 50% van alle OOSCC patiënten. Echter met
de huidige diagnostische beeldvormingstechnieken worden slechts 60-70% van de
metastasen ontdekt. Dit komt met name door het missen van micrometastasen, metastasen
kleiner dan 3 mm in diameter. Door de suboptimale detectie van metastasen wordt een
aanzienlijk aantal patiënten over- of juist onderbehandeld. Overbehandeling is bijvoorbeeld
het verrichten van een halsklierdissectie bij een patiënt die een klinische verdenking heeft
op metastasen (cN+), maar waarbij na onderzoek van de lymfklieren door de patholoog,
geen metastasen worden gevonden (pN0). Dit resulteert in verlies van kwaliteit van leven en
toegenomen zorgkosten. Er is sprake van onderbehandeling indien metastasen niet
gediagnosticeerd worden (cN0, maar in werkelijkheid pN+), waardoor de patiënt een
regionaal recidief of afstandsmetastasen zal ontwikkelen. Dit leidt tot verlies van kwaliteit
van leven, kortere overleving en toegenomen zorgkosten. Het is daarom belangrijk om in de
primaire tumor betere voorspellers te vinden voor de lymfklierstatus.
Een biologisch of moleculair kenmerk van de tumor, zoals de aan- of afwezigheid van een
bepaald eiwit of mutatie kan gerelateerd zijn met het biologisch en daarmee klinische
gedrag van deze tumor zoals het vormen van metastasen. We noemen dit een tumor
biomarker. Er zijn al verschillende histopathologische biomarkers beschreven die zijn
geassocieerd met lymfklierstatus maar deze biomarkers tonen wisselende voorspellende
waarden en inter-beoordelaar variabiliteit. Indien biomarkers separaat gebruikt worden,
hebben ze een matige voorspellende waarde voor het multistep metastaseringsproces in
OOSCC.
Biomarkers voor het voorspellen van respons op behandeling (zogenaamde prognostische
markers) kunnen helpen om de meest optimale behandeling te kiezen voor een specifieke
kankerpatiënt. Dit is in toenemende mate van belang aangezien er steeds meer
“personalized targeted therapy” beschikbaar komt voor de behandeling van OOSCC.
Hiervoor zijn medicijnen ontwikkeld die gericht zijn tegen een specifiek moleculair target dat
aanwezig is in de tumorcel.
Doel van deze dissertatie was om nieuwe moleculaire, biologische en histopathologische
biomarkers in de primaire tumor te vinden, die een waarde hebben voor het voorspellen
van de lymfklierstatus en van de prognose in patiënten met een mondholte- of
orofarynxcarcinoom. Deze gegevens kunnen behulpzaam zijn om de behandelkeuze te
optimaliseren. Om dit doel te bereiken hebben we een database geconstrueerd met hierin
klinisch-pathologische-, therapie- en follow-up gegevens van meer dan 600 patiënten met
meer dan 700 tumoren, waarvan tumorweefsel beschikbaar was in de archieven van de
afdeling Pathologie van het Universitair Medisch Centrum Groningen.
Bij patiënten met een pT1cN0 mondholte carcinoom (OSCC) wordt in het algemeen geen
electieve halsklierdissectie uitgevoerd. Echter indien deze patiënten worden gevolgd met
watchful waiting (strikte 6-weekse follow-up van de klinische lymfklierstatus), ontwikkelt
circa 25% alsnog klinisch detecteerbare lymfkliermetastasen gedurende deze follow-up. De
histopathologische biomarker tumor infiltratiediepte heeft een voorspellende waarde voor
de lymfklierstatus in OSCC. Tot op heden is echter geen klinisch relevant afkappunt voor de
infiltratiediepte vastgesteld. In hoofdstuk 2 is de infiltratiediepte van 212 pT1-2cN0 OSCC
gemeten om de optimale afkapwaarde te bepalen als indicatie om een halsklierdissectie uit
te voeren. De ‘ware N status’ (trueN status) werd gebaseerd op halsklierdissectie of
minimaal twee jaar follow-up (watchful waiting). Er werd aangetoond dat de
infiltratiediepte niet alleen verschilde tussen trueN0 en trueN+ cases, maar infiltratiediepte
was ook een onafhankelijke voorspellende factor voor trueN+ status. Door middel van ROCanalyse werd een afkapwaarde vastgesteld bij een infiltratiediepte van 4.59 mm. Gebruik
van dit afkappunt in de groep van pT1cN0 OSCC resulteerde in een forse toename van
correct behandelde patiënten, van 41% tot 76%. Daarom is onze aanbeveling dat een
infiltratiediepte van ≥4 mm (een praktischer afkapwaarde met dezelfde voorspellende
waarde), gebruikt moet worden als biomarker met een absolute indicatie voor het
verrichten van een halsklierdissectie in pT1cN0 OSCC.
Fotodynamische therapie (PDT) is een minimaal invasieve therapie, die gebruikt kan worden
voor het behandelen van oppervlakkig groeiende tumoren. Een photosensitizer wordt
intraveneus geïnjecteerd en lokaal geactiveerd door de tumor te bestralen met licht van een
specifieke golflengte. Hierbij worden zuurstofradicalen gevormd welke tot celdood leiden.
Doordat licht slechts beperkt doordringt in weefsel is curatieve behandeling beperkt tot
tumoren met ≤5 mm infiltratiediepte. Er zijn geen vergelijkende studies tussen PDT en
chirurgische therapie in OOSCC uitgevoerd. Daarom is de behandelrespons van 156 OOSCC
behandeld met PDT vergeleken met 91 chirurgisch behandelde cT1-2N0 OOSCC met ≤5 mm
infiltratiediepte afkomstig uit onze database in hoofdstuk 3. Het deel tumoren met een
complete respons verschilde niet tussen beide groepen. Echter lokale ziekte-vrije overleving
na complete respons was langer en de noodzaak tot aanvullende behandeling lager in T2
OOSCC behandeld met chirurgie. Voor de T1 OOSCC verschilden alle uitkomstmaten niet
significant tussen PDT en chirurgisch behandelde cases. Deze studie toonde aan dat PDT een
effectieve behandelmodaliteit is bij de curatieve behandeling van een subgroep van cT1N0
OOSCC, geselecteerd op basis van een histopathologische biomarker (≤5 mm
infiltratiediepte). Dit onderzoek maakt de weg vrij voor het opzetten van een
gerandomiseerde studie waarin beide modaliteiten worden vergeleken.
In hoofdstuk 4, werd een literatuuroverzicht gegeven van de biologische rol van het
epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) in carcinogenese, tumorprogressie,
metastasering en overleving van kankerpatiënten. EpCAM is een membraaneiwit dat tot
overexpressie gebracht wordt in de meeste carcinomen. In HNSCC wordt EpCAM de novo
tot expressie gebracht. Omdat dit eiwit celadhesie-eigenschappen heeft, is de expressie in
de primaire tumor onderzocht op associaties met de aanwezigheid van lymfkliermetastasen.
In de literatuur zijn geen duidelijke associaties beschreven. In andere tumoren wordt
EpCAM duidelijk geassocieerd met een beter of juist slechter ziektebeloop. Mogelijk is de rol
van EpCAM afhankelijk van de specifieke cellulaire omgeving. Zo zijn er verschillende
biologische functies van EpCAM beschreven in vitro: EpCAM is een celadhesie eiwit en een
verhoogde expressie kan E-cadherin-gemedieerde celadhesie verstoren, maar EpCAM
associeert ook met claudin-7 in een complex welke de adhesiefunctie verstoort en leidt tot
proliferatie, cel motiliteit en metastasering. Het co-expressie patroon van deze drie
gerelateerde eiwitten zou daarom een betere voorspeller voor lymfklierstatus kunnen zijn
dan elk van deze drie markers separaat.
In hoofdstuk 5 zijn de co-expressie patronen van EpCAM, E-cadherin en claudin-7
onderzocht in een groep van 227 OOSCC, om vast te stellen of deze patronen een betere
voorspeller zijn voor de aanwezigheid van lymfkliermetastasen en regionale recidieven
(lymfkliermetastasen die pas na de behandeling gediagnosticeerd worden) dan iedere
marker separaat. Expressie werd vastgesteld in zowel het tumorcentrum als in het
tumorfront. De co-expressie patronen van E-cadherin, EpCAM en claudin-7 toonden geen
betere voorspellende waarde voor de lymfklierstatus dan de separate markers. Als
individuele marker waren de afwezigheid van E-cadherin expressie en aanwezigheid van
cytoplasmatische EpCAM expressie voorspellend voor de aanwezigheid van
lymfkliermetastasen, maar deze voorspellende waarden waren niet onafhankelijk van de
huidige klinische stadiëring. Een opmerkelijke bevinding was dat de afwezigheid van claudin7 in het tumorcentrum een onafhankelijke voorspellende biomarker is voor het ontwikkelen
van een regionaal recidief. Deze uitkomsten suggereren dat er geen klinisch relevant
modulerend effect is van deze drie markers in OOSCC.
Amplificatie van de chromosomale 11q13.3 regio komt frequent voor in HNSCC. Van de
verschillende genen gelegen in dit amplicon correleert de expressie van het gen dat codeert
voor het Fas-associated death domain (FADD) eiwit het beste met de amplificatiestatus.
Overexpressie van FADD zou de tumorcel voordeel kunnen opleveren en daarom de
drijvende kracht achter de amplificatie kunnen zijn (de ‘driver’ mutatie). In hoofdstuk 6 is de
expressie van FADD geanalyseerd in 177 grotendeels laat-stadium HNSCC die behandeld
waren met chirurgie en post-operatieve radiotherapie. Hoge FADD expressie was
geassocieerd met de aanwezigheid van lymfkliermetastasen, en het sneller ontwikkelen van
afstandsmetastasen. FADD kan gebruikt worden als biomarker voor patiënten met een hoog
risico op ontwikkeling van metastasen op afstand. Hoe FADD deze metastasen veroorzaakt
is momenteel niet duidelijk.
De aanwezigheid van hoog-risico humaan papilloma virus (hrHPV) in orofarynx
plaveiselcelcarcinomen (OpSCC) is een marker voor een langere overall overleving. In
verschillende landen wordt een toenemende, maar sterk wisselende incidentie van HPVgeassocieerde OpSCC beschreven. Recent is een gevalideerd tripel detectie algoritme
beschreven, welke bestaat uit p16 immunohistochemie, hrHPV-ISH en hrHPV-PCR. Dit
algoritme detecteert klinisch relevante hrHPV infectie in het tumorweefsel. Er zijn echter
nog geen complete cohorten getest met dit algoritme. In hoofdstuk 7 werd de prevalentie
en voorspellende waarden van hrHPV vastgesteld met behulp van het tripel algoritme in een
compleet historisch cohort van OpSCC, gediagnosticeerd in een periode van 16 jaren (19972012) in het UMCG (n=193). Ook werd een groep van 176 OSCC getest. HrHPV-positiviteit
was een onafhankelijke voorspeller voor langere ziekte-specifieke- en ziekte-vrije
overleving. 24% van de OpSCC en <1% van de OSCC was hrHPV-positief. Een duidelijke
toename gedurende de studieperiode 1997-2012 werd gezien met 13% hrHPV-positieve
cases in de eerste helft (1997-2004), toenemend tot 30% hrHPV-positief in de tweede helft
(2005-2012). HrHPV kan gebruikt worden als prognostische marker in OpSCC, maar niet in
OSCC. Detectietechniek, populatie selectiecriteria en type overlevingsanalyse kunnen de
prevalentie en prognostische waarde van hrHPV in OpSCC beïnvloeden.
Methylering van specifieke genen wordt gebruikt als biomarker voor diagnose en prognose
in glioma en prostaatkanker. DNA methylering is een vorm van epigenetische genexpressie
regulering. Hypermethylering leidt tot transcriptionele repressie en hypomethylering leidt
tot reactivering van gentranscriptie. Door deze dynamische eigenschappen is methylering
een mogelijk kandidaat mechanisme voor de dynamische genregulatie bij de metastasering
van OOSCC. In hoofdstuk 8 is er gezocht naar nieuwe gemethyleerde biomarkers met een
voorspellende waarde voor lymfklierstatus. Verschillende zoekstrategieën werden gebruikt
om kandidaat markers (genen met een CpG eiland en een negatieve associatie met
lymfklierstatus) te selecteren uit vier onafhankelijke microarray expressie studies die genen
met significant verschillende expressie tussen N0 en N+ HNSCC identificeerden. Alle genen
die in meer dan een van de vier studies gevonden waren werden geselecteerd, net als de vijf
hoogst geplaatste genen uit de twee genome-wide studies. Verder werden de genen
geselecteerd die functionele methylering (verhoogde expressie na behandeling met de
demethylerende middelen dac/TSA) in vitro toonden en genen met een associatie met
lymfklierstatus in baarmoederhalskanker, zoals eerder in ons lab onderzocht. Als laatste
werden vier genen geselecteerd die geassocieerd waren met lymfklierstatus in de literatuur.
In totaal werden er 24 genen geselecteerd, allemaal zonder eerder beschreven regulering
door methylering. Nog eens vier genen die frequent methylering vertonen in HNSCC
literatuur werden meegenomen in de analyse. De 28 genen werden onderzocht op hun
voorspellende waarde voor de lymfklierstatus in een groep van 70 OOSCC. Na optimalisatie
en screening toonden slechts 2/28 (7%) markers een voorspellende waarde voor
lymfklierstatus. MGMT methylering was geassocieerd met pN0 status (p=0,02). DAPK1
methylering was geassocieerd met pN+ status (p=0,008). De twee markers gecombineerd
toonden een sensitiviteit (89%) en specificiteit (41%) vergelijkbaar met de gen expressie
profielen voor lymfklierstatus. Beide markers zijn eerder beschreven als gemethyleerd in
HNSCC. De expressie van genen die het meest verschillend tot expressie komen tussen N0
en N+ cases, zoals vastgesteld in de microarray expressie studies, worden niet gereguleerd
door methylering.
Hoge expressie van Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) is frequent aanwezig in
verschillende tumoren en heeft een sterke associatie met een slechte prognose. Ondanks de
aanwezigheid van EGFR expressie in >95% van HNSCC, ondervindt slechts 10-16% van de
patiënten voordeel van therapie gericht tegen het EGFR molecuul. EGFRvIII is een
veelvoorkomende mutant van EGFR, met een deletie van exon 2-7. Expressie van EGFRvIII
kan in het algemeen niet direct onderscheiden worden van de wildtype EGFR. Het verkorte
EGFRvIII eiwit is continu actief en wordt niet goed afgebroken. EGFRvIII expressie is
geassocieerd met een agressief fenotype en resistentie tegen chemo- en radiotherapie. De
aanwezigheid van EGFRvIII is beschreven in HNSCC en daarom zou EGFRvIII een biomarker
kunnen zijn voor behandelrespons in HNSCC. Om de klinische relevantie van EGFRvIII als
biomarker te onderzoeken, hebben we de prevalentie van dit eiwit in een grote serie van
531 HNSCC vastgesteld in hoofdstuk 9. Immunohistochemie voor EGFRvIII werd verricht en
vergeleken met EGFR en EGFRvIII RNA expressie door middel van specifieke rt-PCRs. Geen
van de 531 HNSCC bracht het EGFRvIII eiwit tot expressie. EGFRvIII draagt daarom niet bij
aan het maligne fenotype en is geen geschikte prognostische marker in HNSCC. De expressie
welke wordt gerapporteerd in enkele kleine studies is waarschijnlijk veroorzaakt door
immunohistochemische artefacten, die geassocieerd zijn met het gebruik van een
streptavidine-biotine detectie methode.