Snelle en betrouwbare analyse van de microbiologische

Snelle en betrouwbare analyse van de
microbiologische zwemwaterkwaliteit met qPCR
Bart Wullings, Leo Heijnen en Edwin Kardinaal
KWR Watercycle Research Institute, Nieuwegein
Inhoud
Microbiologische zwemwaterkwaliteit
qPCR voor snelle en betrouwbare analyses
• E. coli en enterococcen
• Source tracking: o.a. Bacteroides
• Cyanobacteriën (vervolg presentatie Miguel Dionisio Pires)
Conclusies
© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012
2
Europese richtlijn microbiologische zwemwaterkwaliteit
© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012
3
Monitoring zwemwaterkwaliteit
Reguliere monitoring fecale verontreiniging
•
•
•
•
Gestandaardiseerde ISO kweekmethoden
Monstername, analyse en rapportage duurt 2/3 dagen
Bij overschrijding opnieuw 2/3 dagen
Bij calamiteiten is sneller resultaat gewenst!
Monitoring Cyanobacteriën
• Fluoroproob en microscopische telling
• Metingen minder betrouwbaar, temperatuurgevoelig
(fluoroproob) en subjectief en duur (telling)
qPCR
Foto Waterproef
• Snel (<24 uur), betrouwbaar, objectief, reproduceerbaar en
goedkoop(er)
© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012
4
qPCR
• Eerste NEN norm voor qPCR Legionella pneumophila
© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012
5
qPCR voor monitoring fecale besmetting
Onderzoek in opdracht van RWS Waterdienst
In 2011 qPCR methoden voor E. coli en enterococcen
operationeel gemaakt in laboratorium
Eerste veldstudieresultaten zien er goed uit!
© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012
6
qPCR voor monitoring fecale besmetting
Andijk 2010, ente rococce n
C
o
n
ce
n
tra
tie
s(K
V
E+D
N
Ak
o
p
ië
n
/1
0
0m
l)
qPCR
kweek
grenswaarde 'uitstekend'
1,0E+06
1,0E+05
1,0E+04
1,0E+03
1,0E+02
1,0E+01
1,0E+00
11-6-2010
1-7-2010
21-7-2010
10-8-2010
30-8-2010
19-9-2010
Datum
Kleine Ze e tje 2010, E. coli
C
o
n
c
e
n
tra
tie
s(K
V
E+D
N
Ak
o
p
ië
n
/1
0
0m
l)
qPCR
kweek
grenswaarde 'uitstekend'
1,0E+06
1,0E+05
1,0E+04
1,0E+03
1,0E+02
1,0E+01
1,0E+00
11-6-2010
21-7-2010 - 12 juni
10-8-2010
© kwr 2012 - 1-7-2010
Genomics in het waterbeheer
2012
Datum
30-8-2010
19-9-2010
7
Bronopsporing fecale verontreiniging
Vraag:
Welke bronnen van fecale vervuiling?
Methode:
Aantonen van dier-specifieke darmbacteriën
(o.a. Bacteroides): onderzoek 2011/2012
© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012
8
Monitoring van potentieel toxische cyanobacteriën
met qPCR
Opdrachtgever: RWS Waterdienst
KWR (fycocyaninegen)
•
•
•
•
Bart Wullings
Daniëlle van de Linde
Lonneke Hensen
Edwin Kardinaal
Deltares (toxinegenen)
•
•
•
•
Miguel Dionisio Pires
Bas van der Zaan
Merel Collenteur
Jan Gerritse
© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012
9
qPCR voor 4 potentieel toxische geslachten van
Cyanobacteriën
Microcystis
Aphanizomenon
Planktothrix
Anabaena
© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012
10
Ontwikkeling van specifieke primers en probes
Onderzoek gestart in 2009
Doelgen is het fycocyanine operon (cpcBA)
• Uniek voor cyanobacteriën en grote collectie van “referentie”
sequenties beschikbaar in databases (totaal 1000 cpcBA sequenties)
• Microcystis en Planktothrix genus specifiek primers en probe
ontworpen
Geslachten Anabaena en Aphanizomenon zijn niet monofylogenetisch maar vermengd
• Discrepantie tussen morfologische en fylogenetische classificatie
• Sequenties kunnen worden geclusterd in 9 (Rajaniemi et al 2005) of
4 grotere clusters (dit onderzoek)
• Primers
en probes
ontworpen
deze 4 clusters (A,B,C,D)
11
© kwr 2012
- Genomics in
het waterbeheertegen
- 12 juni 2012
Correctiefactor qPCR naar celdichtheid
Genoomcopieen verklaring voor verschil telling versus qPCR
In literatuur is beschreven dat in cel van Cyanobacteriën wel
57 kopieën van genoom aanwezig kunnen zijn.
qPCR resultaten in literatuur in combinatie met celtelling
© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012
12
Veldstudie 2011
35 locaties
Ongeveer 7 bemonsteringen
Totaal 232 monsters
© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012
13
Resultaten veldstudie qPCR (correctie) en celtelling
Camping De Watermolen
Anabaena C
Aphanizomenon D
Microcystis
Planktotrix
Anabaena sp.
Aphanizomenon
Microcystis sp.
Planktothrix sp.
cellen / DNA ko p ie
aan tallen p er m l
1000000
100000
10000
1000
100
10
1
25
27
29
31
33
© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheerWeeknummers
- 12 juni 2012
35
37
39
14
Resultaten veldstudie qPCR (correctie) en celtelling
Bovenwater strand zeilplas
Anabaena C
Aphanizomenon D
Microcystis
Planktotrix
Anabaena sp.
Aphanizomenon
Microcystis sp.
Planktothrix sp.
cellen / DNA kopie
aantallen per ml
1000000
100000
10000
1000
100
10
1
25
27
29
31
33
Weeknummer
35
© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012
37
39
15
Discussie en conclusies
Q-PCR methoden beschikbaar voor het snel screenen van
potentieel toxische cyanobacteriën;
• Betere en snellere beoordeling van zwemwater op risico
cyanobacteriën met qPCR;
• Betrouwbaardere detectie van afzonderlijke vier genera;
• Grotere gevoeligheid waardoor proliferatie in vroeger stadium kan
worden aangetoond;
• Prijs per monster is lager dan voor microscopische telling
• Methoden klaar voor zwemseizoen 2012
• Implementatie van methoden in laboratoria gestart, nu het vervolg;
• Mogelijk uitbreiden van de methoden voor andere genera zoals
Woronichinia
/ Phormidium.
16
© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012
Veldstudie 2011
© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012
17
Stelling
1. qPCR methoden hebben de toekomst en moeten zo snel mogelijk
worden ingevoerd in het waterbeheer
© kwr 2012 - Genomics in het waterbeheer - 12 juni 2012
18