Lesnota`s + Cursus Immunologie
advertisement
Lesnota’s + Cursus Immunologie -Prof. Opdenakker- Jef Vanhamel Pieterjan Vanclooster Hoofdstuk 1: Wat is immuniteit? Essentieel vijandelijke omgeving in ons lichaam van kleine virussen/bacteriën tot lintwormen Afweer: door moleculaire mechanismen 1) Cellen: leukocyten: fagocytose en digestie 2) Moleculen: bv. Complementsysteem en antilichamen Hoe meer ontwikkeld organisme, hoe complexer de immuunreacties: Natuurlijke barrières Complementsysteem (gat in membraan boren met membraan aanvalscomplex) Cytokines Acuut fase eiwitten Antistoffen Natuurlijke barrières: Fysisch: huid en slijmvliezen (bv. Maag-darmmucosa) en structuren Secreties: talg (zweren op huid), mucus, zuur maagvocht, enzymen (bv. Lysozyme: breekt celwand van bacteriën af) = biochemisch Microbieel: commensale flora: bv. E.Coli (colicinen: salmonella onderdrukken) Bescherming tegen infecties, ook kanker (eigen somatische cellen) Twee fenomenen: 1) herkennen pathogenen 2)reactievernietiging 2 systemen a) Niet-adaptief/ aangeboren: 1) Niet specifiek (onafhankelijk van de vijand) 2) Primitief: ook bij lagere diersoorten 3) Snel werkend: minuten tot uren 4) Moleculaire patronen: bv. RNA virussen: RNA heeft welbep. patroon herkenningsmolecule van de myeloïde cellen . Bv. Fagocytose/antivirale interferonen Ook natuurlijke barrières; humoraal via: complement, cytokines en mediatoren b) Adaptief 1) Specifiek 2) Verzamelen info + geheugen (2e aanval is sneller immune memory) 3) Trager (tot 1 week) 4) antigenen 5) herkenningsmoleculen van T- en B-lymfocyten * In principe is elke cel betrokken in verdediging van het organisme MAAR: reeks van gespecialiseerde cellen: specifieke verdedigingstaken leukocyten: fagocyten (micro-organismen opeten) en lymfocyten (moleculen produceren met een specifieke (adaptieve) werking) Interacties: 1) tussen immuun cellen onderling (cytokines, antigenpresentatie, antilichamen) 2) tussen alle cellen van het organisme (cytokines,hormonen, neurotransmitters) 3) tussen 2 systemen ( adaptief – niet-adaptief) bv. opsonisatie (bevorderen van fagocytose) geassisteerd door complementmoleculen, lectines en antistoffen Fundamenten: HERKENNING van vreemde moleculen 1) Niet-adaptief: bv. Toll-like receptoren 2) Adaptief: antigenen = lichaamsvreemde stoffen die vorming van antistoffen opwekken Alle stoffen die T- en B-lymfocyten herkennen herkend die antilichamen (gevormd door B-lymfocyten) cellen herkennen antigenen: specifieke receptoren clonale expansie Mediatoren: 1) Acuut fase eiwitten: eiwitten plots aangemaakt bij infectie. Bv CRP en SAP. - Endotoxine shock: 50% mortaliteit ( exogeen pyrogeen ( = koorts wekkend) bv. LPS (= lipopolysaccharide: oligomeer van lipiden en carbohydraten dat bijdraagt aan edotoxine van gramnegatieve bacteriën . gedraagt zich als polyclonale activator van muriene B-cellen) ↔ endogeen pyrogeen: IL-1) - Activeert TLR-4 NF-kB ( nucleaire factor kappa van de lichte keten enhancer (activator DNA transcriptie) van de geactiveerde B cel = heterodimere transcriptiefactor, waarbij elk dimeer zijn eigen repertoire aan promotoren activeert. Zit in cytoplasma gebonden aan inhibitor van NF-kB: IkB) - ↑↑ MMP’s ( = matrix metaloproteïnase = zink afhankelijke endopeptidasen ) : Collagenasen (MMP-8), gelatinase-B (MMP-9), stromelysinen (MMP-3) - Therapie: Proteïnaseremmers?, proberen leven met ± 4dagen te rekken 2) Cellen van complement systeem: - 20-tal serumeiwitten die ontstekingsreactie regelen. - Factoren regelen immuniteit door interacties met aangeboren, niet-specifieke immuniteit of de specifieke immuniteit. Laatste via antilichamen op parasiet = specifiek adaptief antwoord op antigeen =klassieke weg van complementactivatie. - Complementcascaden: ° eiwitfragmenten met volgende functies: opsonisatie van micro-organismen, lysis van cellen, virussen en bacteriën, vasodilatatie en vaatwandpermeabilisatie en chemotaxis van witte bloedcellen. 3) Cytokines: hormonen van immuunsysteem; glycoproteïnen - kunnen praktisch door elk celtype aangemaakt worden en regelen het immuunantwoord in sterkte (volume, meestal cel proliferatie) en aard (tuning, meestal cel differentiatie) - Werken in op op cellen via specifieke membraanreceptoren (receptor op cel die cytokine produceert, dan spreekt men van autocriene werking (bv IL-2), op cellen in omgeving = paracrien (bv interferon) en kan ook endocrien (bv. IL-1)) - Voorbeelden: de interferonen die interfereren met virusreplicatie, de “colony stimulating factors” laten stamcellen van het beenmerg uitrijpen, de tumor necrosis factor en het lymfotoxine regelen ontstekingsreacties en cytotoxiciteit, chemokinen of chemotactische cytokinen , groeifactoren (FGF, VEGF, TGF, PDGF, EGF) 4) Immunoglobulinen of antilichamen: serumeiwitten geproduceerd door de B-lymfocyten - Eén deel van de antistofmolecule bindt op specifieke wijze het antigeen (fragment antigen-binding, Fab), terwijl andere delen via celreceptoren (Fc receptoren) herkend worden en het gebonden pathogeen organisme dichter bij de immuuncel (met de Fc-receptor) brengen. - Neutrofiele granulocyten en cellen van het MPS dragen zulke Fc-receptoren. Het kleven van antilichamen op een parasiet is een vorm van specifieke opsonisatie en het antilichaam is in dat geval een opsonine - De fysische contactzone van het antigeen met het antilichaam noemt men de antigenische determinant of epitoop van het antigeen. Antigeenreceptor moleculen Herkenning van antigenen: Ig’s + TCR (T-cel receptor: heterodimeer met α en β keten of een γ en δ keten , is een antigeen bindend molecule op membraan van T-cellen en geassocieerd met CD3) Natuurlijk vs. Adaptief Natuurlijk: -PAMP’s ( pathogeen geassocieerde moleculaire patronen) en DAMP’s ( damageassociated molecular paterns; componenten van dode of stervende cellen en weefsels die herkend worden door patroon herkennende receptoren (PRRs) - patronen herkend door receptoren op myeloïde cellen, steeds dezelfde respons (in tijd en intensiteit) Adaptief: Epitopen van antigenen herkend door antistoffen en T-cel receptoren (lymfocyten) Primaire vs. Secundaire (geheugen) respons Endotoxines: bv.LPS herkend door TLR-4, kan shock veroorzaken Toll-like receptoren: TLR’s zijn receptoren van de natuurlijke immuniteit bindingssite voor moleculaire patronen ( specifiek voor elke TLR) samenwerking tussen TLR’s: samenklitten van receptoren signaaltransductie cascaden NF-kB schakelt genen aan die ontstekingsreacties induceren (cytokines en MMP’s) MMP: afbreken van extracellulaire matrix Eerst zymogenen: geactiveerd door proteolyse (Zn-atoom), controle door TIMP’s: anders afbraak van BM overal rond het circulatoir systeem shock! ( ↓bloeddruk) - Diapedese (extravasatie) van leukocyten en migratie - Constitutief/inductie (door ontsteking) - MMP-9 : Gelatinase-B geïnduceerd door TLR - MMP-8: neutrofiel collagenase Expressie door neutrofielen acute ontstekingsreactie en shock! Antigeen receptoren Adaptieve immuniteit herkennen van antigenen 2 soorten moleculen (diversiteit en heterogeniteit door extensieve gen herschikkingen = nodig, want antigenen zijn ook zeer divers en reactie moet specifiek zijn!) : antistoffen en T-cel antigeenreceptoren Ontstaan van diversiteit van antigeenreceptoren: verschillende genen coderen voor verschillende keten van de receptor genen modulair opgebouwd segmenten op variabele wijze aan elkaar koppelen mutaties bij de herschikking stijgende diversiteit combinaties van verschillende ketens (zie 2e pijl) glycosylering ( post-translationeel Immunoglobulinen = glycoproteïnen in de sera en weefselvocht van mammalia gekoppeld aan celopp.: B-cel receptoren (BCR) vrij in circulatie van bloed en lymfe: antilichamen => antigen bindingssite identiek in BCR en antilichamen contact B-cel met vrij antigen => inductie van synthese en secretie van antistoffen T-cel receptoren (TCR): Aan celopp. van T-lymfocyten ( niet vrij in circulatie) Binding met antigenen => immuunreacties => T-helper, T-regulator enT-cytotoxische functies Opmerking: activatie van T-cellen enkel als: antigeen = peptide en als antigeen wordt aangeboden aan oppervlak van antigeen presenterende cellen. Priming vs. Boosting => vaccins Toedienen vaccin: primaire anti-respons na ± 1 week = priming Na 2e contact met pathogeen blootstelling: snelle respons + meer antilichamen Infectieziekten: moeilijk te bestrijden, zelfs met goede medicatie preventie is beste geneeskunde = vaccins preventie is goedkoop Immunoglobulinen 5 klassen: IgG, IgA, IgM, IgD en IgE verschillen in moleculaire grootte, sequenties en glycosylering ( verschillende post-translationele modificatie) Opbouw: * 2 zware / heavy ketens: 4/5eiwitdomeinen *2lichte / light ketens : 2 eiwitdomeinen: V en C disulfidebruggen tussen ketens, door interne zwavelbruggen ° eiwitdomeinen of immunoglobulinevouw Disulfidebruggen tussen de ketens Disulfidebruggen intern: vouwen of folds V= variabel deel: antigen bindend (aminoterminaal) C= constant deel: biologische activiteit Koolhydraten: duwen de 2 ketens uit elkaar ter hoogte van C2- domein 1vouw : 110 AZ 1 Ig = ±150 kDa Nier laat geen Ig’s door geen Ig’s in de urine. Functies: 1) antigeenbinding: variabele delen van de H &L keten: bevatten de Fab plaats (= fragment antigen binding region: regio op N-terminus van antilichaam molecule dat interageert met antigen. Maakt deel uit van H&L keten , verbonden door een interketen disulfidebinding) 2) katalytische werking: C1- domein: bv. oxidatie H2O tot H2O2 (anti-microbieel) 3) C2 geglycosyleerd: interactie met MBL (manose-bindend lectine (acuut fase eiwit) en complement activatie na binding antigen. 4) C3 interactie met receptoren op fagocyterende cellen: Fc-receptoren (FcR) ( Fc region(fragment crystallizable region: regio op C-terminus van antilichaam dat interageert met Fc receptor op andere cellen en componenten van complement systeem; FcR: cel oppervlak receptor (op mastcellen, lymfocten, macrofagen,… specifiek voor de Fc regio van bep. Ig’s) Fab-domein: voor solubele Ig’s: opsonisatie 3x3 vingers in het variabele deel van de H&L keten aan N-terminus CDR-regio’s (complemtaritydeterming region: bevat antigen binding residue) hypervariabel binden antigeen Opmerking: Ab’s als brug tussen antigenen (via Fab) en de cellen (via Fc) die deze antigenen vernietigen Definities: 1) immunogeen: antigen dat een immuunreactie opwekt ( dat wat Ab’s bindt) 2) Epitoop (fysische contact zone)/ antigenische determinant: deel van antigen dat herkend kan worden door antilichamen, B-cellen en T-cellen 3) Hapteen: klein eiwit dat als epitoop kan dienen, maar een carrier nodig heeft om immunisatie op te wekken 4) Adjuvans: versterkend effect van immuunrespons, maar zelf geen direct effect. 5) Framework regions (FR): aminosequentie op de hypervariabele regio in het variabele domein van H&L ketens van immunoglobulines. Tussen de CDR’s van de variabele keten 6) Light chains: variabele regio VL en constante regio CL ( meest voorkomende sequenties K of λ (λ1, λ2 , λ3 en λ4) 7) DNP-ligand = hapteen : bindt aan carrier => vorming van ringstructuur : 3Ab-3Ag (Ag-Ab trimeer) => immunisatie IgG: - majeure soort Ab’s in serum (80%) - ± 150 kDa 4 subklassen: IgG1-4: verschillende heavy chains (γ1γ4) structureel en functioneel verschil ( binden verschillende moleculen via constante domeinen) Zowel binnen als buiten de bloedvaten Secundaire immuunrespons!!! Anti-toxine activiteit + neonatale immuniteit IgA: -zware keten = α keten - Kruising zware ketens in de “hinge region” -2subklassen ( α1 en α2) - 3 constante domeinen: Cα1-3 - 15-20% van serumglobulines -Monomeer ( 160 kDa) of dimeer van (385 kDa) Dimeer: - secreties van slijmvliezen - J-keten: S-bruggen - Secretorische IgA: in seromuceuse secreties -> associatie met secretorische component (fragment van de poly-Ig receptor van de mucosale cellen(enterocyten)) ( niet uit B-cel afkomstig, bindt thv Jketen) Vorming IgA: plasmacel secreteert IgA (dimeer) binding IgA aan poly-Ig receptor van mucosale cel ( aan basale zijde enterocyt)=> internalisatie en enzymatische klieving , actief transport, secretie van sIgA in lumen klier ( bv. melkklier lacterende borst) Immunologische voordelen van moedermelk: sIgA’s: binden aan microben in GI-stelsel baby => ↓ binding microben aan de wand van het GI-stelsel + opname in de weefsels! Lysozyme: vernietigt celwand bacteriën IFN-γ Lactoferine B12-BP: bacteriën hebben Vit.B12 nodig om te groeien IgM: - ±10% van de serumglobulines - µ = zware keten ( additioneel constant domein: CH4) -1e contact met Ag => primaire immuunrespons!! -vormt pentameren (950 kDa) - exclusief tegen T-onafhankelijke antigenen vaak repetitieve structuren (geen eiwitten) Sterconformatie van IgM (in oplossing): S-bruggen thv Cµ3 en Cµ4 van de monomeren en de J-keten van de pentameren -In gebonden toestand niet alle Ag-bindende valenties bezet (±5 IgE: - geproduceerd door B-cellen bij 2e contact met Ag (secundaire immuunrespons) - Bindt aan basofiele granulocyten en aan mastcellen (FcεR : hofe affiniteit voor IgE) => cytofiele moleculen (IgE) Werking IgE: - IgE bindt allergeen aan Fab - IgE –allergeen complex bindt op FcεR van mastcellen => degranulatie + release inhoud granulen (mediatoren van allergische reacties (bv. histamine)) -↑ IgE in serum bij parasitaire infecties en allergische reacties - zware keten: 4 constante domeinen: Cε4 - molecuulgewicht: meer dan 150 kDa omwille van meerdere suikers Opmerking: meestal bindt IgE meerdere allergenen (=> een ongeluk komt nooit alleen) allergie voor meerdere stoffen Subklassen: IgG => 4 subklassen: 4 verschillende zware ketens: γ1γ4 IgA => 2 subklassen: 2 verschillende zware ketens: α1α2 Opmerking: - moleculaire formule: Bv. IgG met 2 zware ketens ( γ) en 2 lichte ketens van de K klasse => γ2K2 - IgM kan pentameren vormen (µ2λ2)n met n= 15 - IgA kan tetrameren vormen (α2K2)n met n= 14 - IgG, IgA en IgD: zware ketens tellen 4 domeinen, zonder de hinge region; IgM en IgE: 5 zware ketens, geen hinge keten - Om polymeren te vormen is steeds een J-keten nodig! Hinge region = peptide tussen CH1 en CH2, rijk aan prolines en cysteïnes: ↑flexibiliteit en Ag-binding IgD: - < 1% van serumeiwitten - 180 kDa - vooral op oppervlak van B-cellen: mIgD -Antigeen afhankelijke prikkeling van B-cellen Antilichaam structuur en varianten: Isotypen: verschil in zware ketens (klasseverschillen) Allotypen: genetische verschillen (≠allelen) : individuele mutaties in constante delen variaties binnen isotypen Idiotypen: verschil in variabele delen ( bv. IgG1 tegen Ag a en IgG1 tegen Ag b) B-cel receptoren (BCR): membraangebonden IgM exact dezelfde structuur als gesecreteerde IgM, behalve een zeer kort C-terminus (hydrofoob) voor verankering aan cel. probleem: C-terminus van maar enkele AZ -> signaaltransductie oplossing: niet-covalente associatie met Igβ/Igα –heterodimeren langs 2 zijden van mIgM => genereren Ag-signaal naar interne zijde van de B-cel => 3 delen samen herkennen Ag: B-cellen delen en produceren IgM (primaire immuunrespons) 2x Ig-vierketen model van Porter: - Lichte keten gemeenschappelijk voor alle Ig’s - Verschillende zware ketens => verschillende klassen Ketens aan mekaar gekoppeld via covalente bindingen ( S-bruggen) en zwakke interacties Valentie van IgG: bestuderen door klieving met proteasen Fab: monovalente Ag-bindende stukken Pepsine Fc: bindt Ag niet Lichte ketens: K of λ. 2 domeinen: N-terminale VL en C-terminale CL ± 110 AZ per domein (per Ig-vouw) 1 S-brug per domein (intraketen) => Ig-vouw Zware ketens: VH +3 of 4 CH met 3 of 4 intraketen S-bruggen Halfwaardetijd: IgG1: ± 3 weken, IgE amper 2 dagen Enkel IgG-moleculen kunnen placenta passeren. IgG3 en IgM kunnen binden aan C1q van het complement systeem, IgG1/IgG2 in mindere mate Immunoglobulinevouw: Ig-superfamilie : Ig/TCR/MHC/CD2-3-4-8 + CAM’s (cel adhesie moleculen: groep van celoppervlak moleculen die intercellulaire adhesie mediëren. Meeste behoren tot 1 van de 4 eiwitfamilies: integrines, selectines, mucin-like receptoren en Ig superfamilie ( box14.2)) - Tertiaire eiwitstructuur ± 110AZ vouwen op tot globulaire eenheid Stabilisatie door intraketen disulfidebrug Elke vouw heeft specifieke functie V= Fab, C1 = oxidatie, C2= complentactivatie, C3 = FCR-interactie Lichte keten: 2 domeinen (2vouwen) VL: 3 vingers die het Ag vastgrijpen: sequentie van de vingers hypervariabel (CDR) Kruisreactiviteit: moleculen die op elkaar gelijken ( bv. Leukotriënen) binden in meer of mindere mate ook dezelfde antilichamen => uitgedrukt in % specificiteit van het antilichaam (hoe specifiek bindt dit Ag aan DIT Ab?) Allergie aan medicatie: Meestal kleine moleculen ( bv. penicilline-derivaten) kunnen binden aan carriers ( eiwitten in het lichaam) aanmaak antistoffen => allergie aan medicatie! Vaccins: Toedienen antigenen en adjuvantia Adjuvans: Ag langer aanwezig laten, WBC aantrekken, B-cellen stimuleren op niet specifieke manier. Dosis en plaats van toediening respecteren! Anders kans op tolerantie! Verschillende types: - Freund’s incomplete adjuvans: verlengt aanwezigheid Ab, versterkt cosimulatoir signaal en induceert granuloma vorming - Freund’s complete adjuvans: zelfde, maar sterker in laatste 2 puntjes -Aluminium Kalium Sulfaat: Al-hydroxide, verlengt aanwezigheid Ab, induceert granuloma vorming. T-cel receptoren (TCR): - - Ag- herkennende moleculen aan oppervlak van T-cellen Membraananker (hydrofoob) 2ketens: α en β 4 Ig-vouwen met variabele en constante delen: Vα en Cα en Vβ en Cβ ( tekening) Steeds celgebonden: celgebonden effecten van binding aan Ag (delen, differentiatie, secretie cytokines en cytotoxica, gewijzigd celmetabolisme,…) Herkennen enkel Ag die peptiden zijn + die gepresenteerd worden door moleculen van MHC (majeur histocompatibility complex) van APC ( antigeen presenterende cellen) (MHC= groep van genen die coderen voor celoppervlak moleculen die nodig zijn voor antigeen presentatie aan T-cellen en voor snelle afstoting. HLA comlex) TCR vormt complex met andere moleculen (CD3-complex) Structureel: - - CD3-complex: ϱ-ϱ homodimeer of ϱ-η heterodimer Externe domeinen van de γ, δ en ε ketens van CD3: alle een Ig-vouw => zijdelingse interactie met TCR en zichzelf (CD3-complex = 2 TCR’s + ϱϱ-homodimeer + γεdimeren + εδ-dimeer) Ionische interactie ter hoogte van celmembraan juiste positionering Lange intracytoplasmatische staarten van de CD3-ketens: gem. sequentie ITAM ( = immunoreceptor tyrosine activatie motieven) signaaltransductie Functie: - Cel gebonden (niet in oplossing) Herkennen enkel korte peptiden, aangeboden door antigeenpresenterende moleculen (MHC klasse I/II) Herkenning tussen TCR en CD4/CD8 => specificiteit +oorsprong Ag + soort T-cel dat antwoordt ↔ CD1-varianten herkenning van glycolipiden APC: Macrofagen ( ook in medulla van lymfeklieren) - B-lymfocyten ( bij lage Ag-concentraties (BESTE!!)) -Dendritische cellen (milt en lymfeklieren) (granulocyten fagocyteren wel, maar presenteren niet!) Ag-Ab interacties: (humorale immuniteit) !!!NOOIT covalent!!! Eendracht maakt macht - Zwakke interacties van verschillende aard: 1) ionische binding (sterkste) bv. tussen –COO- en –NH3+ 2) hydrofobe interacties: hydrofobe delen naar elkaar toe 3) Van der Waals interacties: dipool-krachten: vervorming elektronenwolk rond atomen (zeer zwak) 4) H-bruggen Elementen: a) affiniteit: kracht van 1 binding b) aviditeit: bv. IgM: gesecreteerd door B-cellen tijdens vroege immuunrespons bij adaptieve immuniteit: 10 mogelijke Ag-bindingsplaatsen (5x2) => Ag met repetitieve sequenties => 10mogelijke bindingen totale kracht van de binding = aviditeit (als 1 binding doorbroken wordt, blijven er nog bindingen bestaan) c) specificiteit + kruisreactiviteit ( hoe meer 2 ≠ Ag op elkaar lijken in 3D-structuur, hoe meer kruisreactiviteit) => hoe selectief/uniek is een Ag-Ab binding? d) Ladingsspecificiteit: binden andere Ag met zelfde lading even sterk? e) Verschillende krachten samen bepalen de interactie (L’union fait la force) Toepassingen Antistoffen: Vaccinatie: Ag inbrengen onder niet-schadelijke vorm => inductie van protectieve antistoffen Serotherapie: verworven weerstand kan overgedragen worden van het ene dier naar het andere via het serum: behandeling van infecties en neutralisering toxines probleem: Ig’s ingebracht zijn lichaamsvreemd! Antistoffen tegen serum, 2e injectie waardeloos Monoclonale antistoffen en derivaten Immunotoxines: gemodificeerd antilichaam wordt verbonden met een toxine => geheel ingebracht bij patiënt antilichaam bindt target cel => endocytose => toxine dood cel. Bv. behandeling van KANKER Stellen van diagnoses: RIA, ELISA,… Antilichaam gekoppeld aan merker (enzymen, fluorescerende lichamen,… ) => door kleurreacties en dergelijke bepaalde Ag/pathogenen detecteren. Abzymen: monoclonaal antilichaam met katalytische activiteit (enzymen nabootsen) Remmen van biomoleculen: solubel (enzymen), membraangebonden (auto-immuunziekten, transplantatie (afstoting), allergie,…) membraangebonden moleculen worden aangevallen door antilichamen Immunopathologie: afweerreacties bij ziekten Polyklonaal vs. Monoklonaal Poly: antiserum met Ab’s tegen verschillende epitopen van 1 Ag (Ag met 3≠epitopen, 3mogelijke Ab) Mono: antiserum met Ab’s tegen een en hetzelfde epitoop van 1 Ag. ( slechts 1 soort Ab in bloed) Radicale immunodiffusie: Hoeveelheid Ag meten Ag geconcentreerd in het midden + Ab’s in agarose gel rond Ag => cirkels van precipitine-complexen (onoplosbaar Ab-Ag complex) wanneer Ag migreren naar Ab. => dichtbij centrum cirkel: “ Ag-excess” ( enkel vrije Ag’s) => concentratie precipitatie-complexen in buitenste cirkel stijgt met tijd (densiteit cirkel stijgt) => expansie cirkel stopt als equivalentie bereikt is (evenveel Ag als Ab) => opp. cirkel ~ hoeveelheid Ag Immuno-elektroforese: Ag scheiden door elektroforese in gel (bv. van + naar -) Ab’s ingebracht (om te kijken waar welke Ag gestopt zijn met migreren) => Ab’s en Ag’s bewegen naar elkaar toe door de gel => plaats waar ze ontmoeten = precipitatie complex weergeven met een lijn: precipitatie lijn met Ag-Ab complexen (equivalentiezone) Radio-immuno Assay (RIA): Testen of patiënt besmet is met bep. pathogenen of niet (pathogeen moet gekend zijn) Techniek: In testbuis verzamelt met Ab’s tegen bepaalde pathogenen, in oplossing toevoegen serum patiënt + radioactief gemerkte, kunstmatig gemaakte Ag tegen dat Ab => complexvorming radioactief Ag-Ab in gezond serum 100% radioactieve complexen; in geïnfecteerd serum: daling radioactiviteit door competitie met Ag in serum patiënt ( patiënt is besmet!) Western Blot: Elektroforese van eiwitten in een gel ( SOS-PAGE) => overdracht eiwitten op membraan => membraan bezetten op alle niet-eiwit plaatsen ( enkel waar Ag zit respons) => Ab’s aanbrengen reactie => detectie Immunofluorescentie: Bv. tegen membraangebonden structuren (HER tegen mAg) of tegen subcellulaire structuren ( bv. tubuline) Bij 4°C : patchy: hier en daar stipjes Bij 37°C: Capping: membraan beweegt: vorming van een cap waar receptoren (mAg) zitten FACS: Fluorescent activated Cell Sorting: cellen in oplossing: sommige binden Ab Anti-A, andere Anti-B, andere beide, nog andere geen (afhankelijk van membraangebonden antigenen) deze cellen sorteren door de Ab’s fluorescent te merken en de hele oplossing door soort pipet te sturen. vibrator mechanisme in pipet breekt de straal in druppels zodat 1 druppel, 1 cel bevat straal gaat eerst door een fluorescentiemeter die de aard van de cel detecteert => bij berekenen van de stroom in druppeltjes, krijgt de cel een bepaalde lading, afhankelijk van de detectie door de fluorescentiemeter=> druppel valt door elektrisch veld en wordt afgebogen=> komt in buisje terecht (= sorteren) => op computerscherm resultaat Aanmaak van monoklonale antistoffen: Herhaaldelijk immuniseren van een muis met gezuiverd antigen ( ≠ epitopen) (2e immuunrespons opwekken) => polyklonaal antiserum miltcellen isoleren ( Ab- producerende cellen: plasmacellen) fusie miltcellen met myelomacellen (kankercellen) hybridoma’s (maakt Ab’s en ongelimiteerde celgroei) alle plasmacellen leveren andere Ab’s=> juiste plasmacellen selecteren (die juiste Ab’s maken) => groepjes hybridoma’s laten opgroeien + secreties van deze cellen testen op juiste Ab’s groepen opsplitsen tot individuele klonen zijn bekomen ( die allen dezelfde Ab’s aanmaken) Opmerking: men bekomt MOMAB’S = mouse- monoclonal antibodies => wekt HAMA op: human antimouse antibodies (antilichamen tegen monoklonale antilichamen van de muis, want lichaamsvreemd) Oplossing: ENGENEERING: 1) IMAB = chimeer monoklonaal Ab: constante delen van de Ab’s van de muis vervangen door humane constante delen. 2) UMAB = humaan monoklonaal Ab: ook nog de framework regios in variabele delen humaan maken MAB = Monoclonal antibody IMAB = chimeric MAB UMAB = humanized MAB MOMAB = mouse MAB Voorbeelden : 1) infliximab: chimeer (human-mouse) Ab, Ab tegen Tumor Necrosis Factor (ontsteking) behandeling van Rheumatoïde arthritis en ziekte van Crohn 2) Trastuzumab = Herceptine : humanized monoclonal Ab: tegen HER2 ( human epidermal growth factor receptor 2) (mAg) behandeling van HER2+ borstkankers 3) Rituximab: chimeer monoklonaal Ab: tegen B-cellen ( CD20+) behandeling van resistente Non-Hodgkin lymfoma’s Hoofdstuk3: Tumorimmuniteit Immuniteit tegen kanker opmerking: in 99.9% van de tumorale mutaties grijpt het immuunsysteem succesvol in! Antistoffen (monoklonaal) => behandeling van: - Immuunziekten: wanneer lichaam zelf niet de juiste Ab’s maakt bescherming tegen infecties ( therapeutische werking van Ab’s) -Kanker: na resectie tumorale massa monoklonale Ab’s geven om de residuele, achtergebleven tumorcellen uit te schakelen. Bv. Trastuzumab/Herceptine bij borsttumoren (HER2+) Leukemies en lymfoma’s : maligne tumoren van hematopoietische cellen van het beenmerg (9% van alle kankers) Terminologie: AML = acute myeloïde leukemie ( acuut: minder mature cel) CML = chronische myeloïde leukemie (chronisch: mature cel) ALL = acute lymfatische leukemie (bv. pre B-cel neoplasme) CLL = chronische lymfatische leukemie (bv. CD5+ memory B-cel) acuut vs. chronisch afhankelijk van stadium differentiatie Probleemstelling bij tumorimmuniteit: kankervaccins! = vaccin tegen lichaamsEIGEN moleculen (kanker ≠ lichaamsvreemd) ↔ vaccins tegen virale/bacteriële pathogenen die per definitie lichaamsvreemd zijn (relatief makkelijk te vaccineren) Evidentie dat immuunsysteem betrokken is in de bescherming tegen tumoren: - Vergelijking tussen “normale” mensen en mensen onder immunosuppressiva (bv. na transplantatie) = secundaire immunodeficiëntie (opgewekt) => incidentie van kanker stijgt bij immunosuppressiva. Dus: Immuunsysteem heeft een bijdrage in onderdrukking van tumorontwikkeling. Opmerking: Primaire immunodeficiëntie = genetische defect: daling immuniteit Bv. Boy-in-a-bubble syndroom : (SCID) X-scid-gen: X-gebonden, zowel Bals T-cel deficiëntie: stijgend risico op kanker Tumorantigenen: Ag’s ontstaan in gastheer zelf => “self-Ag’s” 1) Tumor specifieke transplantatie antigenen (TSTA’s) ontstaan door mutaties waar geen DNA-repair gebeurt: bv. AUG (Met) AUX ( ander AZ) => °ander eiwit ( met neo-epitoop) => hierop reactie door immuunsysteem (Ab’s en T-cel activiteit) UV Squamous cell carcinoma Basal cell carcinoma Basale membraan Normaal gezien balans tussen cel vernieuwing ( vanuit populatie basale stamcellen) en celdood. 2 carcinoma’s: controle over groei en proliferatie weg! Ontstaan van mutaties: a) Fysisch: straling (bv. UV) b) Chemisch: roken: bevat bepaalde stoffen (carcinogenen) (polycyclische aromatische kws) chemische verandering op DNA => mutatie c) viraal: kankervirussen: bevatten genen in hun genoom die geïntegreerd worden in dat van de gastcel en coderen voor eiwitten die leiden tot transformatie van cel in een maligne tumorale cel. Bv. HPV, Rous Sarcoma Virus, … 2) Tumor associated transplantatie antilichamen (TATA’s) - Diagnostisch belang met betrekking tot kanker Niet uniek aan tumorcellen (↔TSTA’s): proteïnes die in normale cellen tot expressie komen gedurende embryonale periode wanneer immuunsysteem matuur is => stop aanmaak - Re-expressie van deze proteïnen bij volwassenen kan wijzen op tumor! (bv. AFP) - Proteïnen die normaal slechts in geringe mate wordt aangemaakt, maar bij tumor ontwikkeling stijgt in concentratie Oncofetale antigenen: - op normale foetale cellen aanwezig (nog geen immunocompetentie) - re-expressie op kankercellen => herkend als non-self => immunologische respons! 1) AFP: α-foetoproteïne 2)CEA: carcinoom embryonaal Ag paraneoplastische moleculen: normaal ( geen Ag’s) Opmerking: Merkers zien waar cellen zich op dit diagram bevinden ( bv. α-FP = foetale merker voor AFP) groei Differentiatie Beenmerg cellen Veel groeicapaciteit, weinig gedifferentieerd (bv. hematopo. Stamcellen) Veel gedifferentieerd, weinig groeicapaciteit ( bv. neuronen) AFP: Alfa-foetoprotein (komt voor in het serum) op basis van concentratie in het serum kan een bepaalde kankertherapie gestart worden. Bv: -chirurgie: tumorrescectie - TAF: Trans-Arteriële Embolisatie: met katheter het aanvoerend bloedvat naar de tumor benaderen en hierin klonter doen ontstaan ( = embolisatie) - Chemo: bv. PEI = platinum etoposide ifosfamide Hoe hoger AFP in serum => tumor is terug => meten van AFP in serum is maat voor tumormassa Opmerking: finale behandeling = Bestraling (radiotherapie) sterke daling van AFP CEA: carcino-embryonaal antigen CEACAM-5: CEA cell adhesion molecule-5: zit aan het oppervlak van tumorcellen en op Gi- en levercellen van foetussen(normaal) ( niet zomaar in serum te zien) => met immunohistologie (coupes) bekijken. Na operatie zien bij wie CEA nog hoog is overleving bij patiënten die na chirurgie lage CEA hebben, is veel gunstiger dan patiënten met hoge CEA Dus: CEA is diagnostisch /prognostisch belangrijk Opmerking: CEA is wel in het serum te zien na toevoeging van enzymen die stukje van CEA afknippen=> stukje vrij in serum CD-antigenen (toepassing: identificatie van cellen) - = merkers op cellen, benoemd bij conventie (moleculen op membraan voor adhesie, contact en intercellulaire communicatie) - immunofenotypering ( aan de hand van fenotype van deze merkers bepalen over welke cel het gaat) Door middel van FACS, immunohistochemie etc. - Cluster of Differentiation + nummer. Bv. CD1a, CD2, CD3 etc. - structurele eiwitten (bv. keratine in de huid), functionele eiwitten ( bv. Tyrosinase voor melanocyten) -nuttig voor identificatie van cellen, zowel normale als getransformeerde cellen Soort CD1 a, b, c, d CD2 CD3 CD4 CD5 CD8 CD56 CD59 CD45 DC, B, T T, NK (cyt.) T, NK1 T (MHCII) T, B (matuur) T (MHCI) NK Alle WBC (Pan-leukocyt merker) Herkennen Non-peptide antigen (glyco-… E-rosette receptor TCR-signaal Coreceptor Modulatie TCR, BCR Coreceptor ? MIRL / - NK = natural killer cel = klasse van grote, granulaire, cytotoxische lymfocyten die geen TCR of BCR hebben. Het zijn antilichaam onafhankelijke doders van tumorcellen en kunnen ook deelnemen in antilichaam-afhankelijke cel gemedieerde cytotoxiciteit. - E-rosette receptor: CAM voor LFA-3 op APC - MIRL= membraan inhibitor van reactieve lysis Herkennen van tumorantigenen: aan de hand van merkers => ALL: CD34+, CD10+, CD19+, MHCII+, …. (pre- B-cel); CLL (B-lineage): CD34, CD20, CD19, CD5, MHCII; CLL (T-lineage): CD1a+, CD8+, CD1+, CD2+, CD5+, CD7+ (Monoklonale) antilichamen (bv. tegen HER2) kunnen geconjugeerd worden met andere agentia om effectiviteit te verhogen Bv.: toxines => immunotoxines koppelen aan Ab’s tegen tumor-specifieke Ag’s ( andere cellen niet beschadigd) - Ook: a) immunocytokines b) radioimmunoconjugaten (leveren dosis straling aan tumorcel) c) Chemo immunoconjugaten d) Antibody-directed produg therapy (ADEPT) Produg = voorloper, op zich niet actief, maar door een enzyme geactiveerd => koppelen aan Ab - targets voor mAb-therapie tegen kanker Tumor Ag T-cel merker B-cel merker Hematopoi cel merker Anti-idiotype Tumor type T-cel leukemie/lymfoma B-cel leukemie/lymfoma Acute myeloblastische leukemie B-cel lymfoma Tumor Ag CD5 CD20 CD45 Ig Maligne transformatie: 1) Initeel 1 tumorcel gemodificeerd: mutatie, verliest controle over normale celgroei en deling 2) Gelokaliseerde tumorale massa: carcinoma in situ, benigne (op de basale membraan, nietinvasief) 3) Invasieve tumorcel: aantal mutaties stapelen op (one hit, two hit,… enz) cel verkrijgt eigenschappen om basele membraan af te breken (proteasen, MMP’s, collagenasen,…) => INVASIEF maligne 4) Metastaserende tumorcel: doorbreken BM van de endotheelcellen => hematogene / lymfogene metastase ( naar organen waar bloed/lymfe gefilterd wordt) Kanker inductie (kan viraal!) - - Oncogenen: oorspronkelijke benaming voor celmateriaal (DNA) van virussen die gastheercellen omvormen tot maligne cellen (bv. Rous-sarcoma virus) later ontdekking dat oncogenen gewijzigde genen zijn die bij alle mensen aanwezig zijn => proto-oncogenen Proto-oncogenen: expressie van proteïnen betrokken bij celgroei, proliferatie en differentiatie => membraangebonden (receptoren, bv. groeifactoren) of intracellulaire cascades (bv. transcriptiefactoren). Virale oncogenen en proto-oncogenen lijken zeer sterk op elkaar (soms maar 1 mutatie) Proto-oncogenen coderen voor: 1) groeifactoren en groeifactor receptoren 2) signaaltransductie en transcriptiefactoren: bv. Src, Abl, ras, … - Tumor suppresor genen: rol in het dempen van celgroei en proliferatie => Two-hit hypothese: slechts tumor als maternaal en paternaal gen uitgeschakeld is (recessief) Bv.: DCC: Deleted in Colon Carcinoma => supressor van colon carcinoma APC: Adenomatous Polyposis Colon cancer ! In familiale vormen => one-hit volstaat wel, 1 gen is meestal al aangestast => dominant overervingspatroon! Opmerking: bepaalde virussen integreren hun genetisch materiaal in dat van de gastheer => expressie van groeifactoren of receptoren of nabootsen van enzymatische activiteit of een TF cel in deling gezet = virus-oncogenese Mechanisme: - integratie van een proto-oncogen naar plaats vlakbij een TF => veel afgelezen => veel groeistimuli. of - reciproke translocatie => bv tussen chromosoom 9 & 22 => philadelphia chromosoom => fusie –eiwit ontstaat ↑ kanker Opmerking: virussen vernieuwen virale oncogenen door retrovirale transductie: ontstaan uit oppikken van humane proto-oncogenen Oncogene: expressie van: hyperactieve proteïnes, genamplificatie => te veel genproduct Multistap-mechanisme van oncogenese: inductie van maligne transformatie ten minste 2 stappen nodig initiatie en promotie Initiatie: mutaties die op zich nog niet tot kanker leiden, maar wel tot opstapeling van andere mutaties (= promotie) Bv. colon kanker: initiatie = verlies van APC (= tumor supp.) => normaal epitheel hyperproliferatief epitheel => goedaardig adenoma door DNA hypomethylatie Dan activatie van proto-oncogen K-ras en ↓ van tumor supp DCC en TP53 => carcinoma! Dus: accumulatie van mutaties nodig! Opmerking: ook mutaties in DNA-repair leiden tot kanker (bv. Xenoderma Pigmentosum: opstapeling van mutaties onder invloed van UV-licht) ↑AFP en ↑CEA in serum van zieke patiënten 1) AFP (> 400 µ/ml): vooral in hepatocellulair carcinoma (leverkanker waarbij AFP wordt aangemaakt) 2) CEA (> 10mg/ml): vooral in pancreas- en colorectale kanker (ook andere kankers) Zeldzaam in niet-kanker ziekten: Bv. alcoholische cirrose, pulmonaal emfyseem, ulceratieve colitis => CEA↑ vooral bij GI-kankers, MAAR wees steeds oplettend voor andere mogelijke tumoren. Normale melanocyt groei contactinhibitie↓ enzymen => cellen komen los Foto: weergaven van maligne transformatie : Groei en proliferatie ↑ in eerste instantie, verlies van contactinhibitie, productie van enzymen => verlies van adhesie metastasering mogelijk! Herkennen van kanker Ag’s - Endogene peptide- Ag’s: in de cel ontstane peptiden door mutaties die andere peptiden (neo-epitopen) opleveren of door virus infectie ( zeer snelle translatie slecht gevouwen) -Exogene peptide-Ag’s: door endocytose opgenomen (herkend door specifieke cellen van het immuunsysteem) Mechanisme: - Endogeen => slecht opgevouwen proteïnen worden getarged voor afbraak in proteasoom (ubiquitinilering) Antigenische peptiden komen in cytosol: - transport via TAP (transporter van Ag peptiden) naar ER-lumen => binding aan MHC I => via golgi complex naar celmembraan => APC - Exogeen ( endocytose => endosoom): Productie van MHC II in ER en golgi => endocytose van exogeen Ag => fusie endosoom met golgi-vesikel (CLIP = Class II associated invariant chain peptide) => presentatie Ag aan oppervlak door MHC II Herkenning door : CD8+ -T-cellen (MHC I) => aanval! (ook cytokinen (TNF-α en IFN-γ) en NK-cells) CD4+ - T-cellen (MHC II) Structuur van de T-cell receptor TCR vergelijking met mIgM bij B-cellen (variabele en constante delen) Bv. αβ- TCR: α-keten en β-keten, verbonden met S-brug - - Αβ-TCR is belangrijkste (naast γδ-TCR (vooral in vrouwelijke genitale tractus)) - 90-99% van alle CD3+- cellen - groot TCR V gen kiemcellijn repertoire - ± 60% CD4+, ± 30% CD8+, < 1% dubbel-positief, < 1% dubbel-negatief - MHC II restrictie: CD4+, MHC I restrictie: CD8+ -liganden: MHC + peptide!! Γδ- TCR: - 1-10% van alle CD3+- cellen - kleiner aandeel in genrepertoire - ± 30 % CD8+, ± 60% dubbel negatief - geen MHC restrictie - ligand= fosfolipide Ag’s Variabel deel => V, D, J – segmenten: ( variabel, diverse, junctie) + connective (csegment) CD3-complex: - 2 TCR per CD3-complex= TCR complex => activatie van de T-cel: 1) delen 2) Cytokinen maken 3)moleculen maken om targetcel te doden (bv. perforines) => celgebonden effecten - ηη-homodimeren of ϱϱ-heterodimeer -γε-heterodimeer -δε-heterodimeer γ-, δ- en ε- ketens: alle Ig-vouw op extern domein => interactie met TCR en met zichzelf ionische interacties => juiste ligging Lange intracytoplasmatische staarten met ITAM: immunoreceptor tyrosine activatie motieven: landingsplaats voor fosforyleringsmoleculen => signaaltransductie CD4: herkent MHC II CD8: herkent MHC I (met endogene peptiden) µ Affiniteit: Spectrum van bindingsaffiniteit: groeifactor receptoren => sterke affiniteit, Ab’s grote variatie (afh. van de affiniteitsmaturatie), adhesie moleculen gemiddeld, TCR zwakke affiniteit oplossing: 1000’en receptoren per T-cel + 1000’en MHC I- moleculen per APC => meer kans op goede interactie! Immunologische synaps: Verschil met B-cellen: TCR steeds celgebonden, enkel Ag’s via APC Aard van de Ag’s steeds korte peptiden! 1) ! bijkomende herkenning via CD4/CD8! => endogene eiwit Ag’s steeds gepresenteerd via MHC I => enkel CD8+-T cellen herkennen dit => doden APC = cytotoxische T-cellen (Tc) ! Herkennen van Ag’s vraagt tijd! 500s nodig voor DC(APC) om T-cel te omarmen 2) Bijkomende adhesiemoleculen: helpen om lymfocyt en APC in nauw contact te brengen + helpen soms in signaaltransductie! Dendritische cel vaccinatie: experimentele kankertherapie bv. bij glioblastomen (hersentumor): chirurgisch biopsie doen, uit tumorcellen die bestraald zijn een preparaat maken => aanbieden aan DC’s die men uit bloed van patiënt haalt (in vitro) => DC’s cellen weer inspuiten in patiënt en hopen dat CD8+ T-cellen geactiveerd worden. Wisselend resultaat: men voert exogene peptiden aan DC => MHC II is actief, maar Tc-cellen reageren enkel op MHC I! Algemene info: - Adaptief immuunsysteem=uitbreiding op het innate immuunsysteem (wisselwerking) - - TH-cellen (CD4+) geactiveerd => selectie van cytokines TC-cellen (CD8+) geactiveerd => differentiatie in effectorcellen die gewijzigde “Selfcells” en geïnfecteerde cellen kunnen vernietigen Verschillende B- en T-cellen (klonen) allen zelfde voorloper, maar elke kloon is capabel om een bep. Ag te herkennen: B-cellen (mIg (BCR)) en T-cellen(TCR) Na recognitie Ag => proliferatie en differentiatie => secretie van Ab’s (humoraal) of genereren van cellen die het invaderend pathogeen vernietigen (celgebonden) Meeste micro-organismen worden binnen enkele dagen al opgeruimd door innatemechanismen => geen nood aan activatie adaptieve respons Via cytokines communiceren innate en adaptief immuunsysteem met elkaar. Hoofdstuk: TCR en Antigeen presenterende cellen (APC) + cytokines en receptoren over infecties TCR en antigeen presentatie: vraagt tijd! (voor eliminatie van infecties en kanker; 500s om voor APC om T-cel te omarmen) !Onderdrukken vs. eliminatie! onderdrukken: bv. antivirale medicatie: stop virusreplicatie, MAAR: virus zit er nog!! eliminatie: opruimen van het pathogeen agens. Verschillende moleculen en cellen betrokken Coördinatie immuunrespons via cytokines en receptoren Verschillen tussen BCR (= mIgM) en TCR BCR: structuur van een solubel Ab: -Heavy en light chain (verbonden met S-bruggen thv constante delen) - 2 H-ketens verbonden met S-bruggen -Transmembranair deel en cytoplasmatische staart (zeer kort) TCR: bv. αβ-TCR (γδ-T-cellen zijn innate cellen) - α- en β-keten - VαCα en VβCβ (S-bruggen ter hoogte van connecting sequence) -Transmembranair deel en kleine cytoplasmatische staart => veel lagere affiniteit voor Ag ( Ag (=peptide) moet gepresenteerd worden => enkel voorkant kan herkend worden met 3 vingers (MHC)) endogene peptiden (ook viruspartikels) worden gepresenteerd door MHC I => herkend door TC CD8+ - cellen ↔ exogene (infectueuze agentia) peptiden worden gepresenteerd door MHC II => herkend door TH CD4+-cellen Coöperatie tussen verschillende celtypen: Prikkeling met eiwit Ag’s => presentatie => activatie van CD4+-T-Cellen (voldoende activatie = activatie van B-lymfocyten door cytokine productie!) Types APC: verschillende namen afhankelijk van de plaats van interactie 1) T-cel zones van de milt en lymfeknopen: IDC (fagocytose): efficiënte MHC II- expressie (constitutief!) vooral primaire immuunrespons inductie van proliferatie van T-cellen (B7+ -> co-stimulus) 2) Macrofagen: minder inductie van proliferatie Fagocytose van Ag’s + induceerbare MHC II+B7 (indien geactiveerd, niet in rustende macrofagen) 3) B-cellen: receptor gemedieerde endocytose: Ag binden, internaliseren en processen => presenteren van MHCII (constitutieve MHC II-expressie + induceerbare B7 (costimulus) in geactiveerde B-cel) => bij lage Ag-concentraties zijn het de beste APC’s (mIgM heeft hoge affiniteit) In lymfeknopen is er een specifieke lokalisatie voor antigeenpresentatie: - Subcapsulair: subcapsulaire marginale sinus: macrofagen presenteren polysachariden - Cortex + paracortex: B-zones, follikels (dendritische cellen = APC) en T-cel zones ( IDC= APC) -medulla: macrofagen = APC ! 1 MHC-molecule kan verschillende peptiden presenteren MAAR elke TCR herkent slechts 1 specifiek peptide => specificiteit ligt bij TCR ! Moleculaire interacties in Ag-presentatie Algemeen: Signaal 1: CD4: extern gedeelte met 4 Ig-vouwen TCR: herkenning van peptiden aan MHC II => signaal 1 Versterkt door adhesiemoleculen: signaal 2 => bv. ICAM-1 (APC) – LFA-1 (TH) of LFA-3 (APC) – CD2 (TH) (LFA= lymfocyt functioneel Ag) Signaal 2: CAM’s en cytokines: Bv.: infectie -> productie LPS -> activatie TLR-4 -> IL-1 aangemaakt Cytokines en CAM belangrijke rol in immunologische synaps! Ag-processing in APC: => snelheidsbepalende stap in adaptieve immuunreacties => APC bindt enkel lineaire peptiden in MHC klasse II groeven (cfr. Ab’s) 1) Productie van MHC II in RER + invariante keten Ii (houdt 2 ketens van MHC II open) 2) Verdere bewerking in Golgi => vesikels met MHC II en CLIP ( = Class II invariant peptide, geknipte Ii) 3) Fagocytose van een exogeen Ag (+ afbraak): vorming fagolysoom; versmelting met vesikel met MHC II-CLIP 4) Exocytose in membraan APC => T-cel hulp voor Ab-productie van B-lymfocyten ! Opmerking: TCR-complex: 2TCR per CD3-complex: ϱϱ-dimeer + γε- en εδ- dimeren Ii: zorgt dat 2 ketens MHC II worden open gehouden door proteasen afgebroken tot CLIP Fagocytose Infecties: Ag komt van buiten Kanker 1 TCR complex: Immunoreceptor Tyrosine Activatie Motieven: phosphorylatie door P56 LcK ( proteïne 56kDa lymfocyt kinase) => signaaltransductie (ook BCR helpt voor signaaltransductie) Immunologische synaps: stukje membraan dat Ag-omarmt (niet 1 maar vele!!!!!): In feite vele omarmingen (1000’en MHC II-moleculen per APC) (vraagt TIJD!) TCR-peptide- MHC II : hypervariabele cellen van Vα en Vβ herkennen Ag in groeve van MHC II (Ag kan tot 20 AZ lang zijn; groeve opengehouden door Ii) B-cel interactie ! kan door interactie tussen T-cel en B-cel zijn! - B-cel presenteert Ag in MHC II- groeve => interacties in 2 richtingen - B-cel ontvangt signalen van T-cel om te delen en/of Ab’s te produceren - T-cel ontvangt info om te prolifereren Intracellulair adhesie molecule Signaal 1: centrale interactie: TCR-MHC II Signaal 2: - interacties tussen celadhesiemoleculen: CD2-LFA3; LFA1 - ICAM-1 - andere interacties: (stimulaties) CD28 – B7: stabilisatie mRNA van cytokines in de T-cel - CD5 (TH)-CD72 (B) en CD45 (TH) – R-CD 22 (APC) - B-cellen kunnen IL-1 en IL-6 secreteren => ↑ IL-2 R in TH Genetica van de TCR TCR multigenfamilies - Chromosoom 14: α- en δ-keten (bij herschikking van de α-keten gaat δ-gen verloren! => δsegment in α-loup - Chromosoom 7: β- en γ-keten => gen segmenten: V(various), D (diverse), J(junction) en C (constant) CD3+-cellen: γδ of αβ (-> 90-99%) (progressief in leven zullen αβ-thymocyten toenemen) Genherschikkingen: - Verlies van DNA - Vertrekkende vanuit “ germline α/β/γ/δ-keten” (= hoe je allel van vader/moeder overerft) => herschikkingen tot unieke TCR en vorming van complex van de proteïne producten van de genen (bv. αβ-dimeren)=> vorming van een TCR-repertoire(zeer veel ≠ combinaties mogelijk) Bv.: herschikte α-keten: V- en J-segmenten, herschikte β-keten: V-, J- en D-segmenten => βketen meer uitgebreide heterogeniteit (meer combinaties mogelijk) ! V, J en D coderen voor variabele delen van de TCR; constant deel = C (constant extern domein), H (connecting sequence)- TM(transmembranair domein), CT (cytoplasmastaart) Implicaties in de kliniek! RAG-1 en RAG-2 (aaneengeschakeld op niveau corticale thymocyt; na herschikking dubbel positief CD4/CD8): Recombination Activating gen 1en2: coderen voor recombinatie enzymen Test (of RAG- 1/2 goed werkt): 1) germline DNA laten knippen met EcoRI en Southern Blot doen => fragmenten van 12kb en 4.2kb 2) herschikt DNA laten knippen met EcoRI en Southern Blot => fragmenten van 5 en 4.2kb Maar bij defect RAG1 of 2 => wel nog 12kb stukken => geen herschikking meer Leidt tot SCID (autosomaal recessieve vorm, niet-X-gebonden) (primaire immunodeficiëntie) Thymus: plaats van genherschikking in TCR-genen: van dubbel negatieve naar dubbel positieve cellen ( RAG-expressie aangeschakeld) (eerst uitrijpen β-ketens) Later: CD8+ (30%) of CD4+ (60%), rest blijft dubbel + of -; Lymfoom (bv. CLL) te veel dubbel +/cellen bij FACS T-cel accessoire moleculen (voor celadhesie): T-cel accessoire molecule CD4 CD8 CD2 LFA-1 CD28 CTLA-4 CD45R CD5 Bindt aan AgMHC II MHC I LFA-3 ICAM-1 B7 B7 CD22 CD72 Functie + lid van Igsuperfamilie? Celadhesie (+signaaltrandsductie) en Lid van Igsuperfamilie Signaaltransductie, Tcel aan/uit zette, lid Signaaltransductie,lid Signaaltransd, geen lid Opmerking: CD2 zorgt voor RBC rosetting: RBC van schapen binden aan specifieke T-cellen => bewijs dat er veel verschillende T-cellen zijn Cytokine productie (enkel door geactiveerde cellen): als gevolg van interactie tussen B-cellen/APC en T-cellen aangemaakt door T-cellen => krachtig effect op B-cellen (activatie, differentiatie => ↑ Abproductie) Bv.: IL-2: proliferatie van B- en T-cellen IL-4: vroege B-cel activatie en proliferatie IL-5/6: krachtige stimulus van Ab-producitie TNF α/β: Ab-productie opmerking: recent ook mAb’s tegen T-cel moleculen geïdentificeerd die tussen komen in activatie van lymfocyten T-onafhankelijke Ag’s: = Ag’s die geen TH-cellen activeren -grote polymerische moleculen met repetitieve antigenische determinant voor polysachariden - bij hoge concentraties activatie van B-cellen met specificiteit voor andere Ab’s (polyklonaal) - bij lage concentratie activatie van specifieke B-cellen - vaak resistent aan afbraak door proteasen - primaire immuunrespons al iets vlugger door andere Ag’s + minder intens (IgM) Secundaire respons op T-ind Ag’s: => lijkt op 1e antwoord: zwak en enkel IgM => klasse-switch van IgM naar IgG treedt niet op! - memory-functie zwak of onbestaande - door polymeerstructuur BCR crosslinken en zo B-cel activeren - resistent aan proteasen, maar snelle reactie tegen deze Ag’s - krachtige opwekker van cytokines door macrofagen! Haptenen en carriers: om een goede Ab-productie op te wekken tegen een Ag, moet het Ag (hapteen, zeer klein Ag) gebonden worden aan een carrier. Celactvatie: activatie van APC, T-cellen en B-cellen: gespatieerd in tijd en ruimte 1) APC- activatie: a) door Ag zelf, eventueel met adjuvantia (bv. vaccins) b) door cytokines van de T-cel (TNF-α en IFN-γ) => meer MHC I/II expressie, Fc-receptoren (geopsoneerde moleculen opnemen) en meer adhesiemoleculen => ↑ productie van cytokines en enzymen (MAP’s => ↑ celcontact) 2) Lymfocyten: T-cel receptoren relatief lage affiniteit stabilisatie door adhesiemoleculen (door 1000’en bindingen aan te gaan) => ↑ affiniteit + stevige binding tussen APC en T-cel => activatie (singaaltransd.) signaaltransductie: * P56 LcK wordt geactiveerd door CD4/CD8 => fosforylatie van ITAM’s van CD3 complex: RAS-GDP RAS-GTP raf MEK MAP-kinase … transcriptie activatie ≠ genen PLC PIP2 DAG (+IP3) PKC NF-kB NFAT => ↑ proliferatie en differentiatie naar effectorcellen => ↑cytokineproductie en CAM expressie Belangrijk voor aan/uitschakeling van de TH-cel is CD28-B7/ CTLA-4 – B7 (TH – APC) => 1e golf van genproducten zijn transcriptie factoren: bv. c-fos, c-jun, NF-kB, NFAT (nuclear factor activated in T-cells) => 2e golf zijn cytokines => 3e golf extra adhesiemoleculen (VLA) Specifieke vs. Aspecifieke activatie Specifiek: (monoklonaal): MHC-restrictie: TCR αβ of TCRγδ met CD3-complex en CD4/CD8 => herkennen specifiek een Ag in MHC I/II-groeve => wat is een efficiënt antigenisch signaal? -1000’en MHC-moleculen met 1000’en TCR’s per cel (compenseren voor lage affiniteit van) - Co-signalen: lichaamsvreemde moleculen, cytokines en CAM’s Aspecifiek: (polyklonaal): 1) lichaamsvreemd: - Plantmitogeen (clusters van BCR => activatie) bv. concavaline A (con A), phytoheam agglutinine (PHA: op bonen, polyklonale activatie van T-cellen), Wheat gem agglutinine (WGA) => polyklonale stimulatie van T- en B-cellen (deling↑) (herkennen van suikers) - Superantigenen: moleculen van grampositieve bacteriële oorsprong of sommige virale eiwitten bv. enterotoxinen acute voedselvergiftiging (spuitende diarree) mechanisme: vorming van een moleculaire brug tussen MHC II en Vβ-keten van de TCR => activatie ! voedselvergiftiging: optreden cytokine-storm (inductie IL-2 + IL-2R in T-cellen => blijven delen) => algemene ontstekingsreactie => SHOCK - Phorbol esters: in plantenextracten (cave: THEE!): bootsen DAG na => IP3-pathway (PKC) => autonome activatie van T-cellen 2) Cytokines : 2e manier om op niet-specifieke wijze: => co-stimuli voor T-cel activatie (naast CAM) => hormonen van het immuunsysteem: glycoproteïnen die uit 1 keten bestaan ( solubel+ specifieke R: auto-, para- of endocrien) => regelen celgroei, differentiatie, ontstekingsreacties, immuniteit, wondheling, chemotaxis (= inductie van celbeweging door secretie van bepaalde factoren (bv. cytokines)) en enzymproductie (interactie tussen lymfoïde, inflammatoire en hematopoietische cellen) Mechanisme: - Stimulus induceert genen voor cytokines (essentieel): exocytose van deze cytokines binden op receptoren van een target-cel induceren genen biologische effecten - Wat zijn de targetcellen? Secreterende cel zelf: autocrien (bv. IL-2) (zelfmasturbatie cel) nabij gelegen cel: paracrien (bv. IFN-β) cel op afstand: transport cytokines (via circulatie endocrien (bv. IL-1)) - Pleiotropie: effect van een cytokine is afhankelijk van de cel waar het op inwerkt: bv. IL-4: effect verschillend in B-cel (activatie, proliferatie en differentiatie), thymocyt of mastcel ( proliferatie) Redundantie: verschillende cytokines hebben hetzelfde effect Bv. IL-2/4/5: zorgen allen voor proliferatie van B-cellen Synergie: cytokines versterken elkaars effect ( 2+2 > 4) Bv. IL-4 +IL-5: klasse switch naar IgE in B-cel Antagonisme: blokkeren van een effect bv. IFN-γ blokkeert klasse switch in B-cel geïnduceerd door IL-4 => cytokines werken meestal in mengsels => CYTOKINESOEP Bovendien: cytokines induceren andere cytokines => ketenreacties met signaalamplificatie - Onderverdeling van de cytokines - interferonen (IFN-) antiviraal - interleukines (IL-) cel-cel - colony stimulating factors (CSF-) - polypeptide groeifactoren (FGF, VEGF) - tumor necrosis factoren (TNF-) en lymfotoxines: ontsteking en cytotoxiciteit 1) Interferonen => glycoproteïnes cytokines geproduceerd en gesecreteerd door bepaalde cellen die een ant-virale toestand induceren in andere cellen en ook helpen in de immuunrespons a) IFN-α = leukocyten interferon - familie van moleculen, deel van de innate immuniteit - multiple genen (20-tal eiwitvarianten), niet-geglycosyleerd -induceert resistentie tegen virus-infectie -inhibeert celdeling, doet expressie MHC I stijgen Dendritische cel -behandeling van virusinfecties en hairy-cell leukemia: T-cel leukemie van lymfoblasten Macrofagen - anti-inflammatoir virusb) IFN-β = fibroblasten interferon: -single gene, spectrum van glycosylatievarianten geïnfecteerde cel - behandeling van Multiple Sclerose!! Afbraak van sommige IFN-β door gelatinase-B! -induceert resistentie tegen virus-infecties -inhibeert celdeling, doet expressie MHC II stijgen - anti-inflammatoir - deel innate immuniteit c) IFN-γ = immuun interferon: -single gene, glycosylatievarianten, cytokine van adaptieve immuniteit - immuunstimulerende functie, macrofaag activatie - overmatige productie kan een rol spelen in het onderhouden van ontstekingsreacties en auto-immuniteit - behandeling van chronische granulomateuse ziekten (defect van WBC: te weinig myeloperoxidase in neutrofiele granulocyt) - Ondersteunt TH differentiatie - induceert klasse switch tot IgG subsklasses. - induceert MHC II expressie - zwakke anti-virale en anti-proliferatieve activiteit -PRO-INFLAMMATOIR!!! 2) Interleukines: groep van cytokines gesecreteerd door leukocyten die primair de groei en differentiatie van verschillende hematopoietische en immuuncellen beïnvloedt. a) IL-1: - endogeen pyrogeen (endogene mediator van koorts) - cytokine van innate immuniteit - Product van monocyten, macrofagen, dendritische cellen, NK cellen, en niet-immuun cellen zoals fibroblasten, epitheel-en endotheel cellen, adipocyten, astrocyten en sommige gladde spieren - IL-1- receptoren in hypothalamus zorgen voor thermoregulatie: aanmaak prostaglandines => wijzigen setpoint T° C↑ => koorts ( vanaf 38°C) - Ook inductie van proteolytische enzymes: plasminogeenactivatoren en MMP’s (collagenasen en gelatinasen (afbraak ECM en BM (bv. kraakbeen))) - Bijna alle cellen hebben Il-1-R (endocrien) bv. lever: ↑ acuut-fase eiwitten, vasculair: ontsteking co-stimulus voor TH, maturatie en klonale expansie van B-cellen, expressie van CAM’s op endotheel (rolling en extravasatie), koorts - Pleiotroop effect - Signaaltransductie varwant met deze van TLR-moleculen (Ig-superfamilie) b) IL-2: cytokine van adaptieve immuniteit - celproduct van NK-cellen en CD4+ en CD8+ cellen - werkt in op alle T-cellen (dus autocrien) => proliferatie en activatie (T-cel groeifactor) -> uiteindelijk B-cel ↑ - uitgetest in experimentele kankertherapie - IL-2-R (klasse 1) heeft 3 verschillende subeenheden (α, β en γ): associatie van de ketens is afhankelijk van de affiniteit van het ligand hoge affiniteit => volledige associatie -IL-2-R α-keten = CD25, een merker voor zowel B- als T-lymfocyten c) IL-3: cytokine van adaptieve immuniteit - productie in geactiveerde T-cellen, mestcellen, basofielen en NK-cellen - multi-CSF voor beenmergcellen: hematopoietische groeifactor - kolonies van B-cellen, T-cellen, granulocyten etc. vormen -behandeling van kanker, bij beenmergtransplantatie, stamcelmobilisatie, immunodeficiënties - pro-inflammatoir opmerking: andere CSF zijn: G-CSF = granulocyt CSF, M-CSF = melanocyt CSF, GM-CSF CSF: groei en uitrijping van progenitorcellen in het beenmerg + productie wordt geregeld door mediatoren van ontsteking (IL-1 en TNF-α) d) IL-4: (= B-cell stimulatory factor1): - Klasse 1-R - secretie door TH-cellen, mastcellen en NK-cellen - B-cel activating en differentiation factor - productie van IgG1 en IgE (klasse-switch) - T-cellen activeren en doen groeien - expressie van MHC II in APC - inhibeert cytokineproductie (anti-inflammatoir): ↑ allergische reacties => behandeling van allergie e) IL-5: = Eosinophil differentiation factor (EDF) of Eosiniphil colonystimulating factor(E-CSF) - klasse 1-R - Secretie door TH-cellen en mestcellen - groeifactor voor geactiveerde B-cellen (groei + diff.) en eosinofiele granulocyten - bij parasitaire infecties en allergische reacties f) IL-6: = B-cell stimulatory factor 2 (BSF-2), hybridoma/plasmacytoma growth factor (HPGF) of hepatocyte-stimulating factor (HSF) - Secretie door TH-cellen, macrofagen, beenmerg stroma, fibroblasten, endotheel en spier cellen, adipocyten en astrocyten - pleiotroop: B-cel stimulerend en B-cel groei - hepatocyt-stimulerend: akuut-fase eiwitten (pro-inflammatoir) g) IL-7: = Pre-B-cell growth factor, lymphopoietin-1 (LP-1) - klasse-1-R - secretie door beenmerg en thymus stroma cellen - pre-B-cel groeifactor (ook voor T-cel progenitors) - ↑ groei en activatie van T-cellen h) IL-8: = NAP-1, NAF, granulocyte chemotactic protein 1 (GCP-1), CXCL8 chemokine - secretie door vele celtypes, o.a. macrofagen, granulocyten,.. - familie van chemotactische cytokines -α- chemokine (CXCL-8) - acute en chronische ontstekingen, infecties met HIV en mogelijk ook kanker - GCP: granulocyt chemotactisch proteïne (granulocyten aantrekken, vnl neutrofielen) i) IL-9: T-cell growth factor III - klasse 1-R - secretie door TH-cellen - groeifactor voor T-cellen, mastcellen (allergie) en megaloblastische leukemiecellen - kunnen betrokken zijn bij allergie en astma j) IL-10: = Cytokine synthesis inhibitory factor (CSIF) - klasse 2-R -cytokine-synthese inhibitie factor - remt productie van IFN-γ, remt Ag-presentatie en productie van IL-1, IL-6 en TNF-α door macrofagen (pro-inflammatoire cytokines) i-TH2-cytokine k) IL-17: = cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 8) - aangemaakt door TH17-cellen (CD4+), γδ T-cellen, NK-cellen, intraepitheliale lymfocyten en andere cellen - versterkt acute ontstekingsreacties - gestegen bij Rheumathoïde Arthritis => immunotherapie met mAb’s tegen deze cytokinen!! Opmerking: inhiberende activiteiten van IL-4 en IL-10: bevorderen humorale immuniteit (Abproductie) en worden TH2-cytokinen genoemd cfr. TH1-cytokinen (IFN-γ en IL-2) => stimuleren celgebonden immuniteit X-SCID: X-gebonden SCID (sever combined immunodeficiency): defect van de γ-keten van de IL-2 receptor ( ↓ IL-2/4/7/9/18-R) => onvoldoende activatie van TH-cellen => ↓ B-respons TH1-cellen: secretie van onder andere IL-2 en IFN-γ: promotie van activatie en differentiatie van macrofagen en TC-cellen => cytotoxische immuunrespons (geïnfecteerde cellen vernietigen) TH2-cellen: secretie van IL-4, IL-5, IL-6, IL-10: activeren van Ab productie van B-cellen extracellulaire pathogenen binden, neutraliseren en vatbaar maken voor fagocytose + complement gemedieerde lysis Opmerking: T-cel activatie (door Ag): verandering in expressie van oppervlakkige moleculen in de Tcel: 1) ↑ chemokine-receptoren: enkel Ag-gestimuleerde T-cellen migreren in antwoord op chemokine naar lymfeknoop, milt 2) Oppervlakkige CAM’s: cellen migreren naar plaats van de immuunrespons en blijven daar door celadhesie 3) cytokinereceptoren: ↑ expressie van receptoren voor proliferatie (bv. IL-2R) + voor differentiatie cytokines (IL-4) op deze manier worden enkel de juiste T-cellen gemobiliseerd Hoofdstuk: Cytokines en receptoren Functionele klassen van cytokines - - - Kolonie-stimulerende factoren (CSF): stijging hematopoiese in beenmerg (bv.na transplantatie) => in stand houden van het aantal circulerende WBC (kortlevend!) voor de afweer en aantal erytrocyten voor O2-transport Interleukines: o.a. klonale expansie van lymfocyten in de thymus, lymfeklier, milt, MALT: T-cel groeifactoren: IL-2, IL-7, IL-9, IL-15 B-cel groeifactoren (BCGF) en B-cel stimulerende factoren (BSF): IL-4, IL-5, IL-6 Chemokines: IL-8 Interferonen: (IFN-): bv. IFN-γ: geremd door IL-10 Tumor necrosis factor (TNF-): cytotoxiciteit en ontsteking Groeifactoren: -PDGF: platelet-derived: belangrijkste mitogeen in het serum -EGF: epidermal: wondgenezing e.a. => epithelen herstellen - IGF: insuline-like -FGF: fibroblast: bij bepaalde volkeren overdreven fibroblastengroei (stammen die zichzelf verminken) -TGF: transforming-: ook fysiologische werking, niet alleen bij tumoren Opmerking: CSF’s gebruiken bij stamceldonatie: cellen in beenmerg nemen toe => voorlopercellen komen in de circulatie => beter te isoleren bij de donor! Bv.: IL-8 = chemokine CXCL8 groep: α-chemokines lid van de CXC chemokines die neutrofiele granulocyten aantrekken => C-X-C cysteïne-x-cysteïne: 4 cysteïnes zijn via S-bruggen verbonden => stabilisatie bindt aan de CXCR 1&2 op de neutrofielen stelt gelatinase-B (MMP-9) ECM afbreken, zit in granules => komen vrij op plaatsen van ontsteking => processen IL-8: stukje afknippen IL-8 meer actief (tot 30x) = potentiatie => C-terminus bindt aan GAG’s Opmerking: naast CXCL’s (trekken polymorfonucleairen aan!) ook CCL = MCP’s = monoocyte chemotactisch proteïne ( bindt aan CCR: trekt mononucleairen aan) CXC-familie: α-chemokines =>polymorfonucleairen aantrekken CXCR1 CXCL8, CXCL6 CXCR1 CXCL8, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL7 CXCR3 CXCL10, CXCL9, CXCL11 CXCR4CXCL12 CXCR5 CXCL13 (CXC-groep: familie van cytokines die een S-brug bevatten tussen Cysteïnes, gescheiden door een ander amino-residu (X)) CC-familie (acute en chronische ontsteking, HIV en kanker) β-chemokines (ook S-bruggen) => MCP (monocyt chemotactische proteïnes) CCR1 CCR2 CCL2, CCL7, CCL8 CCR3 CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL24 CCR4CCL17 CCR5 CCL3, CCL4, CCL5 CCR6CCL20 CCR7 CCR8 CCR10CCL1 Bv. TNF-α: gemaakt door macrofagen, monocyten en andere - Tumor-necrosis factor ~IL-1: pro-inflammatoir o.a. voor ontsteking van gewrichten (RA) - Cachectine: lipase-inductie => cachexie - anti-tumoraal: synergie met IFN-γ (2 werken samen sterker dan apart) - acuut-fase inductie - doelwit van neutraliserende Ab’s bij: Infliximab(mAb) (remicade voor Rheumathoide Arthritis, Crohn) - verwant aan lymfotoxine (TNF-β) Primair een transmembranair proteïne, trimeer (3 geassocieerde eiwitten) => wordt geactiveerd tot solubele vorm door TNF-α connecting enzyme (TACE) => functie uitoefenen via TNF-R1/R2 (familie van liganden familie van receptoren) Van waar naar waar? Inspuiten in groeiende tumor geeft necrosis van deze tumor: hemoragisch (met verschrompeld bloed) Maar ook andere effecten van TNF-α!: transgene muis die overexpressie van TNF-α vertoont: - daling botgroei, stijging pilo-erectie (haren recht), diarree, lipase stijgt (mager) en cachexie (daling lichaamsgewicht, daling spiermassa en appetijt) TNF-α is pleiotroop met veel negatieve effecten Cytokinerecptoren en signaaltransductie: - Cytokines werken bij zeer lage concentratie (pg/mL) => receptoren hebben hoge affiniteit => heel wat genen al ontdekt niet altijd signaaltransductie gekend! - Receptoren in families: verschil in functie vaak gebaseerd op verschillen in extracellulair domein (m.a.w. herkenning) 5 verschillende receptoren: 1) Ig-superfamiliereceptoren 2) klasse I- cytokinereceptoren (celgroei) 3) klasse II- cytokinereceptoren (groeiremming) 4) TNF-receptoren 5) G-proteïnegekoppelde receptoren ( gevaar detecteren chemokines) Ig-superfamilie IL-1R Bindt Extracellulair deel Transmembranair deel Intracellulair/ cytoplasmatische staart => transductie => koorts e.a. Lijkt op LPS dat TLR bindt => zelfde effecten (koorts,…) Vb-n.: MHC, TCR, IL-1R, M-CSFR Klasse 1-cytokinerecptor: (hematopoietine receptoren) -grootste familie S-bruggen Invariant AZ: Trp-Ser-X-Trp-Ser Liganden: -Erythropoïtine (EPO) -IL2/3/4/5/6/7/8/9/11/12/13/15 - groeihormoon - GM-CSF - G-CSF - OSM -LIF: leukemia inhibitory factor - CNTF: ciliary neutrofyl factor - PRL Klasse II- cytokinereceptoren (interferonen) : Geconserveerde Cysteïnes - remmen van celgroei en acute inflammatie - Liganden: IFN-α/β/γ en IL-10 - Activatie: => inductie van een oligo-adenylaatsynthetase (OAS = secundaire boodschapper => activatie van kinasen: fosforylatie van eIF1α: initiatiefactor: eiwitsynthese valt stil => activatie van RNAseL (latent) => virale RNA-synthese (anti-viraal!!) Welke kinasen? JAK (Janus-kinase = een Tyr kinase) en TyK (tyrosine kinase) => fosforyleert STAT: signal transduction & activator of transcription (TF) => vormt dimeer en bindt in de kern op response elementen (DNA) => polymerase recruteren => RNA Verschillende vormen: bv.: IFN-γ: JAK1 en JAK2 => STAT1 IFN-α/β: JAK1 en TyK2 => STAT2 ! ook IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10 en IL-12 gebruiken deze pathways! Opmerking: genetische defecten in JAK/TyK en STAT-genen kunnen ernstige immuundeficiënties geven! TNF-receptoren: Aantal Cysteïnes - 4 Cysteïnerijke domeinen - Liganden: TNF-α/β, CD40, NGF (eigenlijk geen groeifactor, eerder overlevingsfactor, zenuwcellen groeien niet meer) en FAS-L (ligand) (= factor die apoptose stimuleert) => via adaptormoleculen apoptose sturen (via caspasen) => adaptormoleculen van trimerische TNF-receptoren zijn eveneens trimeren = FADD (Fas Adaptor with Death Domains) Procaspase-8 => caspase-8 procaspase-3 => caspase-3 => cellulaire autoproteolyse en digestie (endonucleasen breken DNA af) Opmerking: genetisch defect van Fas => faling van apoptose => “lymfoproliferatief syndroom” (= Canale Smith syndroom) (lymfocyten blijven actief) Diagnose: FAC’s: normaal gezien heel weinig dubbel positieve en dubbel negatieve cellen (CD4/CD8) => als Fas niet werkt => zeer veel CD4-/CD8—cellen! Chemokinereceptoren: GPCR: 7 TM-domeinen => herkennen van gevaar!: bv.: transducines in fotoreceptorcellen, gevaar, smaak, adrenaline receptoren, chemokine receptoren Liganden: IL-8, Rantes, MIP-1, PF4, MCAF, NAP-2 G-proteïne AC cAMP PLC DAG + IP3 PKC en Ca2+ (PKL=> actine polymerisatie => beweging) chemotaxis Verschil in expressie van receptoren voor chemokines in lymfocyten of cellen van innate immuunsysteem Bv.: neutrofielen: altijd CXCR1/R2 tot expressie (constitutief) Lymfocyt: in rust geen expressie (tenzij wat CXCR4) MAAR na activatie van bv. IL-2 wel expressie van VEEL chemokinereceptoren => bewegen naar lymfeknoop e.a. (migratie) ! CXCR4 coreceptor van CD4, waar HIV op bindt (R4-stam); CCR5 coreceptor op monocyten => blokkeren als antivirale therapie bij HIV!! => chemokines spelen een rol voor het aantrekken van bv. neutrofielen naar endotheel bij ontstekingsreacties (IL-8 in dit geval) => binding zorgt voor conformatie verandering in integrine => kan binden aan CAM Opbouw: sommige subfamilies van receptoren hebben gemeenschappelijke ketens (subunits) Bv.: GM-CSF receptor subfamilie (klasse I) GM-CSF, IL-3, IL-5 binden allen aan receptor met gemeenschappelijke β-keten => mutatie in niet-gemeenschappelijke keten is niet zo erg (wordt gecompenseerd door de andere ketens) Bv.: IL-6- Receptor subfamilie (klasse I): IL-6, IL-11, CNTF, LIF/OSM alle gemeenschappelijk gp130 keten ! Affiniteit: bv. IL-2R heeft hoogste affiniteit in trimeer-configuratie (α, β en γ) IL-2R subfamilie (IL-2/4/7/9/15) heeft ook allemaal gemeenschappelijke γ-keten => mutaties in γ-keten = ‘Common gamma chain deficiency” = ZWAAR immunodeficit!!! => X-SCID: bubble-boy (γC-keten gen op X-chromosoom) Virale escape mechanismen - Leporipoxvirus en verschillende poxvirussen brengen solubele IFN-γ-R tot expressie => IFN-γ zal hierop binden in plaats van op membraangebonden receptoren => pro-virus!! - Epstein-Barr virus: brengt IL-10 homoloog tot expressie => ↓ ontstekingsreactie (pro-virus) Is allemaal vorm van Cytokine-antagonisten: remmen cytokine activiteit 1) Receptorantagonisten: Bv.: IL-1a (a van antagonist): binden aan cytokinereceptoren zonder activatie te induceren en zonder het cytokine te binden. Zo kan IL-1a bv. endotoxine shock remmen (+ zo weet men dat IL-1 shock veroorzaakt) 2) Solubele receptoren: moleculen die het cytokine binden proteolytische extrac. fragmenten van de receptor (bv. viral escape mechanisme) Secretie van cytokines: TH1-cellen: IL-2, IFN-γ: cellulaire immuniteit (macrofaag activatie, TC-cel activatie) TH2-cellen: IL-4/5/6/10: humorale immuniteit: B-cellen stimuleren Ab’s te produceren + eosinofielen activeren CD4+-T-cel (naïef) ontmoet Ag door presentatie door APC (MHC) => differentieert in TH1 of TH2-cel => 2 werken elkaar tegen IFN-γ houdt differentiatie van TH2-cellen tegen, IL-10 houdt differentiatie van TH1-cellen tegen Toepassingen cytokines: - Exogene cytokines (anti-inflammatoir): IFN-, IL-10 (Crohn, collitis ulcerosa), -CSF voor celmobbilisering - Neutraliseren van pro-inflammatoire cytokines: anti-TNF (infliximab), anti-IL-6 (Bceltumoren), anti-HER (borstcarcinoma’s, trastuzumab) - Immuundeficiëntie en gentherapie: diagnostiek,substitutietherapie en gentherapie (X-SCID) Celadhesiemoleculen (CAM’s) naast cytokines ook interacties tussen verschillende celsoorten (via CAM’s): belangrijk om celproliferatie op gang te brengen (signaal 2) - 4 structurele families: mucines (voor binding aan selectines), selectines, integrines (voor binding aan Ig-superfamilie), Ig-superfamilie (Ig-SF) Rol: initiatie en in stand houden van cellulaire interacties tussen endotheelcellen en WBC’s (rolling en diapedese), tussen leukocyten onderling (immunologische synaps) en met ECMmoleculen en met epithelen (leukocytose) => immunologische synaps vorming, bij inflammatie (beenmerg en bloed) en “homing”( adresseren van de lymfocyt) 1) Mucines: hebben suikers: O-linked (Thr of Ser) of N-linked (Asn) binden aan selectines (lectinen: herkennen suikers) => suiker-eiwit interactie is meestal zwak, vandaar vaak multivalent-vorming (veel contacten tegelijk) => L’union fait la forçe! 2) Integrines binden aan IgSF Geglycosyleerd CLA PSGL-1: P-selectine glycoproteïne ligand-1 MAdCAM-1: mucosaal adressine en cell adhesion molecule-1 => MALT CLA: cutaneous leukocyte Ag ICAM: intercellular cell adhesion molecule VCAM: Vascular CAM LFA: Leukocyt functional Ag VLA: Very late Ag Integrines: 2 ketens in schaarconformatie: activatie parallel 4 stadia voor WBC om naar plaats ontsteking te gaan: 1) Rolling: multiple verbindingen tussen suikers van de mucines of vasculaire adhessines (op HEV, endotheel en slijmvliezen) => reversibele interactie Bv.: interactie tussen E-selectines op endotheel en mucineCAM op neutrofiel of L-selectine op lymfocyt en glyCAM1 op HEV/CD34 op endotheel !Deficiënties van suikers (mucinen) of selectines leidt tot daling weerstand! => oorzaak? => afwezigheid van interacties tussen leukocyten en endothelen => leukocytose (hoge [WBC]) => herhaaldelijke ernstige bacteriële infecties 2) Activatie: door chemokines Bv.: IL-8 => bindt aan GPcR=> activatie (verandering schaarconformatie naar parallele conformatie van integrines) 3) Adhesie: tussen integrines en IgSFCAM’s => irreversibele interactie (eiwit-eiwit) Bv.: LFA-1 – ICAM-1 (integrine op epitheel- IgSF op endotheel) 4) Diapedese/extravasatie Selectines (CD62) (glycoproteïnes) - L-selectine: constitutief tot expressie in elke leukocyt hechting lymfocyt aan lymfeknoop - E-selectine: op endotheel, inductie door IL-1, TNF-α en LPS ( pro-inflammatoire cytokines) rekruteren van neutrofielen, monocyten en T-cellen - P-selectine: op plaatjes: er bestaan isovormen (alternatieve splicing), inductie thrombine, histamine en cytokines (voor stolling) voor binding neutrofiele polymorfonucleairen Integrines: Cel-cel/Cel-ECM adhesie (Ca2+-afhankelijk) niet-covalente heterodimeren binding via RGD-motief (Arg-Gly-Asp) binding aan IgSF en ECM (fibronectine, laminine,…) 15 α-ketens en 8 β-ketens (β1 = VLA, β2=LFA) ! Integrinedefecten => ernstige bacteriële infecties: bv.: LAD-1: leukocyte adhesion deficiency type 1 => defecte β-keten van het LFA-1 => LFA-1 belangrijk co-stimulatorisch signaal bij T-cel activatie in de immunologische synaps ! IgSF: variabel aantal Ig-domeinen: Ig-vouwen ( ±110 AZ met intraketen S-bruggen) Transmembranair domein en cytoplasmatisch domein binden aan integrines Bv.: ICAM-1: 5Ig-domeinen: constitutief actief of na inductie =CD54 PECAM-1: platelet endothelial: 6Ig-domeinen, endotheliale cel merker = CD31 VCAM-1: 7Ig-domeinen, na inductie, = CD106 essentieel bij immunologische synaps van macrofagen/dendritische cellen met T-cellen Verkeer tussen verschillende lymfoïde organen: bloed bevat een pad van circulerende lymfocyten, maar naar waar circuleren deze? Milt (45%), lymfeknoop als naïeve lymfocyt (42%), naar MALT als actieve lymfocyt (10%), efferente lymfe uit lymfeknoop Omte kunnen circuleren en vooral om opgenomen te kunnen worden in 1e, 2e of 3e lymfoïde organen zijn “homing-receptoren” nodig! LAD-2: leukocyt adhesie deficiëntie-2: defect van fucosyl transferase VII geen fucose aangemaakt bij vorming mucines => geen interactie selectine-mucine stijging leukocytose en bacteriële infecties (1e immunodeficiëntie) B-cellen als APC: B7-1/B7-2 op B-cellen integreren met CD28 en CTLA op T-cellen CD28 komt tot expressie op niet-geactiveerde T-cellen => interactie met B-7 => delen! Na activatie komt CTLA-4 tot expressie (met B-7 verbonden T-cellen kunnen geen activatie signaal meer krijgen => negatieve feedback) Leukocytose = ↑ [circulerende WBC], zowel fysiologisch (leeftijd, zwanger, stress, fysieke inspanning,…) als pathologisch wijst op inflammatie - Korte life-span van leukocyten => leukocytose essentieel primaire verdediging van gastheer tegen infecties - Celadhesie in het beenmerg: zwakke maar multivalente suiker-eiwit interacties + sterkere eiwit-eiwit interacties (mucines-selectines + integrines-IgSF) a)Immature myeloïde cellen blijven plakken aan stroma door suiker-lectine (selectine) interactie. b) Stroma produceert SDF-1 (stroma cel derived factor 1) => chemotaxis immature CXCR4+cellen c) Mature cellen verliezen celadhesie en produceren enzymen (bv. gelatinase-B, vrijgezet door degranulatie) om BM af te breken en in de veneuze sinussen te integreren (proteaserelatie) - Naar perifeer: expressie van gefosforyleerde selectine liganden, selectines en andere adhesiemoleculen zorgt voor rolling, adhesie, migratie en diapedese => aangetrokken door gradiënt van chemokines (bv. IL-8) + migratie door productie enzymen die ECM afbreken. Normale WBC concentraties Volwassen Geboorte (40 weken) 1 jaar Kind (4-7jaar) Kind (8-12jaar) 4000-10.000 mm³ of µL 10.000-25.000 mm³ of µL 6000-18.000 mm³ of µL 6000-15.000 mm³ of µL 4500-13.500 mm³ of µL Volwassen: 100.000 mm³ of µL = pre-leukemie 50.000 mm³ of µL = leukemie Celtype in volwassenen (% van totaal) Celtype Hoeveelheid (mm³ of µL) Neutrofielen (40-75%) 2500-7500 Lymfocyten (20-50%) 1500-3500 Monocyten (2-10%) 200-800 Eosinofielen (1-6%) 40-440 Basofielen (1%) 15-100 Lymfocyten: te hoog = lymfocytose, te laag lymfopenie Eosinofielen: gestegen bij allergische reactie en wormen Cytokine productie: IL-1 : macrofagen, bloed monocyten, endotheelcellen, gladde spiercellen en fibroblasten TNF-α: primaire monocyt, macrofagen en andere leukocyten IL-8: vele cellen: leukocyten, myeloïde precursoren, endotheelcellen en fibroblasten IL-3: T-cellen, mestcellen GM-CSF: macrofagen, fibroblasten, T-cellen en B-cellen Proteasen bij Leukocytose: doorbreken BM en ECM: -protease cascade: a) serine proteasen: inhibitie door sepines (PAI-1, PAI-2): plasminogeen activator inhibitor. b) Matrix metalloproteïnasen (MMP’s): inhibitie door TIMP’s (Tissue inhibitors of MMP’s) => inhiberen proteasen - Interactie met cytokinen: activatie, potentiëring en afbraak cytokines, cytokines regelen de proteïnase balans : (25) MMP (4) TIMP’s (balans tussen de 2, afbraak of niet) Hoofdstuk: Cytotoxiciteit en Complement Proteasen: Leukocytose regelt aantal circulerende WBC’s = balans tussen aanvoer uit beenmerg en afvoer perifeer (extravasatie) Naast cytokines spelen ook proteasen belangrijke rol bij extravasatie van WBC naar plaats van ontsteking (afbreken BM + ECM voor migratie) - Types: a) Serine-proteasen (serine in actief centrum) b) MMP’s (Zn2+-centraal) evenwicht bewaren aan de hand van tegenhangers: protease inhibitoren Serine-proteasen Serpines MMP’s TIMP’s interactie met cytokines: - proteasen kunnen zorgen voor activatie, potentiëring (= meer actief maken door stukje af te knippen) of afbraak van cytokines - Cytokines regelen de protease balans: afbraak door proteasen vs. inhibitie van afbraak door protease-inhibitoren; proteasen worden aangemaakt als pro-enzymen (bescherming omgevend weefsel) klieving van het pro-peptide = activatie =ZYMOGENEN (proteïnen die actief worden na klieving) Klassen van proteasen: 1) Serine proteasen (bv. t-PA, u-PA; serine in katalytisch centrum): klieven proteïnen op Lys of Arg 2) Threonine proteasen: proteasoom: 4 ringen van 7 subunits 3) Thiol-proteasen: -SH groep op katalytisch centrum: ICE = IL-1 converting enzyme: procytokine cytokine ICE = thiol protease, nl. C (cysteïne)ASP (Asp)ase-1 (caspase-1) => knipt op Asp-residu 4) Asparaginezuur proteasen (lysosomaal): knippen opgenomen eiwitten 5) MMP’s (Zn2+ in het centrum) Threonine proteasen: Ubiquitinatie van proteïnen (ATP-afhankelijk) => zet ubiquitine op proteïne (= target proteasoom) => proteolytische klieving Thiol proteasen: Caspase systeem bij geprogrammeerde celdood Asparagine proteasen: Bv.: cathepsine D: lysosomaal: werkt bij zure pH (4) ↔ andere pH optima Optimale werking pH optimum pH 7,4 = normaal (vs. cathepsine D) KO-muizen => lymfocytdestructie in milt en thymus Bv.: Cathepsine E: ER, Ag-processing MMP’s: - Zn2+ in centrum Gelatinase-A = MMP-2: constitutief tot expressie Gelatinase-B = MMP-9: induceerbaar: zal bij oudere mensen bij gewrichtspunctie aanwezig zijn Neutrofiel collagenase = MMP-8: breekt collageen af => ° gelatine => kan door gelatinase worden afgebroken Stromelysines: breken proteoglycanen (stroma) af Andere klasse = bv. MT-MMP’s (Membraan Type) membraan gebonden Opmerkingen: - 1 protease komt nooit alleen!: amplificatie reacties en inhibitors - cascade: (proteasen zorgen voor cascadereactie: elk product van een reactie activeert het volgende) 1) Stolling (serine proteasen + serpines): balans: stolling tijdig stoppen! 2) Fibrinolyse ( serine proteasen + serpines): opmerking: fibrinolysine = plasmine 3) Matrixdegradatie (MMP’s + TIMP’s): Balans! 4) Kininogeen systeem (serineproteasen): klieving tot bradykinine 5) Complement!! (serine proteasen): bv. trypsinogeen en trypsine !!!!!!! COMPLEMENT !!!!!!! ontdekt door Jules Bordet: Serum 30min aan 56°C => decomplementering van plasma (complement kapot) geen anti-bacteriële werking meer (geen killing van bacteriën meer) Fractionering door middel van dialyse leverde C1 + C2 op, die samen aanwezig dienen te zijn voor lytische activiteit ontdekking van C3 Antistof-onafhankelijke weg: Bv.: gisten en sommige bacteriën kunnen via alternatieve weg complement activeren Vermogen van complementeiwitten om micro-organismen te doen kleven aan WBC’s (adherentie functie) Wat is het? Set van serumproteïnen coöperatie met innate en adaptieve immuunsysteem. Het doel is eliminatie van pathogenen in bloed en weefsels werkt in een katalytische cascade (cfr. bloedstolling) (elke reactie zet een andere reactie in gang) Hoe werken ze? 1) Lysis: Membraan Aanvals Complex (MAC) => in celmembraan van micro-organismen => maken gaatjes => lysis (cytotoxisch) (CD59 beschermt lichaamseigen cellen) 2) Opsonisatie: na activatie van complementcascade ontstaan complementmoleculen die binden aan pathogenen => binding-targets voor fagocytotische cellen met receptoren voor die complementmoleculen => bevorderen van fagocytose 3) Inflammatoire respons: binden aan receptoren op endotheliale cellen => stijging capillaire doormeter => stijging bloedvoorziening aantrekking van andere cellen richting site van weefselschade (chemotaxis) bevorderen van extravastie en degranulatie (neutrofiele granulocyt met complement kernen) 4) Klaring van Ag-Ab complexen: binden aan immuuncomplexen => target voor fagocytose Nomenclatuur: naamgeving gebeurde in volgorde van ontdekking, niet in volgorde van chronologie van de cascade (=onlogisch!) in volgorde: C1q,C1r, C1s, C4, C2, C3, C5, C6, C7, C8, C9 - vaak zymogenen (pas actief na enzymatische klieving, cfr. proteasen) - klievingsproducten aangeduid met letter als sufix (bv. C3a + C3b) + actieve vorm met streepje boven (bv. C3b) Bv.: C3 (niet actief) = klieving C3a + C3b (actief) en b is steeds groter dan a (behalve C2b) - werken in op receptoren: bv.: C3a-receptor, soms ook CD-nummer of aparte naam (bv. C3breceptor = CR1 = CD35) Activatie van complement 1) Inleiding: klassieke weg: cascade in gang indien Ag én Ab aanwezig is => Ag-Ab complex kan complement activeren [ Intermezzo: essentie van immuniteit: discriminatie SELF-NON SELF! Hoe?: => covalente binding van C3b op partikeltjes (bacteriën + immuuncomplexen) => fungeert als opsonine: MAC lokaliseren. ! Verankerd in cellen van de gastheer ! C3b depositie limiteren + MACvorming verminderen door CD59 = Membrane Inhibitor of Reactive Lysis (MIRL) ] C3 in plasma aan ± 1g/L en wordt geactiveerd door spontane hydrolyse of proteolytische activatie via C3-convertase (serine protease, proteolyse) => C3 heeft posttranslationele modificatie. Nl.: interne Thio-ester gevormd door glutamaat met cysteïne = metastabiel en kan covalente verbindingen vormen. Auto-activatie met water! Klassieke weg wordt gevolgd indien Ag-Ab complexen aanwezig zijn Complementsysteem is evolutionair oud: parasieten, virussen en bacteriën leren uit hun aanvallen op de gastheer en omzeilen aspecten van complementsysteem => ontwikkelen van alternatieve wegen als bescherming; => alle 3 de paden convergeren naar enzymecomplex dat C3 klieft in C3a en C3b = C3-convertasen: klassieke en lectine pathway: C4b2a als C3 convertase; alternatieve pathway: C3bBb als C3 convertase => stijging [ C3b ] (multifunctioneel complement proteïne) => C3b + C3 convertase = C5 convertase (klieft C5 in C5a(inflammatoire mediator) en C5b(initiatiefactor voor MAC) 2) Klassieke pathway: Ag-binding aan pentamerisch IgM of monomerisch IgG => conformatieverandering activatie complement (C1, C2, C3 en C4 zijn betrokken + aanwezig in plasma als zymogenen) Conformatieverandering in non-Ag portie Fc van het Ab molecule => exposeren van een bindingssite (CH2 bij IgG/CH3 bij IgM) voor C1 Opmerking: * C1q kan ook rechtsreeks een aantal micro-organismen binden, C1q = collectine, mannan-bindend proteïne => tevens Ab-onafhankelijke activatie van C1r en C1s * C1-macromolecule: 1 C1q-molecule + 2 C1r en 2 C1s ( beide serine-proteasen): samengehouden in een Ca2+-bindend complex: C1q => 18 polypeptide ketens (= collectine) geassocieerd tot 6 collageen-like triple helices waarvan de hoofdjes binden aan CH2/3 van IgG of IgM Voor een stabiele C1-Ab reactie moet C1q op zijn minst 2 CH-domeinen binden op zijn globulaire hoofdjes: * IgM = pentameer van de 4 keten Ig-structuur (2 IgH + 2 IgL), circulerend zonder Ag => planaire sterconformatie (C1q-bindingssite verborgen) => Aggebonden (minstens 3 bindingssites voor C1q geëxposeerd => 1 IgM kan C1 activeren (minstens 2 Fc sites nodig)) => “nietjes-configuratie” * IgG = monomeer met maar 1 C1q-bindingssite na Ag-binding => minder effectief in activeren van complement Binding van C1q aan CH domein van Fc => conformatieverandering in C1r : activatie tot serineprotease => klieving + activatie van 2e C1r-molecule => 2 actieve C1r – moleculen klieven + activeren 2 C1s – moleculen = C1qr2s2 C1s heeft 2 substraten C4 en C2 => C4 geactiveerd door hydrolyse door C1s => C4a en C4b (C4b: covalente binding aan target-membraan, NH2-terminus overdekt interne Thiol-groep in C4, maar na klieving wordt die vrijgemaakt in C4b waardoor binding aan proteïnen C2 bindt C4b en wordt target voor klieving door C1s => kleiner! C2b fragment diffundeert weg en C2a blijft over, gebonden aan C4b => actief C4b2a of C3-convertase (membraangebonden) C4b2a hydrolyseert C3 => anaphylatoxine C3a en C3b Opmerking: 1 C3-convertase => >200 C3b’s (amplificatie) C3b is belangrijkste complementproteïne: a) covalente binding van C3b op microbiële oppervlak tag voor fagocytose (fagocyten met C3b-R) = opsonisatie b) binding aan Fc-domeinen van solubele immuuncomplexen => klieving door cellen met C3bR c) binding aan C4b2a => C4b2a3b of C5-convertase: klieft C5 in C5a en C5b ( C5b zal MAC vormen met C6, C7, C8, C9 ( geen klieving meer)) 3) Alternatieve weg: Opm: sommige pathogenen of niet-pathogenen (bv. pure KWS zoals insuline en agarose) hebben ook proteolytische activiteit die complement kunnen activeren afwezigheid van Ag-Ab complexen ( dus niet adaptief) er is een continue spontane hydrolyse van C3 in het plasma (hydrolyse van de Thio-ester binding) => C3i : bindt factor B => wordt gevoelig voor klieving door factor D => vorming van C3iBb = convertase voor C3klieving in C3a en C3b (bindt Factor B klieving door Factor D => C3bBb = C3-convertase C3bBb membraangebonden + gestabiliseerd door properdine ( = C3-convertase stabiliseren) => klieving van C3 C3a en C3b => C3bBbC3b (C5C5a en C5b ( MAC)) of C5 convertase 4) Lectine weg: werkt ook via C3-convertase C4b2a, maar herkent geen immuuncomplexen, maar suikermoleculen (polysacharide Ag’s) op oppervlak van pathogenen => MBL = mannose bindend lectines: herkennen mannosen op pathogenen, maar ook Nacetyl glucosamines (GlcNac) maar geen galactosen! => lage levels van MBL = bacteriële infecties en arthritis => interacties tussen MBL en suikers leiden tot activatie van serumproteasen MASP-1 en MASP-2 (MBL-Associated Serine Protease; klieven C3 => activatie van het complement) => C4b2a Membrane Attack Complex (MAC): 3 pathways leiden tot C5-convertase: klassieke + lectine => C4b2a3b; alternatieve => C3bBbC3b => klieving van C5 in C5a en C5b (C5b gegenereerd op oppervlak van de target cel ( C4b2a3b op oppervlak) = bindingssite voor componenten van MAC, MAAR C5b is labiel en moet gestabiliseerd worden door C6, anders wordt het snel geïnactiveerd! C5b bindt C6 en C7 => confarmatieverandering hydrofobe regio’s van C7 geëxposeerd => insertie in microbiële membraan => C5b67-complex C8 bestaat uit 2 peptiden (C8β en C8αγ): C8β bindt aan C5b678 => conformatieverandering in C8αγ => hydrofobe domeinen insereren in membraan => C5b678-complex vormt porie in membraan => lysis van RBC’s, maar niet van genucleëerde cellen. Binding + polymerisatie van C9 aan C5b678 ± 10-14 C9 moleculen kunnen integreren in membraan => MAC (tubulaire vorm, C5b678-complex omringd door poly-9 complex => tunnelstructuur die cel inhoud laat wegvloeien Blokkeert klassieke weg Regulatie van het complementsysteem regeling van de activatie via klassieke weg -> serpine C1 inhibitor (daling C1r en C1s) remming van de vorming van actief C3-convertase -> C4b binding proteïn (C4bBP) breekt C4b af + C4-bindende eiwitten die C4 verwijderen Factor H: blokkeert alternatieve weg door C3b te binden en af te breken Regulatie vorming MAC => verhinderen van destructie gastheercellen door membraan gebonden protectines ( = CD59 = MIRL) blokkeert C5b678-complexen en verhindert insertie in membraan; => S-proteïne: bindt solubel C5b67 + verhindert insertie in membraan. Biologische effecten: - Lysis door MAC: C5b - Inflammatie mediëren (vooral kleinere a-stukjes): degranulatie van mastcellen en basofielen (C3a, C4a, C5a (anaphylatoxines)), degranulatie van eosinofielen (C3a, C5a), extravasatie en chemotaxis van WBC’S op plaats van ontsteking, release van neutrofielen uit beenmerg (C3c), release van hydrolytische enzymen van neutrofielen (C5a) - Opsonisatie: C3b, C4b (macrofagen dragen receptoren) - Virale neutralisatie: C3b, MAC - Klaring van immuuncomplexen: C3b - Aanmaak Vasoactieve kininen en fibrinolyse => ↑ vasculaire permeabiliteit. Complement receptoren: => fragmenten van het complement worden herkend door receptoren aan celoppervlak van immuuncellen => ↑ opname in de cel + activatie van deze cellen - Immuunadherentie door C3-receptoren: 3 opsonerende fragmenten van C3 (opsonines) (C3b, iC3b en C3dg => 4 receptoren: CR1CR4) 1) CR1 (=CD35): klieven van trypanosomen (eencellige parasieten) aan plaatjes/RBC’s van primaten => 4 functies: opsononine receptoren voor granulocyten, monocyten en macrofagen => endocytose; Cofactor voor klieving van C3b naar iC3b en C3dg => bescherming Self-cellen tegen complement; op plaatjes/RBC’s => transportsysteem voor bacteriën naar het MPS (bv. in lever/milt); op B-lymfocyten => lymfocyten activatie samen met CR2. 2) CR2 (= CD21): op B-lymfocyten, FDC’s en epitheliale cellen => verschillende liganden binden: iC3b, C3dg, Epstein-Barr virus, IFN-α 3) CR3 (= CD18/CD11b): op myeloïde cellen (leukocyten) als adhesiemoleculen: integrines: heterodimeren met gemeenschappelijke β2-keten (CD18) + keuze uit 3 verschillende αketens (CD11a/b/c) => β2 + CD11b = CR3, LFA-1 = CD18/11a, CR4 = CD18/11c Integrines binden aan IgSF-receptorfamilie van adhesiemoleculen => binding is Ca2+afhankelijk, sommige receptoren binden via RGD-sequentie (Arg-Gly-Asp) op ligand, ook andere specificiteiten 4) CR4 (CD18/CD11c): bindt iC3b op Ca2+-afhankelijke wijze vooral op weefselmacrofagen Anafylatoxine-receptoren: klievingsproducten van C3 en C5a zijn anaphylatoxinen: degranulatie van mastcellen, 50.000-100.000 receptoren per cel, familie van serpentines (↔serpines), mediëren tevens chemotaxis-signaal Biologisch (extra): - ontstekingsreacties beginnen en versterken C3a en C5a => chemotaxis en leukocytactivatie => leukotriënen en histamine (vasodilatatie) - C3b en C4b als opsonines => stijging fagocytose - complement receptoren op neutrofiele granulocyten, monocyten en macrofagen => exocytose van granulen - interactie met bloedstolling, aanmaak van vasoactieve kininen en fibrinolyse => stijging vasculaire permeabiliteit en contractie van de gladde spieren Celgebonden immuniteit en cytotoxiciteit: lokale reacties van cellen tegen micro-organismen via fagocyten en lymfocyten, niet zozeer via werking van Ab’s (=humoraal) MAAR: onderscheid celgebonden- humoraal is artificieel => cellen spelen cruciale rol in vorming van Ab’s (B-cel stim. en act. Cytokines uit T-cel) + Ab’s belangrijke schakel in celgebonden reacties (Fc-Rn) Effectorcellen: - NK-cellen: CD56+ => kanker en virussen via MHC-onafhankelijke weg, berust op gewijzigde suikers bij pathogenen en kankercellen die herkend worden door lectinen (NKreceptoren) (geen MHC-restrictie suikers herkennen degranuleren!) - geactiveerde macrofagen - cytotoxische T-cellen: Tc/CD8+ - killer cellen (K-cellen): ADCC = antibody dependent cellular cytotoxic Fc-receptoren op membraan van killer cellen herkennen constant gedeelte van Ab’s op targetcel Moleculair antwoord: ontstekingscellen aantrekken, binden van pathogeen internaliseren cytokines maken 1) Chemotaxis: groot aantal substanties geproduceerd door micro-organismen veroorzaken chemotaxis van fagocyten naar ontstekingsaard Welke chemokines? – Formylpeptiden: zoals fMLP geproduceerd door bacteriën aantrekken van granulocyten - C3a +C5a : ontstaan door complementactivatie via alternatieve weg - chemokines geïnduceerd door virussen - leukotriënen (bv. LTB4) geïnduceerd door IL-1 Welke receptoren? – G-proteïne gekoppelde serpentine receptoren met 7 TM-domeinen (hydrofobe AZ) => signaaltransductie via G-eiwitten ( ~fotoreceptoren, ORN’s, feromoon receptoren, NT-receptoren,…) 2) Binding en opname van micro-organismen: binding van de microbe aan membraan van de fagocyt gaat gemakkelijker indien complementactivatie (klassiek via Ab’s of alternatief via repetitieve KWS) Complementactivatie => C3b (herkend door CR1 op macrofagen en andere fagocyten) worden op microbe gekleefd Andere wegen van opsonisatie = binding van Ab’s op microbe herkend door FcR op fagocyten die constant domein van Ab’s herkennen 3) Destructie: vernietiging van de microbes na opname in fagosoom versmelten met lysosoom => fagolysosoom zure hydrolasen verteren macromoleculen => vernietigen van gefagocyteerde bacteriën, virussen en andere parasieten ! infectie van een lichaamscel met een virus => gedeelte van de virale peptiden wordt gekliefd in het proteasoom => peptiden van ± 7 AZ presentatie in MHC I-groeve => via ER naar cel oppervlak => herkenning door Tc-cellen 4) Cytokine-vrijstelling: meeste infectueuze agentia kunnen fagocyten direct stimuleren => vrijstelling cytokines Hoe? => PAMP’s herkend door TLR. Bv.: RNA-dubbelstreng van retrovirussen, bacteriële endotoxines (lipopolysachariden) cytokines werken in een netwerk van interacties => agens stimuleert macrofaag tot vrijstelling van IL-1 en TNF-α + activeert NK-cellen en T-cellen tot productie van lymfokinen (o.a. IFN-γ), immuuninterferon kan macrofagen activeren. T-cel afhankelijk celgemedieerd immuunantwoord: TH-cellen centraal in specifieke cellulaire immuniteit (kiezen de effectormechanismen) a) Specificiteit van het antwoord door te bepalen welke Ag’s en epitopen herkend worden b) Bepalen welk effectormechanisme tegen welk agens in gang wordt gezet c) helpen bij de proliferatie van de juiste effectorcellen d) verhogen de functies van fagocyten en andere effectorcellen - Vergelijking van naïeve en effector T-cellen: co-stimulatorisch signaal ( CD28-B7 interactie) is noodzakelijk voor activatie van naïeve T-cellen, niet voor effector Tcellen naïeve T-cellen exprimeren weinig adhesiemoleculen (CD2 +LFA-1), effector T-cellen veel meer (= 3e golf in respons, golf 1 = transcriptiefactoren, golf 2 = cytokinen) verkeer: naïeve T-cellen: via HEV naar 2e lymfoide organen effector T-cellen: naar 3e lymfoïde weefsels: plaats van ontsteking Hoe gebeurt de selectie van effectormechanismen? TH-cellen herkennen Ag’s in groeve van MHC II via TCR => beslissing: juiste set van cytokinen vrijzetten om de juiste secundaire celsoort te (in)activeren 1) TH-1 cellen: IL-2, IL-3, IFN-γ bevorderen celgebonden immuunreacties en overgevoeligheid van het uitgestelde type II Bv.: TH-1 cellen bindt met TCR aan Ag in MHC II op APC + CD4 als co-receptor + costimulatorisch signaal (CD2/LFA-1) => activatie TH-1 cel produceert IL-2 (autocriene werking, klonale expansie) Maar ook werking op IL-2R op geactiveerde TC-cellen => proliferatie en differentiatie van geactiveerde TC-cellen (= signaal 2) Wat is signaal 1 bij Tc-cellen (enkel geactiveerde Tc-cellen) => Ag herkenning via CD8 (MHC I) (=> activatie) = IL-2R expressie 2) TH2-cellen: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 bevorderen humorale immuniteit, allergie met mastcellen en eosinofiele granulocyten 3) TH17-cellen: IL-17 bevorderen acute ontstekingsreacties (granulocyten) 4) Tneg- cellen: TF FOXp3 /CD25 immunosuppresie Regulatorische rol van cytokinen: Differentiatie van T-cellen in verschillende stadia (onderscheid met merkers) Differentiatie van TH-cellen => activatiemerkers zijn de cytokinespectra die de cellen aanmaken in een bepaald stadium a) Naïeve precursoren (THP)IL-2 b) Korte-termijn stimulatie (THO)IL-2, IL-5, IL-6, IL-10 en IFN-γ c) chronische stimulatie: TH1 en TH2 d) THM (memory): IL-2 (overleven tot 40 jaar) Mutuele uitsluiting van TH1 vs. TH2 cellen: TH1-cellen IFN-γ activatie van macrofagen daling van proliferatie TH2-cellen TH2-cellen IL-10 daling transcriptie van IFN-γ IL-4/IL-5 mastcellen, eosinofielen, B-lymfocyten Celgemedieerde Cytotoxiciteit: = doden van targetcellen (kankercellen, virus besmette cellen, lichaamseigen cellen(auto-immuun, overgevoeligheid); mechanismen verschillen naargelang de soort van immuuncel. (specifiek = MHC-restrictie, aspecifiek = NK-cel, lectine en fagocytose) 1) Virusbesmetting: 1e lijns verdediging tegen virussen is natuurlijke barrières en interferon! Ook fagocytose (na opsonisatie met Ig’n of complement) NK-cellen: receptoren die abnormale glycosylering herkennen => doden cel Permissieve cel vermenigvuldigt virus => viruspartikeltjes worden door APC gepresenteerd op MHC I-Ag’s (o.i. van interferon stijgt aantal MHC-moleculen!) => TC-cellen aan MHC I-Ag + TH-cellen binden ( IL-2 productie stimuleert TC-cellen! (signaal2)) => TC-cellen schakelen target cel uit: = efficiënt om cel viral load te verminderen + secundair antiviraal mechanisme (naast IFN die aspecifiek werken, maar beide mechanisme zijn complementair) Ook Ab-dependente (tijd) weg van killercellen (Ab’s => opsonisatie => FcR) indien tijd genoeg om Ab’s te maken of bij eerder contact met virus of vaccinatie 2) NK-cellen en LAK-cellen bij kanker: Target cel = ontaarde lichaamscel (=Self-cel!) NK-cellen: dragen NK-receptoren: behoren tot de IgSF, herkennen de determinanten van de ontaarde cellen - deel van de LGL = Large Granula Lymphocytes (CD3-, CD16+, CD56+), geen MHC-restrictie met targetcel LAK-cellen: Lymfokine Activated Killer cells: eveneens LGL met zelfde aard van docking van ontaarde cellen; geactiveerd met IL-2 - Therapeutisch: WBC’s opzuiveren bij kankerpatiënt, in vitro activeren met IL-2 terug geven aan patiënt => gestimuleerde cellen meer effectief om kanker te doden? 3) Killercellen: wanneer Ab’s tegen de targetcel gemaakt worden, Ab-dependent doden van targetcellen via K-cellen (= Antibody dependent Cell-mediated cytotoxicity) => FcR op Kcellen om Ab’s op targetcel te vangen 4) Lectinen (o.a. selectinen/ ASPECIFIEK): eiwitten die koolhydraten herkennen; Lectinen binden en vormen een brug met cellen met cytotoxische activiteit; lectinen kunnen ook cellen activeren tot cytotoxiciteit; geen MHC-restrictie vereist! Mechanismen van cytotoxiciteit: 3 belangrijke klassen van moleculen: perforines, enzymen en cytotoxische cytokines 1) Perforines: opgeslagen in granules van LGL; activatie van deze cellen => inhoud via exocytose vrijgesteld Werking? => polymeriseren o.i.v Ca2+ + na proteolytische klieving => vorming van poriën in de membraan van de targetcel => cellen lekken leeg 2) Enzymen: breken membraancompartimenten af; opgeslagen in granulen van granulocyten en lymfocyten = granzymen (granulaire enzymen) 3) Cytokinen: Bv.: synergie tussen TNF-α en IFN-γ => kunnen enkel samen doelwitcel met receptoren voor deze cytokines doden Opmerking: APOPTOSE: cytoplasmatische uitstulpingen, nucleaire desintegratie, aanmaak van endonucleasen die kerninhoud afbreken tot nucleosomen = mechanisme waarmee autoreactieve T-cellen (reageren op Self-Ag’s) in de thymus geëlimineerd worden door negatieve selectie = interactie Fas-FasLigand is cruciaal Hulp van myeloïde cellen: granulocyten in eerste instantie eliminatie van micro-organismen granulocyten kunnen ook meehelpen in elimineren van kankercellen, virus besmette cellen en andere targetcellen (naast enkel exogene pathogenen te bestrijden) secretie van hydrolasen, NO, O-radicalen, peroxides (H2O2) en hydroxylradicalen (-OH-) Bv.: hypochloorzuur activeert protease + aspecifiek hydrolyseren van proteïnen door radicalen (! Niet enkel na fagocytose, ook door secretie van toxische stoffen ! ) Centrale rol van macrofagen in ontsteking: - Anti-microbieel en tumoricied vermogen - dringende rol in weefselbeschadiging en weefselreorganisatie -lymfocyten activatie -inflammatie en koortsregulatie 1) Tumoricied vermogen en anti-microbieel: O2-dependent (H2O2, OH, NO, O2-,…) en O2independent: lysozyme, zure hydrolasen, cationische proteïnen (bv. CAD37) L-Arg NOS NOS: ontstekingsbevorderend Pro-inflammatoir cytokines induceren NOS-variant, nl. iNOS NO : cytotoxische werking tegen bacteriën, schimmels, parasieten en kankercellen 2) Weefselbeschadiging en reorganisatie: verschillende groepen effectormoleculen: matrixenzymen a) proteasen: serine-proteasen (Bv.: trypsine, plasminogenactivatoren t-PA en u-PA) MMP’s (collagenasen en gelatinasen, stromelysines en proteoglycanen en membraangebonden MMP’s) en Thiol- of Cysteïneproteasen en Aspartaatproteasen b) Glycanasen (hyaluronidasen en heparanasen) Andere groep van effectormoleculen zijn groeifactoren (FGF, angiogenesisfactoren ea.) (groeifactoren: bep. weefsel afbreken, andere aanmaken) 3) Lymfocyten activatie: macrofaag doet aan fagocytose, processing en presentatie van Ag’s => lymfocyten activeren Productie van cytokinen (IL-1/6/8 en andere chemokines (pro-inflammatoir), ook IFN-γ en TNF-α) => specifieke weerstand activeren 4) Inflammatie en koorts: IL-1 gesecreteerd door macrofaag => inwerking op setpoint van de thermoregulatie in de hypothalamus => koorts (vanaf 38°C!) = verdedigingsmechanisme! bij 40°C delen micro-organismen minder snel, virussen vermenigvuldigen trager in de gastheer (metabolisme ↓), glycosylering wijzigt => activiteiten van enzymen en cytokinen veranderen IL-1 = endogeen pyrogeen: induceert: Prostaglandines, complementfactoren, acuut-fase eiwitten, stollingsfactoren => modulatie van ontstekingsreactie!! 4 fasen in de activatie van macrofagen: 1) immature macrofaag 2) responsieve macrofaag (beetje IFN-γ), 3) primed macrofaag (veel IFN-γ, LPS), 4) getriggerde macrofaag maakt TNF-α met hoger vermelde effecten op ontsteking. Hoofdstuk: Genetische basis van het repertoire antistoffen en TCR’n: Probleem: menselijk genoom: 3x109Bp vs. repertoire van ± 1015 Ab’s! en grote densiteit aan antigenen => coderende capaciteit volstaat niet! Verschillende theorieën: 1) selectieve druk door Ag’n; 2) instructieve theorie: complementaire Ag-bindingsplaats op Ab is flexibel en past zich aan na Ag-instructies 3) Klonale selectie theorie: elke B-cel maakt 1 type Ab en Ag selecteert welke B-cellen in actie komen. 3 mogelijkheden op moleculair vlak voor grote diversiteit: - multiple genen (niet als uniek mechanisme te weinig genen) - Somatische mutaties in kiemcellijn creëren variatie - Somatische recombinaties pf herschikkingen in deze multiple genen deze 3 mechanismen komen samen voor. Variatie in de antistof ketens: 1 Ab 2 zware en 2 lichte ketens. Stel: 10.000 verschillende lichte ketens (K of λ) met 10.000 zware ketens (µ, α, γ en ε) => 108 mogelijke Ig’s => analyse van de eiwitsequenties van de gezuiverde Ig lichte ketens => plaats waar variatie aan AZ gelokaliseerd is: vanaf Nterminus 3 regio’s van externe variabiliteit: CDR (Complementarity Determing Regions) CDR1,CDR2, CDR3 met eromheen FR (Framework regions): FR1, FR2, FR3, FR4 => hypervariabele CDR-delen in variabele deel van de N-terminus Opmerking: nomenclatuur van de variatie 1) Allotypische variatie: verschillen in AZ-volgorde in de constante delen van de zware keten tussen verschillende individuen 2) Xenotypische variatie: tussen verschillende diersoorten => humaniseren van dierlijke Ig’s bij toepassing bij de mens 3) Isotypische variatie: verschillen in klassen van antistoffen binnen dezelfde soort (binnen 1 individu verschillen in zware ketens) = variatie in constante delen en FR-gebieden van zware keten 4) Idiotypische variatie: verschillen in de Ag-bindingsplaatsen (in de hypervariabele delen) Differentiatie van B-lymfocyten: uitgaande van hematopoietische stamcellen lymfatische progenitor pro-B-cellen met gedeeltelijk herschikte zware keten pre-B-cellen met volledig herschikte zware keten + surogate lichte keten (eerst wordt de zware keten van IgM aangemaakt: µ zware keten) Daarna verwerven deze cellen mogelijkheid om ook lichte ketens aan te maken. ! allelische exclusie! Slechts 1 allel (maternaal of paternaal) wordt gebruikt om Ig’s te maken! Pro-B-cel herschikt zware keten: eerst DJ-recombinatie, dan V-DJ recombinatie (van 1allel): 1) als dit lukt: productief 1e allel en de µ µ zware keten schakelt µ-allel 2 uit (allelische exclusie) en induceert lichte keten K-recombinatie als dit lukt: inhibitie van 2e allel recombinatie voor K + inhibitie λ-recombinatie als dit NIET lukt: proberen K-recombinatie op 2e allel lukt dit: inhibitie λ-gen, Lukt NIET: λ-recombinatie op 1e allel lukt of lukt niet λ-recombinatie op 2e allel lukt, als dit niet lukt apoptose 2) V-DJ recombinatie lukt niet: niet-productief allel 2 => 2e allel proberen: lukt lichte ketens proberen; lukt niet apoptose dus: allelische exclusiviteit: steeds wordt er maar 1 allel gebruikt om IgM te maken, dus ook steeds maar 1 lichte en 1 zware keten (ondanks 2 allelen) 1 Ig = 4 ketens, maar altijd combinatie van zelfde ketens! Hiërarchie: eerst K-lichte ketens produceren, dan pas λ => zware keten is af: PRE-B-CEL => lichte keten is af: IMMATURE B-CEL Zware en lichte ketens geassocieerd tot membraan-gebonden IgM (mIgM) Verdere maturatie leidt tot mature, naïeve B-lymfocyten met zowel IgM als IgD aan oppervlak. Membraangebonden Ig’s volstaan niet om Ab-secretie te veroorzaken intracellulaire signaldomein vereist (BCR enkel geeft geen signaaltransductie) associatie van 2 Igα en Igβ ketens => vorming van BCR-complex Deze mature naïeve B-cel komt in perifere (secundaire) lymfoïde organen terecht stimulatie met Ag => geactiveerde B-cel => differentiatie tot IgM-secreterende plasmacellen = PRIMAIRE IMMUUNRESPONS 2e Ag-CONTACT: 2e herschikking van de zware ketens plaatsvinden ( = klasse switch) => creëren van verschillende isotypes van Ab’s gesecreteerd door plasmacellen ( IgG, IgA of IgE) DUS: 1) recombinaties in zware en lichte ketens in het beenmerg => mIgM in immature B-cel en mIgM en mIgD in mature B-cel 2) recombinaties perifeer na Ag-stimulatie in constante delen van de zware keten (=klasse switch) NA 2e CONTACT MET Ag! Herschikking van de lichte keten DNA: kiemcellijn DNA bevat multiple genen: Bv. multiple variabele (VK) regio’s, maar deze komen wel achter elkaar gegroepeerd voor. elk stukje heeft geassocieerde “leader” sequentie voor het signaalpeptidase (waar geknipt moet worden) DUS: segmentaire opbouw (alle V’s achter elkaar, alle J’s achter elkaar,…) Aan het 3’-uiteinde na de V-segmenten zijn er nog 5 J (joining) segmenten die de rest van de variabele regio coderen. Tenslotte is er nog 1 enkel constant exon (CK) per allel. K-kiemcellijn DNA: => genherschikkingen in somatische cellen (!!!) niet in kiemcellen junctie tussen Vsegment + 1 van de j-segmenten Toegepast op K-lichte keten DNA: Chromosoom 2: 85 variabele segmenten achter elkaar (per allel) + 5 Joining segmenten + CK 3’-uiteinde van elk V-deel kan recombineren met 5’-uiteinde van een downstream segment, hier: J-segment => werking van RAG-enzymen: RAG-1 + RAG-2 zijn Recombination Activating genes: knippen 12/23- paar nucleotiden op basis van recombinatiesignalen die hepta- of nona-nucleotiden-sequenties zijn Spacer-sequenties (12 of 23 nucleuotiden) zijn niet-geconserveerde DNA segmenten die RAG-eiwit knippen. Heptameren/nonameren aan 3’ uiteinde van een segment stroomopwaarts zijn complementair met heptameren/nonameren aan 5’ uiteinde van een stroomafwaarts segment. 12/23 regel: set van hepte/nonanucleotiden gescheiden door 12 spacer-nucleotiden paart enkel met complementaire set gescheiden door 23 nucleotiden. deze regel maakt het voor de zware keten onmogelijk om 2 D-segmenten of een V-segment rechtstreeks met een J-segment aaneen te schakelen ( ! TCR β-keten heeft andere spacers => Dβ-Jβ of Vβ-Jβ is wel mogelijk => grotere variatie!) Immunoglobuline gen geactiveerd => hnRNA (heterogeen nucleair) van de herschikte genen (hnRNA bevat al de sequenties achter de herschikking nog, dus ook alle intronen =>splicing: intronen worden verwijderd en er ontstaat mRNA => wordt naar eiwit vertaald + signaalpeptide wordt afgesplitst tijdens secretie naar het extracellulair compartiment.) Southern Blot: met restrictie enzymen (bv ECOR-I) genomisch DNA klieven en bekomen frequenties scheiden op grootte in agarose-gel => onderscheid te zien tussen kiemcellijn configuraties vs. herschikte DNA van een somatische cel Opmerking: elke herschikking zorgt voor een irreversibele verandering in het genoom + afgeknipte fragmenten DNA worden gewoon verwijderd ( hiërarchie in de herschikking van de lichtere keten: eerst K, dan λ als K niet lukt) Herschikking in de µ-zware keten: anderer opbouw : 300 VH-segmenten met signaalpeptidecoderende gensegmenten, 20-tal D-segmenten (niet aanwezig bij lichte keten extra diversiteit bij zware ketens), 10-tal JH-segmenten en 1 enkel constant segment dat opgebouwd is uit 4 domeinen (Cµ1 tot Cµ4) op 3’ uiteinde nog additionele stukjes DNA voor het carboxyterminaal deel van gesecreteerd Ig og membraangedeelte van mIgM (membraangedeelte: hiertussen bevinden zich polyadenyleringssites voor RNA-processing + bestaat uit hydrofobe AZ!) Bv: na µ-rearrangement blijft volgende keten over: Dus na herschikking DJ en V DJ wordt hnRNA overgeschreven => alternatieve splicing en poly-adenylering herkent 2 soorten zware ketens: 1) sIgM (gesecreteerd (m terminus afgekliefd) en 2) mIgM (20-tal bijkomende AZ aan C-terminus (hydrofoob) => verankering aan membraan) Organisatie van de constante delen in de genlocus van de zware keten: bepaalde volgorde van de constante delen van de zware keten bij de mens => na de oorspronkelijke herschikkingen (VH, DH en JH) kan B-lymfocyt alternatieve splicing gebruiken om tegelijkertijd de zware ketens van IgM of IgD te maken = herschikte lijnorganisatie is zo dat de hele C-regio behouden is en enkel de eerste recombinatieplaats gebruikt wordt (Cµ ligt naast Cδ in genoom) (!! Alle segmenten naast elkaar ( γ, α, µ, δ, ε) ook na transcriptie nog!!) Klasse switch na Ag-stimulatie met als doel niet IgM (primair) maar bv. IgG te maken = 2e herschikking waarbij een andere recombinatieplaats (met hepta- en nonamere herkenning) gevouwen wordt door RAG-1 en RAG-2 Bv.: na herschikking: Mutaties draagt bij tot de diversiteit: bij aaneenhechten van de stukjes DNA door TdT worden fouten gemaakt: resulteert in productief leesraam (andere AZ worden ingebouwd = missense), resulteert in een niet-productief leesraam (stopcodon nonsense mutatie cel gaat dood) opmerking: allelische exclusie: er wordt steeds 1 allel gebruikt voor productie µ eb k of λ (moederlijk of vaderlijk) keuze is random en kan verschillen tussen zware en lichte keten Bv.: cel kan µ-keten van vader afschrijven, gecombineerd met k-keten van moeder (zware en lichte ketens liggen op andere chromosomen!) Mechanismen van diversiteit: van een beperkte hoeveelheid DNA kan een enorm aantal Ab’s aangemaakt worden. Combinaties ontstaan door: - Veel V-segmenten in kiemcellijn van zware en lichte ketens - Recombinatie tussen V en J in de lichte keten - Recombinaties tussen D en J en V en DJ in zware ketens (extra diversiteit) - Variabele recombinaties op junctieplaatsen met behoud van het leesraam (mutaties) - Somatische puntmutaties in V-gebieden - Combinaties tussen lichte en zware ketens (CAVE: allelische exclusie!) Affiniteitsmaturatie: toenemen van de bindingsactiviteit voor een Ag door mutaties in hypervariabele delen => in de loop van de tijd ontstaan er voor 1 Ag meer Ab’s met verhoogde affiniteit voor het Ag Regulatie van de antistof vorming: Specifieke volgorde en gecontroleerd: 1) Zware ketens: D J gevolgd door VDJ => transcript maken in de VDJ-µδ configuratie ( tegelijk ook IgM/D maken!) 2) recombinatie van de gencluster van de lichte ketens: VJ recombinatie, gevolgd door VJCk- transcriptie lukt of lukt niet. Als het niet lukt: VJCλ-transcriptie => na vertaling van beide ketens worden de zware en lichte keten samengevoegd tot IgM/IgD associeren met Igα en Igβ signaalketens => mature B-cellen 1e Ag contact => IgM secretie; 2e contact => 2e genherschikking: klasse switch Klasse switch: genherschikking in constante delen => met (mIgM) of zonder (solubel) Msegment (TM-deel): indien TM-segment wordt ingebouwd => komt in secretorische vesikel => fusie met membraan => mIg (exocytose in de membraan) !! IgG moleculen bevatten CH2-domein met suikers! Dragen ook bij tot de diversiteit => al dan niet activeren van complement via de lectineweg suikers zijn N-linked en ontstaan in ER ER: N-gekoppelde glycosylering: N-Asn-X-Ser/Thr = SEQUON = landingsplaats voor suikers GlcNAc: N-acetyl gekoppelde glycosylering ( O-linked in golgi= GalNAc bv. mucines) Genherschikking van de TCR: - andere kiemcellijn configuratie en chromosomale lokalisaties van de verscheidene ketens van TCR (α, β, γ en δ) vergelijken met lichte en zware ketens van Ig’s - herschikking op analoge wijze als voordien gezien: specifieke recombinasen (RAG-1/2) en herkeninnigsproducten - aantal verschillen met de genclusters van Ab’s: 1) schikking van V, J, C verschillend in α of β keten + geen D-segment in α 2) vaak puntmutaties => verschuiving uit het leesraam Opmerking: D, V en J-domeinen (↔ lichte keten Ig) + ook recombinatie van Dβ-Dβ en VJ mogelijk => heterogeniteit van β ketens is groter Herschikking in de thymus! Van dubbel negatief naar dubbel positief. Bevat een TM-deel voor vasthechting op membraan! Toepassingen: 1) Diagnose van kwaadaardige aandoeningen van B- en T-lymfocyten e.a.: membraangebonden + intracellulaire ketens opsporen met monoklonale Ab’s 2) Southern Blot om DNA-configuraties te onderscheiden: specifieke herschikkingen zien door middel van PCR (bv. RAG-ziekten opsporen) 3) Ig-configuraties in hematopoiëtische cellen van een niet-B-cellijn => 10% van de T-cel leukemies: herschikkingen in de antistofketen genen 4) acute leukemies => herschikking van Ig-genen? 5) B-celleukemie: mono/oligo/polyklonaal? 6) Immunodeficiëntie door defect in genherschikking? ( 2 ) 7) Heavy chain disease: bepaalde cellen voeren herschikkingen van de zware keten uit, zonder dat er lichte ketens gevormd worden. 5 => monoklonaal: beperkt tot 1 lijn (1B-cel 1Ab), poly: meerdere lijnen betrokken. MHC en Ag-processing Functie van het adaptief immuunsysteem = herkenning van vreemde organismen => uitschakeling 2 belangrijke families van moleculen: antistoffen + TCR (gemeenschappelijke oerouderstructuur: Ig-Vouw) Ontwikkeling en differentiatie van lymfocyten => ontstaan van solubele (Ig’s) en membraangebonden (= BCR en TCR) vorm van deze moleculen. wachten op 1e contact met Ag vergemakkelijken door lymofocyten steeds te laten recirculeren door het lichaam met haltpost op strategische plaatsen: LK, milt, MALT => bevordering contact met Ag. 3e groep van moleculen in het adaptief immuunsysteem => MHC: behoort eveneens tot familie van Ig’s + tijdens biosynthese ontstaat er ook een opgevouwen structuur met soort van groeve waarin Ag’s op reversibele wijze kunnen binden. Doel van het systeem: Ag’s herkennen. Functies van MHC: Adaptieve immuunrespons: T-cellen kunnen enkel Ag’s herkennen die geassocieerd zijn met MHCmoleculen (ESSENTIEEL) gepresenteerde Ag’s zijn altijd LINEAIRE PEPTIDEN (CD4) of GLYCOPEPTIDEN/GLYCOLIPIDEN (CD1) (Cfr. BCR herkent direct en onafhankelijk conformationele (=Ag’s van alle aard) antigenische determinanten celproliferatie en differentiatie) MHC-moleculen zijn polymorf => individuele vingerafdruk Gevolg: MHC-eiwitsequenties in ander lichaam zullen lichaamsvreemd herkend worden en geëlimineerd worden => WEEFSELTYPERING en AFSTOTING bij TRANSPLANTATIE. Dus: MHCantigenen deel van onze immunologische identiteit. Locus MHC-eiwitten (= HLA: Human Leucocyte Ag’s, hoewel ze nagenoeg op alle cellen voorkomen!) chromosoom 6 + enorm polymorf => veel allelische varianten kans dat 2 individuen identiek zijn voor de locus is gering. Indeling: * MHC I: gecodeerd door HLA-A/B/C * MHC II: gecodeerd door HLA-D (nog verder onderverdeeld in HLA-DP/DQ/DR) Voor elke subregio kan een individu homozygoot of heterozygoot zijn: beide allelen komen tot expressie aan de oppervlakte van WBC’s overerving = CO-DOMINANT mensen die in 1 allel al verschillen => weefselincompatibiliteit Hoeveel aantal allelen per MHC-subset? MHC I: 100’en voor A, B en C-loci (α-keten + β2 microglobuline) ; MHC II: nog meer (vandaar DP, DQ en DR) => alle subregio’s samen => miljoenen combinatie mogelijkheden. Opmerking: - Ook MHC-III moleculen: subsets C4, C2, BF => product = c’-proteïne + TNF-α/β - Mineure histocompatibiliteitsgenen: ook fuctie in weefselantigeniciteit. Transplantatie: Afstoting= herkennen van transplantatie-Ag’s (namelijk de vreemde HLA-Ag’s) via humorale en cellulaire immuniteit van de receptor = adaptieve immuniteit bloedproducten=> Ab’s; Huid => cel-gemedieerd; organen => Ab’s + celgebonden reacties Wetten van transplantatie: 1) Allogreffe: weefsel met genotype bv. AA wordt afgestoten door immuunsysteem van persoon met genotype BB 2) Autogreffe: weefsel met genotype bv. AA zal aanvaard worden door immuunsyteem van persoon met genotype AA 3) Kruising AA met BB: kinderen AB –> co-dominant => kinderen GEEN donor voor ouder!! 4) 2 verschillende HLA-homozygote ouders (AA vs. BB) => transplantatie mogelijk van ouder naar kind Afstoting voorkomen: Hoe meer donor en acceptor afwijken in hun HLA-bestand, hoe meer kans op afstoting. => Zo goed mogelijke match vinden. 1-eiige tweeling is perfect, meestal is familielid ook oké. => weefseltypering om HLA-moleculen te karakteriseren. Bv: Serologie: gebruik van antisera met mAB’s Perifeer WBC’s nemen MHC: onderzoeken of dit bv. HLA-A3 is. => mAb’s tegen HLA-A3 toevoegen in serum. => zal Ag-Ab complex geven. => complement geactiveerd => WBC’s dood positief voor HLA-A3 Andere technieken: FACS, Mixed Lymphocyte Reactions (MLR), PCR/Southern Blot (gentisch) => MHC-II belangrijker! Wanneer men alle HLA-genen getypeerd heeft => match gaan zoeken in data-base met alle getypeerde donoren (Eurotransplant in Leiden) Welke organen zijn te transplanteren? – Nieren (kan van levende donor) - Hart, Longen (vaak samen) - Pancreas (bij type 1 diabetes) - Lever - Huid (brandwonden vaak allogreffe (van andere persoon) - Cornea (bijna nooit afstoting) - Beenmerg (en dus bloed) Bij transplantatie ± 50.000 donoren screenen op match, maar match is nooit perfect! erg?? NEEN: zolang subklassen maar overeenkomen voor beide allelen. 1) sommige allelen geven exact hetzelfde eiwit (geen bedreiging). 2) sommige allelen geven licht aangepast eiwit dat niet eens gezien wordt door Ab’s (geen bedreiging). 3) Sommige allelen geven sterk veranderde eiwitexpressie => triggert immuunsysteem van host (= wel bedreiging) Problemen bij transplantatie: - Afstoting (rejectie): -primair: al na enkele uren na transplantatie weefselafstoting -secundair: na 1 week afstoting -tertiair: nog later afstoting - Graft-versus-host disease: Wanneer men weefsel transplanteert waarin nog immunocompetente cellen van de donor zitten (vooral TH-cellen) => prolifereren in de lymfeklier van de gastheer => SelfAg’s van de gastheer aanvallen! => vooral na beenmergtransplantatie en vooral afstoting van de huid. Opl.: immunosuppresiva om T-cellen te doden (anti-CD25 => IL-2αR => T-cel activatie onderdrukken) !! Bijna nooit perfect match!! => steeds immunosuppressiva geven na transplantatie Immunosuppressie: 1) Farmaca (bv. antimitotica => daling deling T-cellen) - Purine-analogen (cytostatica, bv. Imuran) - Corticosteroïden (bv. Prednisone) - Tracrolimus (remt IL-2 productie, bv. Prograf) - Cyclosporine (remt IL-2 productie, bv. Neoral) - Antithymocyte globuline (ATG) (Antistoffen tegen thymocyten thymus uitschakelen) 2) Monoklonale Ab’s: - Muromomab-CD3 (mouse monoclonal antibody, schakelt alle CD3 cellen uit) - Daclizumab en Basiliximab (tegen IL-2R) - Alemtuzumab (tegen CD52 depletie T- en B-cellen) 3) Belatacept: blokkeert de celadhesie tussen TH-cellen en APC (bv. CTLA-4: blokkeert signaal 2, CTLA4 = cytotoxisch T-lymfocyte antigen 4: remt CD28) Welke genen zitten er zoal in de HLA-complexen? bv. TAP1/2: Transporters of Ag-peptide => MHC-I moleculen bv. LMP (7,…): Large Molecular Protein Complex = proteasoom-subunit. MHC-I/II molecule: 1) MHC-1: Op alle gekernde cellen (dus niet op RBC’s) α1 + α2 => groeve waarin peptiden kunnen geladen worden β2-microglobuline geassocieerd met MHC-I Moleculaire structuur α-helices wijzen uit het blad => ertussen, rustend op β-sheet, ligt het peptide ingeklemd. Opmerking: α-keten van MHC-I ligt op chr.6, β2-microglobuline ligt op chr.15. Kan heel veel peptiden presenteren (specificiteit in TCR) MHC-II: op een beperkt aantal gespecialiseerde APC’s (macrofagen, dendritische cellen,B-lymfocyten) niet-covalent homodimeer van α en β keten Extra testen voor transplantatie: - Kruisproef: na serumtest 2 bloedstalen (donor-recipiënt) bij elkaar gieten => kijken of er geen agglutinatie optreedt. - Mixed Lymphocyte Reaction (MLR): WBC’s van de receptor bestralen (=doden), dan WBC’s van de donor toevoegen => als donor WBC’s (o.a. lymfocyten) de WBC’s van recipiënt als vreemd herkent => proliferatie van TH-cellen (exogene Ag’s) met D (HLA-gen) => MHC-II Ag-processing en Ag-presentatie: 2 routes: 1) endocytose exogene Ag’s; 2) via proteasomen (intracellulair) endogene Ag’s (virussen e.a) 1) Endogene Ag’s: virale eiwitten + sterk opgevouwen proteïnen uit de eiwitbiosynthese => in de cel gefragmenteerd! Moleculen worden geubiquitinileerd (ATP-afhankelijk) = targetsignaal voor proteasoom Werkt als moleculaire lat en genereert peptiden van 7 ± 2 AZ => 90% afgebroken, 10% gepresenteerd in de groeve van MHC-I moleculen. Er is een zekere structuurspecificiteit (vandaar de zovele MHC-varianten) Vorming van vesikels met MHC-I + peptide in het ER: membraan bevat TAP-1/2 om peptiden naar binnen te brengen naar golgi budding van vesikels met MHC-I + Ag aan luminale zijde => fusie met celmembraan => toont geladen peptiden aan TC-cellen. Interactie met T-cellen: 1) geëxposeerd deel van het lineair peptide bindt specifiek aan TCR 2) Specifieke T-cellen interageren met MHC-I moleculen = TC CD8+-cellen (doden de doelwit cel) => ageren tegen indringers/gevaren die zich IN de gastheercel bevinden. 2) Exogene Ag’s: - Indringers/gevaar van buiten de cel => eliminatie via fagocytose en endosomale weg. -Ook intracellulaire vesikels van het golgi-apparaat kunnen versmelten met lysosomen. -Vesikels ontstaan in het ER: MHC-II moleculen worden voorverpakt + uniek peptide: invariant chain (Ii) (om de α-helicale groeve van MHC-II open te houden) -> Fagocytose van exogene Ag’s => fusie fagosoom met lysosoom => FAGOLYSOSOOM (lysosoom: zure hydrolasen (cathepsines, thiol-en aspartaatproteasen) genereren peptiden met grote variabiliteit in lengte (9-15 residues) (↔moleculaire lat van het proteasoom)) -> fusie met vesikels met MHC-II peptidegroeve MHC-II o aan beide zijden open (cfr. MHCI) => grote variabiliteit aan eiwitfragmenten dragen. -> fusie met celmembraan => presentatie peptide-Ag aan T-cellen ! duidelijke specificiteit tussen peptide-TCR en MHC-II en T-cel: steeds CD4+ TH-cellen => geven helpersignaal aan B-cellen. ! Exogene Ag’s worden ook verwijderd door Ab’s (humorale immuniteit) => 2e helperformatie van TH-cellen! Samenwerking tussen MHC-I en MHC-II: Bv. virusbesmetting: - virus dringt binnen op gastheercel - virus intracellulair gerepliceerd via MHC-I (in gekernde cellen) TC-cellen activeren => antiviraal effect. - viruspartikels komen vrij in extracellulair milieu door APC gefagocyteerd via endosomale weg MHC-II presentatie activatie van TH-cellen (proliferatie en differentiatie) (hulp voor B-cellen die Ab’s produceren tegen de viruspartikels) ! Vooraleer deze vormen van adaptieve immuniteit optreden is er ook al eerstelijns-innate verdediging opgetreden (bv. interferonen) Toepassingen HLA-systeem in de diagnostiek: Bep. HLA-varianten geassocieerd met bepaalde ziekten! HLA-genen gebruiken als genetische merkers voor deze ziekten => uitgedrukt in RR (relatief risico) = patiënten met specifiek HLA X controles zonder dit HLA / patiënten zonder spec. HLA X controles zonder dit HLA. Bv.: Ankyloserende spondylarthritis: ontsteking van een ruggenwervel (groeit vast) => komt 90% meer voor bij mensen met de HLA-B27 variant Mechanisme: bepaalde lineaire peptiden van microben bootsen een lichaamseigen structuur na => associëren met MHC-antigenen en selecteren T-cellen die gaan proliferen tot autoreactieve lymfocyten => AUTO-IMMUUNZIEKTE! Opmerking: op chromosoom 1 liggen CD1-genen die coderen voor Ag-presenterende receptoren die sterker gelijken op MHC-I moleculen => presenteren glycolipiden-Ag’s => opgebouwd uit α1-α2-α3 Ig-vouw + β2- microglobuline( ~MHC-I) Dus: probleem voor XENOTRANSPLANTATIES (organen van dieren in de mens) => andere HLA-genen + andere glycosilering! CD1: Cluster of differentiation; op T-cellen; Lijkt op MHC-I; bindt op β2-microglobuline; presenteert glycolipiden Hoofdstuk: Overgevoeligheidsreacties: In de immunopathologie worden 2 groepen onderscheiden: 1) Te hevige werking + te snel tempo => collaterale schade (door cytokines en cellen) => overgevoeligheid (type I, type II, III en IV) => auto-immuunziekten 2) Te weinig activiteit => immunodeficiëntie (primair (bubble-boy) of verworven (HIV, aids)) 4 types overgevoeligheid: Type I-> III: humorale immuniteit, Type IV: celgebonden immuniteit 1) Type I overgevoeligheid: ALLERGIE Onmiddelijke allergische reactie (hyperacuut: < 15min.), tegen bepaalde Ag’s hier allergenen genoemd. Bv.: bijen/wespensteek: binnen 15 min. acute ontsteking: calor (lokale warmte), dolor (lokale pijn), rubor (lokale roodheid), tumor (lokale zwelling) en functio laesa (functieverlies) Wat gebeurt er?: Ab’s die een rol spelen zijn IgE’s: ontstaat uit een klasse switch van IgM, dus na vroeger contact met allergeen (anders geen acute reactie mogelijk) Atopisch: niet-plaatsgebonden (niet op plaats waar allergeen contact maakt met huid) IgE verschilt van IgG: extra constant domein in heavy chain: C4, meer glycosylering ( zwaarder: 180 kDa), verschil in S-S bruggen in het Fab-gedeelte (dat allergeen bindt), specifieke receptorbindingsplaatsen voor de Fcε-R (vnl. mastcellen) IgE-reactie is een secundaire immuunrespons: 1e blootstelling aan allergeen: klasse switch IgMIgE: memebraangebonden vorm t solubel => 2e blootstelling: IgE bindt allergeen => immuuncomplex bindt met hoge affiniteit aan FcεR op mastcellen (cytofiel voor mastcellen) = TRIGGERING => degranulatie: vrijzetting van histamine, leukotriënen, prostaglandines,… vasodilatatie, bronchoconstrictie, ontsteking,… astma, hooikoorts, atopisch eczeem. Welke cytokinen komen vrij?: IL-4, IL-5, IL-6 => B-cel: stijging IgE-productie IL-3 en IL-4 (Ig-klasse switch) => beenmerg + activatie innate cellen Chemokinen => WBC’s recruteren naar degranulatie plaats Klassieke mediator = histamine vasodilatatie=> daling BD, Bronchoconstrictie => gladdes spieren luchtwegen, GI-constrictie Oplossing: anti-histaminica: snel toedienen! Naast acute-fase, volgt een latere fase van inflammatie IgE in allergische patiënten: Normale IgE titer: < 250 ng/mL: korte T1/2, beschermt tegen wormen en parasieten, concentratie stijgt bij allergie Opsporen of iemand gevoelig is voor allergie => IgE-titers bepalen Wat bepaalt de hoeveelheid IgE?: genetisch + TH/Treg-cel werking - Ag toedienen aan controle patiënt IgE stijgt, bereikt hoogtepunt na 1,5 week, dan terug daling - Ag toedienen aan proefdier met thymectomie (geen thymus meer) IgE stijgt en blijft hoog! - Ag toedienen aan proefdier met thymectomie + Treg-cellen geven na 2 weken => daling IgElevels als respons op Treg Dus Treg-cellen regelen de allergische reactie (zorgt dat ze op tijd stopt) Waarom zijn sommige mensen allergisch? IgE-respons is afhankelijk van de dossis Ag + genetische samenstelling Bv.: bepaald type MHC = low responder Ag-geven => klasse switch naar IgG in plaats van IgE ! Ag geftactioneerd toedienen (verdelen over verschillende dosis) heeft geen effect ! vaccins: dosis respecteren! Bij low responders (genetisch) treedt geen allergische reactie op Bv.: High responders zelfde dosis Ag => klasse switch naar IgE en IgG => allergische reactie Genetisch risico In de populatie: ± 15% kans (bij gezonde ouders) 1 ouder allergisch => kind 30% kans (x2) 2 ouders allergisch => kind 50% kans => bepaalde HLA-genen geassocieerd met allergische reacties (bv. HLA-A1/B8) (HLA = humaan leukocyt antigen complex = term voor MHC in mensen) Genetische invloeden hebben effect op individuele productie van cytokinen (IL-4/5/9) => verschil in serum IgE Types mastcellen: Mucosale mastcel vs. bindweefsel mastcel Vnl. leukotriënen naast histmamine, Vnl. Prostaglandines naast histamine In GI- en long-mucosa Ca2+-afhankelijke degranulering daling BD => vochtopstapeling contractie gladde spieren darm (gevuld met vocht) => diarree Mastcel activatie: - FcεR –triggering: 1) Ag (IgE-complex, clustering FcεR) 2) Anti-IgE, anti-idiotype geven clustering van FcεR 3) Lectines: clustering van FcεR. Lectines: 2 bindingsplaatsen crosslinken (cluster) => degranulatie - Complement: C3a en C5a zijn anafylatoxines binden op GPCR degranulatie - Medicatie: calcium ionoforen, codeïne (hoestsiroop ↔ sinecod: geen codeïne), morfine,… Algemeen principe: Ca2+ -influx => degranulatie Diagnostiek: 1) Skin Prick Test: geringe dosis Ag intradermaal inspuiten => acuut verheven papil met rode zone (~netelrood) = “wheal en flare” : onderhuids oedeemvocht + rood worden = bij eerst read-out na 20min. 2e read out na 5u: reactie is weggetrokken: nog inflammatoir infiltraat aanwezig. 2) Patch Test: kleefpleister van 30x30cm op rug van de patiënt aanbrengen: bevat verschillende allergenen op bepaalde plaats + negatieve controle (bv. NaCl) => laten diffunderen in de huid => na 24u zachtjes verwijderen en rode zones zoeken. ! In het begin lokale reactie later verspreiding naar groter huidgebied Latere ontstekingsreactie ontstaat door recruteren van WBC’s (vnl. neutrofielen en eosinofiele granulocyten naar plaats van degranulatie) !! Bijna geen lymfocyten (zijn te traag) !! Veel voorkomende allergie is die voor huisstofmijt leeft van keratine van de huidschilfers => allergenen zijn de uitwerpselen van de huisstofmijt aangeduid als Der p1/4 (vglk. Notenallergie: Ara h1 h4, kattenallergie Fel d1d4) Behandeling: 1) Preventie: contact met allergenen vermijden bv. voor huisstofmijt: stofzuigen met filter < 1µM. Hoe pollen en insecten vermijden? = moeilijk! 2) Medicatie: - Cromoglicinezuur (bv. Lomudal, Na-cromoglycaat) - Anti-histaminica (bv. Zyrtec) - Glucocorticosteroïden (= breed spectrum van ontstekingsremmers) (↔mineralocorticosteroïden) 3) Desensitatietherapie: in gespecialiseerde centra of de ervaren huisarts allergeen inspuiten om de 11 dagen gedurende 6-tal sessies: op termijn wordt meer IgG dan IgE aangemaakt op contact Ag en verdwijnt de allergie ! Patiënt kan in shock gaan bij deze sessies!: voorzorgen nemen: patiënt informeren, mag niet met de auto komen, moet 20 minuten ter observatie blijven bij acute ongevallen: EPI-pen: adrenaline inspuiten 2) Type II overgevoeiligheid: Ab-afhankelijk, cytotoxiciteit: geen allergenen maar Ag’s (boosdoeners nu opp. gebonden) gebonden aan oppervlak van de cel IgG en IgM binden => immuuncomplex ter hoogte van de membraan complementactivatie via klassieke weg MAC op cellen met ovoldoende MIRL en cellen gaan kapot (lichaamseigen) => tragere reactie: uren tot 1 dag (snelheidsbepalende stap = klasse switch) Andere manier: neutrofiele granulocyt (of andere fagocyt) herkennen C3b op membraan van de targetcel => geraken gefrustreerd omdat ze deze reuze structuur niet kunnen fagocyteren => als “wraak” laten ze hun granule inhoud vrij => weefselbeschadiging Chematactische stimuli (bv. anafylatoxines die vrijkomen bij complementcascade) recruteren de WBC’s (o.a. neutrofiele granulocyten) => ontstekingsreacties Opmerking: “gefrustreerde fagocyt” normaal kan fagocyt met zijn Fc-R + C3b-R binden aan respectievelijk Fc-domein van het Ab en C3b op de microbe => fagocytose. MAAR: bij deze membraanvariant is dit niet mogelijk (te grote structuur) => degranulatie: extracellulaire enzymen breken de BM af => schade aan de cel Voorbeelden: 1) Transfuscie-accident: ABO-bloedgroepen: - verschillen in glycosylering op de RBC’s O = default, A = extra N-acetyl galactose, B = extra galactose per accident verkeerde transfusie geven. Bv. bloedgroep A krijgt bloed van B => anti-B lichamen zorgen voor haemolyse binnen 15minuten: deze reactie is snel omdat Ab’s al aanwezig zijn! (hevige koorts, lage rugpijn, gevoel van beklemming, nausea en braakneigingen (O2-tekort)) corticosteroïden geven! 2) Haemolytische ziekte van de pasgeborenen = Rhesus incompatibiliteit Rhesus factor is aanwezig op membraan RBC Stel: moeder is Rhesus negatief (Rh- : dd) en vader is Rhesus positief (Rh+ : Dd od DD) => kind is Rhesus positief => bij eerste zwangerschap geen probleem: kind zit beschermd in de baarmoeder en vruchtzak en IgM kan niet door placenta! MAAR: bij de bevalling wordt moeder geïmmuniseerd => klasse switch IgM IgG en IgG kan wel door placenta. DUS: volgende zwangershap met Rh+-baby => haemolyse leverzwelling, milt groeit,… door hepatomegalie daalt aantal stollingsfactoren Preventie: Rho-γ globulines tegen Rh-factor geven wanneer Rh- - moeder bevalt van Rh+ - kind (zeer snel) => Rho-γ bindt aan RBC van het kind die bij moeder zijn achtergebleven => haemolyse van deze RBC’s voor ze complementactivatie kunnen veroorzaken (en voor immunisatie wordt opgewekt) 3) Indirect Coomb’s test (diagnostisch): opsporen of iemand Ab’s heeft tegen Ag’s op oppervlak van RBC’s (onder microscoop RBC-reactie bekijken (agglutinatie of niet)) Agglutinatie = samenklitten van RBC’s omdat Ab’s 2 Fab-domeinen hebben en dus meerdere Ag’n op RBC’s kunnnen binden 4) Medicament overgevoeligheid: medicatie of metabolieten van de medicatie binden aan RBC-Ag’s => binding van Ab’s tegen medicament => vorming MEMBRAANGEBONDEN IMMUUNCOMPLEX complementactivatie zorgt voor lysis van RBC’s * Wat is het fenotype van haemolytische patiënten? hevige koorts, hypotensie, lage-rugpijn, gevoel van beklemming, braakneigingen 5) Acute Greffe Reactie: reeds circulerende Ab’s aanwezig tegen vreemde Ag’s op het donor-orgaan 6) Ziekte van Goodpasture: auto-immuunziekte: Ab’s tegen (=self-) nierglomerulus => opsporen met lineaire immunofluorescentie: Ab’s van serum van de patiënt fluorescent maken en laten binden aan de BM van een gezonde nier => fluorescent => positieve test Ziekte van Goodpasture: lineare IMF met antistoffen van patienten 7) Myasthenia Gravis = auto-immuunziekte: Ab’s tegen AchR ter hoogte van motorische eindplaat in de neuromusculaire junctie => complementactivatie => kapot Behandeling: Ach-esterase remmers geven algemeen: behandeling = PREVENTIE!! 4) Type III overgevoeligheid: immuuncomplex ziekte: IgM/IgG tegen Ag’s in oplossing (cfr. type II) => activatie van het complementsysteem 3 subcategorieën: a) Persisterende infectie: door microbieel Ag in geïnfecteerde organen => immuuncomplexen in de doelwitorganen (vaak daar waar de haemodynamiek de immuuncomplexen tegen het endotheel neerslaat (bv. nierglomeruli)) b) Auto-immuniteit: Self-Ag gaat ter hoogte van nieren, gewrichten, arteriën of huid complexvorming faciliteren c) Inhalatie van extrinsieke schimmels, plant- of dier Ag’s: immuuncomplexen gevormd die in de longen schade veroorzaken (bv. extrinsieke alveolitis) Voorbeelden: 1) Hepatitis B virus produceert “surface Ag’s” => Ab’s van de gastheer => vorming van immuuncomplexen => wordt door haemodynamiek tegen de wand van de arteries geslagen => arteritis (ontsteking van de arteries) 2) systemische lupus erythematosis Ab’s tegen eigen DNA 3) extrinsieke alveolitis Arteritis opsporen met immunofluorescentie met gemerkte IgM complexeert met Ag op bloedvatwand => arteritis Duivenmelkerslong => infiltratie van WBC (granulocyten tussen de alveolen) (extrinsieke alveolitis) Mechanisme: complementactivatie door circulerende Ag-Ab complexen => productie van vasoactieve amines door basofiele granulocyten en bloedplaatjes =>microthrombi in de kleine vaten door plaatjes agregatie => lokale vrijstelling van lysosomale enzymen meer schade aan BV-wand => nefritis en arteritis Serumziekte: lichaamsvreemd eiwit (Ag) in circulatie => na 1 week Ab’s hiertegen => vorming immuuncomplexen => nefritis en arteritis => Ag weg, enkel Ab’s blijven over. T1/2 van IgG = ± 21 dagen (cfr. IgE) complement breekt de complexen af + zolang complexen aanwezig zijn, is men ziek! Behandeling: vroeger: paarden immuniseren tegen het Ag => paardenserum geven aan patiënten. Probleem: Fc-domein van paarden Ab’s is vreemd! Deze serumtherpie kan men maar 1 keer doen! Arthus fenomeen: subcutaan of intradermaal Ag inspuiten => als er reeds circulerende Ab’s aanwezig zijn tegen het Ag zal er lokaal een snelle anti-inflammatoire respons optreden met roodheid en lichte zwelling (± 15 min.) Schade van Type III-reacties vooral in organen met hoge haemoconcentraties circulerende immuuncomplexen meer kans om met vaatwand in contact te komen ( bv. nier, choroïdplexussen, corpus ciliare, bifurcaties grote bloedvaten,…) Circulerende complexen opsporen (diagnose): centrifugeren van testserum met polyethyleenglycol (PEG) 5% => vrije Ab’s in oplossing en complexen zakken naar bodem complement bindingstest: gelabelde Ab’s tegen immuuncomplexen op C1q -complement Behandeling: anti-inflammatoire medicatie (corticosteroïden e.a.)+ serum? 5) Type IV cellulaire immuniteit: gesensitiseerde T-cellen Traag (minstens 12u nogid om tot stand te komen, zoals late reactie bij Type I) 3 soorten: a) contact dermatitis: (topische eczeem) 48-72u na blootstelling Ag b) Tubreculine reactie (48-72u) c) granulomateuze reactie (21-28dagen) => infiltratie van T-lymfocyten (celgemedieerd) => chronische ontsteking Wordt ook uitgestelde hypersensitiviteit genoemd! 1) Contact hypersensivisiteit: ter hoogte van de contactzone op de huid (topisch eczeem) Eerste contact immunisatie: hapteen wordt door Langerhanscellen van de huid (=dendritische APC’s) gecapteerd => presentatie in MHC-II groeve (TCR) => presentatie in lymfeklier (bv. oksel) => gesensitiviseerde T-cellen (proliferatie en diff. in verschillende types) Tweede contact cytokine-gemedieerde respons => infiltratie met T-cellen en macrofagen => rode, vesiculaire huiduitslag. Typisch tegen nikkel, cobalt, zink,… (sieraden) 2) Tuberculine reactie: Bv. subcutaan tuberculine inspuiten => lokale huid infiltratie DUS: solubele intra-dermale Ag’s (afkomstig uit micro-organismen): 1e blootstelling: dendritsche cellen als APC => sensitivatie van T-cellen (wordt geactiveerd: TH1/2/17-cellen) 2e blootstelling: T-cellen maken cytokines (IFN-γ, TNF-β) => macrofagen geactiveerd + epitheloïde cellen (ontstaan uit monocyten) => fusie tot “GIANT CELLS” => inflammatie na 48-72 u. (Topisch) Skin Test: testen of iemand ooit met tuberculine in contact is geweest en dus gesensitiseerde T-cellen draagt. Tb-Ag intra-dermaal inspuiten en 2 dagen wachten => DTH-reactie of niet? = MANTOUX TEST Rol lymfokines: = cytokines door lymfocyten geproduceerd => gesensitiseerde T-cel produceerd deze na Ag-contact => activatie macrofagen en andere inflammatoire cellen 3) Granulomateuse reactie: door persistentie van Ag’s ( na ± 3 weken) => epitheloïde cellen, fusionering van macrofagen tot Giant-cells, uitgesproken lymfocyten massa (uitzicht = granuloma) => later necrosis en fibrosis: Bv. Lepra: verheven, goed omrande zone die niet rood is (gefibrodeerd, in necrose => later afvallen) !! infiltraat met reuscellen, monocyten en lymfocyten, GEEN granulocyten!! Kan ook bij longen voorkomen (tuberculose, sarcoïdose). Steeds infiltraties (granulomen) met zelfde histopathologisch uitzicht reuscellen, lymfocytenkransen en epitheloïde cellen Hoofdstuk: Auto-Immuniteit AIZ 100x meer frequent dan primaire/verworven immuundeficiënties Bv. Hypothyroïdie: Ab’s aangemaakt tegen Thyreoglobuline (TG) !!!!! => niet gekleurde zwelling: geen acute, maar chronische ontsteking (inflammatoire cellen van de adaptieve immuniteit. Bv. lymfefollikels e.a. !!! Eigenschappen van Auto-immuniteit 1) Auto-reactiviteit is normaal: kunnen reageren tegen eigen Ag’s: Ag-processing en Ag-presentering is een proces dat peptiden gebruikt. Zowel eigen eiwitten als die van micro-organismen hebben dezelfde bouwstenen => niet-verwonderlijk dat er in het repertoire Ab’s en TCR’s paratopen (epitoop-bindingsplaatsen) zijn tegen SelfAg’s! Wat beschermt ons dan? a) Centrale tolerantie: bv.: T-cellen: in het beenmerg aangemaakt, dan naar Thymus waar ze hun merkers krijgen en waar TCR-diversiteit ontstaat (herschikkingen) Aantal specifieke cellen in de Thymus (bv. interdigiterende dendritische cellen) die MHC-Ag’s dragen geladen met “ Self-peptides” in de medulla! TCR reageert sterk met deze MHCmoleculen => T-cellen uitgeschakeld (apoptose) = NEGATIEVE SELECTIE TCR met lage affiniteit overleven en verlaten Thymus als CD4+ of CD8+ cellen = POSITIEVE SELECTIE ± 10% van alle T-cellen dat Thymus verlaat is auto-reactief. Dus bijkomende bescherming nodig. b) Perifere tolerantie: onvermogen van autoreactieve T-cellen om te reageren in de perifere weefsels. 10% is auto-reactief o.w.v: 1) geringe aantal receptoren, 2) slecht contact (lage affiniteit van de receptoren), 3) slechte communicatiesignalen, 4) afwezigheid van bepaalde Self-Ag’s in de thymus 2 perifere verdedigingsmechanismen: - Clonale anergie: afwezigheid van essentiële co-stimulatorische signalen: minstens 2 signalen nodig om T-cellen te activeren: TCR binding en CAM’s, cytokines,… (enkel bij infecties cytokines vrijgezet) - 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) Immunologische ignorantie: onresponsiviteit door afwezigheid van voldoende Agstimulus. T-cel verlaat Thymus, maar vindt zijn Ag niet waarop het zal reageren, omdat het verstopt zit achter anatomische barrières (bv. BBB, bloed-testisbarrière) Opmerking: naast MHC-restrictie (MHC I TC, MHC II TH), ook peptidemodificaties zoals glycopeptiden en glycolipiden! Alternatieve glycosylering kan TC/TH—cellen activeren en Ab-productie stimuleren! (zie rheuma) AIZ zijn multifactorieel: Nature (genetica) ↔ Nurture (omgeving (onderzoeken in tweelingstudies): voeding – microbioom (in kiemvrije proefdieren is het heel moeilijk om AIZ op te wekken => microbioom speelt een rol) Balans tussen proteasen en protease-inhibitoren: extracellulaire proteolyse (mag niet uit de hand lopen) (bv. MMP’s ↔ TIMP’s) REGA-model: Rest Epitopen Genereren Auto-immuniteit: natuurlijke, innate immuniteit is de basis voor het ontstaan van AIZ: monocyten, granulocyten, dendritische cellen (myeloïde cellen) maken proteasen en scheiden die extracellulair af genereren rest-epitopen die worden gefagocyteerd en gepresenteerd => genereert adaptieve immuunrespons tegen SelfAg’s Onder andere gelatinase-B (MMP-9) is protease: induceerbaar door infecties (bv. LPSTLR) => extracellulaire proteolyse Gelatinase-B klieft gedenatureerde collagenen Gelatinase-B klieft cytokinen en chemokinen Gelatinase-B klieft substraat in rest-epitopen Gelatinase-B is target enzyme in acute inflammatie en AIZ Opmerking: hier vooral gefocust op rol van gelatinase-B, maar andere proteasen hebben hetzelfde effect! Verdere intracellulaire vs. extracellulaire processing van Ag’s Bv.: hypothyroïdie: TG extracellulair afgebroken door proteasen systemische lupus, erythomatosis: Ab’s aangemaakt tegen SnRP’s (small nuclear ribonucleoproteins, splicing factoren), nodig in elke cel (intracellulaire processing) => sytemische AIZ Opmerking: ontdekking van auto-Ab’s in Hashimoto-serum => testserum met Ab’s van AIZpatiënt in proefbuis samen met TG, gescheiden door laagje Agar => Ab’s migreren naar TG en ontmoeten elkaar halfweg in de Agarose-oplossing en vormen immuuncomplexen Spectrum van AIZ: van orgaanspecifieke (Hashimoto hypothyroidie, pernicieuze anemie, Type I Diabetes,…) naar systemische (lupus erythomatosis, rheumatoïde arthritis,…) AIZ overlap tussen Auto-antilichamen! –vooral tussen orgaanspecifieke Ab’s, ook tussen systemische (nucleaire) en orgaan specifieke Ab’s Let ook op “mimicry” (andere mechanisme buiten REGA model): wanneer patiënten een virusinfectie doormaken, worden soms virale Ag’s gepresenteerd die sterk lijken op Self-Ag’s => T-cellen kunnen geactiveerd worden die ook gaan reageren op die bepaalde Self-Ag’s: verworven AIZ (bv. Ankyloserende Spondylitis) Ziekte van Basedow-Graves: hyperthyroïdie Ab’s tegen de TSH-receptor (opm: vrouwen 3x zoveel AIZ dan mannen omwille van endocriene redenen) => klasse-switch: IgG tegen TSH-R kan door de placenta!! ( CAVE!: zwangerschap!) Pernicieuze anemie: orgaanspecifieke AIZ (maag) Ab’s tegen intrinsieke factor (van Castle) bindt B12 voor opname in de darm => geen resorptie van B12 meer oplossing is intramusculaire injectie van B12 Ziekte van Goodpasture: Type-II overgevoeligheid –> zie eerder! !!! REGA-MODEL voor AIZ !!! = voorgesteld model voor de pathofysiologie van de vroege fase van AIZ (acute fase ↔ chronisch: T-cellen) Oorsprong van de ziekte? Etiologisch agens: bv. virus, bacterie, dubbelstrengig RNA,… => zet de ontsteking in gang: lokale aanmaak van primaire ziektebevorderende cytokinen (bv. IL-1, TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-17, IL-3,…) lokken de productie van secundaire cytokinen uit (bv. CCL’s, CXCL’s, MCP: monocyt chemotactisch proteïne, GCP: granulocyte chemotactisch proteïne,… ) => chemokinen die myeloïde cellen recruteren en stimuleren => !! eerst worden innate cellen zoals granulocyten en monocyten gerecruteerd!! (lymfocyten zijn trager) Er ontstaat een cytokinesoep die inwerkt op de lokale inflammatoire + de aangetrokken cellen => enzymcascade wordt in gang gezet: secretie van proteasen (bv. MMP’s, zoals gelatinase-B, granzymes,…) afbreken van cytokines + substraat eiwitten => ontstaan van immunogene restepitopen door extracellulaire proteolyse! door APC in contact met Tcellen (TH1 + TH17 => opnieuw cytokine release) => specifiek immuunsysteem getriggerd. ! Tegenwicht van anti-inflammatoire cytokines (bv. IL-10, IFN-α/β, IL-4, IL-6,…) => invloed op verschillende celtypes om protease-inhibitoren vrij te zetten (bv. TIMP’s, PAI’s,…) verantwoordelijk voor periodes van remissie (verminderd symptomen) => activatie van Treg en TH2-cellen die secretie van anti-inflammatoire cytokines bestendigen Opmerking: anti-inflammatoire cytokines + protease-inhibitoren als therapie in AIZ!! Multiple Sclerose: = inflammatoire demyeliniserende ziekte van het CZS => neurologische klachten en symptomen: paresthesieën in de ledematen, optische neuritis, verlamming !! ontsteking in het CZS leidt tot de ziekte!! (oorzaak nog steeds onbekend!!) 80% van de patiënten heeft Relapsing-Remitting MS (RR-MS) = periodes van opstoten (relaps) die daarna weer verdwijnen (remissie), maar nooit volledig weg! Pathofysiologie op moleculair niveau: bestuderen in muismodellen: Experimentele AutoImmune Encephalomyelitis opwekken in muizen door inspuiten van myeline component samen met adjuvans => EAE-muizen met chronische RR-MS (~mens) Bestuderen van deze modellen toont (niet-)specifieke immuunrespons in deze muizen: - verschijnen van Ig’s in het CSV -verhoogde expressie van MHC-moleculen -geactiveerde T-cellen tegen myeline oorzaak of gevolg van de ziekte? -cytokinen en proteasen => genereren van auto-antigenen waartegen T-cellen reageren (immunogene restepitopen)? Rol van proteasen: vrijgezet door geactiveerde microgliacellen (macrofagen van de hersenen) + geïnfiltreerde inflammatoire cellen => myelineschede afbreken Geïnfiltreerde inflammatoire cellen? Hoe komen deze door de BBB? BBB bevat 2BM: - endotheliale BM: kunnen bij ontsteking WBC’s doorlaten - eindvaatjes van de astrocyten niet-permeabel voor WBC’s => cuff tussen de 2 BM waarin WBC’s zich opstapelen (= Vascular Cuffing) Maar: lokale inflammatoire cellen + WBC’s in de cuff zullen degranuleren en proteasen vrijzetten die BBB afbreken en extracellulaire matrix afbreken (MMP’s) => migratie door BBB! PAI-1/2 inhibeert (Serpine) Vooral Gelatinase-B (MMP-9) bestudeerd: => product van een proteasecascade, geactiveerd door t-PA/u-PA vorming van plasmine uit plasminogeen vorming van collagenase uit Inhibitie door TIMP’s pro-collagenase vorming stromelysine uit pro-stromelysine Membraan-MMP zet constitutief pro-gelatinase-A om in Gelatinase-A => samen met stromelysine wordt pro-gelatinase-B omgezet in gelatinase-B! Aangetoond dat gelatinase-B aanwezig is bij EAE-muizen en MS-patiënten + NIET in gezonde controles! gelatinase-B in vergelijking met gelatinase-A veel groter en bevat suikers (glycoproteïne) in kiemvrije dieren is het heel moeilijk om EAE-muizen MS te laten krijgen (rol van het microbioom) gelatinase-B knock-out in EAE-muizen zorgt voor stijging survival en daling symptomen (dus protease inhibitoren kunnen therapeutisch zijn) MAAR gelatinas-B is niet enige factor (gelatinase-B geneest niet) gelatinase-B zou BM van de BBB kunnen afbreken (collageen en arterieel elastine wordt gekliefd) gelatinase-B klieft MBP (myelin based proteïn)= hoofdbestandeel menselijk myeline - Epitoopscanning: bij MS patiënten worden T-cellen aangemaakt tegen rest-epitopen bv. klieving van αB-crystalline door MMP-9 => minder crystalline, meer restepitopen, MAAR: welke restepitopen zijn immunogeen? => epitoopscanning! Crystalline werkt op zich beschermend tegen MS, restepitopen zijn schadelijk (activatie autoreactieve T-cellen) Opmerking: ontsteking die in de hersenen ontstaat is te vergelijken met perifeer acute ontstekingsreacties (rolling, adhesie, extravasatie o.i.v chemotactische factoren geproduceerd door microgliacellen) CAVE: MS-patiënten vaak behandeld met recombinant IFN-β (anti-inflammatoir) MAAR: E.Coli IFN-β wordt afgebroken door gelatinase-B => 1/30 maakt Ab’s tegen IFN-β op basis van de restepitopen! => AIZ geïnduceerd door de behandeling!!!!! OPLOSSING: patiënten met alternatief geglycosyleerd IFN-β behandelen (IFN-β-1a) => wordt niet afgebroken! Naar genezing? KO voor MMP-2 (gelatinase-A) in muizen => nog steeds ziek - KO voor MMP-9 (gelatinase-B) in muizen => nog steeds ziek - dubbel KO (MMP-2 en MMP-9) in muizen => niet meer ziek!!!! DUS: focussen op meer proteasen uitschakelen om symptomen te doen dalen!! Arthritis: = ontsteking van synoviaal slijmvlies van de gewrichten Onderscheid tussen acute vs. chronische fase van ontsteking Acuut: innate immuuncellen aangetrokken REGA-model Chronisch: na maanden evolutie: lymfocyten te zien + dendritische cellen met gelatinase-B => presenteren Ag’s en maken contact met T-cellen (eigenlijke AIZ, op basis van T-cellen) Pathofysiologie: Ontsteking stijging IL-1 + TNF-α: inductie van chemokines zoals IL-8 die neutrofielen aantrekken gewricht wordt etterig. Stijging IL-1 induceert ook proteasen. Door degranulatie van WBC’s wordt collagenase en gelatinase-B vrijgezet => denaturatie van de collageen II triple helix en neutrofiel collagenase (MMP-8) klieft op 1 plaats, zodat ¾ wordt afgesplitst => ontstaan van gelatine dat door gelatinase-B wordt gekliefd zodat restepitopen ontstaan => opgenomen door macrofagen/dendritische cellen => processing + Ag presentatie in MHC I => T-cel activatie! ! Positieve feedback op ontstekingsproces zorgt voor chronisch aspect van de ziekte ! geactiveerde T-cellen produceren cytokinen + IL-8 wordt gekliefd door gelatinase-B waardoor het 30x zo actief wordt! => veel schade aangericht! Muismodellen maken kip-collageen inspuiten = Collagen Induced Arthritis (CIA) Restepitopen in RA? => humaan collageen type II is een glycoproteïne triple helix wordt niet gekliefd gelatinase-B Enkel na denaturatie of klieving door collagenase (MMP-8) wordt collageen II gedegradeerd tot restepitopen door MMP-9 (= enkel bij ontsteking) MMP-1 is interstitieel collagenase dat samen met MMP-9 collageen II afbreekt MMP-8 = neutrofiel collagenase MMP-13 = collagenase-3 MMP-2 = gelatinase-A Rol van gelatinase-B in RA? => IL-8 (CXCL 8) induceert neutrofielen-influx naar synoviaal vocht. IL-8 stimuleert degranulatie van neutrofielen => secretie van MMP-8 en MMP-9 => pro-gelatinase-B gelatinase-B => degradatie collageen II (na bewerking door MMP-8) Restepitopen? => epitoopscanning van collageen II => tegen welke fragmentjes worden Tcellen geactiveerd? => 2 fragmentjes blijken immunodominant te zijn: OH-groep op Lys en Pro met hexose op => glycopeptiden: als suiker niet te groot is, kunnen deze door T-cellen herkend worden! CAVE: CIA kan ook gepaard gaan met Chondrodermatitis (1/105 patiënten) => AIZ die huid en kraakbeen aantast (oren en neus) => oren vallen af, neus valt af = enorm pijnlijk en met geen pijnstilling te verhelpen (hoge zelfmoord aantallen) => gelatinase-/- muizen hebben dit niet => therapie? Diabetes: Het gaat hier over Type I diabetes of Insuline-Afhankelijke Diabetes (Insulin Dependent Diabetes Mellitus) = AIZ: destructie van de eilandjes van Langerhans die de insuline-producerende en secreterende β-cellen bevatten. => β-cellen bevinden zich vooral aan de periferie van de pancreas, men spreekt ook wel van een “Peri-Insulitis” = lymfocyteninfiltratie aan de periferie Resultaat = hyperglycemie => te veel suikers in het bloed kunnen aanleiding geven tot het vormen van “AGE’s” = Advanced Glycation End-product = ver doorgedreven glycosylering van eiwitten die hierdoor vernietigd worden o.a. pancreas wordt aangedaan: AGE’s binden aan RAGE (Receptor voor AGE). O.a. hemoglobine kan een AGE worden o.i.v. hoge bloedsuikerspiegel! Rol van gelatinase-B: In beginnende pancreatitis beginnen neutrofiele granulocyten (geen lymfocyten) te infiltreren die gelatinase-B positief zijn (zit in hun granulen) acute pancreatitis: infiltratie van ontstekingscellen in exocriene pancreas met gelatinase-B chronische pancreatitis: ontstekingscellen hebben de exocriene pancreas kapot gemaakt (gefibroseerd) en ductulaire cellen maken nu gelatinase-B aan! ! Insuline wordt door β-cel in eilandjes uitgescheiden naar extracellulair, maar ook ductulaire cellen scheiden nu hun gelatinase-B uit naar extracellulair ! => gelatinase-B komt in contact met insuline => afbraak van insuline! Experimenteel bewijs: MMP-9 toevoegen doet insuline dalen + remmer van MMP-9 doet insuline weer stijgen REGA-model voor diabetes: Heel REGA-schema is te volgen in proces van pancreatitis diabetes Ook restepitopen? JA! Gelatinase-B klieft insuline => sommige restepitopen blijken immunodominant fagocytose door APC => presentatie in MHC II => respons van T-cellen! In proefdieren? => diabetes induceren met Streptozotocine => muismodel voor diabetes => gelatinase-B wordt ook geïnduceerd! ! Activatie van MMP-9 in pancreatitis: Pro-gelatinase-B Gelatinase-B Trypsinogeen (Gel-B = zymogeen) splitsing Pathofysiologie van pancreatitis: 1) Acuut: infiltratie van inflammatoire myeloïde cellen (neutrofielen o.a) => productie van gelatinase-B en andere proteasen die exocriene pancreas afbreken ( fibrose) + gelatinase-B begint insuline af te breken 2) Chronisch: exocriene pancreas gefibroseerd + ductulaire cellen maken gelatinase-B => Insuline Restepitopen Presentatie aan auto-reactieve TGelatinase-B cellen => diabetes en AIZ tegen eigen insuline Opmerking: Gelatinase-B breekt niet enkel insuline af (maar braakt vanalles af), bv. ook GAD (= glutamaat decarboxylase) => verschillende soorten restepitopen LUPUS: Systemische Lupus Erythomatosis: vlindervormige huiduitslag (o.a. op aangezicht) (vroeger werd gedacht dat deze mensen door een wolf gebeten waren => lupus) Meestal vrouwen getroffen (over algemeen voor alle AIZ) men maakt anti-SnRPs (splicing factoren), anti-DNA, anti-nucleair => tast veel weefsels aan (= systemisch) IMMUUNDEFICIËNTIES: Bv. geen thymus meer => geen T-cellen meer => geen hulp van B-cellen om Ab’s te maken => drastische daling van de adaptieve immuunrespons! Alarmtekens te herkennen bij 1e ID-ziekten: 1) Onvoldoende gewichtstoename (bij kind) zonder direct aanwijsbare reden 2) Chronische diarree; recidiverende darminfecties 3) > 7 infecties per jaar: van de bovenste LW met nood aan antibiotica (bv. sinusitis, otitis,…) 4) >= 2 pneumonieën per jaar of 1 pneumonie ten gevolge van een opportunistische infectie (bv. Aspergillus,…) 5) >1 ernstige infectie bv. osteomyelitis, sepsis (zonder aanwijsbare oorzaak), meningitis,… 6) Onvoldoende antwoord op antibiotica behandeling (langer dan 2 maanden) of herhaalde nood aan antibiotica IV per jaar 7) Ernstige recidiverende diepe abcessen (huid, lever) 8) Recidiverende gist- of schimmelinfecties 9) Vergrote milt en/of lever, klieren of lymfoïde hyperplasie van de darm zonder etiologie 10) 1 of meer familieleden met een 1e ID Bv.: defect in myeloperoxidase (MPO) dat in de granules van neutrofielen voorkomt => Chronische Granulomateuze Ziekte (behandelen met IFN-γ) ! CGZ ≠ granuloom! Type IV overgevoeligheid => chronische ontsteking waarbij IFN-γ wordt aangemaakt! Heel wat ID-ziekten zijn X-gebonden => tasten vooral mannen aan (cfr. AIZ vrouwen) Opmerking: Ook secundaire (2e) ID: verworven: bv. aids via HIV-virus, EBV (Epstein-Barr virus: B-cel transformatie) bv.: Bare-Lymfocyte Syndrome: defecte expressie van MHC II => geen APC meer! = geen hulp van TH-cellen meer Bv.: DiGeorge Syndroom: afname thymus: geen T-cellen meer => herkenning: oren laag geïnplanteerd, open verhemelte, veel infecties
