TENTAMEN BIOCHEMIE

Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
TENTAMEN Moleculaire Cel Biologie (8A840)
Prof. Dr. Ir. L. Brunsveld & Dr. M. Merkx
24-01-2014 9:00 – 12:00 (totaal 100 punten, plus max. 5 extra voor bonus)
6 opgaven in totaal + 1 bonusvraag! (aangegeven tijd is indicatie)
Gebruik geen rode pen! Geef uw antwoorden direct op dit tentamen. In principe
volstaat de gegeven ruimte, maar gebruik indien nodig de achterkant van de
specifieke opgave. Schrijf naam en studentnummer bovenaan iedere pagina!
1
Kwaliteitscontrole
(~20 minuten; 15 punten)
a. “Editing’ is een mechanisme dat zowel in replicatie als in translatie gebruikt wordt om
het aantal fouten in de synthese van respectievelijk DNA en eiwitten zo klein mogelijk te
houden. Leg uit hoe editing werkt tijdens DNA replicatie en hoe en waar editing wordt
gebruikt tijdens translatie. (5P)
DNA replicatie; DNA polymerases hebben een polymerase (P) en een editing
(E) site. Wanneer een base na inbouw in de groeiende DNA keten in de P-site
niet gehybridiseerd blijft aan de template strand (bijvoorbeeld als gevolg van
tautomerisatie) kan de volgende base niet efficiënt worden ingebouwd. Er
vindt dan een conformatieverandering plaats waardoor het uiteinde van de
nieuw gevormde DNA keten naar de editing site wordt verplaatst en de 3’->5’
exonuclease activiteit de niet-complementaire base verwijdert.
Translatie: t-RNA synthetase bevatten ook een editing site. Na koppeling van
een aminozuur aan het 3’-uiteinde van een t-RNA vindt ook hier een
conformatieverandering plaats en controleert het enzym of het aminozuur dat
gekoppeld is niet te klein is. Als dit zo is past het in de editing site en wordt de
ester binding tussen aminozuur en t-RNA weer gehydrolyseerd.
b. Met 3 basen per codon zijn er 64 verschillende codons mogelijk. Hiervan coderen er 61
voor de 20 natuurlijke aminozuren en 3 worden gebruikt als stopcodon. Cellen bevatten
echter minder dan 61 verschillende tRNAs. Leg uit hoe in het ribosoom toch elk van die
61 codons kan worden vertaald naar het juiste aminozuur. (5P)
Dit is het gevolg van wobble base pairing. Bij de binding tussen codon op het
mRNA en het anticodon van het tRNA moeten de eerste 2 basen
complementair zijn, maar voor de 3 de base is dit vaak minder strikt. Op deze
positie bevindt zich in het anticodon vaak een I, welke met verschillende
basen kan binden. Het gevolg hiervan is dat 1 tRNA meerdere codons kan
herkennen. Deze codons coderen natuurlijk wel allemaal voor hetzelfde
aminozuur.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
c. Stel dat u een bacterie zou willen maken waarin 1 van de 64 codons codeert voor een
stopcodon, en waarin elk aminozuur slechts wordt gecodeerd door 1 codon. Dit zou u in
staat stellen om naast de 20 nu gebruikte aminozuren nog 43 andere aminozuren te
coderen en te laten inbouwen in eiwitten. Noem twee dingen welke we minimaal moeten
aanpassen in deze bacterie om dit mogelijk te maken? (5P)
Veel antwoorden zijn mogelijk:
-
Je moet 63 verschillende tRNA’s hebben
-
Je hebt 63 verschillende tRNA synthases nodig die elk een
specifeke combinatie van tRNA en aminozuur herkennen
-
Om ervoor te zorgen dat de E.coli eiwitten dezelfde
aminozuurvolgorde behouden moet je de DNA sequentie van E. coli
aanpassen waarbij je voor elk van de 20 natuurlijke aminozuren dus
maar 1 codon kunt gebruiken
-
Je moet de Release Factoren uitschakelen die 2 van de 3 stop
codons, die je niet meer wilt gebruiken herkennen
-
Je zou wellicht de synthese van die 43 andere aminozuren moeten
inbrengen, al zou je deze aminozuren ook gewoon aan de cellen
kunnen toevoegen.
-
Het ribosoom mag geen ‘wobble base paring’ meer toelaten
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
2
Van DNA naar Eiwit
(~25 minuten; 20 punten)
In een aquariumwinkel komt u een exotische vis tegen die een felle rode fluorescentie
laat zien onder belichting met groen licht. U herinnert zich uit het college moleculaire
celbiologie dat rood fluorescente eiwitten gewild zijn in de celbiologie als alternatief voor
GFP, maar dat de huidige rood fluorescente eiwitten nog niet erg fel zijn. U besluit een
poging te wagen om te zien of u het gen dat verantwoordelijk is voor de rode
fluorescentie kunt isoleren en tot expressie kunt brengen in bacteriën. Omdat u hoopt dat
het DNA dat codeert voor het rood fluorescente eiwit sterk lijkt op de sequentie van reeds
bekende fluorescente eiwitten, besluit u het meteen serieus aan te pakken en het
complete genoom van de rood fluorescente vis te sequencen.
a. Leg uit hoe dideoxy sequencing werkt. (5P)
Dit is de klassieke manier van DNA sequencing die ontwikkelt is door Sanger.
Bij deze techniek heb je een ssDNA template nodig, een primer, de 4
deoxyribonucleoside trifosfaat (dATTP, dTTP, dCTP, en dGTP) en een DNA
polymerase en tenslotte van 1 van de 4 ribonucleosides ook de dideoxy
variant, bijvoorbeeld ddATP. Deze ddATP heeft geen OH groep op de 3’
positie. Als deze ribonucleotide wordt ingebouwd stopt de reactie. Tijdens de
polymerisatie reactie worden daarom verschillende lengtes DNA fragmenten
gevormd, die echter allemaal de A als laatste base hebben aan de 3’ kant van
de keten. Door de reactie 4 uit te voeren met telkens een andere dideoxy
ribonucleoside trifosfaat en de fragmenten vervolgens op grootte te scheiden
kun je op een gel of na kolomchromatografie aflezen wat de DNA sequentie
van de template was.
Helaas kunt u geen gen ontdekken dat homologie vertoont met een reeds bekend
fluorescent eiwit. Als alternatief besluit u het RNA uit de rood fluorescente cellen te
isoleren en daarmee een cDNA bibliotheek te maken.
b. Wat is cDNA en hoe maak je cDNA? (5P)
cDNA staat voor complementair DNA. cDNA is de vertaling van mRNA in DNA.
cDNA wordt gemaakt door het enzym reverse transcriptase te gebruiken met
mRNA als template en een poly-T als primer. Hierdoor ontstaat in eerste
instantie een DNA-RNA hybride structuur. Na selective hydrolyse van de RNA
strand, wordt in een 2de polymerisatie reactie dsDNA gemaakt. Dit DNA bestaat
dus gehaal uit coderend DNA zonder intron sequenties, omdat deze er in de
synthese van mRNA al zijn uitgespliced.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
c. Elk cDNA wordt gekloneerd in een plasmide, welke vervolgens wordt getransformeerd
in bacteriën. Teken schematisch een plasmide en geef aan welke onderdelen minimaal
aanwezig moeten zijn voor succesvolle transformatie van het plasmide en expressie van
het cDNA in de bacterie. (5P)
Plaatje moet de volgende onderdelen bevatten:
- Origin of replication (anders kan het plasmide niet worden
vermenigvuldigd in de bacterie)
- Gen voor antibiotica resistentie (voor selectie van bacterieen die het
plasmide hebben opgenomen)
- Het cDNA
- Een promotor aan de 5’ kant van het cDNA zodat een RNA
polymerase van de bacterie het gen herkent en er transcriptie van
het cDNA zal plaatsvinden)
Eureka! U hebt een bacterie kolonie gevonden op uw voedingsbodem die onder
belichting met groen licht een sterke rode fluorescentie vertoont. U isoleert het plasmide
en heldert de DNA sequentie op van het gen dat codeert voor het rood fluorescente eiwit.
d. In tegenstelling tot veel andere fluorescente eiwitten blijkt het door u gevonden
fluorescente eiwit ook bij lage pH nog fluorescent. Als eerste toepassing wilt u het daarom
gebruiken om de lysosomen in een HeLa cel zichtbaar te maken. Leg uit wat u nog moet
aanpassen aan het eiwit om ervoor te zorgen dat het eiwit in deze cellen in de lysosomen
terecht komt. (5P)
Lysosomale eiwitten worden via co-translationeel transport op ribosomen
gemaakt op het ER en in het ER gevouwen. Vervolgens worden ze via
vesculair transport naar de Golgi getransporteerd, waar een bepaalde eiwit
sequentie bepaald dat ze van een mannose-6-fosfaat groep worden voorzien.
Dit is een signaal voor verder vesculair transport naar de lysosomen. Het eiwit
moet dus worden voorzien van een N-terminale ER-targeting sequentie en een
sequentie die voor modificatie met een mannose-6-fosfaat groep zorgt.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
3
DNA mutaties
(~20 minuten; 15 punten)
Bijna alle organismen, variërend van een simpele E. coli bacterie tot de mens, hebben
ongeveer dezelfde mutatiesnelheid van 1:10 9. Recent hebben wetenschappers op 3000
meter onder het aardoppervlak een primitieve vorm van leven ontdekt met een veel
grotere mutatiesnelheid.
Twee dingen vallen de wetenschappers op:
1. Het DNA in deze oerbacterie bevat uracil in plaats van thymine als een base.
2. De DNA polymerase heeft geen primers nodig om DNA te repliceren.
a. Welke van deze twee observaties (1, 2, of beide) zouden de verhoogde
mutatiesnelheid kunnen verklaren? Leg uw antwoord uit. (9P )
Beide.
1. Deaminering van cytosine resulteert in uracil. In deze bacterie zal deze vorm
van DNA schade niet herkent kunnen worden en dus ook niet gerepareerd,
waardoor de mutatiesnelheid zal toenemen.
2. DNA polymerases maken normaal gebruik van een editing mechanisme om
te controleren of de net ingebouwde base wel echt goed is. Dit mechanisme
controleert of de net gesynthetiseerde DNA strand goed gehybridiseerd is.
Een consequentie van dit mechanisme is dat DNA polymerases altijd een
primer nodig hebben voor DNA synthese. DNA polymerases die geen primer
nodig hebben, kunnen geen gebruik maken van dit controle mechanisme en
zullen dus meer fouten maken.
b. Behalve fouten tijdens DNA replicatie zijn er nog een aantal andere processen die voor
genetische variatie zorgen. Noem 3 andere processen. (6P)
-
Verschillende vormen van DNA schade als gevolg van deaminering,
depurinering, ioniserende straling, etc
Reparatie van dsDNA breuken via non-homologous end-joining
Reparatie van dsDNA breuken via homologe recombinatie
Homologe recombinatie tijdens meiose
Insertie van transposons.
Naam:
Opleiding:……..
Studentnummer:
4
Controle over transcriptie en translatie
(~20 minuten; 15 punten)
a. In een eukaryotische cel kan het proces van DNA tot actief eiwit tijdens elke stap
gereguleerd worden. Plaats (de nummers van) de onderstaande controleprocessen op de
plek in bijgevoegd figuur. (3P)
1. translationele controle
2. mRNA degradatie controle
3. eiwitactiviteit controle
4. RNA transport en lokalisatie controle
5. RNA processering controle
6. transcriptionele controle
6
5
1
4
3
2
b. Plaats 1 van onderstaande termen bij iedere definitie (slechts 1 antwoord correct). (4P)
chromatine immunoprecipitatie
DNA affiniteitchromatografie
leucine zipper
gen-regulerend eiwit
helix-loop-helix motief
helix-turn-helix motief
homeodomein
histon eiwit
zink vinger
1. Een eiwit welke bindt aan een specifieke DNA sequentie en daarmee de
expressie van een gen beïnvloed. gen-regulerend eiwit
2. Structuurmotief in veel DNA bindende eiwitten waarin twee -helices van
verschillende eiwitten bij elkaar worden gehouden in een coiled-coil.
leucine zipper
3. Methode gebaseerd op het cross-linken van eiwitten aan DNA in levende cellen
welke gebruikt wordt om te bepalen welke gebieden op het DNA door een
specifiek eiwit worden bezet. chromatine immunoprecipitatie
4. DNA-bindingsmotief waarin een -helix en -sheet bij elkaar worden gehouden
door een metaalion. zink vinger
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
c. Transcriptie kan gereguleerd worden door liganden die binden aan gen-regulerende
eiwitten. De combinatie van een ligand met een eiwit kan transcriptie activeren, maar ook
blokkeren. Beschrijft u schematisch/conceptueel hoe transcriptie van een gen negatief
gereguleerd kan worden met behulp van een gen-regulerend eiwit en een ligand. Maakt u
eventueel gebruik van een schematische schets om uw antwoord te ondersteunen. (4P)
Een van de twee aangegeven concepten. Dan
wel duidelijk getekend, dan wel de processen
duidelijk
uitgelegd
zoals
in
de
ondersteunende
tekst
in
de
figuur
aangegeven.
d. Regulatie van de translatie van het eiwit ferritine wordt onder andere gecontroleerd
door de interactie tussen een hairpin structuur in het mRNA, genaamd iron-response
element (IRE), en het iron-response protein (IRP) welke daaraan bindt. Als IRE is
gebonden aan IRP is translatie geblokkeerd. Om goed te functioneren moet het IRE dicht
bij het 5’ einde van het mRNA gepositioneerd zijn. Als het meer dan 60 nucleotiden
hiervan verwijderd is kan IRE niet langer translatie inhiberen. Legt u uit via welk
mechanisme / hoe IRE samen met IRP translatie blokkeert er waarom naar uw inzicht
daarbij de positie van het IRE in het mRNA zo cruciaal is. (4P)
Gebonden IRP interfereert met de translatie door de stabiele associatie van de
kleine ribosomale sub-eenheid aan het mRNA te blokkeren; de eerste stap in de
initiatie van translatie. (De kleine ribosomale sub-eenheid bindt aan de 5’ cap
structuur en scant dan het mRNA af tot er een geschikt AUG start codon is
gevonden om de translatie te starten.) Wanneer er een IRP is gebonden nabij de 5’
cap kan de kleine ribosomale sub-eenheid niet binden. Als IRP binding verder
downstream (>60 nucleotiden) is, door een veranderde locatie van de IRE, kan de
kleine ribosomale sub-eenheid wel binden aan het 5’ uiteinde van het mRNA.
Blijkbaar is in dat geval het ribosoom sterk genoeg gebonden om de gevouwen IRE
en gebonden IRP te ontvouwen en verwijderen.
Naam:
Opleiding:……..
Studentnummer:
5
De celcyclus
(~20 minuten; 15 punten)
U bent onlangs benoemd tot directeur van het nationale ballet en gefascineerd geraakt
door de overeenkomst tussen de voorstellingen (kindermatinee en avondprogramma) en
de celcyclus. Elke keer loopt het theater vol, de lichten gaan uit, het gordijn aan de kant,
de dansers dansen, het gordijn valt, de lichten gaan aan en het theater loopt leeg. En
tussen iedere voorstelling is er een periode van rust van langere of kortere duur
(namiddag of nacht). Een goed gedefinieerde, zich herhalende sequentie, net als de
celcyclus.
a. Ook in de celcyclus komen rustperiodes (gaps) voor tussen de S en M fasen. Noem
twee redenen waarom er van deze rustperiodes zijn in de celcyclus. (4P)
-Cellen gebruiken de rustperiodes om te groeien/om bouwstenen aan te maken
voor de processen in de S en M fase. Bouwstenen voor DNA synthese, nieuwe
organellen, etc. Als dit niet zou gebeuren zouden cellen steeds kleiner worden.
-Cellen gebruiken de rustperiodes (vooral de G1) om aanwezig te blijven zonder
verder te delen. De afwezigheid van groeisignalen laat de cellen als het ware
overwinteren. Hiervoor zijn de rustperiodes goed geschikt.
-Cellen gebruiken de rustperiodes om de interne en externe omgeving te
controleren, om er zeker van te zijn dat de omstandigheden gunstig zijn om de
grote veranderingen van S en M fase te kunnen ondergaan.
b. Tijdens het kindermatinee blijken er het dubbel aantal
bezoekers in de zaal te passen als in de avond (twee
kinderen per stoel). Eenzelfde soort fenomeen zien we bij
de celcyclus m.b.t. de hoeveelheid DNA in de cel. In de
flow cytometrie figuur hiernaast is de correlatie tussen het
aantal cellen en de hoeveelheid DNA (door al het DNA
fluorescent aan te kleuren) tegen elkaar uitgezet. Geef in
de figuur aan waar u het signaal verwacht van cellen in
ieder van de volgende fasen: G1, S, G2 en M. (3P)
G1
G2 + M
S
0
1
2
Uitleg (niet gevraagd): The peak with the lowest fluorescence corresponds to cells
in G1, which are diploid. The peak with the highest fluorescence corresponds to
cells in G2 and M, which have finished replication and are tetraploid (and thus have
twice the fluorescence of G1 cells). Cells in S phase, which are replicating their
DNA, are between diploid and tetraploid and thus have intermediate levels of
fluorescence.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
c. Schets een soortgelijke figuur als bovenstaand waarin de celdistributie staat
aangegeven nadat de celcyclus is geblokkeerd in de G1 fase (bijvoorbeeld door een
medicijn). (3P)
0
1
2
d. Noem en beschrijf in een paar zinnen 2 conceptueel verschillende manieren waarmee
de activiteit van cycline-Cdk complexen wordt gereguleerd. (5P)
-De activiteit van cycline Cdk complexen kan worden gereguleerd door
phosphorylering en dephosphoryleringsreacties. Activatie door phosphorylering
van de Cdk; Inhibering door dubbele phosphorylering van Cdk (en natuurlijk de
terugwerkende mechanismen door dephosphorylering.) (Eventueel ook nog
activiteitsregulatie van de Cdk modificerende enzymen door (de)phosphorylering)
-De activiteit van cycline Cdk complexen kan worden gereguleerd door binden van
en Cdk inhibitor (CKI) eiwitten. Binden van een CKI aan een Cdk-cycline complex
leidt tot inactivatie.
-De activiteit van cycline Cdk complexen kan worden gereguleerd door
gereguleerde synthese en proteolyse van de verschillende cyclines, en ook CKIs.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
6
Kanker, Signaaltransductie en Apoptose
(~25 minuten; 20 punten)
a. Mouse mammary tumor virus (MMTV) is een oncogeen virus dat tot borstkanker in
muizen leidt wanneer het integreert in het genoom. U wilt weten of dit virus zelf een
oncogeen bevat of dat het er een genereert na integratie in het genoom. U isoleert 26
verschillende borstkankers van muizen blootgesteld aan MMTV en bepaald de plek van
de retrovirale integratie. In 18 van de 26 tumoren wordt de integratie gevonden binnen
een 20 kilobase segment van het muisgenoom. Het blijkt dat bij deze 18 tumoren een
RNA van het muisgenoom tot expressie komt, welke in niet geïnfecteerde cellen niet tot
expressie komt. Wat vertellen deze observaties u m.b.t. de vraag of het MMTV een
oncogeen bevat of een oncogeen genereert na integratie. Leg uw antwoord kort uit. (5P)
De observaties zijn hele sterke indicaties dat MMTV een oncogeen genereert na
integratie in het genoom van de muis. Het is heel onwaarschijnlijk dat MMTV puur
door toeval zo vaak zou integreren in dezelfde regio van het genoom. Tevens wordt
er een uniek transcript gegenereerd van de regio waar het virus geïntegreerd
wordt, wat suggereert dat een gen wordt aangezet als respons op de naburige
geïntegreerde virale sequenties.
b. Het Arf eiwit inhibeert het Mdm2
eiwit, welke weer het p53 eiwit
inhibeert. De relatie tussen deze 3
eiwitten is gerepresenteerd in de figuur
hiernaast. Dit is een voorbeeld van een
“dubbel-negatief” mechanisme: Arf is
een inhibitor van een inhibitor van p53.
Verwacht u dat een Arf-knockout muis meer of minder gevoelig is voor het ontwikkelen
van een tumor dan een normale muis? Leg uw antwoord kort uit. (5P)
Een Arf-knockout muis zal naar verwachting meer gevoelig zijn voor de
ontwikkeling van een tumor dan een wild-type muis. In de afwezigheid van Arf zal
het Mdm2 meer actief zijn/worden. Dit overactieve Mdm2 zal vervolgens de p53
meer onderdrukken dan normaal. De consequentie van een Arf knockout is dus
gereduceerde p53 activiteit. Hierdoor zal p53 minder in staat zijn abnormale cellen
tot een cel cyclus arrest of apoptose te laten overgaan. Als gevolg zullen meer
“pre-kanker” cellen van de celdood ontsnappen en worden meer tumoren gevormd.
Naam:
Opleiding:……..
Studentnummer:
c. Beschouw onderstaande signaleringscascade. Leg uit wat er gebeurt bij iedere
genummerde stap in de signaleringscascade en wat het uiteindelijke cellulaire gevolg is
(roze blokje). (10P)
1
3
4
4
4
2
5
5
6
8
7
9
10
1. Een extracellulair “overlevingssignaal” bindt, dimerizeert en activeert een
Receptor Tyrosine Kinase (RTK).
2. De gedimerizeerde activeert zichzelf middels cross-phosphorylatie.
3. De gephosphoryleerde RTK fungeert als dockings platform en recruteert en
activeert een PI 3-kinase. De PI 3-kinase is hierdoor nu actief en
membraangebonden en kan daardoor PIP2 phosphoryleren tot PIP3.
4. Twee van deze PIP3 binden aan de PH domeinen van PDK1 en Akt en fungeren
als dockingsplatform om deze twee eiwitten dicht bij elkaar te brengen en te
activeren.
5. Akt wordt dubbel gephosphoryleerd door PDK1 en mTOR en daardoor
geactiveerd.
6. Door de phosphorylering ondergaat Akt een conformatie verandering en het
geactiveerde Akt laat los van het membraan.
7. Het actieve Akt phosphoryleert het Bad eiwit.
8. Gephosphoryleerd Bad laat het inhibitor eiwit los en wordt zelf weggehaald uit
de actieve cascade door binding aan een 14-3-3 eiwit.
9. Het apoptose inhibitor eiwit komt vrij en wordt actief.
10. Apoptose wordt geinhibeerd, waardoor de cellen overleven.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
Bonusvraag
(~5 minuten; 5 punten)
Welke twee humane eiwitten worden door het papillomavirus in hun werking gestoord
waardoor er baarmoederhalskanker kan ontstaan? (namen volstaan)
Rb en p53