Chapter 2 - biosdocumenten

Samenvatting
Moleculaire biologie: Introductie
1
Definitie van moleculaire biologie
Moleculaire biologie is de stusie van de genstructuur en hun functie op moleculair niveau.
2
Chapter 2: The molecular structure of the genes
2.1 The molecular nature of the genes
De onderzoeken die mogelijk de structuur van de genen kon blootleggen begon in 1869. Minchester
isoleerde in dat jaar nucleï van witte bloedcellen. Hij ontdekte dat in de nucleï een niewe
fosforbevattende verbinding aanwezig was. Hij noemde deze stof nucleïne. Nucleïne bestaat
hoofdzakelijk uit chromatine, dat een complex is van DNA en chromosomale eiwitten.
Tegen het einde van de negentiende eeuw, werden zowel DNA als RNA gescheiden van de proteïnen
die hen bonden aan de cel, waardoor het mogelijk werd om verder chemische analyse te doen naar
deze nucleïnezuren.
Tgen 1930 was aangetoond dat RNA bestond uit een suiker (ribose), 4 basen en een fosfaatgroep en
dat DNA een andere suiker (deoxyribose) bevatte. Voor de rest bestaat het ook uit 4 verschillende
basen en een fosfaatgroep.
1
Griffith’s experiment
Griffith legde de fundamenten voor de identificatie van DNA als het genetisch materiaal. Hiervoor
transformeerde hij S.pneumoniae. Het wild type is een sferische cel die wordt omgeven door een
slijmlaag, capsule genaamd. De cellen vormen gladde kolonies (S). Deze cellen zijn virulent, ze
kunnen een dodelijke infectie veroorzaken als ze in muizen worden ingespoten. Van deze bacterie
species bestaat een zekere mutant die niet virulent is. Als deze wordt opgekweekt, dan lijdt dit tot
ruwe kolonies.
De belangrijkste onrdekking van Griffith was, dat dode virulente stammen, de niet virulente stammen
konden transformeren naar virulente stammen. Zowel de gedode virulente stammen als de avirulente
stammen konden op zichzelf zorgen dat de muizen stierven. Samen waren ze echter dodelijk. Dit wil
zeggen dat de avirulente stamen op een bepaalde manier het gen voor virulentie hebben opgenomen.
Dit wil dus zeggen dat het transformerende agens in de gedode acteriën het gen zelf is, dat
verantwoordelijk is voor virulentie. Het enigewat men niet wist was welk molecule het
transformerende agens is.
DNA: the transforming material
Avery, MacLeod en McCarthy leverde het missende element, van wat het transformerende agens was.
Zij voerde hiervoor eenzelfde transformatie test uit als Griffith. Om na te gaan welke moleculen
verantwoordelijk was voor de transformatie deden zij volgende zaken. Zij verwijderden de proteïnen
via een extractie. Het mengsel kon nog steeds zorgen voor transformatie. Dan voerden zij
verschillende enzymatische reacties uit. In een eerste reactie voegde zij chemotrypsine en trypsine toe
om de overgebleven proteïnen te vernietigen. Het mengsel was nog steeds in staat om te
transformeren. Hierna voegde zij ribonuclease toe, een enzym dat RNA afbreekt. Het mengsel zorgde
nog steeds voor transformatie, wat RNA en de proteïnen uitsloot als transformerend agens. In laatste
fase voegde zij deoxyribonuclease toe, dat DNA afbreekt. Vanaf dan kon het mengsel geen
transformatie meer geven. Uit deze resultaten trokken zij de conclusie dat DNA de gentische code
moest bevatten.
De directe fysisch/chemische analyse ondersteunde de hypothese dat het gezuiverde transformerend
agens DNA is. Volgende methoden gebruikte zij:

Ultracentrifugatie: Dit gebruikte zij om de molecuaire massa te bepalen van het
transformerend agens. Het transformerend agens sedimenteerde zeer snel, wat een hoge
moleculaire massa suggereert, die typisch is vor DNA.
2



Electroforese: Zij plaatse het transformerend agens in een elektrisch veld om na te gaan hoe
snel het hierin beweegt. De mobiliteit van het agens was relatief hoog, wat ook karakteristiek
is voor DNA (heeft een m/z ratio).
UV spectrometrie: Het absorptie spectrum van het transformerend agens komt overeen met dat
van DNA.
Elementaire chemische analyse: Dit leverde een N/P ratio van 1,67 op. Dit is dezelfde N/P
ratio als die van DNA, dat rijk is aan fosfor en stikstof. Voor proteïnen is deze veel te laag,
aangezien dit enkel rijk is aan stikstof. Zelfs een kleine contaminatie met proteïnen zou de N/P
ratio hebben doen stijgen.
Wanneer Watson en Crick het dubbele helix model in 1953 publiceerde, waren de meeste genetici het
erover eens dat de genen waren opgebouwd uit DNA. Volgende bewijzen hebben er onder andere voor
gezorgd dat dit werd geloofd. In 1950 toonde Chargaff aan dat de basen in het DNA niet in gelijke
proporties voorkwamen, zoals eerder bewijs suggereerden, en dat de basecompositie verschilde van
soort tot soort. Dit is iets wat men zou verwachten van genetisch materiaal.
In 1952 leverde Hersley en Chase nog extra bewijs dat DNA het genetisch materiaal was. Dit deden ze
met behulp van volgend experiment:
Zij gebruikte de bacteriofaag T2 die E.coli infecteert. Gedurende de infectie worden de genen van het
virus in de gastheer gebracht zodat deze het metabolisme van de cel kunnen overnemen. Een
bacteriofaag is opgebouwd uit DNA en uit proteïnen. De vraag die nu reist is welk van beide dringt de
cel binnen. Uit het onderzoek blijkt dat hoofdzakelijk het DNA de cel binnendringt. Natuurlijk was het
bewijs niet ondubbelzinnig.
Het hersley en Chase experiment werd uitgevoerd door het DNA te labelen met 32P (niet aanwezig in
proteïnen) en 35S (niet aanwezig in DNA).
Ze lieten het genetisch materiaal de cel indringen en verwijderden dan de lege faag omhulsels. Omdat
ze wisten dat de genen de cel moesten binnendringen, was hun vraag of 32P of 35S de cel was
binnengedrongen. Als eerder is vermeld was het hoofdzakelijk 32P.
The chemical Nature of polynucleotides
DNA is opgebouwd uit stikstofbevattende basen, fosfaat en de suiker deoxyribose. RNA is
opgebouwd uit stikstofstofbevattende basen, fosfaat en de suiker ribose. De basen aanwezig in DNA
3
zijn adenine (A), Cytosine (C), guanine (G) en thymine (T). RNA bevat dezelfde basen, op T na die
vervangen is door Uracyl (U). A en G zijn gerateerd aan purine en worden daarom de purines
genoemd. C, T en U zijn verwant aan pyrimidine en worden daarom de pyrimidines genoemd.
Figuur 1: De chemische structuur van de DNA en RNA basen
In onderstaande figuur zijn de structuren van de suikers van RNA en DNA weergegeven. Zij
verschillen enkel op de 2’ positie van elkaar. Ribose heeft hier een OH groep, terwijl deze in
deoxyribose is vervangen door een H-atoom.
Figuur 2: De structuur van ribose en deoxyribose
De Basen en de suikers zijn in RNA en DNA met elkaar verbonden in eenheden die nucleosiden
worden genoemd. De namen van de nucleosiden zijn afgeleid van de corresponderende basen:
Base
Adenine
Guanine
Cytosine
Uracil
Thymine
Ribonucleoside
Adenosine
Guanosine
Cytidine
Uridine
-
Deoxyribonucleoside
Deoxyadenosine
Deoxyguanosine
Deoxycytidine
Deoxythymidine
De subeenheden van DNA en RNA worden nucleotiden genoemd. Dit zijn nucleosiden waar via een
esterbinding een fosfaatgroep is gekoppeld aan de 5’ OH groep. De nucleotiden worden met elkaar
verbonden via een fosfodiësterbinding.
4
Figuur 3: de structuur van nucleotiden
Polynucleotides and polarity
Figuur 4: polynucleotiden en polariteit
5
2.2 DNA structure
Rosalind Franklin voerde X-stralen kristallografie uit op DNA. Haar data suggereerden dat de DNA
keten een helix structuur heeft. Haar data gaven ook indicatie dat de structuur regelmatig en herhalend
was. Dit iis echter paradoxaal, want als DNA het genetisch materiaal is, dan heeft het namelijk een
onregelmatige sequentie.
Watson en Crick zagen hoe deze paradox opgelost kon worden: DNA moest een dubbele helix zijn,
waarvan de suiker-fosfaat backbone aan de buitenzijde ligt en de basen aan de binnenzijde van de
helix. De basen moesten paren. Hierbij paart altijd een purine van één keten met een pyrimidine van
een andere keten. Op deze manier is de helix uniform.
Figuur 5: De DNA dubbele helix structuur
Hierbij werd ook voldaan aan Chargaff’s regel dat de hoeveelheid A gelijk was aan de hoeveelheid T
en dat de hoeveelheid C gelijk is aan de hoeveelheid G.
Uit hun observaties blijkt dat de vorm van de A-T baseparen bijna gelijk is met die van G-C
baseparen. Hieruit vormde zij het postulaat dat A altijd met T en G altijd met C een basepaar vormt.
Dit zorgt ervoor dat het dubbelstrengig DNA uniform is.
De plaats tussen de basenparen bedraagt 3,4 Å en de grote van een helixwinding bedraagt 34 Å, wat
betekent dat er 10 bp per helixwinding aanwezig zijn. De ketens zijn antiparallel.
2.3 Physical chemistry of nucleïc acids
De structuur van DNA die wordt voorgesteld door Watson en Crick vertegenwoordigde de structuur
van het natriumzout van DNA in een vezel, die geproduceerd is bij een zeer hoge relatieve vochtigheid
(92%). Deze wordt de B vorm van DNA genoemd. Alhoewel het dicht in de buurt komt van de
werkelijke structuur van het meeste DNA in de cel, is het niet de enige mogelijke conformatie. Als de
relatieve vochtigheid daalt tot 75%, dan gaat het Na-zout van DNA over naar de A-vorm. Deze
6
verschilt van de B vorm in verschillende aspecten. Het meest belangrijke verschil is dat de baseparen
niet meet loodrecht staan op de as van de helix, maar 20° gedraaid is. In de A vorm zijn er 17 bp per
helixwinding en elke winding heeft een grootte van 24,6 Å. Zowel de A als de B vorm zijn
rechtsdraaiend.
De derde structuur wordt Z-DNA genoemd. Deze heeft een zigzaggend patroon.
Figuur 6: De verschillende DNA structuren
7
Separating the two strands of a DNA double
helix
Hoewel de verhouding G:C en A/T constant zijn
in een bepaald organisme, varieert dit toch tussen
verschillende organismen. De waarden variëren
tussen 22 en 73% GC –gehalte. Deze verschillen
worden waargenomen door verschillen in fysische
eigenschappen.
Als een DNA oplossing voldoende wordt
verwarmd, dan zullen de waterstofbruggen tussen
de twee ketens verzwakken en uiteindelijk
verbroken worden. Dit proces wordt DNA
denaturatie of smelten genoemd. De temperatuur
waarbij de helft van de waterstofbruggen
verbroken is wordt Tm of de smelttemperatuur
genoemd. Onderstaande curve geeft een
smeltcurve van DNA weer. De hoeveelheid
denaturatie wordt gemeten door UV absorptie bij
260 nm. Nucleïnezuren absorberen bij deze
golflengte licht door de elektronenstructuur van de
basen. Als er baseparing optreedt, dan een deel
van de absorptie gequenched. Als de twee strengen
worden gescheiden, dan vervalt dit effect en zal de
absorptie met 30-40% toenemen. Dit wordt een
hyperchromische shift genoemd. Bij de
temperatuur waarbij de helft van de
hyperchromische shift wordt bereikt is Tm.
Figuur 7: Smeltcurve van DNA
Het GC gehalte heeft een belangrijke invloed op Tm. Hoe hoger dit gehalte, hoe hoger Tm. De reden
hiervoor is dat er 3 H-bruggen gevormd worden tussen G en C en slechts 2 tussen A en T. Tijdens
denaturatie worden deze H-bruggen verbroken.
8
Figuur 8: relatie tussen GC gehalte en Tm
Verwarmen is niet de enige methode om DNA te smelten. Andere methoden zijn het toevoegen van
organische solventen zoals DMSO (dimethyl sulfoxide) en formamide, de pH te verhogen, het
toevoegen van chaotropen (bv ureum, zij vernietigen de waterstructuur) of de zoutconcentratie te
verlagen (negatieve ladingen worden niet van elkaar afgeschermd → repulsie).
Het GC gehalte heeft ook een invloed op de dichtheid van het DNA. Onderstaande figuur toont het
recht evenredige verband tussen GC% en de dichtheid van DNA. De reden hiervoor is dat G en C een
kleiner molair volume hebben dan A en T.
9
Reuniting the separated DNA strands
Als de twee DNA ketens van elkaar gescheiden zijn, dan kunnen zij onder de juiste condities terug bij
elkaar komen. Dit proces wordt renaturatie of annealing genoemd. Volgende factoren hebben een
invloed op dit proces:



Temperatuur: Voor renaturatie is de beste temperatuur 25°C onder Tm. Deze temperatuur is
laag genoeg om geen promotie meer te hebben voor denaturatie, maar hoog genoeg om een
snelle diffusie te bekomen en om de binding tussen mismatchete sequenties te verzwakken.
Indien een mengsel zeer snel wordt afgekoeld, dan zal er geen renaturatie kunnen optreden.
DNA concentratie: Binnen bepaalde grenzen zal bij een stijgende DNA concentratie de kans
op renaturatie groter worden, daar de kans op het tegenkomen van de complementaire streng
groter wordt.
Renaturatie tijd: Hoe langer de renaturatieprocedure wordt aangehouden, des te meer het zal
gebeuren.
10
Hybridization of two different polynucleotide chains
Het is ook mogelijk om andere ketens, dan complementaire ketens te laten renatureren. Bijvoorbeeld
DNA kan men laten renatureren me RNA. Deze techniek wordt hybridisatie genoemd. Dit is een
techniek met vele toepassingen zoals northern blotting, S& mapping, Microarrays, FISH, …
11
DNAs of various sizes and shapes
DNA grootte wordt weergegeven op drie verschillende manieren: moleculair gewicht (in Da), het
aantal baseparen (bp, kb, Mb), en de lengte (Å). Al deze eenheden staan met elkaar in verband. 1 één
helixwinding (33,2 Å) zijn er 10,4 bp aanwezig. Om het aantal bp om te zetten naar moleculair
gewicht wordt het aantal bp vermenigvuldigd met 660.
lDNA =
# bp
× 3, 32Å
10, 4
Hoe kunnen we de grootte en de vorm van DNA bepalen. Voor kleine DNA moleculen is dit vrij
makkelijk. De vorm kan bepaald worden door het te bekijken met behulp van een
elektronenmicroscoop. Om DNA hiermee te kunnen bekijken is het noodzakelijk dat het DNA
elektronen stopt. Dit kan bewerkstelligd worden door shadowing toe te passen. Dit wordt gedaan door
het DNA te behandelen met een zwaar metaal zoals Pt. Om dit te doen wordt het DNA staal gedurende
5 minuten gebombardeerd met metaal, dat zich zal opstapelen rond het DNA.
De grootte van DNA kan geschat worden met behulp van gelelektroforese.
The relationship between DNA size and genetic capacity



E.coli Chromosoom:
o 4.639.695 bp
o ~ 4200 genen die coderen voor proteïnen
Faag λ
o 48502 bp
o ~ 44 proteïne coderende genen
Faag ϕx174
o 5375 bp
o ~ 5 proteïne coderende genen
12
DNA content and the C-value paradox
Je zou verwachten dat complexere organismen meer genen nodig heeft dan een minder complex
organisme. Daardoor zouden zij een hogere C-waarde, of DNA hoeveelheid per haploïde cel moeten
hebben. In het algemeen klopt dit wel, maar niet altijd. Zo heeft een kikker 7x meer DNA dan de
mens. Dit wordt de C-waarde paradox genoemd. Een verklaring hiervoor is dat deze organismen veel
DNA sequenties hebben die niet coderen voor proteïnen.
13