De impact van oceaanverzuring in combinatie met chemische stress

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2010-2011
De impact van oceaanverzuring in combinatie met
chemische stress door koper op Mytilus edulis
Jolijn Boumon
Promotor: Prof. Dr. ir. Karel De Schamphelaere
Copromotor: Prof. Dr. Colin Janssen
Tutoren: Michiel Claessens en Dr. ir. Michiel Vandegehuchte
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master in de Bio-ingenieurswetenschappen: Milieutechnologie
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2010-2011
De impact van oceaanverzuring in combinatie met
chemische stress door koper op Mytilus edulis
Jolijn Boumon
Promotor: Prof. Dr. ir. Karel De Schamphelaere
Copromotor: Prof. Dr. Colin Janssen
Tutoren: Michiel Claessens en Dr. ir. Michiel Vandegehuchte
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master in de Bio-ingenieurswetenschappen: Milieutechnologie
De auteur en de promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de
beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron
te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.
The author and supervisors give the permission to use this thesis for consultation and to
copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more
specifically the source must be extensively specified when using from this thesis.
Gent, 25 augustus 2011
De auteur,
Jolijn Boumon
De promotoren,
Prof. Dr. ir. Karel De Schamphelaere
Prof. Dr. Colin Janssen
While you are experimenting, do not remain content with the surface of things. Don’t
become a mere recorder of facts, but try to penetrate the mystery of their origin.
Ivan Pavlov
Woord vooraf
Met het schrijven van dit woord vooraf sluit ik een intensief en boeiend thesisjaar af. Bij
deze wil ik een aantal personen bedanken die mij tijdens het voorbije jaar bijgestaan hebben
met raad en daad.
In de eerste plaats wil ik mijn dank betuigen aan mijn promotoren Prof. Dr. ir. Karel De
Schamphelaere en Prof. Dr. Colin Janssen om mij de kans te geven dit onderzoek binnen hun
vakgroep te verrichten. Professor De Schamphelaere, bedankt om kostbare tijd vrij te maken
om mij te begeleiden doorheen het hele proces. Dank ook om uw kennis met mij te delen en
een oplossing te zoeken indien iets voor mij op het eerste zicht ‘vrij onmogelijk’ leek. Professor Janssen wil ik bedanken voor zijn goede raad en zijn kritische inbreng in mijn thesis.
Uw aanstekelijk enthousiasme en passie voor het wetenschappelijk onderzoek verbazen me
telkens weer.
Michiel Vandegehuchte en Michiel Claessens ben ik dankbaar voor hun praktische begeleiding in het labo bij respectievelijk mijn experimenten met mossellarven en adulte mosselen.
Bedankt om telkens weer gewillig naar mijn vragen en problemen te luisteren en oplossingen
te bieden. Daarnaast waardeer ik ook ten zeerste de hulp van alle andere mensen in het
labo. Nancy, bedankt voor de hulp met de CO2 -doorborreling, voor het uitvoeren van de eiwitanalyses en nog zoveel meer. Dank ook aan Emmy voor de analyses van mijn DOC-stalen.
Verder gaat mijn dank uit naar Nancy Nevejan van het Laboratorium voor Aquacultuur voor
het ter beschikking stellen van de oesterlarven, de mariene algen en het gefilterde zeewater.
Ook de tips & tricks voor de omgang met mosselen waren zeer handig.
Mijn mede-thesisstudenten wil ik bedanken om er een fijne tijd van te maken in de duistere
Plateaukelders. Tu, merci voor de hulp bij het wassen van de aquariums, voor het gezelschap
in de frigo en voor de plezante babbeltjes tussendoor.
Mijn maatjes Elke en Lien dank ik om op gepaste tijden te zorgen voor een dosis relativering
en ontspanning. Ook de hulp bij Latex was meer dan welkom. Dankuwel voor de aanmoediv
gingen op moeilijke momenten en om er in het algemeen een onvergetelijke studententijd van
te maken. Elke, bedankt ook voor de praktische steun in het labo op kritieke momenten én
voor de chocolade op een eenzame kerstavond tussen de mosselen. En Lien, ik moet nog iets
bekennen: ik ga je écht keihard missen de komende zes maanden.
Tot slot wil ik mijn ouders en zus bedanken om mijn geklaag en gezaag het voorbije jaar
geduldig te aanhoren en voor de liters rijstpap, vanillepudding en chocoladecrème die ik naar
binnen gewerkt heb. Bedankt om mij de kans te geven deze studie te volbrengen en voor
jullie onvoorwaardelijke steun.
Jolijn Boumon
Zottegem, 22 augustus 2011
Lijst van afkortingen
ANOVA
ATP
BSA
CEA
cPLA2
DIC
DMSO
DOC
EC50
EPOCA
ETS
INT
IPCC
LMS
LOEC
NOEC
NPOC
NRR
PAK
pCO2
PMCA
POP
PVP
TA
TCA
TRIS
Analysis Of Variance
Adenosinetrifosfaat
Bovine Serum Albumine
Cellular Energy Allocation
Ca2+ Afhankelijk Cytosolisch Fosfolipase A2
Dissolved Inorganic Carbon
Dimethylsulfoxide
Dissolved Organic Carbon
Median Concentration of 50% Effect
European Project on Ocean Acidification
Electron Transport System
P-iodonitrotetrazolium
Intergovernmental Panel on Climate Change
Lysosomal Membrane Stability
Lowest Observed Effect Concentration
No Observed Effect Concentration
Non-Purgeable Organic Carbon
Neutral Red Retention
Polycyclische Aromatische Koolwaterstoffen
Partieeldruk van CO2
Plasmamembraan Ca2+ -ATPase
Persistente Organische Polluenten
Polyvinylpyrrolidone
Total Alkalinity
Trichloorazijnzuur
2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol
vii
Samenvatting
Oceaanverzuring is het proces waarbij de oceaan zuurder wordt als gevolg van de opname
van CO2 uit de atmosfeer. Er wordt verwacht dat de atmosferische CO2 -concentratie zal
stijgen van het huidige niveau van 380 ppm tot een concentratie van 750 ppm in het jaar
2100. Daardoor zal het carbonaatsysteem van de oceaan grondig wijzigen en zullen diverse
mariene ecosystemen nadelig beı̈nvloed worden. Voor mariene mosselen werden er reeds effecten door oceaanverzuring geobserveerd op de groei, de calcificatie, de zuur-base balans,
het immuunsysteem en de larvale ontwikkeling.
Chemische stress door zware metalen zoals koper vormt een andere bedreiging voor het
mariene leven. De toxiciteit van de metalen wordt grotendeels bepaald door de biobeschikbaarheid en de speciatie ervan. Er wordt verwacht dat de toxiciteit van koper zal wijzigen
onder condities van oceaanverzuring. Het doel van deze thesis is de invloed van oceaanverzuring, verontreiniging door koper en een combinatie van beide stressoren op de mariene mossel
Mytilus edulis in kaart te brengen.
Er werden eerst twee technieken uitgeprobeerd om het carbonaatsysteem te manipuleren en
de verwachte condities van oceaanverzuring te realiseren. De doorborreling van zeewater met
CO2 -gas bleek in praktijk moeilijk uitvoerbaar op kleine laboschaal en werd daarom verder
niet toegepast. Door additie van HCO−
3 en HCl aan zeewater konden de veranderingen in
het carbonaatsysteem wel nauwkeurig nagebootst worden. Deze techniek werd gebruikt bij
de oceaanverzuringsexperimenten met de larvale stadia.
Daarna werden adulte mosselen gedurende 14 dagen blootgesteld aan een range van koperconcentraties. Het effect van de koperstress op de mosselen werd gekwantificeerd met behulp van
twee cellulaire biomarkers, namelijk Cellular Energy Allocation (CEA) en Lysosomal Membrane Stability (LMS). Door analyse van het energiebudget van de mossel met CEA werd een
reductie in de energiereserves onder de vorm van proteı̈nen en koolhydraten waargenomen bij
32 en 100 µg Cu L−1 . Aan de hand van de biomarker LMS werd een destabilisatie van de
lysosomale membranen geobserveerd bij mosselen die blootgesteld werden aan 100 µg Cu L−1 .
ix
Vervolgens werden experimenten uitgevoerd met pas bevruchte embryo’s van de mossel
Mytilus edulis. Eerst werden daarvoor de methoden voor de spawning, de bevruchting en
de incubatie van de larven geoptimaliseerd. De larvale stadia werden op basis van deze
geoptimaliseerde methoden gedurende 48 h blootgesteld aan condities van oceaanverzuring,
aan koperstress en aan een combinatie van beide stressoren. Er werd een aantal eindpunten
bepaald en de koperspeciatie werd berekend. Blootstelling aan oceaanverzuring veroorzaakte
geen verandering voor het eindpunt mortaliteit maar resulteerde wel in een stijging van het
gehalte aan abnormale en onvolledig ontwikkelde larven. Koperstress veroorzaakte zowel een
effect op de mortaliteit als op de normaliteit. Vervolgens werd de hypothese getest dat koper
meer toxisch is onder condities van oceaanverzuring. Voor het eindpunt mortaliteit werd deze
hypothese bevestigd maar voor het eindpunt normaliteit niet.
Als conclusie kan gesteld worden dat zowel oceaanverzuring als koperstress schadelijke impacten veroorzaakten op de mossel Mytilus edulis. Onder de omstandigheden van oceaanverzuring werd de toxiciteit van koper wel degelijk gewijzigd, zij het niet altijd zoals verwacht.
Verder onderzoek is noodzakelijk om de exacte mechanismen te ontrafelen.
Inhoudsopgave
Inleiding
1
1 Literatuurstudie
3
1.1
Het carbonaatsysteem in de oceaan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
1.2
Testorganisme: Mytilus edulis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
1.2.1
Voorkomen en classificatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
1.2.2
Reproductie, morfologie en fysiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
1.2.3
Mytilus edulis als testorganisme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
Effecten en mechanismen van oceaanverzuring . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
1.3.1
Algemeen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
1.3.2
Invloed op de groei . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
1.3.3
Invloed op de calcificatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
1.3.4
Invloed op de zuur-base balans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10
1.3.5
Invloed op het immuunsysteem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12
1.3.6
Invloed op de reproductie en de larvale ontwikkeling . . . . . . . . . .
12
Effecten en mechanismen van chemische koperstress . . . . . . . . . . . . . .
13
1.4.1
Belang, voorkomen en bronnen van koper . . . . . . . . . . . . . . . .
13
1.4.2
Biobeschikbaarheid en speciatie van koper . . . . . . . . . . . . . . . .
14
1.4.3
Opname en accumulatie van koper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
1.4.4
Effecten en mechanismen van kopertoxiciteit . . . . . . . . . . . . . .
15
Gecombineerde effecten van oceaanverzuring en koperstress . . . . . . . . . .
18
1.3
1.4
1.5
2 Materiaal en methoden
21
2.1
Analysetechniek voor totale alkaliniteit in zeewater . . . . . . . . . . . . . . .
21
2.2
Analysetechniek voor pH in zeewater . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
2.3
Methoden ter manipulatie van het carbonaatsysteem . . . . . . . . . . . . . .
22
2.3.1
23
2.3.2
2.4
Doorborreling met CO2 -gas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Additie van
HCO−
3
en HCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
23
Blootstelling van adulte mosselen aan koperstress . . . . . . . . . . . . . . . .
26
2.4.1
26
Experimenteel design . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
xi
2.4.2 Analyse en berekening van de waterkwaliteitsparameters . . . . . . . .
2.4.3 Analyses aan de hand van biomarkers . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Blootstelling larven aan koperstress en oceaanverzuring . . . . . . . . . . . .
2.5.1 Blootstelling van oesterlarven aan koperstress . . . . . . . . . . . . . .
2.5.2 Optimalisatie van spawning en bevruchting bij de mossel Mytilus edulis
2.5.3 Optimalisatie van de larventest met de mossel Mytilus edulis . . . . .
2.5.4 Blootstelling van mossellarven aan koperstress in combinatie met oceaanverzuring . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
27
34
34
35
37
3 Resultaten en discussie
3.1 Analysetechniek voor totale alkaliniteit in zeewater . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Methoden ter manipulatie van het carbonaatsysteem . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1 Doorborreling met CO2 -gas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.2 Additie van HCO−
3 en HCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3 Blootstelling van adulte mosselen aan koperstress . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.1 Analyse en berekening van de waterkwaliteitsparameters . . . . . . . .
3.3.2 Cellular Energy Allocation (CEA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.3 Lysosomal Membrane Stability (LMS) . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4 Blootstelling larven aan koperstress en oceaanverzuring . . . . . . . . . . . .
3.4.1 Blootstelling van oesterlarven aan koperstress . . . . . . . . . . . . . .
3.4.2 Optimalisatie van spawning en bevruchting bij de mossel Mytilus edulis
3.4.3 Optimalisatie van de larventest met de mossel Mytilus edulis . . . . .
3.4.4 Blootstelling van mossellarven aan koperstress in combinatie met oceaanverzuring . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
43
43
43
46
47
48
49
55
58
58
59
59
4 Algemene conclusie
75
5 Ideeën voor verder onderzoek
77
Referenties
79
Bijlagen
88
A Blootstelling van adulte mosselen aan koperstress
89
2.5
39
61
B Blootstelling van mossellarven aan koperstress in combinatie met oceaanverzuring
97
Inleiding
Oceaanverzuring wordt wel eens ‘het andere CO2 probleem’ of ‘het duivelse broertje van de
klimaatverandering’ genoemd. Naast de opwarming van de aarde is er een ander gevolg van
de toename van de atmosferische CO2 -concentratie, namelijk het minder gekende maar potentieel even dramatische probleem van de oceaanverzuring. Gedurende de voorbije 250 jaar
hebben de oceanen een groot deel van het CO2 dat vrijkwam door antropogene activiteiten
geabsorbeerd, met een verzuring van de oceanen tot gevolg. Vooral het gebruik van fossiele
brandstoffen en de ontbossing worden aanzien als de grote boosdoeners.
Het probleem van de oceaanverzuring werd voor het eerst gerapporteerd in de jaren 70. De
chemische gevolgen van de CO2 -opname door de oceanen waren toen reeds goed gekend. Er
treden veranderingen op in de samenstelling van het carbonaatsysteem van de oceaan, met
de daling van de pH als belangrijkste wijziging. De biologische impacten van de oceaanverzuring waren echter minder goed gekend maar zijn gedurende de voorbije tien jaar wel
veelvuldig onderzocht. Het meest waarschijnlijke gevolg is de tragere groei van organismen
die kalkachtige skeletten of schalen produceren, zoals koralen en mollusken. De meerderheid
van de organismen die gevoelig zijn voor oceaanverzuring is bovendien belangrijk op zowel
cultureel, biologisch als op economisch vlak. Op lange termijn kunnen daardoor waardevolle
ecosystemen beschadigd of vernietigd worden.
Er wordt verwacht dat oceaanverzuring de potentiële schadelijke effecten van andere antropogene stressoren, zoals chemische verontreiniging, zal versterken. In dat opzicht vormt pollutie
door zware metalen een aanzienlijke bedreiging voor mariene ecosystemen. Toxische metalen
kunnen immers schadelijke effecten veroorzaken bij diverse organismen en op die manier de
diversiteit van de biologische gemeenschap beı̈nvloeden. De invloed van oceaanverzuring op
de toxiciteit van metalen voor mariene organismen werd tot nu toe weinig of niet onderzocht.
In deze thesis zal daarom de hypothese getest worden dat het essentiële metaal koper meer
toxisch is voor de mossel Mytilus edulis onder condities van oceaanverzuring.
In de eerste plaats zullen twee technieken uitgetest worden voor de manipulatie van de carbonaatchemie van het zeewater, namelijk de doorborreling van zeewater met CO2 -gas en
1
2
de gecombineerde additie van HCO−
3 en HCl. Vervolgens zullen adulte mosselen gedurende
14 dagen blootgesteld worden aan koperstress. De potentiële effecten van de kopertoxiciteit
zullen geanalyseerd worden aan de hand van de biomarkers Cellular Energy Allocation (CEA)
en Lysosomal Membrane Stability (LMS). Tot slot zullen vroege larvale stadia van de mossel
Mytilus edulis blootgesteld worden aan oceaanverzuring, aan vervuiling door koper en aan
een combinatie van beide stressoren.
In het eerste deel van deze thesis zal de voornaamste relevante literatuur aangehaald worden. De chemische principes van het oceanische carbonaatsysteem en de kenmerken van het
testorganisme Mytilus edulis zullen beschreven worden. Daarna zal een overzicht gegeven
worden van de huidige kennis van de effecten en mechanismen van stress door oceaanverzuring en van koperstress. Vervolgens zal de hypothese omtrent de gecombineerde blootstelling
aan oceaanverzuring en koperstress gedefinieerd worden. In een volgend onderdeel zullen de
gebruikte technieken en de uitgevoerde experimenten beschreven worden. Nadien zullen de
resultaten geanalyseerd en bediscussieerd worden. Tot slot zullen de belangrijkste conclusies
opgesomd worden en zullen ideeën gegeven worden voor verder onderzoek.
Hoofdstuk 1
Literatuurstudie
1.1
Het carbonaatsysteem in de oceaan
Als gevolg van de vrijstelling van CO2 door o.a. verbranding van fossiele brandstoffen is de
CO2 -concentratie in de atmosfeer sterk toegenomen. In het pre-industriële tijdperk bedroeg
deze concentratie ongeveer 280 ppm, terwijl op dit moment waarden rond 380 ppm gemeten
worden in de omgeving. Het Intergovernmental Panel on Climat Change (IPCC) voorspelt
dat de concentratie in de toekomst verder zal stijgen en in het jaar 2100 reeds 750 ppm zal
bedragen (Riebesell et al., 2010).
Slechts een deel van deze CO2 -emissies blijft aanwezig in de atmosfeer. Een gedeelte wordt
namelijk opgenomen door de terrestrische biosfeer en een belangrijk deel wordt geabsorbeerd
door de oceanen. Het gedrag van CO2 in het zeewater wordt beschreven aan de hand van het
carbonaatsysteem, dat hoofdzakelijk gekarakteriseerd wordt door het zuur-base evenwicht
van H2 CO3 (Vergelijking 1.1).
CO2 + H2 O *
) H2 CO3 *
) HCO3− + H + *
) CO32− + 2H +
(1.1)
Indien de atmosferische CO2 -concentratie stijgt, zal meer CO2 diffunderen in het oppervlaktewater van de oceanen, waardoor de partieeldruk van CO2 (= pCO2 ) in het zeewater stijgt.
Dit gasvormig CO2 lost op in het zeewater en vormt H2 CO3 , dat vrij snel dissocieert in bicarbonaationen met vrijstelling van protonen. HCO−
3 kan vervolgens verder dissociëren in
carbonaationen en protonen.
Terzelfdertijd treedt ook een reactie op die carbonaationen consumeert en geen verandering
in de pH teweegbrengt (Vergelijking 1.2).
CO2 + H2 O + CO32− *
) 2HCO3−
(1.2)
Het totale gevolg van beide reacties is een daling in de concentratie aan CO2−
3 en een daling van de pH, wat resulteert in een verzuring van het zeewater. Dit proces waarbij de
3
4
HOOFDSTUK 1. LITERATUURSTUDIE
samenstelling van het carbonaatsysteem gewijzigd wordt (Figuur 1.1), wordt oceaanverzuring genoemd (Zeebe & Wolf-Gladrow, 2001). Ten opzichte van pre-industriële waarden is de
gemiddelde pH in de oceaan reeds gedaald met 0.1 eenheid. Volgens het IPCC IS92a scenario
zal de pH tegen het einde van de eeuw met 0.4 eenheden gedaald zijn en bedraagt de maximale pH reductie tegen het jaar 2300 maar liefst 0.77 eenheden (Caldeira & Wickett, 2003).
Deze pH reductie kan negatieve gevolgen hebben voor de mariene biota en kan wijzigingen
in het volledige mariene ecosysteem veroorzaken (zie sectie 1.3).
Figuur 1.1: Voorspelde veranderingen in het carbonaatsysteem van de oceaan ten gevolge
van veranderingen in atmosferische pCO2 , volgens het IS92a scenario (Rost et
al., 2008)
Naast deze verzuring zal een stijging in pCO2 ook een effect hebben op de saturatiestatus van
CaCO3 in het zeewater. Deze saturatiestatus Ω wordt weergegeven door Vergelijking 1.3.
Ω=
[Ca2+ ][CO32− ]
Ksp
(1.3)
Hierbij geeft Ksp het stoichiometrische oplosbaarheidsproduct weer dat afhankelijk is van temperatuur, saliniteit en druk. Onder de gegeven saliniteitscondities zal de Ca2+ -concentratie
in beperkte mate variëren en zal de saturatiestatus dus hoofdzakelijk bepaald worden door
2−
de CO2−
3 -concentratie. Bij afname van [CO3 ] ten gevolge van een stijgende pCO2 zal de
CaCO3 -verzadiging dus afnemen. Dit kan een ernstige bedreiging vormen voor calcificerende
mariene organismen die het CO2−
3 ion nodig hebben als bouwsteen om hun kalkachtig skelet
te precipiteren.
1.2. TESTORGANISME: MYTILUS EDULIS
5
2−
Naast pH, pCO2 , [HCO−
3 ] en [CO3 ] wordt het carbonaatsysteem gekarakteriseerd door nog
twee parameters, namelijk DIC en TA. DIC of ‘Dissolved Inorganic Carbon’ is de som van
alle opgeloste anorganische koolstofspecies, namelijk:
DIC = [CO2 ] + [HCO3− ] + [CO32− ]
(1.4)
TA of ‘Total Alkalinity’ wordt afgeleid uit titratie met een sterk zuur en is de som van
volgende componenten:
−
+
TA = [HCO3− ] + 2[CO32− ] + [B(OH)−
4 ] + [OH ] + [H ] + minor componenten
(1.5)
Indien twee van bovenstaande parameters en de saliniteit en temperatuur gekend zijn, kunnen alle andere componenten berekend worden en is dus de samenstelling van het volledige
carbonaatsysteem gekend (Zeebe & Wolf-Gladrow, 2001).
De huidige samenstelling van het carbonaatsysteem van de oceaan in 2007 en de verwachte
samenstelling voor het jaar 2010 wordt samengevat in Tabel 1.1 (Riebesell et al., 2010).
Tabel 1.1: Samenstelling van het carbonaatsysteem van de oceaan in 2007 en 2100 bij 18.9◦ C
en saliniteit 34.9. (a) x 10−6 (Riebesell et al., 2010)
Jaar
pCO2
(µatm)
pHT
(-)
TA
(a)
DIC
(a)
[CO2 ]
(a)
[HCO−
3]
(a)
[CO2−
3 ]
(a)
Ωcalciet
(-)
Ωaragoniet
(-)
2007
2100
384
793
8.07
7.79
2325
2325
2065
2191
12.8
26.4
1865
2055
187
110
4.5
2.6
2.9
1.7
1.2
1.2.1
Testorganisme: Mytilus edulis
Voorkomen en classificatie
De mossel Mytilus edulis is een mariene bivalve die sterk verspreid is in de noordelijke hemisfeer. Deze benthische invertebraat komt onder andere voor op de Noord-Atlantische kusten
van Noord-Amerika, Europa en in andere gematigde en polaire waters over de hele wereld.
Mytilus edulis is een sessiel organisme dat voorkomt in intertidale gebieden en vastgehecht is
op rotsen of andere vaste substraten. De classificatie van het organisme wordt weergegeven
in Tabel 1.2.
Mytilus edulis kan een brede temperatuurrange tolereren, gaande van minimum −3◦ C tot
maximum 44◦ C (Bayne, 1976). Het organisme is euryhalien en komt voor in gebieden waar
de saliniteit varieert van 4 tot 40 psu. De mossel kan daardoor zowel overleven in volledig
oceanische condities met een gemiddelde saliniteit van 34 psu als in mesohaliene en estuariene
6
HOOFDSTUK 1. LITERATUURSTUDIE
Tabel 1.2: Classificatie van Mytilus edulis (Gosling, 2003)
Rijk:
Stam:
Klasse:
Orde:
Familie:
Geslacht:
Species:
Animalia
Mollusca
Bivalvia
Mytiloida
Mytilidae
Mytilus
Mytilus edulis
condities (5 - 18 psu). Het organisme realiseert deze saliniteitstolerantie door het lichaamsvolume te reguleren door de concentraties aan intracellulaire vrije aminozuren en andere kleine
organische moleculen aan te passen. Op die manier werkt Mytilus edulis als osmoconformer
die in staat is om zijn cellen iso-osmotisch te houden met de extracellulaire fluida (Gosling,
2003).
1.2.2
Reproductie, morfologie en fysiologie
De voortplanting van Mytilus edulis gebeurt niet in het organisme zelf maar in de waterkolom.
Wanneer de gonaden rijp zijn, worden min of meer gelijktijdig sperma- en eicellen geloosd
in het zeewater, waar vervolgens de bevruchting plaatsvindt. 24 tot 48 h later ontwikkelen
de bevruchte eicellen zich tot ciliate trochofore larven. Op dit moment gebeurt reeds de
afscheiding van de eerste larvale schaal door de schaalklier, namelijk de prodissoconch I. De
larve vertoont dan een D-vorm en dit stadium wordt daarom het ‘D-shaped veliger stadium’
genoemd. Vervolgens wordt de tweede en sterker gecalcificeerde larvale schaal, de prodissoconch II, door de mantel afgescheiden. Dit stadium houdt gedurende verschillende weken
stand en wordt het planktotrofische of veliger stadium genoemd. De larven groeien snel en
zwemmen en voeden zich actief in de waterkolom door gebruik te maken van hun cilia. De
larven ontwikkelen zich verder door de vorming van een umbo, de ontwikkeling van een voet
en het voorkomen van gepigmenteerde ‘eye spots’. Uiteindelijk bereiken ze het pediveliger
stadium en zijn ze in staat om aan metamorfose te doen. Tijdens die fase zoeken ze een
geschikt substraat en hechten zich eraan vast door de afscheiding van byssusdraden (Gosling,
1992, Gosling, 2003).
Na de metamorfose begint de secretie van de adulte schaal, de dissoconch, die qua structuur
en mineralogie sterk verschilt van de prodissoconch I en II. De larvale schaal bestaat initieel
vooral uit amorf calciumcarbonaat dat getransformeerd wordt tot aragoniet (Weiss et al.,
2002). De adulte schaal bestaat uit drie lagen. Het dunne buitenste periostracum bedekt
het externe oppervlak van de schaal en bestaat uit conchyoline. Deze laag is vaak aangetast
door mechanische afslijting of door parasieten. De middelste prismatische laag bestaat uit
1.2. TESTORGANISME: MYTILUS EDULIS
7
calciet of aragoniet, dit zijn kristallijne vormen van calciumcarbonaat. Daarop volgt de
binnenste kalkachtige parelmoerlaag die opgebouwd is uit aragoniet. Het periostracum en
de prismalaag worden afgescheiden door de buitenste mantelplooi, terwijl de parelmoerlaag
afgescheiden wordt door het algemene manteloppervlak (Figuur 1.2). De schaal groeit in
cirkelomtrek door de additie van materiaal vanuit de mantelrand en ze groeit in dikte door
afzetting vanuit het algemene manteloppervlak (Gosling, 1992, Gosling, 2003).
Figuur 1.2: Doorsnede doorheen de schaal en de mantel van Mytilus edulis. EPS, extrapalliale ruimte; IF, binnenste mantelplooi; MF, middelste mantelplooi; NC, parelmoerlaag; OE, buitenste mantelepithelium; OF, buitenste mantelplooi; P, periostracum; PG, periostracum groeve; PL, palliale lijn; PM, palliale spier; PN,
palliale zenuw; PR, prismatische laag (Wilt, 2005)
De schaal vervult een aantal belangrijke functies. Ze fungeert namelijk als skelet voor
de vasthechting van spieren en als substraat voor de vasthechting van andere organismen
zoals epibionten. Bovendien beschermt ze de mossel tegen predatoren en andere stressoren
(Gutierrez et al., 2003).
Mosselen zijn filtervoeders. Ze nemen grote hoeveelheden water op en gebruiken het gefiltreerde plankton en gesuspendeerd organisch materiaal als voedsel. Door beweging van de cilia
wordt het materiaal naar de maag gebracht, die volledig ingebed ligt in de verteringsklier.
Deze klier is niet enkel de belangrijkste site voor de intracellulaire digestie, ze speelt ook een
cruciale rol in de opslag van metabolische reserves. Die reserves worden als energiebron gebruikt gedurende de gametogenese en gedurende periodes van fysiologische stress. Bovendien
is de verteringsklier een belangrijke site voor de opname van metalen en organische contaminanten. Om deze redenen wordt de klier vaak gebruikt voor analyses tijdens experimenten.
Het hemale systeem van Mytilus edulis bestaat uit het hart en een aantal hemolymfe kanalen.
8
HOOFDSTUK 1. LITERATUURSTUDIE
Hemolymfe bevat hemocyten die rondzweven in een kleurloos plasma en belangrijk zijn bij
het interne afweersysteem. De cellen herkennen namelijk onbekende substanties en reageren
erop door fagocytose of inkapseling. Daarnaast speelt het hemolymfe ook een belangrijke
rol in verschillende andere fysiologische processen, zoals gasuitwisseling, osmoregulatie en
distributie van nutriënten (Gosling, 2003).
1.2.3
Mytilus edulis als testorganisme
De mossel Mytilus edulis wordt vaak gebruikt als indicatorsoort en modelorganisme in verschillende onderzoeken. Vermits deze soort een brede geografische range heeft en de populaties
relatief stabiel zijn, speelt ze een belangrijke rol in een groot aantal mariene en estuariene
ecosystemen.
De mosselbedden treden op als habitat voor verschillende kleinere benthische invertebraten,
ook wel ‘cryptic fauna’ genoemd. Mosselen worden aanzien als echte ‘ecosysteem ingenieurs’
omdat ze zorgen voor de handhaving van de biodiversiteit en de sediment stabiliteit in diverse
milieus. Mosselen vormen een voedselbron voor zowel andere mariene organismen als voor
diverse zeevogels. Ook voor de mens fungeren de mosselen als voedselbron, waardoor ze ook
een economische functie hebben en van groot belang zijn binnen de aquacultuur. Mosselen
kunnen gebruikt worden als biomonitors voor de kustwaterkwaliteit en als testorganisme bij
toxicologische experimenten. Via filtervoeding zijn ze immers in staat om chemicaliën en
andere componenten op te concentreren in hun weefsels, wat de analyse van trace-elementen
vergemakkelijkt. Bovendien zijn mosselen vrij goedkoop en relatief gemakkelijk te onderhouden onder labo-omstandigheden (Beesley et al., 2008).
1.3
1.3.1
Effecten en mechanismen van oceaanverzuring
Algemeen
Er wordt verwacht dat de verzuring van de oceaan een impact zal hebben op diverse mariene
organismen en ecosystemen. Het effect dat momenteel het meest gerapporteerd wordt, is de
tragere groei van organismen die kalkachtige skeletten of schalen produceren, zoals koralen
en mollusken. Maar ook een hele reeks andere fysiologische processen kunnen beı̈nvloed
worden door oceaanverzuring, zoals de immuunrespons, het metabolisme en de pH-balans
van de organismen. Bovendien blijkt een hogere concentratie aan CO2 te interfereren met
de reproductie- en ontwikkelingsprocessen van een aantal organismen. Deze verschillende
processen zijn sterk gelinkt aan elkaar en bepalen de mogelijkheid van het organisme om te
overleven. Oceaanverzuring kan op die manier leiden tot wijzigingen in de structuur en in
de functie van ecosystemen en uiteindelijk zelfs tot een verlies van mariene biodiversiteit. In
wat volgt zal de invloed van oceaanverzuring op een aantal processen bij de mossel Mytilus
1.3. EFFECTEN EN MECHANISMEN VAN OCEAANVERZURING
9
edulis besproken worden.
1.3.2
Invloed op de groei
In een aantal experimenten werd de langetermijninvloed van oceaanverzuring op de groei van
adulte mariene mosselen onderzocht. Berge et al. (2006) observeerde een significante reductie
van de groeisnelheid bij pH’s kleiner of gelijk aan 7.4 bij M. edulis. Bij M. galloprovincialis
veroorzaakte blootstelling aan zeewater bij pH 7.3 55% groeireductie (Michaelidis et al.,
2005). Deze studies werden echter uitgevoerd bij pH-niveaus die lager zijn dan de voorspelde
waarde voor 2100.
Er wordt gesuggereerd dat de groeireductie het gevolg is van een daling van de metabolische
snelheid of van het optreden van extracellulaire acidose. Ook een degradatie van proteı̈nen en
een afname van calcificatie kan een rol spelen (Berge et al., 2006, Michaelidis et al., 2005). In
een onderzoek van Thomsen & Melzner (2010) werd echter aangetoond dat de geobserveerde
groeireductie bij M. edulis niet veroorzaakt werd door een metabolische suppressie (zie sectie
1.3.4). Hieruit blijkt dat het exacte mechanisme achter de groeireductie dus niet gekend
is, maar dat het waarschijnlijk veroorzaakt wordt door een combinatie van verschillende
fysiologische processen.
1.3.3
Invloed op de calcificatie
Diverse mariene organismen zoals koralen, mollusken en crustacea zijn afhankelijk van carbonaationen om hun kalkachtige schalen of skeletten te vormen. Dit proces waarbij het
mineraal CaCO3 wordt gevormd, wordt calcificatie genoemd. Door oceaanverzuring daalt
de concentratie aan CO2−
3 ionen en kan de saturatiestatus van CaCO3 in het zeewater (Ω)
kleiner dan één worden. Onder deze condities vertonen de meeste organismen een gereduceerde calcificatie. Er kan eveneens dissolutie van de schaal optreden, waarbij de schaal
wel goed gevormd wordt maar het CaCO3 uiteenvalt in de ionische componenten Ca2+ en
CO2−
3 .
Bij blootstelling van de mossel Mytilus edulis en de oester Crassostrea gigas gedurende 2 h
aan zeewater met een CO2 -concentratie van 740 ppm, werd een reductie van de calcificatiesnelheid met respectievelijk 25% en 10% geobserveerd (Gazeau et al., 2007). De oesters
bleken minder gevoelig, wat erop wijst dat de intensiteit van de effecten varieert van soort
tot soort.
De respons van de mossel M. edulis op oceaanverzuring is bovendien ook gevarieerd. In
drie langetermijnstudies op M. edulis werd, in tegenstelling tot het onderzoek van Gazeau
et al. (2007), geen effect waargenomen van oceaanverzuring op de calcificatie (Ries et al.,
10
HOOFDSTUK 1. LITERATUURSTUDIE
2009, Findlay et al., 2009, Thomsen et al., 2010). Deze studies tonen aan dat de mossel op
lange termijn in staat is om de calcificatie te handhaven en zich dus aan te passen aan de
verzuringscondities.
Bij een aantal organismen werd zelfs een verhoogde calcificatie geobserveerd bij langetermijnblootstelling aan oceaanverzuring. Onder andere de oester Crassostrea virginica (Ries et
al., 2009) en de kieuwslak Littorina littorea (Findlay et al., 2009) vertoonden een hogere
netto calcificatie. In deze onderzoeken wordt gesuggereerd dat CO2−
3 ionen niet optreden als
koolstofbron tijdens de calcificatie en dat de calcificatie dus niet het kritische proces is dat
beı̈nvloed wordt door oceaanverzuring.
1.3.4
Invloed op de zuur-base balans
Een stijging van atmosferische pCO2 veroorzaakt niet alleen acidose of verzuring in het zeewater maar ook in de weefsels (intracellulair) en in het hemolymfe (extracellulair) van de
mossel. Wanneer het gehalte aan pCO2 stijgt, zal het opgeloste CO2 namelijk meer penetreren doorheen de biologische membranen en komt het de intra- en extracellulaire ruimtes
binnen. Daar reageert het CO2 met de interne lichaamsvochten waardoor de concentratie
aan H+ stijgt en bijgevolg de pH daalt. Op die manier wordt de zuur-base balans in het
organisme verstoord (Fabry et al., 2008).
Er zijn een aantal mechanismen beschikbaar voor de regulatie van de zuur-base balans waardoor een gedeeltelijke of gehele compensatie van de pH-daling gerealiseerd wordt (Portner
et al., 2004, Seibel & Walsh, 2003). De belangrijkste mechanismen zijn een buffering van
de intra- en extracellulaire compartimenten en een metabolische suppressie. Ook het actief transport van zuur-base equivalente ionen doorheen de celmembranen is een manier om
de zuur-base balans te compenseren (Fabry et al., 2008). Door deze regulatie bereiken de
gehaltes aan ionen een nieuw steady-state niveau. Indien de zuur-base status onvoldoende of
niet gecontroleerd wordt, kan de wijzigende pH een invloed hebben op tal van functies, zoals
de groei- en metabolische snelheid. Dit bewijst nogmaals dat alle fysiologische processen
sterk met elkaar verbonden zijn.
De twee belangrijkste regulatiemechanismen, namelijk buffering van intra- en extracellulaire
compartimenten en metabolische suppressie worden hieronder beschreven.
Buffering van intra- en extracellulaire compartimenten
De passieve buffering van de compartimenten is een mechanisme dat direct beschikbaar is om
de pH-veranderingen te beperken. De buffering omvat een accumulatie van bicarbonaationen
en kan zowel intra- als extracellulair gebeuren (Fabry et al., 2008).
1.3. EFFECTEN EN MECHANISMEN VAN OCEAANVERZURING
11
Intracellulaire buffering
Bij verschillende experimenten waarbij mosselen blootgesteld werden aan oceaanverzuring
werd geobserveerd dat de intracellulaire pH volledig gehandhaafd bleef (Beesley et al., 2008,
Michaelidis et al., 2005, Seibel & Walsh, 2003, Thomsen & Melzner, 2010). De organismen
beschikken namelijk over een sterk mechanisme om hun weefsels te beschermen. Het CO2 dat
diffundeert in de intracellulaire compartimenten wordt gehydrateerd tot H+ en HCO−
3 . Deze
reversibele reactie wordt gekatalyseerd door het enzym koolzuuranhydrase. De intracellulaire
accumulatie van HCO−
3 zorgt voor een toename van pH en bijgevolg voor een regulatie van
de zuur-base balans (Fabry et al., 2008). Dit regulatiemechanisme vraagt echter een extra
energetische kost, wat op lange termijn kan leiden tot een reductie van de groei en van de
metabolische snelheid (Beesley et al., 2008).
Extracellulaire buffering
Een daling van de pH in het hemolymfe van een organisme wordt een extracellulaire acidose
genoemd. Er wordt gesuggereerd dat een stijging van het gehalte HCO−
3 als buffering in
het geval van een extracellulaire acidose het gevolg is van dissolutie van de schaal. Deze
extracellulaire buffering is meestal minder sterk dan de intracellulaire buffering waardoor de
pH-verandering in het hemolymfe vaak onvoldoende gecompenseerd wordt.
Bij blootstelling van de mossel M. galloprovincialis gedurende 90 d aan zeewater bij pH 7.3,
werd een permanente extracellulaire acidose waargenomen die gebufferd werd door hogere
gehaltes aan HCO−
3 (Michaelidis et al., 2005). Thomsen et al. (2010) observeerde echter geen
accumulatie van HCO−
3 bij kortetermijnblootstelling (14 d) van M. edulis aan zeewater met
pH 7.7. Mogelijk treedt de extracellulaire buffering enkel op na langetermijnblootstelling aan
sterkere condities van oceaanverzuring.
Metabolische suppressie
Er wordt gesuggereerd dat de toegenomen pCO2 en de CO2 -geı̈nduceerde verstoringen in
de extracellulaire zuur-base balans metabolische suppressie veroorzaken. Metabolische suppressie is een strategie van aquatische organismen om de overleving van stresscondities te
garanderen. De suppressie wordt bereikt door de intensiteit van energetisch intensieve processen, zoals de proteı̈nesynthese, te reduceren. Daardoor kan het organisme omgaan met de
stresscondities maar kan de groei en de reproductie eveneens gereduceerd worden (Fabry et
al., 2008, Seibel & Walsh, 2003).
Bij blootstelling van M. galloprovincialis aan oceaanverzuring (pH 7.3, 90 d) werden inderdaad een lagere metabolische snelheid en een nettodegradatie van de proteı̈nen geobserveerd
(Michaelidis et al., 2005). In studies van Thomsen et al. (2010) en Thomsen & Melzner
(2010) met de mossel M. edulis werden dergelijke suppressies echter niet waargenomen. De
resultaten van deze studies suggereren dat er geen causale relatie bestaat tussen de zuur-base
12
HOOFDSTUK 1. LITERATUURSTUDIE
status en een metabolische suppressie bij realistische gehaltes van oceaanverzuring. De organismen zullen namelijk hoofdzakelijk proberen de ongunstige condities te compenseren in
plaats van hun activiteit te reduceren.
1.3.5
Invloed op het immuunsysteem
Het is mogelijk dat oceaanverzuring een impact heeft op het immuunsysteem van mosselen. Het mechanisme voor interne verdediging bij mariene bivalven omvat fagocytose door
circulerende hemocyten, gevolgd door de vrijstelling van reactieve zuurstofmetabolieten en
bepaalde enzymen. De hemocyten zijn bovendien betrokken bij de digestie van nutriënten en
bij het herstellen van wonden en schade aan cellen (Bibby et al., 2008).
Wanneer de mossel M. edulis gedurende 32 d blootgesteld werd aan zeewater van verschillende zuurtegraden, bleek het gehalte aan fagocytose te dalen als functie van de afnemende
pH (Bibby et al., 2008). Dit veroorzaakte een schadelijk effect op de gezondheid van de
mossel door onderdrukking van het immuunsysteem. Het exacte mechanisme voor dit effect
werd niet aangetoond, maar vermoedelijk wordt de reductie van de fagocytose veroorzaakt
door toegenomen Ca2+ -concentraties in het hemolymfe die afkomstig zijn van dissolutie van
de schaal. Er wordt gesuggereerd dat deze calciumionen een impact hebben op de werking
van de hemocyten.
In een studie van Beesley et al. (2008) werd een verlies van lysosomale membraanstabiliteit
geobserveerd bij M. edulis na blootstelling gedurende 60 d aan verschillende niveaus van
oceaanverzuring. Dit effect werd ook verklaard door een te hoog gehalte aan calciumionen.
Door destabilisatie van het lysosomale membraan wordt het poreus en komt de functionaliteit
van het lysosoom in het gedrang. Schade aan de lysosomen leidt tot aantasting van het
immuunsysteem, vermits het lysosomale systeem een belangrijke functie vervult bij de digestie
van macromoleculen door fagocytose door de hemocyten.
1.3.6
Invloed op de reproductie en de larvale ontwikkeling
De vroege reproductie- en ontwikkelingsstadia van mariene bivalven zijn meestal het meest
gevoelig aan verstoringen in het milieu. Fluctuaties of mortaliteit binnen deze larvale stadia
regelen de grootte en de compositie van de adulte populatie (Kurihara et al., 2007). Om het
effect van oceaanverzuring op populatieniveau te kunnen inschatten, is het belangrijk dat de
invloed op de larvale stadia bestudeerd wordt.
Gazeau et al. (2010) stelde pas bevruchte embryo’s van de mossel M. edulis gedurende 48 h
bloot aan condities van oceaanverzuring. Blootstelling aan zeewater bij pH 7.8 veroorzaakte
een reductie van de groeisnelheid maar geen significant effect op de reproductiesnelheid. Bij
1.4. EFFECTEN EN MECHANISMEN VAN CHEMISCHE KOPERSTRESS
13
blootstelling aan pH 7.6 werd het zeewater ondergesatureerd voor aragoniet (Ωaragoniet < 1)
en werd zowel een daling van de groeisnelheid als van de reproductiesnelheid waargenomen.
Blootstelling van embryo’s van M. galloprovincialis gedurende 6 d aan een verzuringsniveau
van pH 7.4 veroorzaakte eveneens hinder voor de larvale ontwikkeling (Kurihara et al.,
2009). Er werd een afname van de schaalgroei en een reductie van de reproductiesnelheid
waargenomen. Bovendien trad er ontwikkelingsvertraging op en vertoonden alle veliger larven
morfologische abnormaliteiten, zoals misvormingen van de schaal en van de mantel. Er moet
wel opgemerkt worden dat het gebruikte pH-niveau in deze studie lager is dan de verwachte
waarde voor het jaar 2100.
De resultaten van bovenvermelde studies tonen aan dat oceaanverzuring kan interfereren met
de vroege ontwikkeling van mosselen. Vooral de synthese van de larvale schaal, die start
tijdens deze larvale stadia, wordt beı̈nvloed. Door dit effect en door de reductie van de
reproductiesnelheid kan de overleving van de adulte populatie in het gedrang komen en kan
uiteindelijk het gehele mariene ecosysteem beı̈nvloed worden.
1.4
1.4.1
Effecten en mechanismen van chemische koperstress
Belang, voorkomen en bronnen van koper
Koper is een roodkleurig metaal dat veel toepassingen kent en bijgevolg wijdverspreid is in de
huidige samenleving. De koperconcentratie in onvervuilde kustwateren bedraagt ongeveer 2 5 µg Cu L−1 (Davenport & Redpath, 1984). In vervuilde aquatische gebieden kunnen concentraties van 100 µg Cu L−1 en meer voorkomen (Robins et al., 1997, Fitzpatrick et al., 2008).
Deze gebieden worden hoofdzakelijk vervuild door koper afkomstig van antropogene bronnen,
zowel diffuse bronnen als puntbronnen. Diffuse koperverontreiniging omvat o.a. vrijstelling
van koper uit bepaalde verven en corrosie van koperen dakbedekking. Mogelijke puntbronnen
zijn vervuiling afkomstig van afval van mijnactiviteiten en vrijstelling van koper uit effluenten
van de metaalindustrie (Geffard et al., 2002).
Koper is een essentieel metaal en daardoor belangrijk voor het normaal functioneren van een
organisme. Essentiële metalen worden namelijk geı̈ncorporeerd in een aantal metabolische
processen die cruciaal zijn voor de overleving, de groei en de reproductie van organismen.
Koper is een component van verschillende enzymen, zoals tyrosinase en cytochroomoxidasen.
Bovendien is koper essentieel als onderdeel van hemocyanine, een vaak voorkomend zuurstoftransportpigment in mollusken (Parry & Pipe, 2004). Bij voldoende hoge concentraties
wordt koper echter toxisch voor bepaalde organismen (Millero et al., 2009).
14
1.4.2
HOOFDSTUK 1. LITERATUURSTUDIE
Biobeschikbaarheid en speciatie van koper
De toxiciteit van een metaal is niet enkel afhankelijk van de concentratie van dat metaal in
de omgeving maar ook van zijn biobeschikbaarheid. Die biobeschikbaarheid wordt beı̈nvloed
door de fysische en chemische speciatie van het metaal of met andere woorden door de verschillende vormen waaronder het metaal kan voorkomen. Koper bestaat onder twee fysische
vormen, namelijk opgelost in waterige milieus of gebonden aan partikels. Wat de chemische
speciatie betreft, kan koper voorkomen als vrij metaalion of als organische en anorganische
complexen. Het is het vrije Cu2+ ion dat toxisch is voor de organismen. De complexen zijn
meestal minder biobeschikbaar en bijgevolg minder toxisch (Hirose, 2006).
Zeewater is een chemisch complex systeem met hoge concentraties aan calcium en magnesium.
Deze Ca2+ en Mg2+ ionen kunnen in competitie treden met het koper voor bindingssites op
het grensvlak tussen het organisme en het zeewater. Op deze manier kan de biobeschikbaarheid en de toxiciteit van het koper eveneens afnemen (Hirose, 2006).
1.4.3
Opname en accumulatie van koper
De manier waarop koper opgenomen wordt in een organisme is afhankelijk van de fysische
speciatie van het metaal. Voor de opname van opgeloste koperionen uit water vormen de
kieuwen de belangrijkste route bij mollusken. Kieuwen hebben namelijk een groot uitwisselingsoppervlak en het water met de opgeloste koperionen kan met een hoge snelheid over dit
oppervlak gepompt worden (Lorenzo et al., 2005).
De opname van koper via de kieuwen kan op twee manieren gebeuren (Marigomez et al.,
2002). Een eerste manier omvat het transport van de koperionen over het epithelium met
behulp van transportproteı̈nen. Opname via het tweede mechanisme gebeurt door binding
van de koperionen met metallothioneı̈nes. Dit zijn cytosolische eiwitten met een laag moleculair gewicht (Geffard et al., 2002). De ionen gebonden aan de metallothioneı̈nes worden
vervolgens geı̈ncorporeerd in de lysosomen en uiteindelijk vrijgesteld in het hemolymfe.
Lorenzo et al. (2005) toonde aan dat de koperopname door de kieuwen bij M. edulis beschreven
werd door een lineaire functie van de tijd (2 h) en de koperconcentratie waaraan het organisme blootgesteld werd (0 - 150 mg Cu L−1 ). Binnen deze tijdsperiode trad er geen saturatie
van de koperopname op.
Blootstelling van organismen aan koperionen die gebonden zijn aan partikels gebeurt hoofdzakelijk via het voedsel. De opname van het metaal gebeurt langs het verteringskanaal door
endocytose. Het koper wordt getransfereerd naar de lysosomen en vervolgens overgebracht
naar de residuele lichaampjes in de verteringsklier (Marigomez et al., 2002).
Mosselen zijn als filtervoeders in staat grote volumes aan zeewater te filteren en kunnen op
1.4. EFFECTEN EN MECHANISMEN VAN CHEMISCHE KOPERSTRESS
15
die manier contaminanten zoals koper accumuleren en sterk opconcentreren in hun cellen en
in hun weefsels. Hoge concentraties aan metalen in de weefsels kunnen ernstige metabolische,
fysiologische en structurele verstoringen veroorzaken. Tussen de verschillende weefsels is
transport van de metalen mogelijk. Dit gebeurt hoofdzakelijk met behulp van hemocyten
(Marigomez et al., 2002).
Lorenzo et al. (2005) observeerde dat de accumulatie van koper in het weefsel van de mossel
M. edulis lineair toenam bij blootstelling aan lage koperconcentraties en dat de accumulatie
een verzadiging vertoonde bij hogere niveaus van koperblootstelling. Ook in een studie van
Pipe et al. (1999) werd een gelijkaardig fenomeen geobserveerd. De accumulatie van koper
in het weefsel van de verteringsklier van de mossel M. edulis vertoonde een maximum bij een
blootstelling aan 0.2 mg Cu L−1 . Blootstelling aan 0.5 mg Cu L−1 resulteerde in minder
koperaccumulatie. Er werd gesuggereerd dat bij hoge koperconcentraties de voedselopname
gereduceerd werd en dat er bijgevolg minder koper opgenomen en geaccumuleerd werd door
het organisme.
1.4.4
Effecten en mechanismen van kopertoxiciteit
Algemeen
Eens opgenomen in het organisme kan het koper binden aan diverse biomoleculen zoals eiwitten, enzymen en aminozuren. Dit kan leiden tot het blokkeren van bepaalde essentiële
functionele groepen in deze biomoleculen. Het is ook mogelijk dat metaalionen verplaatst
worden in de moleculen en dat de actieve conformatie van de moleculen gewijzigd wordt.
Bovendien kan het opgenomen koper in de cellen een redoxcyclus ondergaan, wat resulteert
in de vorming van reactieve zuurstofradicalen. Deze kunnen schade aanrichten aan het DNA
en aan de weefsels van het organisme. Er kan bijvoorbeeld oxidatie van lipidemembranen optreden of het koper kan cellulaire reacties induceren door interferentie met de structurele en
enzymatische componenten van andere celmembranen (Hole et al., 1993, Mason & Jenkins,
1995).
Naast deze directe acties op specifieke lichaamsweefsels en moleculen kan koper ook een
aantal homeostatische mechanismen beı̈nvloeden. Het is bijvoorbeeld mogelijk dat de calciumhomeostase en de werking van het immuunsysteem verstoord worden onder invloed van
koperstress (Coles et al., 1995, Pipe et al., 1999).
Invloed op de calciumhomeostase
De calciumhomeostase is de regulatie en de handhaving van de concentratie aan vrij Ca2+ in
het cytosol van een organisme. Dit gebeurt door een extrusieproces en een compartimentalisatiesysteem waarbij het plasmamembraan Ca2+ -ATPase (PMCA) een belangrijke rol speelt.
Het PMCA is namelijk een transportproteı̈ne in het plasmamembraan van de cellen, dat instaat voor de verwijdering van Ca2+ uit de cel. De aanwezigheid van metaalionen kan de
16
HOOFDSTUK 1. LITERATUURSTUDIE
werking van de calciumhomeostase echter beı̈nvloeden waardoor de regulatie van het gehalte
aan Ca2+ in de cel verstoord wordt (Burlando et al., 2004).
Viarengo et al. (1996) onderzocht de calciumhomeostase in het plasmamembraan van kieuwcellen van mosselen (M. galloprovincialis) die blootgesteld werden aan 38 µg Cu L−1 . Onder
deze condities werd een inhibitie van de activiteit van het PMCA geobserveerd. Er werd
gesuggereerd dat deze inhibitie het gevolg was van de sterke affiniteit van het koper voor de
functionele sulphydrylgroepen die in het PMCA aanwezig zijn. Koper kan deze sulphydrylgroepen aantasten door directe binding of door productie van oxyradicalen. Deze oxyradicaalproductie leidt namelijk tot oxidatieve stress die peroxidatie van de membraanlipiden kan
induceren. Dit kan uiteindelijk resulteren in een wijziging van de membraanstructuur.
In een gelijkaardig experiment met M. galloprovincialis werd zowel een reductie in de activiteit van het PMCA in het plasmamembraan van de kieuwcellen als van de verteringsklier
geobserveerd (Burlando et al., 2004). Dit bewijst nogmaals dat koper in staat is een inhibitorisch effect uit te oefenen op het PMCA en op die manier de calciumhomeostase te
verstoren.
Invloed op het immuunsysteem
Zoals reeds vermeld in sectie 1.3.5 bestaat het interne verdedigingssysteem van bivalven uit
fagocytose door hemocyten gecombineerd met de werking van degradatieve enzymen en de
productie van reactieve zuurstofmetabolieten (Bibby et al., 2008, Parry & Pipe, 2004).
In een studie van Pipe et al. (1999) werd de invloed onderzocht van koperstress (0, 0.02, 0.05,
0.2 en 0.5 mg Cu L−1 ) gedurende 7 d op de immuunrespons van de mossel M. edulis. Bij alle
koperconcentraties werd een stijging van het gehalte aan circulerende hemocyten ten opzichte
van de controle geobserveerd. Na blootstelling aan 0.2 mg Cu L−1 werd bovendien een significante stimulatie van de fagocytose waargenomen. Bij 0.5 mg Cu L−1 was het gehalte aan
fagocytose echter lager dan bij de controlebehandeling.
Deze resultaten suggereren dat er een concentratiedrempel bestaat. Bij stress door koperconcentraties die zich onder deze drempel bevinden, wordt de fagocytose gestimuleerd en wordt
de immuunrespons bijgevolg bevorderd. Op lange termijn kunnen de energetische kosten van
deze stimulatie echter nadelig worden voor het organisme. Bij blootstelling aan koperconcentraties boven de drempel treedt er inhibitie van het immuunsysteem op en kan er ernstige
schade veroorzaakt worden op het cellulaire niveau. De koperionen kunnen bijvoorbeeld de
celmembranen aantasten door de inductie van lipideperoxidatie. Er kan bovendien een invloed zijn op de proteı̈nesynthese en op de werking van bepaalde enzymen (Hole et al., 1993).
Tot slot kan er ook destabilisatie van de lysosomale membranen optreden als gevolg van de
1.4. EFFECTEN EN MECHANISMEN VAN CHEMISCHE KOPERSTRESS
17
kopertoxiciteit. Brown et al. (2004) observeerde een reductie in de lysosomale stabiliteit bij
blootstelling van M. edulis gedurende 7 d aan 68.1 µg Cu L−1 . Door deze verzwakking van
de lysosomale membranen is het mogelijk dat hydrolytische enzymen vrijgesteld worden en
schade aanrichten in het cytosol.
Invloed op de larvale ontwikkeling
Larvale stadia van het geslacht Mytilus zijn één van de meest gevoelige organismen voor koperstress. De metaalconcentraties die letale toxiciteit veroorzaken bij embryo’s en larven zijn
een aantal grootteordes lager dan deze die gerapporteerd worden voor adulte bivalven (Beiras
& Albentosa, 2004). De larvale stadia worden daarom veelvuldig gebruikt bij de monitoring
van pollutie door zware metalen.
Experimenten met gameten en vroege ontwikkelingsstadia van M. edulis en M. galloprovincialis toonden aan dat de fertilisatie en de embryogenese nadelig beı̈nvloed kunnen worden
door koperstress (Arnold et al., 2009, Hoare et al., 1995, Prato & Biandolino, 2007). Bij
blootstelling aan stijgende koperconcentraties werden stijgende gehaltes aan morfologische
abnormaliteiten waargenomen bij de ontwikkelende larven. Voor de mossel M. edulis worden
Median Concentrations of 50% Effect (EC50’s) voor het eindpunt normale embryonale ontwikkeling gerapporteerd in de range van 5.8 - 7.9 µg Cu L−1 (Barnes, 1989, His et al., 2000,
Martin et al., 1981).
Inductie van detoxificatiemechanismen
Wanneer mosselen blootgesteld worden aan hoge koperconcentraties kunnen detoxificatiemechanismen geı̈nduceerd worden. Het belangrijkste mechanisme is de synthese van metallothioneı̈nes. Deze proteı̈nen zorgen naast de opname van metaalionen via de kieuwen (zie
sectie 1.4.3) dus ook voor een detoxificatie ervan. De metallothioneı̈nes worden geconcentreerd in de lysosomen van bijvoorbeeld de verteringscellen en binden vervolgens met de
sulphydrylgroepen van het koper. De lysosomen en hun inhoud worden getransformeerd in
residuele lichaampjes die daarna uitgescheiden kunnen worden. Op die manier wordt het
koper geëlimineerd en gebeurt een detoxificatie (Hole et al., 1993, Marigomez et al., 2002).
18
1.5
HOOFDSTUK 1. LITERATUURSTUDIE
Gecombineerde effecten van oceaanverzuring en chemische koperstress
In de toekomst zullen aquatische organismen niet enkel stress ondervinden door oceaanverzuring maar ook door de combinatie van verzuring met andere stressoren, zoals metaalcontaminatie door koper. Vermoedelijk zal de lagere pH de speciatie en bijgevolg de biobeschikbaarheid en de toxiciteit van de metalen wijzigen.
In zeewater is slechts een kleine fractie van het koper aanwezig als vrij Cu2+ ion. Een groot
deel vormt complexen met organische en anorganische liganden (zie sectie 1.4.2). Deze complexen zijn niet of minder beschikbaar voor de organismen, waardoor de toxiciteit gereduceerd
wordt. Oceaanverzuring zal een invloed hebben op de adsorptie van het koper aan het organische en anorganische materiaal.
Koper vormt vooral sterke complexen met het anorganische ligand CO2−
3 . Bij een daling van
2−
−
de pH dalen de concentraties aan OH en CO3 in het zeewater. Onder deze condities zullen
dus minder complexen gevormd worden en zal er een hogere fractie aan vrije Cu2+ ionen
aanwezig zijn. Dit is belangrijk aangezien vrije metaalionen in het algemeen meer toxisch
zijn voor aquatische organismen (Millero et al., 2009).
Naast de anorganische speciatie zal ook de organische metaalspeciatie beı̈nvloed worden door
oceaanverzuring. Er werd reeds aangetoond dat meer dan 99% van het koper aanwezig is
als organische complexen (Hirose, 2006). Door de heterogene compositie en ongekende structuren van de organische liganden is het effect van een dalende pH op deze complexen echter
minder goed gekarakteriseerd. Aangezien de meeste organische partikels negatief geladen zijn,
wordt wel verwacht dat er bij dalende pH minder adsorptie van het koper zal gebeuren door
competitie met H+ ionen. Dit leidt opnieuw tot hogere concentraties aan Cu2+ en bijgevolg
meer toxiciteit (Millero et al., 2009).
Het gecombineerde effect van oceaanverzuring en metaaltoxiciteit op mariene organismen is
nog maar zelden bestudeerd. Tot op vandaag zijn er geen dergelijke studies op mosselen bekend. Pascal et al. (2010) onderzocht al de toxicologische interactie tussen oceaanverzuring
en metalen bij de copepode Amphiascoides atopus. Bij lagere pH werd meer mortaliteit van
de organismen geobserveerd. Er werd gesuggereerd dat deze verhoogde toxiciteit het gevolg
is van de geobserveerde stijging in de Cu2+ -concentratie en het antagonisme tussen CO2 en
Cu2+ .
In Tabel 1.3 wordt het percentuele aandeel van de belangrijkste koperspecies weergegeven in
functie van de pH en de tijd (Caldeira & Wickett, 2003, Millero et al., 2009). Bij dalende
pH stijgt het aandeel aan Cu2+ en CuCO3 , terwijl de fractie CuOH+ en Cu(CO3 )2−
2 daalt.
2+
Er werd reeds aangetoond dat Cu het meest biobeschikbare en meest potentieel toxische
1.5. GECOMBINEERDE EFFECTEN VAN OCEAANVERZURING EN KOPERSTRESS19
koperspecies in aquatische systemen is (Allen et al., 1980, Verweij et al., 1992).
Op basis hiervan en op basis van de resultaten uit de studie van Pascal et al. (2010) wordt
de hypothese geformuleerd en onderzocht dat koper onder condities van oceaanverzuring (pH
7.8) meer toxisch zal zijn voor mariene mosselen dan bij normale zuurtegraad (pH 8.1).
Tabel 1.3: Fractie (%) van de belangrijkste koperspecies in zeewater als functie van pH en
tijd bij 25◦ C en saliniteit 35 (Caldeira & Wickett, 2003, Millero et al., 2009)
Jaar
pH
2000
8.1
2050
8.0
2070
7.9
2085
7.8
2100
7.7
7.67
4.70
66.98
18.34
9.64
4.70
68.51
15.26
12.04
4.66
69.25
12.49
14.92
4.59
69.14
10.05
18.32
4.47
68.14
7.95
Species
Cu2+
CuOH+
CuCO3
Cu(CO3 )2−
2
Hoofdstuk 2
Materiaal en methoden
2.1
Analysetechniek voor totale alkaliniteit in zeewater
Tijdens de experimenten werd steeds een aantal waterkwaliteitsparameters gemeten, waaronder de totale alkaliniteit. De optimale methode om de totale alkaliniteit in zeewater te meten,
wordt beschreven in SOP 3a en omvat een automatische potentiometrische titratie in een gesloten cel (Dickson et al., 2007). Omdat deze methode in het labo niet uitgevoerd kon worden,
werd een vereenvoudigde methode gebruikt.
De totale alkaliniteit (TA) werd bepaald via een visuele titratie die gebaseerd is op Vergelijking
2.1 (ISO 9963-1, 1994).
CO32− → HCO3− → H2 CO3 → CO2 + H2 O
(2.1)
Een gekende hoeveelheid zeewaterstaal (25 mL) werd in een open systeem getitreerd met
HCl (0.0093 M) tot een pH van 4.5 bereikt werd. Er werd ook telkens een standaard (1
M Na2 CO3 ) en een blanco (0.7 M NaCl) geanalyseerd. Het zeewaterstaal, de standaarden
en de blanco’s werden steeds op de gewenste temperatuur gebracht alvorens de analyse uit
te voeren. De reagentia werden aangemaakt zoals beschreven in SOP 3a (Dickson et al.,
2007). Het sterke zuur HCl werd bereid in een NaCl achtergrond om de ionensterkte van
zeewater (0.7 mol kg−1 ) te benaderen en om ervoor te zorgen dat de activiteitscoëfficiënten
bij benadering constant waren tijdens de titratie. De titer van HCl werd bepaald t.o.v. borax
of natriumtetraboraat (Na2 B4 O7 .10H2 O). De visuele titratie werd uitgevoerd met de indicator methylrood. Uit het aantal mL verbruikt HCl en uit de concentratie van de gebruikte
reagentia werd m.b.v. Vergelijking 2.2 het aantal µmol berekend dat door het staal verbruikt
werd.
CHCl .VHCl 6
.10
(2.2)
totale alkaliniteit [µmol L−1 ] =
Vstaal
Daarbij stelt CHCl de concentratie van het sterke zuur HCl voor in mol L−1 . VHCl is het
volume HCl (mL) dat toegevoegd werd tot pH 4.5 en Vstaal is het volume van het geanaly21
22
HOOFDSTUK 2. MATERIAAL EN METHODEN
seerde staal (mL). De totale alkaliniteit [µmol L−1 ] werd omgerekend naar de eenheid µmol
kg−1 met de dichtheid van het gebruikte zeewater.
De performantie van de gebruikte vereenvoudigde procedure werd nagegaan door een aantal
standaarden (0.5, 1 en 1.25 M Na2 CO3 ) te titreren en de berekende alkaliniteiten te vergelijken
met de theoretische waarden (respectievelijk 1000, 2000 en 2500 µM ) (Dickson et al., 2007).
2.2
Analysetechniek voor pH in zeewater
Tijdens de experimenten werd de pH van het zeewater gemeten volgens de methode beschreven
in SOP 6a (Dickson et al., 2007). De methode maakt gebruik van een glas/referentie elektrodecel en een 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol (TRIS) buffer. De TRIS-buffer werd
aangemaakt in synthetisch zeewater en voor de meting werd de buffer op dezelfde temperatuur als het zeewaterstaal gebracht. De elektromotorische kracht (e.m.f. in mV) van de
TRIS-buffer (Es ) en van het zeewaterstaal (Ex ) werd gemeten met een pH-meter. De temperatuur (T) en saliniteit (S) werden eveneens gemeten. De pH van het zeewaterstaal (pH(X))
werd vervolgens berekend met Vergelijking 2.3.
pH(X) = pH(S) +
ES − EX
RT
ln(10)
f
(2.3)
de ideale Nernst waarde weer. pH(S) is de pH van de TRIS-buffer
Daarbij geeft R T ln(10)
f
die berekend wordt met Vergelijking 2.4.
1
T
− 366.27059 + 0.53993607 S + 0.00016329 S 2
pH(S) = (11911.08 − 18.2499 S − 0.039336 S 2 )
+ (64.52243 − 0.084041 S) ln(T ) − 0.11149858 T
2.3
(2.4)
Methoden ter manipulatie van het carbonaatsysteem
Om mosselen bloot te stellen aan oceaanverzuring moet het zeewater en dus het carbonaatsysteem gemanipuleerd worden. De huidige en de verwachte samenstelling van het zeewater
voor respectievelijk het jaar 2007 en 2100 wordt weergegeven in Tabel 1.1 (Riebesell et al.,
2010). Daaruit blijkt dat de pCO2 zal stijgen en de pH zal dalen in 2100 t.o.v. 2007. De
totale alkaliniteit TA blijft constant en de concentratie aan DIC stijgt door de oceaanverzuring. Om het zeewater aan te passen aan deze verwachte condities voor het jaar 2100, kan
het carbonaatsysteem op verschillende manieren gemanipuleerd worden. Meestal houdt dit
een verandering in TA of DIC in. Een verandering in één component van het carbonaatsysteem kan echter leiden tot wijzigingen in alle andere componenten. Bij het uitvoeren van
dergelijke manipulaties is het daardoor niet mogelijk om één component te veranderen en de
2.3. METHODEN TER MANIPULATIE VAN HET CARBONAATSYSTEEM
23
rest constant te houden.
Twee methoden om zeewater te verzuren worden beschreven en uitgetest, namelijk de doorborreling met CO2 -gas en de gecombineerde additie van HCO−
3 en HCl.
2.3.1
Doorborreling met CO2 -gas
De meest gebruikte methode om het carbonaatsysteem te manipuleren is het doorborrelen
van het zeewater met CO2 -gas. Bij deze methode stijgt de concentratie aan DIC terwijl de
alkaliniteit constant blijft (Figuur 3.6).
Om deze methode uit te testen werd een aquarium met ongeveer 7 L Instant Ocean zeewater (2
kg Instant Ocean synthetisch zeezout in 60 L gedeı̈oniseerd water) doorborreld met CO2 -gas
met een concentratie van 750 ppm (Air liquide Deutschland GmbH). Er was geen headspace
aanwezig en het aquarium werd afgedekt om te voorkomen dat veranderingen optraden in
de concentraties en de speciatie van de componenten door uitwisseling van CO2 -gas tussen
het water en de atmosfeer. Vijf verschillende stroomsnelheden werden uitgetest, namelijk 30,
80, 200, 800 en 1100 mL CO2 -gas min−1 . Op verschillende tijdstippen werd de pH van het
doorborrelde zeewater gemeten tot er evenwicht bereikt werd.
Om na te gaan wat de invloed van adulte mosselen is op dit evenwicht, werden vier opstellingen doorborreld met CO2 -gas: een aquarium met enkel 7 L Instant Ocean zeewater,
een aquarium met zeewater en 4 mL voedsel (Shellfish Diet, Instant Algae), een aquarium
met zeewater en 12 adulte mosselen en een aquarium met zeewater en zowel voedsel als 12
mosselen. De doorborreling gebeurde met een stroomsnelheid van 1000 mL CO2 -gas min−1 .
De pH van het zeewater werd op verschillende tijdstippen gemeten.
Tot slot werd een experiment uitgevoerd om de zuurstofconsumptie van adulte mosselen te
bepalen. 12 mosselen werden gedurende ongeveer 20 h in een afgesloten aquarium met 7
L Instant Ocean zeewater (normale pH 8.1) geplaatst. De mosselen werden niet gevoed en
het zeewater werd niet belucht. Op verschillende tijdstippen werden de zuurstofconcentratie
en het aantal mV van het zeewater gemeten. Daaruit werd de zuurstofconsumptie van de
mosselen en de pH van het zeewater berekend.
2.3.2
Additie van HCO−
3 en HCl
Voor het blootstellen van mossellarven aan oceaanverzuring werd een methode uitgetest waarbij het carbonaatsysteem van zeewater gemanipuleerd werd door gecombineerde additie van
HCO−
3 en HCl. Daarvoor zijn kleinere volumes aan zeewater nodig dan bij experimenten
met adulte mosselen. De methode bootst alle veranderingen in de carbonaatchemie na die
verwacht worden in het jaar 2100. Volgens Riebesell et al. (2010) is deze methode even be-
24
HOOFDSTUK 2. MATERIAAL EN METHODEN
trouwbaar als de manipulatie via doorborreling met CO2 -gas.
Voor de experimenten met larven werd er niet gewerkt met Instant Ocean zeewater maar
wel met artificieel zeewater, aangezien dit aangeraden wordt in het ASTM protocol (ASTM,
2004). In Tabel 2.1 worden de chemische stoffen vermeld die opgelost worden in gedeı̈oniseerd
water voor de bereiding van het artificieel zeewater (Zaroogian et al., 1969).
Tabel 2.1: Samenstelling van artificieel zeewater (Zaroogian et al., 1969)
chemische stof
massa per liter (g L−1 )
SrCl2 .6H2 O
H3 BO3
KBr
KCl
CaCl2 .2H2 O
N a2 SO4
M gCl2 .6H2 O
N aCl
N a2 SiO3 .5H2 O
N aHCO3
20
30
100
700
1470
4000
10780
23500
15
200
Het aangemaakte artificieel zeewater had normaal gezien een pH van 8.1 en de alkaliniteit
bedroeg 2325 µmol kg−1 . In sommige gevallen was de gemeten pH of alkaliniteit lager dan
deze waarden. Dan werd 0.1 M NaOH toegevoegd in een open systeem om de pH en de alkaliniteit tot de gewenste waarde te doen stijgen. Het artificieel zeewater met deze condities
voor pH en alkaliniteit werd gebruikt als controlebehandeling voor de oceaanverzuring.
Om het artificieel zeewater te verzuren werden achtereenvolgens NaHCO3 en HCl toegevoegd
(Figuur 3.6). 0.1 M NaHCO3 werd aan het zeewater toegevoegd om de concentratie aan DIC
op het juiste peil te brengen. Daardoor steeg echter de alkaliniteit, wat teniet gedaan werd
door vervolgens 0.1 M HCl toe te voegen. Er werd steeds in een gesloten systeem gewerkt
om gasuitwisseling met de atmosfeer te voorkomen.
Met het R package Seacarb (Lavigne et al., 2008) werd berekend hoeveel NaHCO3 en HCl
aan het systeem toegevoegd moest worden. Daarvoor werd de functie ‘oa’ gebruikt bij de
juiste temperatuur en saliniteit. Onderstaand commando werd gebruikt:
oa(flag=8, var1=8.1, var2=2325e-6, pCO2f=750, S=33.3, T=15, k1k2=”l”, kf=”pf”,
ks=”d”, pHscale=”T”, plot=TRUE)
2.3. METHODEN TER MANIPULATIE VAN HET CARBONAATSYSTEEM
25
Dit commando bevat volgende argumenten:
flag
var1
var2
S
T
k1k2
kf
ks
pHscale
plot=TRUE
selectie van het koppel variabelen dat gekend is
(flag = 8, pH en alkaliniteit gegeven)
waarde van de eerste variabele, namelijk de pH
waarde van de tweede variabele, namelijk de alkaliniteit in mol kg−1
saliniteit
temperatuur in ◦ C
eerste en tweede stoichiometrische evenwichtsconstante
(k1k2 = ”l”, de constanten van Lueker et al. (2000) werden gebruikt)
evenwichtsconstante voor waterstoffluoride
(kf = ”pf”, de constante van Perez & Fraga (1987) werd gebruikt)
evenwichtsconstante voor het bisulfaat ion
(ks = ”d”, de constante van Dickson (1990) werd gebruikt)
pH schaal (pHscale = ”T”, de totale pH schaal werd gebruikt)
geeft een figuur met de verandering in DIC en TA als gevolg van
diverse manipulatiemethoden (Figuur 3.6)
Vervolgens werden alle componenten van het carbonaatsysteem berekend met behulp van het
R package Seacarb (Lavigne et al., 2008). Het carbonaatsysteem bestaat uit zes variabelen,
2−
+
namelijk [CO2 ], [HCO−
3 ], [CO3 ], [H ], DIC en TA. Indien twee van deze zes variabelen
gekend zijn, kunnen alle andere berekend worden. Bij deze uitgevoerde manipulatiemethode
zijn telkens de variabelen [H+ ] of de pH en de alkaliniteit gekend.
De initiële toestand van het zeewater (pH 8.1 en alkaliniteit 2325 µmol kg−1 ) werd gekarakteriseerd met behulp van de functie ‘carb’, namelijk met het commando carb(flag=8, var1=8.1,
var2=2325e-6, S=33.3, T=15). De veranderingen in het systeem na toevoegen van NaHCO3
werden gesimuleerd met de functie ‘pTA’ door middel van het commando tmp=pTA(flag=8,
sys=0, var1=8.1, var2=2325e-6, co3=0e-6, hco3=122.85e-6, S=33.3, T=15). Daarbij wijst
‘sys=0’ erop dat er gewerkt werd in een gesloten systeem. De parameters ‘co3’ en ‘hco3’ geven
weer hoeveel mol kg−1 van respectievelijk Na2 CO3 en NaHCO3 aan 1 kg zeewater toegevoegd
werd. Met behulp van de functie ‘ppH’ werden de componenten van het carbonaatsysteem
gekarakteriseerd na toevoegen van HCl. Volgend commando werd gebruikt: ppH(flag=8,
sys=0, var1= tmp$pH[2], var2= tmp$ALK[2], vol=-0.0012285, N=0.1, S=33.3, T=15). De
parameters ‘vol’ en ‘N’ geven het volume en de concentratie weer van het toegevoegde HCl.
Deze berekeningen in het R package Seacarb zijn gebaseerd op een aantal vergelijkingen
(Zeebe & Wolf-Gladrow, 2001). De concentratie aan CO2 werd berekend met Vergelijking
26
HOOFDSTUK 2. MATERIAAL EN METHODEN
2.5.
∗ B
∗
KB
KW
T
∗ +h − h
KB
K1∗
2 K1∗ K2∗
h +
h2
TA −
s=
+h
(2.5)
Met:
s
TA
K∗B
BT
h
K∗W
K∗1
K∗2
[CO2 ]
de totale alkaliniteit (µmol kg−1 )
de stoichiometrische dissociatieconstante van boorzuur
de totale boorconcentratie in zeewater (mol kg−1 )
[H+ ]
de stoichiometrische evenwichtsconstante van water
de eerste stoichiometrische evenwichtsconstante
de tweede stoichiometrische evenwichtsconstante
Aan de hand van de berekende waarde voor s werd vervolgens DIC berekend met Vergelijking
2.6.
K∗ K∗ K∗
(2.6)
DIC = s (1 + 1 + 1 2 2 )
h
h
2.4
2.4.1
Blootstelling van adulte mosselen aan koperstress
Experimenteel design
Voor dit experiment werden volwassen mosselen gebruikt met een lengte van 42 - 50 mm die
afkomstig waren uit Middelkerke. De opstelling bestond uit acht constant beluchte aquariums
met daarin telkens 24 mosselen in 10 L Instant Ocean zeewater. Gedurende tien dagen
werden de mosselen in deze opstelling geacclimatiseerd en drie keer per week ververst. Op
dag 0 van het experiment werden 12 mosselen uit elk aquarium verwijderd en geanalyseerd
bij wijze van controle. Het volume aan zeewater in de aquariums werd aangepast tot 5 L,
zodat de densiteit gelijk bleef. De mosselen werden gedurende 14 dagen blootgesteld aan vier
koperbehandelingen, namelijk 0, 10, 32 en 100 µg Cu L−1 , waarna ze ook geanalyseerd werden.
De koperoplossingen werden aangemaakt uit een stockoplossing van CuCl2 en minstens één
dag belucht vooraleer ze gebruikt werden. Om de twee dagen werd het medium ververst
en werden de aquariums proper gemaakt. Zowel tijdens de acclimatisatie als tijdens het
experiment werden de mosselen twee maal per dag gevoed met 2 mL Shellfish Diet (Instant
Algae). Shellfish Diet is een mix van vier inerte algen, het bestaat namelijk uit 30% Isochrysis,
20% Pavlova, 30% Thalassiosira weissflogii en 20% Tetraselmis.
2.4.2
Analyse en berekening van de waterkwaliteitsparameters
Gedurende het experiment werden dagelijks de saliniteit, geleidbaarheid, O2 , temperatuur,
pH, alkaliniteit, ammonium en Dissolved Organic Carbon (DOC) gemeten. De metingen
2.4. BLOOTSTELLING VAN ADULTE MOSSELEN AAN KOPERSTRESS
27
en staalnames werden telkens op ongeveer hetzelfde moment uitgevoerd, namelijk tussen de
twee voedingen. De saliniteit, geleidbaarheid, O2 , temperatuur en pH werden steeds met
dezelfde elektrode gemeten. De zuurstofmeter stond ingesteld bij een saliniteit van 35. De
alkaliniteit en pH werden gemeten en berekend zoals in sectie 2.1 en 2.2. De ammoniumconcentratie werd bepaald met de testkit Merck Spectroquant nr. 1.14752.0001. De absorbantie
werd gemeten met behulp van de Aquamate Spectrofotometer Thermo Electra Corporation.
Vermits de concentratie aan ammonium in zeewater werd bepaald, werd 0.1 mL 5 M NaOH
aan de stalen toegevoegd. DOC werd gemeten als Non-Purgeable Organic Carbon (NPOC)
met een Total Organic Carbon Analyzer (TOC-5000, Shimadzu, Duisburg, Germany). Er
werden eveneens stalen genomen van het zeewater voor analyse van de koperconcentraties.
In wat volgt zullen steeds de nominale koperconcentraties vermeld worden.
Om het volledige carbonaatsysteem te karakteriseren werden de niet-gemeten waterkwaliteitsparameters berekend met behulp van het R package Seacarb (Lavigne et al., 2008). Bij
de kopertest zijn de variabelen [H+ ] of de pH en de alkaliniteit gekend en worden de pCO2
en DIC berekend met de functie ‘carb’.
De statistische analyse van de metingen van de waterkwaliteitsparameters werd uitgevoerd
in SPSS 16. Eerst en vooral werden een aantal voorwaarden nagegaan. Om de gelijkheid van
varianties of homoscedasticiteit te controleren werd een Modified Levene Test uitgevoerd.
De onafhankelijkheid werd getest met een Chi-Square Test, terwijl de normale verdeling
van de gegevens nagegaan werd met een One-Sample Kolmogorov Smirnov Test. Het significantieniveau werd vastgelegd op 5%. Vermits de varianties niet gelijk verdeeld waren,
werd een niet-parametrische test uitgevoerd. Met behulp van een Mann-Whitney U Test
werd nagegaan of er een significant verschil bestond in waterkwaliteitsparameters tussen de
verschillende koperbehandelingen en de onderzochte aquariums. Het voordeel van deze nietparametrische methode is dat ze gebaseerd is op zwakke veronderstellingen over de verdeling
van de residuelen en dat ze minder gevoelig is voor outliers dan de parametrische methoden.
De Mann-Whitney U test vergelijkt de rangschikking van de observaties en detecteert of de
verdeling van de waarden van de ene groep verschoven is ten opzichte van de verdeling van
de waarden van de andere groep (OECD, 2006).
2.4.3
Analyses aan de hand van biomarkers
Om het effect van de verschillende koperbehandelingen op de gezondheidsstatus van de mosselen te kwantificeren, werden twee cellulaire biomarkers voor stress gebruikt. Biomarkers
vormen namelijk een kosteneffectieve methode om de toxische effecten van polluenten op
mariene biota te identificeren.
De respons van de mosselen op de koperstress zal zich vermoedelijk hoofdzakelijk situeren op
28
HOOFDSTUK 2. MATERIAAL EN METHODEN
twee gebieden. Enerzijds zullen de metalen geaccumuleerd worden in de cellen van de verteringsklier. De verteringsklier is een belangrijke site van intracellulaire vertering en vormt
een cruciale interface tussen het organisme en zijn omgeving. De effecten van de koperbehandelingen op dit niveau zullen onderzocht worden met de biomarker Cellular Energy Allocation
(CEA). Anderzijds zullen mogelijke veranderingen in de lysosomale activiteiten ten gevolge
van de koperstress onderzocht worden aan de hand van de biomarker Lysosomal Membrane
Stability (LMS).
Cellular Energy Allocation (CEA)
Analyse beschikbare en geconsumeerde energie
Om het effect van de toxische stress door koper op het energiebudget van het testorganisme te
bepalen, werd de biomarker CEA gebruikt. Analyse van de beschikbare en de geconsumeerde
energie gebeurde op de verteringsklier van de mossel Mytilus edulis. Voor de bepaling van
de beschikbare energie werd het aandeel aan proteı̈nen, koolhydraten en lipiden geanalyseerd
en uitgedrukt in een energiegehalte. Het energieverbruik werd bepaald door de activiteit van
het Elektronen Transport Systeem (ETS) te meten.
Bij het begin van de test (0 d) werd de verteringsklier van 96 niet-blootgestelde mosselen
gedissecteerd. Deze 96 mosselen hadden gedurende tien dagen reeds een acclimatisatie ondergaan en zaten verdeeld over acht aquariums. Gedurende de volgende 14 dagen werden
96 andere geacclimatiseerde mosselen blootgesteld aan vier koperbehandelingen (0, 10, 32
en 100 µg Cu L−1 ). Per koperbehandeling werden dus 24 mosselen blootgesteld die telkens
verdeeld zaten over twee aquariums. Zowel op 0 d als op 14 d werd de verteringsklier uit
de mossel gedissecteerd en in twee gesneden zodat op één mossel telkens twee verschillende
energiefracties (proteı̈nen, koolhydraten, lipiden of ETS) bepaald werden. Na bepaling van
de massa van de halve verteringsklier werden de klieren ingevroren in Eppendorf buisjes tot
op het moment van de eigenlijke analyse. Uiteindelijk werd slechts de helft van de verzamelde
stalen geanalyseerd. Voor elke energiefractie werden dus zes replica’s per koperbehandeling
geanalyseerd, afkomstig uit twee verschillende aquariums.
De CEA-analyses werden uitgevoerd volgens het protocol van De Clerck (2008). De stalen
werden uit de diepvries gehaald en langzaam ontdooid op ijs. Ook tijdens de analyses werden
de stalen voortdurend op ijs geplaatst en werd de centrifuge telkens afgekoeld tot 4◦ C.
Het principe van de bepaling van het proteı̈negehalte steunt op de reactie tussen de proteı̈nen
in de oplossing en de kleurstof Briljant Blue G in het Bradford reagens. Er ontstaat een blauw
gekleurd complex dat een maximale absorbantie heeft bij een golflengte van 595 nm.
Na het ontdooien werden de verteringsklieren gehomogeniseerd in een 0.05 M TRIS buffer
en gedurende 15 min gecentrifugeerd bij 9000 rcf (Hettich Microcentrifuge, Mikro 200R).
2.4. BLOOTSTELLING VAN ADULTE MOSSELEN AAN KOPERSTRESS
29
Vervolgens werden de stalen verdund in gedeı̈oniseerd water en werden van elk staal drie
replica’s van 25 µL in een multiwell gebracht. Het gehalte aan proteı̈nen werd bepaald ten
opzichte van een standaardreeks van Bovine Serum Albumine (BSA) van 0.4, 0.2, 0.1, 0.05
en 0.025 mg mL−1 . Er werden twee sets van standaarden en drie blanco’s (gedeı̈oniseerd
water) aan de multiwell toegevoegd. Vervolgens werd met een multipipet aan elke well snel
250 µL Bradford reagens toegevoegd. Nadat de plaat gedurende 15 min in het donker werd
geı̈ncubeerd, werd de optische densiteit bij 595 nm gemeten met een plate reader spectrofotometer (Thermo Labsystems, Multiskan Ascent).
Voor de bepaling van het gehalte aan koolhydraten in de verteringsklier werden de stalen
eerst gehomogeniseerd in gedeı̈oniseerd water. Vervolgens werden de interfererende proteı̈nen
geprecipiteerd door toevoeging van 15% trichloorazijnzuur (TCA). Gedurende 10 min werden
de stalen gecentrifugeerd bij 3500 rpm, waardoor een scheiding gebeurde tussen de koolhydraten en de neergeslagen proteı̈nen. Het supernatant met de koolhydraten werd overgebracht
naar een nieuw Eppendorf buisje en op ijs geplaatst. De pellets met proteı̈nen werden nogmaals heropgelost in 5% TCA en gecentrifugeerd (10 min, 3500 rpm). Het supernatant werd
toegevoegd aan het Eppendorf buisje waarna het staal verdund werd in gedeı̈oniseerd water.
De stalen werden gemeten ten opzichte van een standaard van glucose. Een 0.5% oplossing
van glucose werd aangemaakt, waaruit een standaardreeks van 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.031
en 0.016 mg mL−1 bereid werd door verdunning met gedeı̈oniseerd water in Eppendorf buisjes. Als blanco werd gedeı̈oniseerd water gebruikt.
Van de stalen, standaarden en blanco’s werd 250 µL in nieuwe Eppendorf buisjes gebracht.
Daaraan werd achtereenvolgens 250 µL 5% fenol en 1 mL H2 SO4 toegevoegd. Door reactie
van de koolhydraten met fenol en zwavelzuur ontstond een oranje gekleurd complex dat een
maximale absorbantie vertoonde bij een golflengte van 492 nm. Uit elk Eppendorf buisje
werd 300 µL overgepipetteerd naar de multiwell die vervolgens 15 min in het donker en bij
kamertemperatuur geı̈ncubeerd werd. De optische densiteit van het complex werd spectrofotometrisch bepaald bij 490 nm.
De stalen voor de bepaling van het gehalte aan lipiden werden gehomogeniseerd in gedeı̈oniseerd water. Om de lipiden af te scheiden van de cellulaire matrix werd 500 µL CHCl3 , 500
µL CH3 OH en 250 µL gedeı̈oniseerd water aan de stalen toegevoegd. Vervolgens werden
ze gedurende 10 min gecentrifugeerd bij 3000 rpm. De bovenste fase, die bestaat uit water
en methanol, werd verwijderd. De onderste laag bevat chloroform met daarin opgelost de
lipiden, die nog eens extra verdund werd in chloroform.
Het gehalte aan lipiden werd bepaald ten opzichte van een standaardreeks van tripalmitine
van 6.25, 3.12, 1.56, 0.78, 0.39, 0.19 en 0.09 mg mL−1 . Van de stalen, standaarden en
blanco’s (chloroform) werden drie replica’s van 100 µL gedurende 30 min in glazen buisjes bij
60◦ C gedroogd. Vervolgens werd 500 µL H2 SO4 toegevoegd en werden de buisjes nogmaals
30
HOOFDSTUK 2. MATERIAAL EN METHODEN
gedroogd, gedurende 15 min bij 200◦ C. Door toevoeging van het zwavelzuur werd de lipiderijke fractie bij deze hoge temperatuur ontbonden tot koolstof, wat resulteerde in een zwarte
kleur. Na afkoeling werd 1.5 mL gedeı̈oniseerd water aan de buisjes toegevoegd en werd 250
µL van elk staal in een multiwell gebracht. Er werden eveneens twee sets van standaarden
en drie blanco’s aan de multiwell toegevoegd. De optische densiteit van de koolstof werd
spectrofotometrisch bepaald bij 340 nm.
Om de hoeveelheid geconsumeerde energie te bepalen, werd de activiteit van het Elektronen Transport Systeem (ETS) gemeten. Het ETS bevindt zich in de mitochondriën en de
microsomen van een cel en bestaat uit een complexe keten van enzymen. De cytochromen,
flavoproteı̈nen en metallische ionen transporteren elektronen van de gekataboliseerde levensmiddelen naar O2 , dat fungeert als elektronacceptor. Op die manier wordt de oxidatieve fosforylatie ondersteund en levert het ETS energie om adenosinetrifosfaat (ATP) te genereren.
De activiteit van dit enzymsysteem wordt bepaald door de snelheidslimiterende stap, in dit
geval de oxidatie van het coenzyme Q-cytochroom B complex. Om de snelheid van het elektronentransport te registreren werd p-iodonitrotetrazolium (INT) aan het staal toegevoegd.
Deze artificiële elektronacceptor vervangt zuurstof als elektronacceptor in de mitochondriën,
waarbij 2 mol INT correspondeert met 1 mol O2 . Daardoor werd het optisch actieve en
rood gekleurde formazan gevormd, waarvan de absorbantie vervolgens spectrofotometrisch
bepaald werd (Fanslow et al., 2001, Cammen et al., 1990, Packard, 1971). De stalen werden
eerst gehomogeniseerd in homogenaat buffer (0.01 M PO4 buffer bij pH 8.5, 0.05 M TRIS,
75 µmol L−1 MgSO4 , 4.5 mg mL−1 polyvinylpyrrolidone (PVP) en 1 mL Trixton X-100).
Vervolgens werden ze gedurende 10 min bij 3000 rpm gecentrifugeerd en werd het supernatant overgebracht naar een nieuw Eppendorf buisje en verdund in homogenaat buffer. Drie
replica’s van 60 µL van elk staal werden in de multiwell gebracht. Als blanco werd 60 µL
homogenaat buffer gebruikt. Aan elke well werd vervolgens 180 µL gebufferde substraatoplossing toegevoegd. Deze oplossing bestaat uit 1.7 mmol L−1 NADH en 0.25 mmol L−1
NADPH in 10 mL substraat buffer (0.01 M PO4 buffer bij pH 8.5, 0.05 M TRIS en 1 mL
Trixton X-100). Het NADH en NADPH dienen om respectievelijk het mitochondriale en het
microsomale ETS te satureren. Daarna werd met een multipipet snel 60 µL INT-oplossing (2
mg mL−1 ) aan elke well toegevoegd. Van zodra het INT werd toegevoegd, werd de kinetische
reactie elke zeven seconden gemeten bij 490 nm en werd de reactiesnelheid van het accepteren
van de elektronen door het INT bepaald.
Berekening beschikbare en geconsumeerde energie
Voor elke energiefractie (proteı̈nen, koolhydraten en lipiden) werd de beschikbare energiehoeveelheid apart berekend. In de eerste plaats werden de resultaten van de standaarden
gebruikt om een regressielijn op te stellen tussen de standaardconcentratie (mg mL−1 op de
X-as) en de gemeten absorbantie (op de Y-as). Aan de hand van deze regressielijn en de geme-
2.4. BLOOTSTELLING VAN ADULTE MOSSELEN AAN KOPERSTRESS
31
ten absorbanties voor proteı̈nen, koolhydraten en lipiden werden de concentraties (XB , in mg
mL−1 ) aan deze drie energiefracties berekend. Vervolgens werd het gehalte aan proteı̈nen,
koolhydraten en lipiden in de verteringsklier (XDG , in mg) berekend met Vergelijking 2.7.
XDG =
XB VW V
DF
(2.7)
Hierbij is VW het volume staal in mL, na alle homogenisatie, extractie en centrifugatie stappen. Voor de proteı̈nen, koolhydraten en lipidenfractie bedraagt VW respectievelijk 0.025
mL, 0.250 mL en 0.100 mL. V stelt de gebruikte verdunning van het staal voor, die verschilt
van analyse tot analyse. De dilutiefactor DF brengt alle volumes in rekening die toegevoegd
werden aan het weefsel. Voor de proteı̈nenanalyse bedraagt DF 25 µL/400 µL, aangezien 25
µL staal gebruikt werd uit een volume van 400 µL. Voor de koolhydraten is DF 250 µL/500
µL en voor de analyse van de lipiden bedraagt DF 100 µL/500 µL.
Vervolgens werd het aantal milligram proteı̈nen, koolhydraten en lipiden per nat gewicht
verteringsklier berekend [mg mg−1 klier]. Door dit te vermenigvuldigen met een energiefactor werd tot slot voor elke energiefractie de energiehoeveelheid per milligram verteringsklier
berekend [J mg−1 klier]. Deze energiefactor bedraagt 24 J mg−1 voor de eiwitfractie, 17.5 J
mg−1 voor de koolhydraatfractie en 39.5 J mg−1 voor de vetfractie.
Om de hoeveelheid geconsumeerde energie te bepalen, werden de resultaten van de ETS
metingen gebruikt. De hoeveelheid verbruikte O2 per minuut werd berekend met Vergelijking
2.8.
Vmax Vw V
(2.8)
mol O2 min−1 =
2 l DF 106
Vmax is de maximale slope (absorbantie min−1 ) die berekend werd tijdens de analyse. Vw is
het totale volume aanwezig in de well en bedraagt 300 µL. Er werd met een verdunning V van
5 gewerkt. De extinctiecoëfficiënt voor INT-formazan bedraagt 15900 (mol L−1 )−1 cm−1
en de optische lengte l is 0.7795 cm. De dilutiefactor DF bedraagt 60 µL/400 µL aangezien
voor de meting 60 µL staal gebruikt werd uit een beschikbaar volume van 400 µL. De factor
106 brengt de conversie van µL naar L in rekening.
De hoeveelheid gerespireerde O2 per uur werd bepaald door de hoeveelheid O2 per minuut
te vermenigvuldigen met 60 min h−1 . De verbruikte energie werd berekend met Vergelijking
2.9.
kJ uur−1 = mol O2 h−1 484 kJ mol−1 O2
(2.9)
Door de hoeveelheid verbruikte energie te delen door het gewicht van de geanalyseerde verteringsklier, werd tot slot de energieconsumptie per uur en per mg verteringsklier berekend
(De Clerck, 2008).
32
HOOFDSTUK 2. MATERIAAL EN METHODEN
De verhouding van de hoeveelheid beschikbare en geconsumeerde energie werd niet berekend
omdat de vier energiefracties niet op hetzelfde testorganisme geanalyseerd werden.
Statistische analyse
De statistische analyse van de CEA resultaten werd uitgevoerd in SPSS 16. In de eerste plaats
werden de voorwaarden van homoscedasticiteit, onafhankelijkheid en normaliteit nagegaan.
Het significantieniveau werd steeds vastgelegd op 5%. Voor elke energiefractie (proteı̈nen,
koolhydraten, lipiden en ETS) werd vervolgens een Two-Sample T Test uitgevoerd op de
controles om na te gaan of er een verschil was tussen de energiehoeveelheden bij 0 d en 14
d. Voor de resultaten van de analyses op dag 0 werd bovendien met een One-Way Analysis
Of Variance (ANOVA) onderzocht of er een significant aquariumeffect aanwezig was. Indien
dit het geval was, werden de gemiddelden meervoudig vergeleken met de Tukey methode.
Op de dataset van dag 14 werd een General Linear Model toegepast met de koperconcentratie als vaste factor en het aquarium als toevallige factor. Indien er een significant effect
van deze factoren werd vastgesteld, werd een meervoudige vergelijking van de gemiddelden
uitgevoerd. Voor vergelijking van de koperconcentraties met de controlebehandeling werd
de Dunett methode toegepast (OECD, 2006), terwijl de Tukey methode gebruikt werd om
de aquariumeffecten te vergelijken. Indien er niet voldaan werd aan één van de hierboven
vermelde voorwaarden, werd een niet-parametrische test uitgevoerd (Mann-Whitney U Test
of Kruskal-Wallis H Test).
Lysosomal Membrane Stability (LMS)
Neutral Red Retention assay
Het lysosomale systeem bij mosselen is zeer goed ontwikkeld in de verteringsklier en in de
hemocyten. De belangrijkste functie van de lysosomen is de digestie van diverse macromoleculen en bijgevolg ook de sequestratie en de accumulatie van toxische contaminanten
zoals koper. Deze accumulatie kan destabilisatie van de lysosomale membranen veroorzaken,
met lekkage van de contaminanten in het cytosol en uiteindelijk zelfs de dood tot gevolg.
De Lysosomal Membrane Stability (LMS) als gevolg van koperstress in de hemocyten werd
geëvalueerd aan de hand van de Neutral Red Retention assay (NRR assay) (Moore et al.,
2004). De kleurstof neutral red is een zwakke base die aan de cellen in het hemolymfe
toegevoegd wordt. De kleurstof diffundeert in de cellen, wordt gevangen in de lysosomen
door protonatie (vermits de omgeving van de lysosomen een lage pH heeft) en gaat eventueel
verloren door schade aan de lysosomen. De voortgang in de opname van de kleurstof en de
eventuele lekkage ervan in het cytosol in het geval van beschadiging, wordt gekwantificeerd
met behulp van de lysosomale retentietijd.
De NRR assay werd uitgevoerd op 12 mosselen per koperbehandeling (0, 10, 32 en 100 µg
2.4. BLOOTSTELLING VAN ADULTE MOSSELEN AAN KOPERSTRESS
33
Cu L−1 ). Deze 12 mosselen zaten gedurende de test verspreid over twee aquariums om mogelijke effecten tussen de aquariums onderling in rekening te brengen. Na onttrekking van
het hemolymfe werden de mosselen verder gebruikt voor de CEA analyses.
Het hemolymfe werd geëxtraheerd door de kleppen van de mossel langs de ventrale zijde
voorzichtig open te houden met een mes en het aanwezige water in de schelpholte eerst
te laten weglopen. Daarna werd 0.1 mL hemolymfe onttrokken uit de achterste sluitspier
met behulp van een 1 mL spuit met daarin reeds 0.1 mL fysiologische zoutoplossing. De
samenstelling van de zoutoplossing wordt weergegeven in Tabel 2.2.
Tabel 2.2: Samenstelling van de fysiologische zoutoplossing voor de NRR assay. De chemische
stoffen worden opgelost in 1 L gedeı̈oniseerd water en de pH wordt indien nodig
aangepast tot 7.36
chemische stof
massa per liter (g L−1 )
HEPES
NaCl
MgSO4
KCl
CaCl
4.77
25.48
13.06
0.75
1.47
De inhoud van de spuit werd overgebracht in een 2 mL epje en gedurende maximum 20
min op ijs geplaatst. Vervolgens werd 50 µL van het mengsel hemolymfe en zoutoplossing
gepipetteerd op een draagglaasje en gedurende 20 min geı̈ncubeerd in een donkere en vochtige
omgeving om adhesie van de hemocyten te bewerkstelligen. Na 20 min werd de overtollige
suspensie rondom de cellen voorzichtig verwijderd en werd 40 µL neutral red werkoplossing op
de hemocyten gepipetteerd. De werkoplossing werd aangemaakt door 10 µL neutral red stockoplossing te verdunnen in 5 mL fysiologische zoutoplossing. De neutral red stockoplossing
van 100 mM werd bereid door 28.8 mg kleurstofpoeder op te lossen in 1 mL dimethylsulfoxide (DMSO). De kleurstof penetreerde in de lysosomen en na 15, 30, 60, 90, 120 en 180 min
werden de stalen onderzocht onder de microscoop (Medilux 12, Kyowa). Na 180 min werd de
test in elk geval beëindigd vermits de kleurstof dan zelf toxisch wordt voor de organismen.
Gezonde lysosomen kunnen grotere hoeveelheden kleurstof opnemen en ze kunnen deze kleurstof bovendien langer vasthouden dan beschadigde cellen (Figuur 2.1A). Aangetaste lysosomen vertonen abnormaliteiten in grootte en kleur (bv. vergroting van de cellen, Figuur
2.1B) of ondervinden lekkage van de kleurstof vanuit de lysosomen in het cytosol (Figuur
2.1C). Het eindpunt van de NRR assay is wanneer 50% of meer van de cellen lysosomale
lekkage of structurele abnormaliteiten vertoont. De retentietijd wordt bepaald als de laatste
tijdsperiode waarin er nog geen bewijs was van kleurstofverlies of lysosomale abnormaliteiten.
34
HOOFDSTUK 2. MATERIAAL EN METHODEN
Figuur 2.1: Mytilus edulis lysosomen blootgesteld aan de kleurstof neutral red. A, Gezonde
cellen na een retentietijd van 15 min; B, Cel vergroting; C, Cel lekkage (totale
magnificatie: 1000x) (Coates, 2009)
Statistische analyse
Om na te gaan of er significante effecten optraden van de koperbehandeling en het onderzochte aquarium, werden statistische analyses uitgevoerd in SPSS 16. Vermits er niet voldaan
werd aan de voorwaarden van homoscedasticiteit, normaliteit en onafhankelijkheid, werden
niet-parametrische Kruskal Wallis Testen en Mann-Whitney U Testen uitgevoerd op het 5%
significantieniveau.
2.5
Blootstelling van larven aan koperstress in combinatie
met oceaanverzuring
Larvale stadia van mollusken zijn gevoeliger voor verschillende stressfactoren dan adulten.
Aantasting van de larvale stadia kan ernstige gevolgen hebben voor de samenstelling en
de conditie van de gehele populatie (Gazeau et al., 2010). Daarom werden ontwikkelende
embryo’s en larven van oesters en mosselen blootgesteld aan condities van oceaanverzuring
en koperstress en aan een combinatie van beide.
2.5.1
Blootstelling van oesterlarven aan koperstress
Oesterlarven van ongeveer 48 h oud werden in een acute en chronische opstelling blootgesteld
aan een range van koperconcentraties. Om de larven op te concentreren, werden ze eerst
gezeefd over een zeef met maaswijdte van 35 µm en vervolgens terug opgelost in een kleiner
volume artificieel zeewater. De concentratie aan larven (aantal larven per mL) werd bepaald
in een Sedgwick-Rafter telkamer.
Tijdens de acute test werden de larven gedurende 24 h blootgesteld aan 1, 5, 10, 40 en 100
µg Cu L−1 . Deze koperoplossingen werden aangemaakt uit een stockoplossing van CuCl2
2.5. BLOOTSTELLING LARVEN AAN KOPERSTRESS EN OCEAANVERZURING 35
in twee verschillende mediums, namelijk artificieel zeewater en Instant Ocean zeewater. Op
die manier kon een mogelijk effect van het medium onderzocht worden. De larven, met een
densiteit van 10 larven mL−1 , werden voorzichtig gepipetteerd in een multiwell met daarin
telkens 2 mL koperoplossing. Er werd gewerkt met drie replica’s per koperconcentratie en drie
blanco’s (= artificieel zeewater of Instant Ocean zeewater). De acute test werd geı̈ncubeerd
bij 20◦ C en na 24 h werd de mortaliteit van de oesterlarven bepaald.
Gedurende de chronische test werden de oesterlarven 14 d blootgesteld aan 10 en 40 µg Cu
L−1 . Ook deze koperoplossingen werden aangemaakt in artificieel zeewater en Instant Ocean
zeewater uit een stockoplossing van CuCl2 . De larven werden gepipetteerd in glazen potjes
van 200 mL met daarin 100 mL koperoplossing. De densiteit bedroeg 10 larven mL−1 . De
chronische test bestond uit twee replica’s per koperconcentratie en twee blanco’s. De test
werd gedurende 14 d geı̈ncubeerd bij 20◦ C en continu belucht. Drie keer per week werden de
larven gezeefd over 30 µm en werd het medium ververst. De larven werden drie keer per week
gevoed met mariene algen (80000 cellen mL−1 ). Volgens Galley et al. (2010) is er immers
geen verschil in groeisnelheid tussen het dagelijks voeden van de larven of het voeden om de
2 à 3 dagen met een grotere hoeveelheid algen. De vulling van de maag van de larven werd af
en toe gecontroleerd onder de microscoop om na te gaan in welke mate de toegediende algen
geconsumeerd werden. De mariene algen (Laboratorium voor Aquacultuur) werden gekweekt
in glazen flessen onder een dag/nacht-lichtcyclus met continue beluchting. De eerste twee
keren werden de larven gevoed met de flagellaat Isochrysis, daarna werd telkens een mengsel
van flagellaten en diatomeeën gebruikt, namelijk een verhouding van 2/3 Isochrysis en 1/3
Chaetoceros. De verdunning werd uitgevoerd in artificieel zeewater. De algen werden geteld
in een Bürker telkamer. Daarbij werd telkens het aantal algencellen in 20 kleine vierkantjes
in het bovenste (= n1 ) en in het onderste telrooster (= n2 ) geteld. De concentratie aan algen
(c, in cellen mL−1 ) werd vervolgens bepaald via Vergelijking 2.10 (Lavens & Sorgeloos, 1996).
c=
n1 + n2
. verdunningsfactor. 106
160
(2.10)
Na 14 d werd de mortaliteit bepaald en werden lengtemetingen uitgevoerd onder de microscoop (Medilux 12, Kyowa) met de software Image Tool.
2.5.2
Optimalisatie van spawning en bevruchting bij de mossel Mytilus
edulis
Algemene procedure
Larven van de mossel M. edulis werden blootgesteld aan koperoplossingen onder condities van
oceaanverzuring. Daarvoor werd eerst de procedure voor het verwerven van de larven en het
opzetten van de larventest geoptimaliseerd. De spawning of het kuitschieten, de bevruchting
en de incubatie zijn grotendeels gebaseerd op bestaande protocols (ASTM, 2004, Claessens,
36
HOOFDSTUK 2. MATERIAAL EN METHODEN
2008). Er zullen een aantal aspecten opgesomd worden die aangepast werden om de algemene
procedure te optimaliseren.
Vermits mossellarven zeer gevoelig zijn voor contaminatie, werd het gebruikte glaswerk steeds
grondig gereinigd met zuur en gedurende minstens 2 h gesteriliseerd bij 150◦ C. Het gebruikte zeewater (artificieel zeewater, Instant Ocean zeewater of gefilterd zeewater) en de
koperoplossingen werden vooraleer ze te gebruiken, steeds gedurende minstens 24 h belucht
en bewaard bij 15◦ C.
Voor de spawning werden geslachtsrijpe adulte mosselen uit Middelkerke gebruikt. De mosselen werden bewaard bij 8 à 9◦ C, dagelijks gevoed, continu belucht en twee keer per week
werd het zeewater ververst. Om de spawning of het vrijstellen van gameten te induceren,
ondergingen de mosselen een temperatuurschok. De thermische stimulatie werd gestart door
de mosselen in een thermostatisch bad bij 25◦ C te plaatsen. Indien na 30 minuten nog geen
enkel organisme kuitgeschoten had, werd een nieuwe temperatuurschok toegediend door de
mosselen te verplaatsen naar een thermostatisch bad bij 15◦ C. Dit proces werd een aantal
keer herhaald tot voldoende zaad- en eicellen verzameld werden. Eventueel werd additionele
stimulatie gegeven door het wateroppervlak te verstoren door bijvoorbeeld met een spuitfles
zeewater op de mossel te spuiten. De gameten werden steeds in suspensie gehouden en bij
15◦ C geplaatst.
Na het verzamelen van de gameten werd de kwaliteit ervan onderzocht onder de microscoop
(Biolux-12, Kyowa). De zaadcellen zijn initieel immobiel maar moeten na 15 min mobiel en
actief zijn om een goede kwaliteit te garanderen. De eicellen hebben net na de spawning een
ovale of onregelmatige vorm en moeten rond worden na 15 min.
De zaadcellen van goede kwaliteit werden gepoold en gezeefd over 35 µm om feces en ander
materiaal te verwijderen. De beste eicellen werden eveneens gepoold, gezeefd over 112 µm en
opgevangen in een 500 mL maatcilinder. De eicellen werden continu in suspensie gehouden
met een plunger. Om de concentratie van de eisuspensie te bepalen, werd een staal van 1 mL
genomen en werd het aantal eicellen per milliliter geteld m.b.v. een Sedgwick-Rafter telkamer.
De eicellen werden bevrucht door 5 mL spermasuspensie toe te voegen aan de 500 mL
maatcilinder. Dit gebeurde steeds bij dezelfde temperatuur als die waarbij de larventest
geı̈ncubeerd werd, namelijk 15◦ C. Na 5 à 10 min werd een staal van 200 µL genomen en
geanalyseerd onder de microscoop. Er moesten 3 tot 10 zaadcellen per eicel aanwezig zijn
om te kunnen spreken van een goede fertilisatie. Was dit niet het geval, dan werden extra
zaadcellen toegevoegd. Indien te veel zaadcellen worden toegevoegd, ontstaat er een risico
op het optreden van polyspermie. Vervolgens werden de bevruchte eicellen al dan niet nog
2.5. BLOOTSTELLING LARVEN AAN KOPERSTRESS EN OCEAANVERZURING 37
eens extra gezeefd. Ongeveer één uur na de bevruchting werd opnieuw een staal van 1 mL
genomen en werd de concentratie aan embryo’s in de suspensie bepaald met behulp van een
Sedgwick-Rafter telkamer. Bevruchte eicellen kunnen herkend worden door de aanwezigheid
van een poollichaampje of doordat ze de eerste tekenen van celdeling vertonen. De fertilisatie
was succesvol indien meer dan 80% van de eicellen bevrucht werd. De larventest werd steeds
opgestart binnen de vier uur na de fertilisatie en de embryosuspensie werd ondertussen goed
in suspensie gehouden met een plunger.
Optimalisatie van de procedure
Twee methoden werden uitgeprobeerd om de algemene spawning- en bevruchtingsprocedure
te optimaliseren en om het percentage bevruchte eicellen te maximaliseren.
Methode 1
Bij de eerste methode werden de adulte mosselen elk in een aparte weckpot met daarin
ongeveer 300 mL artificieel zeewater geplaatst. De weckpotten werden afwisselend in het
warme en koude thermostatisch bad gezet om de spawning te induceren. Van zodra de
spawning startte, werd de weckpot uit het bad gehaald en bij de incubatietemperatuur
geplaatst, namelijk 15◦ C. Na de bevruchting werd de suspensie bij deze methode niet meer
gezeefd (Claessens, 2008).
Methode 2
Bij de tweede methode werden de mosselen allemaal in één groot aquarium met Instant
Ocean zeewater geplaatst. De avond voor de test werd één aquarium, enkel gevuld met het
zeewater, in het warme thermostatisch bad en één aquarium in het koude thermostatisch bad
geplaatst, zodat het zeewater de volgende morgen de gewenste temperatuur had. Tijdens
de thermische schok werden de mosselen nauwkeurig geobserveerd en van zodra een mossel
begon kuit te schieten, werd ze verplaatst naar een aparte weckpot met artificieel zeewater
bij 15◦ C. Een half uur na de spawning werden de verzamelde zaad- of eicellen weggegooid
en werd de kuitschietende mossel in een nieuwe weckpot met artificieel zeewater geplaatst.
Na de fertilisatie werd de embryosuspensie eerst gezeefd over een 54 µm zeef om debris te
verwijderen, zoals beschreven in het ASTM-protocol (2004). Vervolgens werden overmatige
zaadcellen, kleine protozoa en bacteriën verwijderd door de suspensie te zeven over 22 µm en
te backwashen met artificieel zeewater.
2.5.3
Optimalisatie van de larventest met de mossel Mytilus edulis
Algemene procedure
Eens de fertilisatie gelukt was, werden de embryo’s toegevoegd aan het testmedium en werd
de incubatie gestart. De larventesten werden uitgevoerd in plastieken cups van 50 mL die
38
HOOFDSTUK 2. MATERIAAL EN METHODEN
afgedekt werden met parafilm en met een stevige plaat om zuurstofuitwisseling en contaminatie te voorkomen. Volgens de protocols (ASTM, 2004, Claessens, 2008) moet aan een
testvolume van 50 mL tussen 150 en 1500 µL embryosuspensie toegevoegd worden. Het pipetteren gebeurde zeer traag en voorzichtig om te voorkomen dat de larven gestresseerd werden.
Het optreden van mechanische stress kan immers misvormingen veroorzaken bij de ontwikkelende embryo’s. De larven werden geı̈ncubeerd bij 15◦ C en werden niet gevoed gedurende de
test.
Optimalisatie van de procedure
Standaard wordt een test met larven van de mossel M. edulis geı̈ncubeerd gedurende 48 h
waarna de eindpunten geanalyseerd worden. Indien de test uitgevoerd werd volgens de algemene procedure, bleek dat onvoldoende larven in de controlebehandeling (bij pH 8.1 en 0
µg Cu L−1 ) ontwikkelden tot het gewenste D-stadium. Dit is het stadium waarbij de larven
gekarakteriseerd worden door de eerste larvale schaal, namelijk de prodissoconch I. De larven
vertonen tijdens dit stadium een D-vorm. Werd de larventest langer geı̈ncubeerd, namelijk
gedurende 72 h, dan werd geen verbetering opgemerkt. De larven kunnen gedurende maximaal 72 h geı̈ncubeerd worden, vermits ze vanaf dat moment gevoed moeten worden. Een
aantal parameters werd aangepast om de algemene procedure en dus de incubatie van de
larventest te optimaliseren. Er werd daarbij telkens een staal genomen van de controlebehandeling na 48 h om de voortgang van de larvale ontwikkeling te controleren en het percentage
larven dat ontwikkelde tot het D-stadium werd gerapporteerd.
Parameter 1: densiteit toegevoegde embryo’s
De densiteit van de embryosuspensie die toegevoegd wordt aan het testmedium, kan een invloed hebben op de ontwikkeling van de embryo’s. Om dit effect te onderzoeken, werd een
larventest uitgevoerd met drie verschillende densiteiten, namelijk 15, 30 en 45 embryo’s per
milliliter testmedium.
Parameter 2: type testkamer
Er werd onderzocht of de testkamer een invloed heeft op de larvale ontwikkeling. De larventesten werden daarvoor enerzijds uitgevoerd in plastieken cups en anderzijds in glazen
recipiënten van hetzelfde volume.
Parameter 3: testmedium
De derde parameter die onderzocht werd, is het testmedium dat gebruikt werd voor de
controlebehandeling en waarin de koperoplossingen aangemaakt werden. Twee types werden getest, namelijk artificieel zeewater en gefilterd zeewater. Het artificieel zeewater werd
aangemaakt volgens het recept beschreven in Tabel 2.1. Het gefilterd zeewater (0.2 µm) werd
gefilterd over een zandfilter en UV-behandeld (Laboratorium voor Aquacultuur).
2.5. BLOOTSTELLING LARVEN AAN KOPERSTRESS EN OCEAANVERZURING 39
Parameter 4: staalnametechniek
De manier waarop na 48 h een staal (1 mL) van het testmedium met de larven genomen
wordt, bepaalt het aantal larven dat teruggevonden wordt in dit staal. Dit is belangrijk
om een goede analyse van de eindpunten mogelijk te maken. Bij een eerste techniek werd
de volledige inhoud van de testkamer (50 mL) gezeefd over 15 µm en werden de larven
terug opgelost in een kleiner volume artificieel zeewater. Een tweede mogelijkheid is dat de
testkamer niet gemengd werd, maar lichtjes schuin gehouden terwijl de larven bezonken. Het
staal werd dan gepipetteerd van op de bodem van de testkamer. Bij de derde techniek werd
de inhoud van de testkamer zacht gemengd door te roeren met de pipettip en werd het staal
vervolgens gepipetteerd.
2.5.4
Blootstelling van mossellarven aan koperstress in combinatie met
oceaanverzuring
Experimenteel design
Nadat de procedures voor spawning, bevruchting en incubatie geoptimaliseerd werden, werd
een definitieve larventest uitgevoerd. Daarbij werden ontwikkelende embryo’s van maximum
4 h oud blootgesteld aan een range van koperconcentraties onder normale condities en onder condities van oceaanverzuring. De geslachtsrijpe adulte mosselen werden gesampeld in
Middelkerke. De spawning en de bevruchting werden uitgevoerd volgens methode 2. De
embryo’s werden vervolgens gedurende 48 h blootgesteld aan koperoplossingen met concentraties 0, 1, 2, 4, 8, 16 en 32 µg Cu L−1 . Deze koperoplossingen werden aangemaakt in
artificieel zeewater met pH 8.1 en pH 7.8. De koperoplossingen bij pH 8.1 werden gebruikt
als controle voor de oceaanverzuring, vermits pH 8.1 overeenkomt met de huidige concentratie
aan CO2 in de atmosfeer (380 ppm). De koperoplossingen bij pH 7.8 geven de condities van
oceaanverzuring weer, aangezien pH 7.8 overeenstemt met de voorspelde atmosferische concentratie aan CO2 in 2100 (750 ppm). De koperoplossingen met de juiste zuurtegraad werden
aangemaakt volgens de procedure beschreven in sectie 2.3.2. Voor elke koperconcentratie per
pH-behandeling werden vijf replica’s opgezet. De incubatie van de larven gebeurde volgens
de algemene principes, aangevuld met de geoptimaliseerde parameters. De embryo’s werden
aan de testmediums toegevoegd met een densiteit van 80 embryo’s mL−1 . Als testkamer
werden plastieken cups van 50 mL gebruikt die tot aan de rand gevuld werden en afgedekt
werden met parafilm en een stevige plaat (Figuur 2.2). Op die manier kon de zuurtegraad van
de koperoplossingen niet wijzigen door zuurstofuitwisseling en werd contaminatie vermeden.
De staalname na 48 h gebeurde door de inhoud van de testkamer voorzichtig te mengen en
vervolgens 1 mL staal te pipetteren. De larventest werd geı̈ncubeerd bij 15◦ C en de larven
werden tijdens de test niet gevoed.
40
HOOFDSTUK 2. MATERIAAL EN METHODEN
Figuur 2.2: Opstelling van de definitieve larventest met M. edulis
Analyse en berekening van de waterkwaliteitsparameters
Bij het begin en bij het einde van de larventest werden een aantal waterkwaliteitsparameters
gemeten op de gepoolde replica’s per behandeling. Het aantal mV werd gemeten met een
micro-elektrode (Knick, Portamess) en de pH werd vervolgens berekend volgens Vergelijking
2.3 in sectie 2.2. De alkaliniteit werd gemeten en berekend zoals beschreven in sectie 2.1.
De saliniteit, de geleidbaarheid en de O2 -concentratie werden telkens met dezelfde elektrode
gemeten. Er werden eveneens stalen genomen voor analyse van DOC en van de koperconcentraties. In wat volgt zullen telkens de nominale koperconcentraties gebruikt worden. pCO2 ,
DIC en de saturatiestatus voor calciet en aragoniet werden berekend met het R package
Seacarb (Lavigne et al., 2008).
Aan de hand van een Two-Sample T Test werd onderzocht of er significante verschillen
optraden in de waterkwaliteitsparameters tussen 0 h en 48 h. Daarvoor werden eerst de
voorwaarden voor homoscedasticiteit, normaliteit en onafhankelijkheid nagegaan. Indien er
aan minstens één van deze voorwaarden niet werd voldaan, werd een niet-parametrische
Mann-Whitney U Test toegepast. Het significantieniveau werd ingesteld op 5%.
Analyse van de eindpunten
Na 48 h werden stalen genomen uit de testkamers en werden de eindpunten mortaliteit, normaliteit, abnormaliteit en onvolledige ontwikkeling geanalyseerd. Per testkamer werd telkens
drie keer een staal van 1 mL genomen en voorzichtig gepipetteerd in een multiwell. De analyses gebeurden met behulp van een geinverteerde microscoop (Nikon TMS, Japan).
Voor het eindpunt mortaliteit werd het aantal dode en het aantal levende D-larven geteld. De
2.5. BLOOTSTELLING LARVEN AAN KOPERSTRESS EN OCEAANVERZURING 41
levende larven zwemmen actief rond en kunnen eveneens herkend worden aan hun bewegende
ciliën. De dode larven vertonen geen beweging meer.
De eindpunten normaliteit, abnormaliteit en onvolledige ontwikkeling werden onderzocht op
gefixeerde stalen. Er werd 25 µL 37% formaldehyde aan het 1 mL staal toegevoegd waardoor
de larvale ontwikkeling gestopt werd. Voor het eindpunt normaliteit werd het aantal larven
geteld dat volledig en normaal ontwikkelde tot het D-stadium (Figuur 2.3a). Het eindpunt
abnormaliteit omvatte alle larven die het D-stadium bereikten maar die misvormingen vertoonden, zoals een ingesneden schaalrand (Figuur 2.3b), een uitpuilende mantel (Figuur 2.3c)
of een convex scharnier (Figuur 2.3d). Als derde eindpunt werd het aantal onvolledig ontwikkelde larven geteld. Dit is het aantal larven dat het D-stadium niet bereikte en waarvan
de celdeling en schaalvorming nog niet compleet was.
Figuur 2.3: Overzicht van de types larven van de mossel Mytilus galloprovincialis. a, normale larven; b, abnormale larven met een ingesneden schaalrand; c, abnormale
larven met een uitpuilende mantel; d, abnormale larven met een convex scharnier
(Kurihara et al., 2009)
Statistische analyse en gebruikte software
De statistische verwerking van de resultaten gebeurde in SPSS 16. Er werd gewerkt met
het gemiddelde van de drie tellingen per replica, zodat per koperconcentratie vijf datapunten
voorhanden waren. In de eerste plaats werd met een One-sample Kolmogorov-Smirnov Test
nagegaan of de gegevens normaal verdeeld waren. Vermits dit niet het geval was, werd voor
42
HOOFDSTUK 2. MATERIAAL EN METHODEN
elk eindpunt (mortaliteit, normaliteit, abnormaliteit en onvolledige ontwikkeling) en voor elke
pH-behandeling (8.1 en 7.8) de koperbehandeling vergeleken met de controle aan de hand van
een niet-parametrische Mann-Whitney U test. Aan de voorwaarden van onafhankelijkheid
en homoscedasticiteit werd wel voldaan. De No Observed Effect Concentration (NOEC) en
de Lowest Observed Effect Concentration (LOEC) werden bepaald. De LOEC is de laagste
concentratie waarbij een statistisch significant verschil met de controle geobserveerd werd.
De NOEC is de concentratie net onder de LOEC. Vervolgens werden de koperbehandelingen
tussen de twee pH-behandelingen ten opzichte van elkaar vergeleken met een Mann-Whitney
U test. De verschillen werden steeds significant bevonden indien de p-waarde kleiner was dan
0.05.
De 48 h 50% effect concentraties (EC50) en de 95% betrouwbaarheidsintervallen bij de larventest werden berekend met de trimmed Spearman-Karber methode (Hamilton et al., 1977). Dit
is een niet-parametrische methode waarbij extreme waarden ‘weggetrimd’ worden vooraleer
de EC50 berekend wordt. De gerapporteerde EC50’s zijn gebaseerd op nominale koperconcentraties.
De speciatieberekeningen werden uitgevoerd in Visual MINTEQ 3.0 beta (Gustafsson, 2010).
Visual MINTEQ is een chemisch evenwichtsmodel voor de berekening van onder andere
metaalspeciatie, oplosbaarheidsevenwichten en sorptie in natuurlijke aquatische systemen.
Voor de activiteitscorrectie werd de ‘Specific Ion Interaction’ (SIT) theorie volgens BrønstedGuggenheim-Scatchard toegepast. Meestal wordt hiervoor de Debye-Hückel vergelijking of
de Davies vergelijking toegepast, maar deze zijn beperkt tot zeer lage ionensterktes, respectievelijk 0.1 mol kg−1 en 0.3 mol kg−1 . Vermits de ionensterkte van zeewater ongeveer 0.7 mol
kg−1 bedraagt, zijn deze vergelijkingen in dit geval niet toepasbaar (Zeebe & Wolf-Gladrow,
2001). De SIT theorie kan toegepast worden bij ionensterktes tot ongeveer 3.5 mol kg−1 en
heeft slechts een beperkt aantal empirische parameters nodig als input (Thoenen & Hummel,
2000).
Net zoals bij de adulte kopertest werden de niet-gemeten parameters van het carbonaatsysteem, namelijk DIC, pCO2 en de saturatiestatussen, berekend met het package Seacarb in R
(Lavigne et al., 2008).
Hoofdstuk 3
Resultaten en discussie
3.1
Analysetechniek voor totale alkaliniteit in zeewater
De totale alkaliniteit van een zeewaterstaal werd geanalyseerd m.b.v. een visuele titratie met
methylrood. De performantie van deze vereenvoudigde procedure werd onderzocht door de
gemeten alkaliniteit van drie standaarden (0.5, 1 en 1.25 M Na2 CO3 ) te vergelijken met de
theoretische waarde voor de alkaliniteit (respectievelijk 1000, 2000 en 2500 µM ) (Dickson et
al., 2007). Het rendement van de procedure bedroeg gemiddeld 89%. De gemeten alkaliniteit
was steeds lager dan de theoretische waarde. Dit verschil kan verklaard worden doordat de
titratie uitgevoerd werd in een open systeem en dat het dus mogelijk is dat de concentratie
aan DIC varieerde tijdens de titratie.
3.2
3.2.1
Methoden ter manipulatie van het carbonaatsysteem
Doorborreling met CO2 -gas
Er bestaan verschillende methoden om het carbonaatsysteem van zeewater te manipuleren en
op die manier aquatische organismen tijdens experimenten bloot te stellen aan condities van
oceaanverzuring. Een veel gebruikte methode is het doorborrelen van zeewater met CO2 -gas.
Om deze methode uit te testen werd Instant Ocean zeewater in een gesloten systeem doorborreld met vijf verschillende stroomsnelheden aan CO2 -gas van 750 ppm. De geobserveerde
pH in functie van het tijdstip wordt weergegeven op Figuur 3.1. Daaruit blijkt dat de gewenste pH-reductie tot pH 7.8 enkel bereikt werd met de hoogste stroomsnelheid van 1100 mL
min−1 . In dat geval was de pH eveneens in evenwicht.
43
44
HOOFDSTUK 3. RESULTATEN EN DISCUSSIE
Figuur 3.1: Verloop van de pH van het doorborrelde zeewater in functie van het tijdstip voor
verschillende CO2 -stroomsnelheden
Vervolgens werd onderzocht welke wijzigingen het evenwicht onderging wanneer adulte mosselen toegevoegd werden aan het aquarium met zeewater. Vier opstellingen werden daarvoor
doorborreld met CO2 -gas (1000 mL min−1 ): één aquarium met enkel zeewater, één met zeewater en voedsel, één met zeewater en mosselen en één met zeewater, voedsel en mosselen.
Figuur 3.2 geeft de pH weer in functie van de tijd voor de vier opstellingen. Wanneer mosselen en voedsel aan het systeem toegevoegd werden, bleek dat er een extra verzuring van het
zeewater optrad en het gewenste evenwicht niet bereikt werd.
Figuur 3.2: Verloop van de pH van het doorborrelde zeewater in functie van het tijdstip voor
vier verschillende opstellingen. IO, Instant Ocean zeewater; v, 4 mL voedsel; m,
12 mosselen
Wanneer de pH van normaal zeewater in een gesloten systeem met daarin 12 mosselen
3.2. METHODEN TER MANIPULATIE VAN HET CARBONAATSYSTEEM
45
gedurende ongeveer 20 uur werd opgevolgd, werd eveneens een sterke daling van de pH
waargenomen (Figuur 3.3). De gemeten zuurstofconcentratie van het zeewater in dit systeem
wordt weergegeven op Figuur 3.4. Op basis van deze gegevens en het gemiddelde gewicht van
een gedissecteerde mossel (3.045 g) werd via een trendlijn een zuurstofconsumptie van 0.49
mL O2 h−1 g−1 berekend. Deze waarde is iets hoger dan de gerapporteerde waarden in de
literatuur, namelijk 0.37 mL O2 h−1 g−1 (Vahl, 1973) en 0.38 mL O2 h−1 g−1 (Bayne, 1973).
Figuur 3.3: Verloop van de pH in functie van de tijd voor zeewater in een gesloten systeem
met 12 mosselen
Figuur 3.4: Verloop van de zuurstofconcentratie in functie van de tijd voor zeewater in een
gesloten systeem met 12 mosselen
Uit de resultaten van bovenvermelde experimenten blijkt dat het met de methode van doorborreling van CO2 -gas enkel mogelijk is om de gewenste verzuring van het zeewater te realiseren bij een zeer hoge stroomsnelheid. Dit impliceert een zeer groot verbruik van CO2 -gas, wat
46
HOOFDSTUK 3. RESULTATEN EN DISCUSSIE
in praktijk met onze beschikbare middelen niet haalbaar bleek. Bovendien werd het initiële
evenwicht sterk verstoord door de aanwezigheid en de metabolische activiteit van de mosselen
zelf. Zowel biologische (bv. respiratie en calcificatie) als fysische processen (bv. temperatuur
en uitwisseling van CO2 tussen lucht en zeewater) kunnen de oorspronkelijke condities modificeren (Riebesell et al., 2010). De methode van doorborreling met CO2 -gas werd daarom
tijdens de verdere experimenten niet toegepast.
Een mogelijke oplossing voor de geobserveerde problemen bij deze methode is het gebruik van
een pH-stat systeem. Bij dit systeem wordt de pH continu gemonitord en is er een controller
aanwezig die ervoor zorgt dat de stroomsnelheid van het CO2 -gas automatisch aangepast
wordt wanneer de gemeten pH zich boven of onder een vooropgestelde waarde bevindt. Op
die manier worden pH veranderingen ten gevolge van bijvoorbeeld respiratie gecompenseerd
(Riebesell et al., 2010). Het verlagen van de biomassa/volume ratio en bijgevolg het verlagen
van de biologische activiteit kan eveneens een oplossing bieden.
3.2.2
Additie van HCO−
3 en HCl
De methode voor de manipulatie van het carbonaatsysteem door middel van additie van
NaHCO3 en HCl werd uitgetest. Achtereenvolgens werden NaHCO3 en HCl aan het zeewater toegevoegd en werden de pH en de alkaliniteit gemeten.
Door toevoeging van 122.85 µmol 0.1 M NaHCO3 aan 1 kg artificieel zeewater in een gesloten
systeem steeg de concentratie aan DIC tot het gewenste niveau. De pH wijzigde niet terwijl de alkaliniteit steeg. Er wordt echter voorspeld dat de alkaliniteit door het optreden van
oceaanverzuring niet zal wijzigen. Om deze ongewenste stijging in alkaliniteit te compenseren
werd 122.85 µmol 0.1 M HCl toegevoegd in een gesloten systeem. Daardoor daalde de pH tot
het gewenste niveau en wijzigde de concentratie aan DIC niet meer. De metingen van de pH
en TA kwamen overeen met de simulaties die uitgevoerd werden met het R package Seacarb
(Lavigne et al., 2008) (Figuur 3.5).
Uit de resultaten blijkt dat deze methode, de additie van NaHCO3 en HCl, in praktijk goed
toegepast kan worden voor experimenten met larvale mosselstadia. De manipulatie kan erg
precies uitgevoerd worden en bootst de veranderingen in het carbonaatsysteem door oceaanverzuring zeer nauwkeurig na.
Figuur 3.6 geeft een overzicht van de wijzigingen in het carbonaatsysteem (TA en DIC) als
gevolg van manipulatie door verschillende methoden. Door doorborreling van zeewater met
CO2 -gas stijgt DIC terwijl de alkaliniteit niet wijzigt. Deze methode bleek echter moeilijk
praktisch uitvoerbaar bij experimenten met adulte mosselen. Het toevoegen van een sterk
zuur veroorzaakt een dalende alkaliniteit bij constante DIC. De methode die toegepast zal
3.3. BLOOTSTELLING VAN ADULTE MOSSELEN AAN KOPERSTRESS
47
Figuur 3.5: Overzicht van de methode om het carbonaatsysteem te manipuleren door additie
van NaHCO3 en HCl. In de tabellen worden de waarden voor de componenten
van het carbonaatsysteem weergegeven die gesimuleerd werden met Seacarb. (1)
Initiële toestand van het zeewater; (2) Toestand van het zeewater na toevoeging
van NaHCO3 ; (3) Toestand van het zeewater na toevoeging van NaHCO3 en HCl;
(a) x 10−6 mol kg−1
worden voor het blootstellen van mossellarven aan oceaanverzuring is de additie van NaHCO3
en HCl. Dit veroorzaakt eerst een stijging in DIC en alkaliniteit, gevolgd door een daling
in alkaliniteit bij constante DIC. Dezelfde methode kan ook uitgevoerd worden met Na2 CO3
i.p.v. NaHCO3 .
3.3
Blootstelling van adulte mosselen aan koperstress
Tijdens dit experiment werden adulte mosselen gedurende 14 dagen blootgesteld aan vier
koperbehandelingen, namelijk 0, 10, 32 en 100 µg Cu L−1 . Het effect van de koperstress op
de mosselen werd onderzocht op basis van twee cellulaire biomarkers, namelijk CEA en LMS.
48
HOOFDSTUK 3. RESULTATEN EN DISCUSSIE
Figuur 3.6: Veranderingen in het carbonaatsysteem door verschillende manipulatiemethoden
bij 15◦ C en saliniteit 33.3. De figuur werd gecreëerd met behulp van de Seacarb
functie ‘oa’ (Lavigne et al., 2008)
3.3.1
Analyse en berekening van de waterkwaliteitsparameters
Om de kwaliteit van het water in de testaquariums te karakteriseren, werden gedurende de
adulte kopertest elke dag acht waterparameters gemeten. pCO2 , DIC en de saturatiestatus
voor calciet en aragoniet werden berekend op basis van de gemeten pH en alkaliniteit met
het R package Seacarb (Lavigne et al., 2008). De data worden weergegeven in Tabel A.1 en
Tabel A.2 in Appendix A.
Uit statistische analyse van de gemiddelde meetwaarden over 14 dagen bleek dat er geen significante verschillen waren in de waterkwaliteitsparameters tussen de vier koperbehandelingen
(0, 10, 32 en 100 µg L−1 , nominale concentraties). Voor elke koperbehandeling werden de
mosselen verspreid over twee aquariums om aquariumeffecten in kaart te brengen. Tussen de
twee aquariums per koperconcentratie bleken er geen statistisch significante verschillen op te
treden in de gemiddelde waarden van de waterkwaliteitsparameters over 14 dagen.
3.3. BLOOTSTELLING VAN ADULTE MOSSELEN AAN KOPERSTRESS
49
Er dient wel opgemerkt te worden dat de gemiddelde pH van het zeewater over 14 dagen
bij alle behandelingen beduidend lager was dan de waarde in natuurlijke omstandigheden,
namelijk 8.1. De pH van het aangemaakte Instant Ocean zeewater bedroeg gemiddeld 8.06
maar nadat de mosselen aan de aquariums toegevoegd werden, daalde deze pH tot gemiddeld
7.95. Uit de standaardafwijkingen in Tabel A.1 in Appendix A blijkt bovendien dat de gemeten pH ook sterk varieerde van dag tot dag. Deze daling en variatie in pH werden mogelijk
veroorzaakt door de respiratie en de calcificatie van de aanwezige mosselen. De berekende
pCO2 bedroeg gemiddeld 717 ppm, wat dichter aanleunt bij een scenario van oceaanverzuring (793 ppm CO2 in 2100) dan bij het huidige gehalte (384 ppm CO2 ) (Tabel 1.1). Het is
mogelijk dat de mosselen naast de toxiciteit door koper, extra stress ondervonden door de
lage pH en de hoge pCO2 .
De saturatiestatus voor calciet en aragoniet (Tabel A.2 in Appendix A) was steeds groter
dan één, wat er op wijst dat het zeewater in de aquariums steeds overgesatureerd was. Er
trad dus op geen enkel moment dissolutie van calciet en aragoniet op.
3.3.2
Cellular Energy Allocation (CEA)
Om het effect van stress door koper op het energiebudget van de mossel M. edulis te onderzoeken, werd de biomarker CEA gebruikt. Daarbij werd de hoeveelheid beschikbare en
geconsumeerde energie bepaald. De beschikbare energie omvat de energie die vervat zit in de
hoeveelheden proteı̈nen, koolhydraten en lipiden aanwezig in de verteringsklier. De verdeling
van deze drie fracties bij de controlebehandeling op 0 d wordt weergegeven op Figuur 3.7.
Het is duidelijk dat de meeste beschikbare energie aanwezig was onder de vorm van lipiden
(58%), gevolgd door proteı̈nen (26%) en koolhydraten (16%).
Figuur 3.7: Gemiddelde energie in de vorm van proteı̈nen, koolhydraten en lipiden bij 0 µg
Cu L−1 op 0 d. De foutenbalken geven de gemiddelde standaardafwijking weer
van 24 replica’s
50
HOOFDSTUK 3. RESULTATEN EN DISCUSSIE
Voor elke energiefractie werd een eventuele correlatie nagegaan door de gemiddelde energie
per aquarium op 0 d te plotten ten opzichte van 14 d. Voor proteı̈nen, koolhydraten, lipiden
en ETS bedroegen de correlatiecoëfficiënten respectievelijk 0.19, 0.03, 0.13 en 0.28. Dit wijst
erop dat de data op 0 d en 14 d niet gecorreleerd waren.
Voor de proteı̈nenfractie werd geen statistisch significant verschil in energiehoeveelheid
vastgesteld tussen de controlebehandeling (0 µg Cu L−1 ) op 0 d en 14 d (Figuur 3.8). Voor
de controlebehandeling op 0 d werden 24 stalen onderzocht, verdeeld over acht aquariums. Er
werden geen statistisch significante verschillen tussen de aquariums onderling waargenomen
(Figuur A.1 in Appendix A).
Bij de stalen die geanalyseerd werden na 14 dagen blootstelling aan vier koperbehandelingen,
werden significante verschillen (p<0.05) waargenomen in de energie in de vorm van proteı̈nen
(Figuur 3.8). De energiefracties bij de koperbehandelingen 32 µg Cu L−1 en 100 µg Cu L−1
waren significant lager dan de energiefractie bij de controle (0 µg Cu L−1 ).
Per koperbehandeling werden stalen afkomstig uit twee aquariums geanalyseerd. Er werden
geen significante verschillen in energiefractie in de vorm van proteı̈nen op 14 d vastgesteld
tussen de twee aquariums per koperconcentratie (Figuur A.2 in Appendix A).
Figuur 3.8: Gemiddelde energie in de vorm van proteı̈nen voor de controlebehandeling (0
µg Cu L−1 ) op 0 d en voor de controle en de drie koperbehandelingen bij 14 d.
De sterretjes geven significante verschillen in energie weer ten opzichte van de
controlebehandeling bij 14 d. De foutenbalken stellen de gemiddelde standaardafwijking voor van zes replica’s per koperconcentratie
Vervolgens werd de beschikbare energie in de vorm van koolhydraten onderzocht. Statis-
3.3. BLOOTSTELLING VAN ADULTE MOSSELEN AAN KOPERSTRESS
51
tische analyse toonde aan dat er geen significante verschillen waren tussen de energie op 0
d en 14 d bij de controlebehandeling (0 µg Cu L−1 ) (Figuur 3.9). Ook tussen de aquariums
onderling bij 0 µg Cu L−1 op 0 d werden geen significante verschillen vastgesteld (Figuur A.3
in Appendix A).
De energie in de vorm van koolhydraten bij 32 µg Cu L−1 en bij 100 µg Cu L−1 was significant
verschillend (p<0.05) ten opzichte van de fractie bij 0 µg Cu L−1 (Figuur 3.9).
Figuur 3.9: Gemiddelde energie in de vorm van koolhydraten voor de controlebehandeling
(0 µg Cu L−1 ) op 0 d en voor de controle en de drie koperbehandelingen bij
14 d. De sterretjes geven significante verschillen in energie weer ten opzichte
van de controlebehandeling bij 14 d. De foutenbalken stellen de gemiddelde
standaardafwijking voor van zes replica’s per koperconcentratie
Bij de koolhydratenanalyses op 14 d werden bovendien aquariumeffecten vastgesteld (p<0.05).
Bij de koperbehandelingen 10, 32 en 100 µg Cu L−1 was de energiehoeveelheid significant
verschillend tussen respectievelijk de aquariums 1 en 6, 4 en 5 en 2 en 3 (Figuur A.4 in Appendix A). Er werden echter geen opmerkelijke verschillen in de waterkwaliteitsparameters
tussen de aquariums onderling waargenomen.
De beschikbare energie in de vorm van lipiden verschilde niet significant tussen de controlebehandelingen (0 µg Cu L−1 ) bij 0 d en 14 d (Figuur 3.10). Bij de controlebehandelingen op
0 d werden geen significante aquariumeffecten waargenomen (Figuur A.5 in Appendix A).
Statistische analyses van de energiefracties in de vorm van lipiden bij 14 d toonden geen significante effecten van de koperconcentratie (Figuur 3.10) en geen significante aquariumeffecten
(Figuur A.6 in Appendix A) aan.
52
HOOFDSTUK 3. RESULTATEN EN DISCUSSIE
Figuur 3.10: Gemiddelde energie in de vorm van lipiden voor de controlebehandeling (0 µg
Cu L−1 ) op 0 d en voor de controle en de drie koperbehandelingen bij 14 d. De
foutenbalken geven de gemiddelde standaardafwijking weer van zes replica’s per
koperconcentratie
De hoeveelheid geconsumeerde energie werd bepaald aan de hand van analyses van de
Elektron Transport Systeem (ETS) activiteit. In dit geval werd wel een significant effect
(p<0.05) vastgesteld tussen de energiehoeveelheden bij de controlebehandelingen (0 µg Cu
L−1 ) op 0 d en 14 d (Figuur 3.11). Bij het gemiddelde energieverbruik op 0 d werden geen
significante effecten van het onderzochte aquarium waargenomen (Figuur A.7 in Appendix A).
Er waren geen significante effecten tussen de verschillende koperbehandelingen ten opzichte
van de controle bij 14 d (Figuur 3.11). Bij 100 µg Cu L−1 was er wel een significant effect
(p<0.05) tussen het energieverbruik geanalyseerd in aquarium 2 en 3 (Figuur A.8 in Appendix A).
Zowel de hoeveelheid energie in de vorm van proteı̈nen als koolhydraten waren dus significant
lager bij de mosselen die gedurende 14 dagen blootgesteld werden aan 32 en 100 µg Cu L−1
ten opzichte van de controlebehandeling na 14 dagen. Voor de proteı̈nenfractie daalde het
energiegehalte met 29% en 30% bij respectievelijk 32 en 100 µg Cu L−1 . De energie-inhoud
onder de vorm van koolhydraten daalde met 27% en 30% bij respectievelijk 32 en 100 µg Cu
L−1 . Hieruit blijkt dat de afname bij proteı̈nen en koolhydraten en bij beide koperconcentraties ongeveer even groot was.
De meeste energie bij de testorganismen was beschikbaar onder de vorm van lipiden. Na 14
dagen blootstelling aan koper werd een daling in deze energiehoeveelheid ten opzichte van de
controlebehandeling waargenomen bij 10 en 32 µg Cu L−1 en een toename met 6% bij 100
µg Cu L−1 . Deze veranderingen waren echter niet significant.
3.3. BLOOTSTELLING VAN ADULTE MOSSELEN AAN KOPERSTRESS
53
Figuur 3.11: Gemiddeld energieverbruik voor de controlebehandeling (0 µg Cu L−1 ) op 0 d en
voor de controle en de drie koperbehandelingen bij 14 d. De foutenbalken geven
de gemiddelde standaardafwijking weer van zes replica’s per koperconcentratie
Er werd dus een afname in de reserves aan proteı̈nen en koolhydraten geobserveerd. Uit de
literatuur blijkt dat mosselen bij voorkeur koolhydraten en lipiden gebruiken als substraat
(Gosling, 1992). Proteı̈nen vormen de primaire structurele en functionele elementen van het
lichaam. Vermits de omzetting en de depositie van proteı̈nen energetisch duur is, worden deze
energiereserves enkel in stresssituaties gebruikt (Bayne & Thompson, 1970, Gosling, 1992).
Wat de hoeveelheid geconsumeerde energie betreft werden na 14 dagen blootstelling geen significante verschillen in ETS activiteit ten opzichte van de controle op 14 d waargenomen. Dit
wijst erop dat de koperbehandelingen geen significant effect hadden op het energieverbruik
van de mosselen.
Wanneer de ETS activiteit van de mosselen die geanalyseerd werden na 14 dagen, vergeleken
werd met de controlemosselen die op 0 d onderzocht werden, werd voor de vier behandelingen
(0, 10, 32 en 100 µg Cu L−1 ) een stijging in het energieverbruik na 14 dagen opgemerkt. Bij
de blootstelling aan 0 en 32 µg Cu L−1 was deze stijging significant, namelijk respectievelijk
42% en 45%. Dit is logisch vermits de analyse van het ETS de metabolische activiteit over
een periode van verschillende weken integreert. Dit in tegenstelling tot directe metingen van
de actuele respiratie, die enkel een momentopname weergeven. Mede doordat het ETS minder onderhevig is aan experimentele artefacten en aan kortetermijnfluctuaties gedurende het
meetproces, is de analyse van het ETS een betere indicator dan de meting van de respiratiesnelheid (Fanslow et al., 2001, Cammen et al., 1990).
54
HOOFDSTUK 3. RESULTATEN EN DISCUSSIE
De geobserveerde reducties in de beschikbare energie, onder de vorm van proteı̈nen en koolhydraten, kunnen het gevolg zijn van twee fenomenen of van een combinatie van beide. De
eerste mogelijkheid is dat de mosselen een grotere hoeveelheid proteı̈nen en koolhydraten
verbruikt hadden. Wanneer er namelijk meer energie verbruikt wordt voor de metabolische
activiteit (bv. voor onderhoud en reproductie) dan er opgenomen wordt, worden de energiereserves uitgeput. Er werd echter geen significante toename in het energieverbruik geobserveerd,
waardoor dit eerste fenomeen niet erg waarschijnlijk is.
De tweede mogelijke verklaring is dat er in de verteringsklier van de mosselen minder proteı̈nen
en koolhydraten aangemaakt werden. Voedselconsumptie vormt de belangrijkste bron van
energie voor de mosselen. De geassimileerde nutriënten worden ofwel gekataboliseerd om
energie te verschaffen om de levensprocessen te ondersteunen, ofwel worden ze afgezet als
reserves onder de vorm proteı̈nen, koolhydraten of lipiden (Gosling, 1992). Wanneer de voedingsactiviteit van de mosselen vermindert en er dus minder nutriënten opgenomen worden,
zal dit gevolgen hebben op twee vlakken. Enerzijds zal er minder energie beschikbaar zijn
voor de levensprocessen, waardoor de organismen hun energiereserves moeten aanspreken en
dit resulteert in de uitputting ervan (zie eerste mogelijkheid). Anderzijds zijn er minder nutriënten beschikbaar en zullen er daardoor minder reserves aan proteı̈nen, koolhydraten en
lipiden aangemaakt worden.
De afname in beschikbare energie kan bijgevolg best verklaard worden door een reductie in
de voedselopname door de mosselen. Bij verschillende organismen werd reeds geobserveerd
dat hun voedselopname vermindert onder condities van toxische stress. Filtratie en ingestie
bij Daphnia magna verminderden wanneer ze gedurende 24 h blootgesteld werden aan toenemende concentraties aan kopersulfaat (0.01, 0.02, 0.05 en 0.08 mg L−1 ) (Ferrando & Andreu,
1993). Bij de zoetwater amphipode Gammarus fossarum werd een reductie in de voedingsactiviteit waargenomen bij de organismen die zich bevonden op sites met een ernstige metaalcontaminatie (As, Cd, Cu en Zn) (Dedourge-Geffard et al., 2009). Ook voor de mariene mossel
Mytilus edulis werd een gelijkaardig fenomeen geobserveerd. De voedselopname werd gereduceerd bij mosselen die blootgesteld werden aan sediment dat gecontamineerd was met zware
metalen en Polycyclische Aromatische Koolwaterstoffen (PAK’s) (Eertman et al., 1995).
De geobserveerde reductie in de beschikbare energie kan sterke negatieve gevolgen hebben
voor de organismen. De energiereserves zijn namelijk essentieel om de mosselen te ondersteunen gedurende suboptimale condities of tijdens periodes van lage voedselbeschikbaarheid.
Organismen gebruiken energie hoofdzakelijk voor groei, reproductie, onderhoud en basaal
metabolisme. Wanneer een organisme toxische stress ondervindt, zal het meer energie verbruiken om zijn basaal metabolisme op peil te houden zodat de primaire levensprocessen
toch kunnen blijven doorgaan. Daardoor zal er minder energie beschikbaar zijn voor groei
3.3. BLOOTSTELLING VAN ADULTE MOSSELEN AAN KOPERSTRESS
55
en reproductie wat kan leiden tot aantasting van bijvoorbeeld de ontwikkelingsprocessen (De
Coen & Janssen, 2003, Smolders et al., 2004).
3.3.3
Lysosomal Membrane Stability (LMS)
Om te bepalen wat het effect was van koperstress op de lysosomale stabiliteit van de mosselen, werd de retentietijd van de kleurstof neutral red in de lysosomen bepaald. Op dag
0 werden 48 niet-blootgestelde mosselen, die tijdens de acclimatisatie verdeeld waren over 8
aquariums, geanalyseerd bij wijze van controle. Vervolgens werden mosselen gedurende 14
dagen blootgesteld aan een controle en drie koperbehandelingen (0, 10, 32 en 100 µg Cu
L−1 ). Per behandeling werden 12 mosselen blootgesteld, die telkens verdeeld zaten over twee
aquariums om mogelijke aquariumeffecten in kaart te brengen.
De gemiddelde retentietijden per aquarium op 0 d werden uitgezet ten opzichte van de retentietijden per aquarium op 14 d. Vermits de correlatiecoëfficiënt 0.16 bedroeg, waren de
retentietijden bij het begin en op het einde van de test niet gecorreleerd.
Uit de statistische analyse bleek dat er geen significant verschil was tussen de retentietijden
bij de controlebehandelingen (0 µg Cu L−1 ) op 0 d en 14 d (Figuur 3.12). Tussen de acht nietblootgestelde aquariums bij het begin van de test (0 d en 0 µg Cu L−1 ) werden wel significante
verschillen (p<0.05) vastgesteld (Figuur A.9 in Appendix A). Er werden nochtans geen opmerkelijke verschillen opgemerkt in de waterkwaliteitsparameters tussen de acht aquariums.
Mogelijk beı̈nvloeden de mosselen binnen een aquarium elkaars responsen of verschillen de
aquariums onderling op één of andere ongekende manier van elkaar.
Mosselen met een retentietijd groter of gelijk aan 120 min worden aanzien als gezonde organismen. Indien de retentietijd kleiner is dan 120 min maar groter of gelijk aan 50 min, zijn
de organismen matig gestresseerd maar kunnen ze deze effecten eventueel nog compenseren.
Mosselen met een retentietijd kleiner dan 50 min zijn ernstig gestresseerd en ondervinden
sterke nadelige effecten op hun gezondheid (Moore et al., 2004). De mosselen uit aquarium
7, 4 en 3 hadden een retentietijd kleiner dan 120 min maar wel groter of gelijk aan 50 min
(Figuur A.9 in Appendix A). Dit wijst erop dat, ondanks het feit dat de mosselen nog geen
koperblootstelling ondergaan hadden, ze toch al matig gestresseerd waren.
Er was een significant verschil (p<0.05) tussen de retentietijd van de mosselen die gedurende
14 dagen blootgesteld werden aan 100 µg Cu L−1 ten opzichte van de niet-blootgestelde mosselen (0 µg Cu L−1 ) op 14 d (Figuur 3.12). Vermits de retentietijd bij de vier behandelingen
steeds tussen 120 min en 50 min lag, ondervonden alle mosselen, ook deze uit de controlebehandeling, na 14 dagen een matige stress.
56
HOOFDSTUK 3. RESULTATEN EN DISCUSSIE
In een gelijkaardige studie van Brown et al. (2004) werd een significante reductie in de retentietijd waargenomen na zeven dagen blootstelling van de mossel M. edulis aan 68.1 µg Cu
L−1 . Er werd gesuggereerd dat, ongeacht het testorganisme, de membraanstabiliteit steeds
één van de eerste parameters is die verstoord wordt door blootstelling aan koper vermits het
een algemene indicator is van de stress die een organisme ondervindt (Brown et al., 2004).
Figuur 3.12: Gemiddelde retentietijd voor de controlebehandeling (0 µg Cu L−1 ) op 0 d en
voor de controle en de drie koperbehandelingen bij 14 d. Het sterretje geeft een
significant verschil in retentietijd weer ten opzichte van de controle bij 14 d. De
foutenbalken geven de gemiddelde standaardafwijking weer van twaalf replica’s
per koperconcentratie
Bij de controlebehandeling (0 µg Cu L−1 ) op 14 d was er een significant verschil in retentietijd
(p<0.05) tussen de twee onderzochte aquariums, namelijk aquarium 7 en 8 (Figuur A.10 in
Appendix A). Een mogelijke verklaring hiervoor is dat de pCO2 in aquarium 7 gemiddeld
gedurende de 14 dagen hoger was dan in aquarium 8, namelijk respectievelijk 707 ppm ten
opzichte van 682 ppm. Uit Figuur A.10 in Appendix A blijkt dat de verschillen tussen de
aquariums afnamen met toenemende koperconcentratie. De mosselen in de aquariums 7, 6,
4, 5, 2 en 3 waren matig gestresseerd. De mosselen ondervonden na 14 dagen in geen enkel
geval ernstige stress aangezien de retentietijd nooit kleiner dan 50 min was.
De lysosomen van mosselen zijn in staat zware metalen, zoals koper, te accumuleren en
intracellulair te verteren. Ze vormen op die manier een belangrijk cellulair compartiment
voor de detoxificatie van contaminanten (Moore et al., 2004). Indien de concentratie aan
toxische metalen te hoog wordt, resulteert dit echter in lysosomale schade zoals in dit experiment geobserveerd werd. Er werd een significante reductie in de retentietijd van de
kleurstof neutral red geobserveerd na blootstelling aan 100 µg Cu L−1 , wat er op wijst dat
3.3. BLOOTSTELLING VAN ADULTE MOSSELEN AAN KOPERSTRESS
57
de lysosomale membranen destabiliseerden. De membranen werden fragieler en de integriteit
verminderde, waardoor lekkage van hydrolytische enzymen in het cytosol kan optreden. Deze
enzymen kunnen daar ernstige cellulaire schade aanrichten. Er werd eveneens een vergroting
of zwelling van de lysosomen opgemerkt. Het is mogelijk dat de lysosomen fuseren zodat
grotere organellen geproduceerd worden die betrokken zijn bij autofage processen waarbij
eigen celmateriaal verteerd wordt. Deze effecten resulteren uiteindelijk in een reductie van
de gezondheidsstatus van de mossel.
In een aantal studies op M. galloprovincialis werd aangetoond dat een gereduceerde neutral
red retentietijd positief gecorreleerd is met de concentratie aan contaminanten (bv. koper) in
de weefsels van de mosselen (Castro et al., 2004, Martinez-Gomez et al., 2008). De schade
aan het lysosomale systeem gaat namelijk vaak vooraf aan ernstige schade aan cellen en
weefsels. Daarom is LMS dus ideaal als vroege indicator van het schadelijke effect van een
koperblootstelling (Moore et al., 2006).
Het mechanisme waarmee zware metalen de lysosomale functie beı̈nvloeden, is nog niet
volledig gekend. In een onderzoek op M. galloprovincialis werd gesuggereerd dat de lekkage
van de lysosomale inhoud in het cytosol het gevolg is van schade aan de protonpomp. De zure
omgeving van de lysosomen wordt namelijk onderhouden door een membraan Mg2+ -ATPase
dat afhankelijk is van een H+ ion protonpomp (Martinez-Gomez et al., 2008). Viarengo et
al. (2000) observeerde bij M. galloprovincialis een stijging in lysosomale pH die geı̈nduceerd
werd door blootstelling aan Cd en Hg. Voor koper werd dit effect echter niet onderzocht.
Ook hier werd gesuggereerd dat de lysosomale membraandestabilisatie gelinkt is aan deze
pH-stijging, die waarschijnlijk ontstaat door inhibitie van de lysosomale membraan protonpomp (Viarengo et al., 2000).
Er wordt eveneens verondersteld dat het Ca2+ dat aanwezig is in het cytosol, betrokken is
bij de effecten van metalen op lysosomen (Viarengo et al., 2000). Dit werd eerst aangetoond
met het hormoon oestradiol op M. galloprovincialis (Burlando et al., 2002). Na blootstelling
van hemolymfe cellen aan 17β-oestradiol werd een toename in de concentratie aan cytosolisch
Ca2+ ([Ca2+ ]i ) geobserveerd. Volgens welk mechanisme deze toename tot stand kwam, werd
niet vastgesteld. Via de NRR assay werd daarenboven een destabilisatie van de lysosomale
membranen opgemerkt. Er werd gesuggereerd dat er een strikte associatie bestaat tussen
deze membraan destabilisatie en de [Ca2+ ]i toename. De destabilisatie van de membranen
zou voornamelijk gebeuren door een Ca2+ afhankelijk mechanisme dat een activatie van het
Ca2+ afhankelijk cytosolisch fosfolipase A2 (cPLA2) met zich meebrengt. Fosfolipase A2
is een klasse van fosfolipasen, dit zijn enzymen die fosfolipiden hydroliseren tot vetzuren
en andere lipofiele substanties. Ze zijn betrokken bij verschillende processen in cellen zoals
de inflammatoire respons (Murakami & Kudo, 2002). De activiteit van het cPLA2 kan
58
HOOFDSTUK 3. RESULTATEN EN DISCUSSIE
verschillende membraanstructuren beı̈nvloeden, mogelijk dus ook de lysosomale membranen
(Burlando et al., 2002).
Na blootstelling van hemolymfe cellen van de mossel M. galloprovincialis aan 50 µM Cu2+
(≈ 3.2 mg Cu L−1 ) werden dezelfde conclusies getrokken. Er werden eveneens een stijging in
de cytosolische calciumconcentratie en een destabilisatie van de lysosomale membranen geobserveerd. Wanneer de hemolymfe cellen op voorhand blootgesteld werden aan een specifieke
inhibitor van het cPLA2, werd er minder destabilisatie van de membranen waargenomen.
Deze gegevens tonen aan dat het cPLA2 betrokken is bij de lysosomale membraan destabilisatie door zware metalen. Een toename in [Ca2+ ]i start namelijk een cascade die leidt tot de
activatie van het cPLA2 (Marchi et al., 2004).
Tot slot moet opgemerkt worden dat de lysosomale destabilisatie ook geı̈nduceerd kan worden
door niet-chemische stressoren. Een goede biomarker moet ongevoelig zijn voor omgevingsfactoren, maar het is toch mogelijk dat de respons in beperkte mate varieert met milieufactoren
zoals de temperatuur, de saliniteit en de ouderdom van het organisme (Brown et al., 2004).
Het is bovendien belangrijk dat de mosselen bij de sampling en gedurende de acclimatisatie zo
weinig mogelijk gestresseerd worden. Om extra stress te vermijden werden de byssusdraden
steeds doorgesneden i.p.v. losgetrokken en werden extreme temperaturen vermeden.
3.4
3.4.1
Blootstelling van larven aan koperstress in combinatie
met oceaanverzuring
Blootstelling van oesterlarven aan koperstress
Er werden een acute (24 h) en een chronische test (14 d) uitgevoerd waarbij oesterlarven van
ongeveer 48 h oud blootgesteld werden aan een range van koperconcentraties. De initiële concentratie aan larven werd bepaald m.b.v. een Sedgwick-Rafter telkamer en bedroeg ongeveer
600 larven mL−1 . De oesterlarven werden aan de testoplossingen toegevoegd met een densiteit van 10 larven mL−1 .
Tijdens de acute test werden de oesterlarven 24 h blootgesteld aan 1, 5, 10, 40 en 100 µg
Cu L−1 . Deze oplossingen werden aangemaakt in artificieel zeewater en in Instant Ocean
zeewater. Na 24 h werd de mortaliteit bepaald in 1 mL staal maar er werden telkens slechts
gemiddeld 4 (± 4) larven teruggevonden in dit staal. Vermits onvoldoende larven geobserveerd werden en er een grote standaardafwijking was, kon de mortaliteit niet bepaald
worden.
Bij de chronische test werden de larven blootgesteld aan 10 en 40 µg Cu L−1 gedurende 14
d. Na 14 d werden in stalen van 1 mL zeer weinig tot geen larven geobserveerd. De bepaling
3.4. BLOOTSTELLING LARVEN AAN KOPERSTRESS EN OCEAANVERZURING 59
van de mortaliteit en de lengtemetingen konden daardoor niet uitgevoerd worden. Het is
mogelijk dat een deel van de larven verloren ging tijdens het zeven.
De bovenvermelde problemen benadrukken het belang van een goede schatting van de initiële
larvenconcentratie. Om ervoor te zorgen dat steeds voldoende larven in de stalen aanwezig
zijn, kan het verder opconcentreren van de larven een oplossing bieden.
3.4.2
Optimalisatie van spawning en bevruchting bij de mossel Mytilus
edulis
Vooraleer mossellarven bloot te stellen aan koperstress en oceaanverzuring, werd de procedure
geoptimaliseerd om spawning te induceren bij adulte mosselen en bevruchting te realiseren.
Daarvoor werden twee methoden uitgeprobeerd en op basis van de resultaten werd de beste
methode geselecteerd.
Methode 1
In de eerste methode werden de adulte mosselen elk in een aparte weckpot geplaatst en werd
de embryosuspensie na de bevruchting niet extra gezeefd. Het percentage bevruchte eicellen
bedroeg in dit geval gemiddeld 42%. Vermits dit lager is dan de vooropgestelde 80%, was de
bevruchting niet succesvol.
Methode 2
In de tweede methode werden de mosselen allemaal samen in een aquarium in het thermostatisch bad geplaatst om de spawning te induceren. Van zodra de spawning startte, werd
de betreffende mossel overgebracht naar een aparte weckpot met artificieel zeewater. Na een
half uur werden de zaad- en eicellen weggegoten en werd de mossel in een nieuwe weckpot
geplaatst. In dit geval werd de embryosuspensie nogmaals gezeefd over 54 en 22 µm. Bij
deze methode gebeurde de inductie van de spawning sneller, mogelijk doordat het spawninggedrag van de mosselen gestimuleerd werd doordat steeds een kleine hoeveelheid zaad- en
eicellen achterbleef in het aquarium. Het percentage bevruchte eicellen bedroeg 82%, wat
impliceert dat de bevruchting succesvol was. Ook het percentage embryo’s dat ontwikkelde
tot het D-stadium (het stadium waarbij de larven een karakteristieke D-vorm vertonen door
aanwezigheid van de eerste larvale schaal) was in dit geval groter dan bij de eerste methode
(respectievelijk gemiddeld 93% t.o.v. 18%). Aangezien de tweede methode de beste resultaten
opleverde, werd de definitieve larventest volgens deze methode uitgevoerd.
3.4.3
Optimalisatie van de larventest met de mossel Mytilus edulis
Na de optimalisatie van de spawning en de bevruchting werd de procedure voor de incubatie
van de larventest geoptimaliseerd. Daarvoor werd de invloed van vier parameters op de
60
HOOFDSTUK 3. RESULTATEN EN DISCUSSIE
larvale ontwikkeling in de controlebehandeling (pH 8.1 en 0 µg Cu L−1 ) na 48 h onderzocht.
Parameter 1: densiteit toegevoegde embryo’s
Drie verschillende densiteiten van de embryo’s die toegevoegd werden aan het testmedium
werden onderzocht. Bij een densiteit van 15, 30 en 45 embryo’s mL−1 bedroeg het percentage
embryo’s dat ontwikkelde tot het D-stadium respectievelijk 27%, 31% en 38%. Bij deze
larventest werden de spawning en de bevruchting uitgevoerd volgens methode 1 (zie sectie
2.5.2), waardoor de percentages D-larven vrij laag zijn. Hoe hoger de densiteit, hoe hoger
het percentage D-larven. De larventest wordt dus best uitgevoerd met een hoge densiteit
aan embryo’s, maar deze densiteit mag ook niet te hoog zijn vermits er dan risico’s op
misvormingen ontstaan.
Parameter 2: type testkamer
Om na te gaan of er een invloed is van het recipiënt of de testkamer waarin de larventesten
uitgevoerd worden, werd de larvale ontwikkeling bestudeerd in zowel plastieken als glazen
testkamers met een volume van 50 mL. De spawning en de bevruchting werden in dit geval
uitgevoerd volgens methode 2 (zie sectie 2.5.2). In de plastieken cups bedroeg het percentage
D-larven na 48 h 93%, terwijl het in de glazen testkamers 87% bedroeg. Het percentage was
iets hoger in de plastieken testkamers en daarom werd bij de definitieve larventest met dit
type gewerkt.
Parameter 3: testmedium
Twee types van testmediums waarin de koperoplossingen aangemaakt worden, werden uitgetest, namelijk artificieel zeewater en gefilterd zeewater. Bij deze larventest gebeurden de
spawning en de bevruchting volgens methode 2 (zie sectie 2.5.2). Het percentage larven dat
ontwikkelde tot het D-stadium bedroeg 93% in het artificieel zeewater en 91% in het gefilterd
zeewater. Er bleek geen significant verschil te bestaan tussen beide mediums.
Parameter 4: staalnametechniek
Drie technieken om na 48 h een 1 mL staal uit de testkamers te nemen en te analyseren,
werden onderzocht. Indien de volledige inhoud (50 mL) van de testkamer gezeefd werd over
15 µm en terug opgelost werd in een kleiner volume artificieel zeewater, waren de larven
veel te geconcentreerd en konden de eindpunten niet nauwkeurig bepaald worden. De tweede
techniek die onderzocht werd, was het schuin houden van de testkamer zonder ze te mengen,
de larven even te laten bezinken en vervolgens op te pipetteren van op de bodem. De derde
techniek omvatte het voorzichtig mengen van de inhoud van de telkamer met de pipetpunt
en vervolgens het pipetteren van het staal. Vermits bij de derde techniek ongeveer 46%
3.4. BLOOTSTELLING LARVEN AAN KOPERSTRESS EN OCEAANVERZURING 61
meer larven teruggevonden werden in het staal dan bij de tweede techniek, werd deze derde
techniek gebruikt bij de definitieve larventest.
3.4.4
Blootstelling van mossellarven aan koperstress in combinatie met
oceaanverzuring
Ontwikkelende larven van de mossel M. edulis werden gedurende 48 h blootgesteld aan koperoplossingen met concentraties 0, 1, 2, 4, 8, 16 en 32 µg Cu L−1 . Deze koperoplossingen werden
aangemaakt in artificieel zeewater met enerzijds pH 8.1 als controlebehandeling en anderzijds
pH 7.8 als conditie van oceaanverzuring.
Analyse en berekening van de waterkwaliteitsparameters
Bij het begin (0 h) en op het einde (48 h) van de larventest werden het aantal mV, de saliniteit, de geleidbaarheid, de alkaliniteit en de O2 -concentratie van de oplossingen gemeten.
De pH werd berekend zoals beschreven in sectie 2.2. Met behulp van het R package Seacarb
werden de pCO2 , DIC en de saturatiestatus van calciet en aragoniet berekend (Lavigne et
al., 2008). In Tabel B.1 en Tabel B.2 in Appendix B worden de waarden voor de gemeten en
berekende waterkwaliteitsparameters weergegeven.
Figuur 3.13 geeft de berekende pH in functie van de nominale koperconcentratie weer. Zowel
bij de pH-behandeling van 8.1 als 7.8 werd na 48 h een significante afname van de gemeten pH met gemiddeld 0.14 (± 0.02) eenheden waargenomen. De oorspronkelijke condities
werden waarschijnlijk gemodificeerd door de metabolische activiteit van de organismen. De
geobserveerde daling in pH werd mogelijk veroorzaakt door de respiratie en de calcificatie
van de ontwikkelende larven.
Figuur 3.13: Berekende pH na 0 h en 48 h in functie van de koperconcentratie voor de pHbehandelingen 8.1 en 7.8
62
HOOFDSTUK 3. RESULTATEN EN DISCUSSIE
De saliniteit en de geleidbaarheid waren gelijkaardig bij beide pH-behandelingen en daalden
significant na 48 h. De O2 -concentratie wijzigde enkel significant bij pH 7.8 na 48 h. De
alkaliniteit en de hoeveelheid DIC veranderden niet significant na 48 h.
De pCO2 bij de start bedroeg bij pH-behandeling 8.1 gemiddeld 344 ppm (± 7) en steeg na
48 h met gemiddeld 143 ppm (± 21). Bij pH-behandeling 7.8 steeg de pCO2 significant van
gemiddeld 776 ppm (± 18) tot gemiddeld 1076 ppm (± 83) na 48 h. Het verloop van de
pCO2 wordt weergegeven in Figuur 3.14.
Figuur 3.14: Berekende pCO2 na 0 h en 48 h in functie van de koperconcentratie voor de
pH-behandelingen 8.1 en 7.8
De saturatiestatus voor calciet en aragoniet was groter bij pH-behandeling 8.1 dan bij pHbehandeling 7.8 en daalde steeds significant na 48 h blootstelling. Vermits de saturatiestatus
altijd groter was dan één, trad er op geen enkel moment dissolutie van calciet en aragoniet
op.
Analyse van de eindpunten
Na 48 h ontwikkelde gemiddeld 92% van de embryo’s tot het D-stadium. Er werden stalen van
1 mL genomen waarop de eindpunten mortaliteit, normaliteit, abnormaliteit en onvolledige
ontwikkeling geanalyseerd werden.
Voor het eindpunt mortaliteit werd na 48 h het aantal dode en levende larven in het staal
geteld. De resultaten van de tellingen voor pH-behandeling 8.1 en 7.8 zijn terug te vinden
in respectievelijk Tabel B.3 en Tabel B.4 in Appendix B. De resultaten voor de eindpunten
normaliteit, abnormaliteit en onvolledige ontwikkeling worden weergegeven in Tabellen B.5
en B.6 en Tabellen B.7 en B.8 in Appendix B voor respectievelijk pH-behandeling 8.1 en 7.8.
3.4. BLOOTSTELLING LARVEN AAN KOPERSTRESS EN OCEAANVERZURING 63
Voor de verschillende eindpunten werden de resultaten statistisch verwerkt in SPSS en werd,
indien mogelijk, een EC50 berekend. Voor het eindpunt mortaliteit was het zowel bij pHbehandeling 8.1 als 7.8 niet mogelijk om een EC50 te berekenen. Zoals op Figuur 3.15
zichtbaar is, wordt het percentage levende larven in functie van de nominale koperconcentratie namelijk niet beschreven door een dosis-respons relatie.
Uit de statistische analyse bleek dat tussen dezelfde koperconcentraties bij de twee pHbehandelingen er geen significante verschillen aanwezig waren. Ook bij 0 µg Cu L−1 was
dit het geval, wat erop wijst dat er geen significant effect was van oceaanverzuring op de
mortaliteit.
Bij pH-behandeling 8.1 was er enkel bij de hoogste koperconcentratie van 32 µg Cu L−1 een
significant effect ten opzichte van de controle (0 µg Cu L−1 ) aanwezig (p<0.05). De NOEC
en LOEC bedroegen bijgevolg respectievelijk 16 µg Cu L−1 en 32 µg Cu L−1 .
Bij pH-behandeling 7.8 (combinatie van koperstress met oceaanverzuring) was er reeds een
significant verschil op te merken t.o.v. 0 µg Cu L−1 bij 16 µg Cu L−1 (p<0.05). In dit geval
was de NOEC 8 µg Cu L−1 en de LOEC 16 µg Cu L−1 . Gecombineerde blootstelling aan
koperstress en verzuring veroorzaakte dus een strenger effect vermits de NOEC en LOEC in
dit geval lager waren.
Figuur 3.15: Gemiddeld percentage levende larven bij pH-behandeling 8.1 en 7.8 in functie
van de koperconcentratie. De sterretjes stellen significante verschillen ten
opzichte van de controle (0 µg Cu L−1 , p<0.05) voor en de foutenbalken geven
de gemiddelde standaardafwijking weer van vijf replica’s per koperconcentratie
Voor het eindpunt normaliteit werd het aantal larven geteld dat volledig en normaal ontwikkelde tot het D-stadium. Wanneer de koperconcentraties tussen de twee pH-behandelingen
vergeleken werden, werd een significant verschil opgemerkt in percentage normale larven bij
0, 4, 8 en 16 µg Cu L−1 (p<0.05). Vermits dit percentage significant lager was bij pH 7.8
64
HOOFDSTUK 3. RESULTATEN EN DISCUSSIE
dan bij pH 8.1 (p=0.047) was er voor dit eindpunt wel een significant effect van de oceaanverzuring.
De berekende EC50 voor normaliteit bij pH-behandeling 8.1 bedroeg 4.67 µg Cu L−1 met een
95% betrouwbaarheidsinterval van [3.96;5.52]. Voor pH-behandeling 7.8 werd een EC50 van
18.65 µg Cu L−1 berekend met een 95% betrouwbaarheidsinterval van [15.35;22.69]. Vermits
de EC50 hoger was bij pH 7.8, was koper minder toxisch onder condities van oceaanverzuring.
Zowel bij pH-behandeling 8.1 als 7.8 was er een significant effect (p<0.05) vanaf 4 µg Cu L−1
(Figuur 3.16). De NOEC en LOEC bedroegen in beide gevallen respectievelijk 2 µg Cu L−1
en 4 µg Cu L−1 .
Figuur 3.16: Gemiddeld percentage normaal ontwikkelde larven bij pH-behandeling 8.1 en 7.8
in functie van de koperconcentratie. De sterretjes stellen significante verschillen
ten opzichte van de controle (0 µg Cu L−1 , p<0.05) voor en de foutenbalken
geven de gemiddelde standaardafwijking weer van vijf replica’s per koperconcentratie
Het eindpunt abnormaliteit omvat het aantal larven dat ontwikkelde tot het D-stadium
maar waarbij de larven misvormingen vertoonden. De larven worden in dit geval gekarakteriseerd door bijvoorbeeld een ingesneden schaalrand, een uitpuilende mantel of een convex
scharnier. Abnormale larven zijn niet in staat zich te voeden, waardoor ze binnen een aantal
dagen sterven wat uiteindelijk leidt tot een stijging van de mortaliteit. Bij abnormale larven
van de mossel M. galloprovincialis die gekarakteriseerd werden door een uitpuilende mantel,
werd bovendien zweminhibitie geobserveerd (Beiras & His, 1995).
Enkel bij de koperconcentratie van 16 µg Cu L−1 verschilde het percentage abnormale larven
significant tussen beide pH-behandelingen (p<0.05). Aangezien er geen significant verschil
was tussen pH 8.1 en 7.8 bij de controle koperbehandeling (0 µg Cu L−1 ), was er geen effect
van oceaanverzuring.
Bij beide pH-behandelingen was het niet mogelijk om een EC50 te berekenen voor het aantal
3.4. BLOOTSTELLING LARVEN AAN KOPERSTRESS EN OCEAANVERZURING 65
abnormale larven. Uit de statistische analyse bleek dat zowel voor pH-behandeling 8.1 als
7.8 de NOEC 2 µg Cu L−1 en de LOEC 4 µg Cu L−1 bedroegen (Figuur 3.17).
Figuur 3.17: Gemiddeld percentage abnormaal ontwikkelde larven bij pH-behandeling 8.1
en 7.8 in functie van de koperconcentratie. De sterretjes stellen significante
verschillen ten opzichte van de controle (0 µg Cu L−1 , p<0.05) voor en de
foutenbalken geven de gemiddelde standaardafwijking weer van vijf replica’s
per koperconcentratie
Larven die het D-stadium niet bereikten en waarvan de schaalvorming en/of de celdeling niet
compleet was, werden ingedeeld in de categorie onvolledige ontwikkeling.
Bij de koperconcentraties 4, 8 en 16 µg Cu L−1 was er een significant verschil in percentage
onvolledig ontwikkelde larven tussen pH-behandelingen 8.1 en 7.8 (p<0.05). Er was geen
invloed van de oceaanverzuring op dit eindpunt vermits er dus geen significant verschil was
bij de controle koperbehandeling van 0 µg Cu L−1 .
De EC50 voor dit eindpunt bij pH-behandeling 8.1 bedroeg 6.81 µg Cu L−1 met een 95%
betrouwbaarheidsinterval van [5.11;9.08]. Voor pH-behandeling 7.8 was de EC50 31.22 µg
Cu L−1 met een 95% betrouwbaarheidsinterval van [23.75;41.04]. De EC50 was dus hoger bij
de lagere pH waardoor koper minder toxische effecten uitoefende op de ontwikkeling onder
condities van oceaanverzuring.
De NOEC en LOEC voor pH-behandeling 8.1 bedroegen respectievelijk 2 µg Cu L−1 en 4
µg Cu L−1 (Figuur 3.18). Voor pH-behandeling 7.8 was er enkel een significant effect ten
opzichte van de controle bij concentraties 8 en 32 µg Cu L−1 (p<0.05).
Door de ontwikkelingsvertraging zal het langer duren vooraleer de larven metamorfose ondergaan. Daardoor blijven ze langer in het planktotrofe stadium waar de kans op predatie en
mortaliteit groter is (Dupont & Thorndyke, 2009). Uiteindelijk kan door de aantasting van
de larvale stadia de samenstelling en de overleving van de volledige populatie wijzigen.
66
HOOFDSTUK 3. RESULTATEN EN DISCUSSIE
Figuur 3.18: Gemiddeld percentage onvolledig ontwikkelde larven bij pH-behandeling 8.1 en
7.8 in functie van de koperconcentratie. De sterretjes stellen significante verschillen ten opzichte van de controle (0 µg Cu L−1 , p<0.05) voor en de foutenbalken geven de gemiddelde standaardafwijking weer van vijf replica’s per koperconcentratie
Berekening van de koperspeciatie
Het is algemeen bekend dat de pH een invloed uitoefent op de speciatie en bijgevolg op de
biobeschikbaarheid en de toxiciteit van metalen. Daarom werd voor de koperbehandelingen
(0, 1, 2, 4, 8, 16 en 32 µg Cu L−1 ) en de berekende EC50’s de koperspeciatie bij de twee pHbehandelingen berekend met Visual MINTEQ (Gustafsson, 2010). De vijf meest voorkomende
+
2+ en CuOH+ .
anorganische species waren Cu(CO3 )2−
2 , CuCO3 (aq), CuHCO3 , Cu
In Tabel B.9 in Appendix B worden de berekende concentraties van de vijf koperspecies
weergegeven. Voor de vijf species steeg de berekende concentratie steeds exponentieel met
toenemende koperbehandeling. In alle gevallen (pH-behandeling 8.1 en 7.8 bij zowel 0 h als 48
h) was de concentratie aan Cu(CO3 )2−
2 beduidend groter dan de concentratie van de andere
species.
Bij de procentuele species distributie werden enkel die species in rekening gebracht waarvan
het aandeel meer dan 0.1% bedroeg, namelijk Cu(CO3 )2−
2 en CuCO3 (aq). Het procentuele
2−
aandeel van Cu(CO3 )2 was beduidend groter dan het percentage CuCO3 (aq) (Figuur 3.19).
Bij pH 8.1 op 0 h was er, gemiddeld over de 7 koperbehandelingen, 99% Cu(CO3 )2−
2 ± 0.02
en 1% CuCO3 (aq) ± 0.02 aanwezig. Bij pH 7.8 was er op het tijdstip 0 h iets meer CuCO3
(aq) beschikbaar, namelijk gemiddeld 98% Cu(CO3 )2−
2 ± 0.03 en 2% CuCO3 (aq) ± 0.03. Na
48 h was er zowel bij pH-behandeling 8.1 als 7.8 een kleine daling met respectievelijk 0.4% en
3.4. BLOOTSTELLING LARVEN AAN KOPERSTRESS EN OCEAANVERZURING 67
0.6% in het percentage Cu(CO3 )2−
2 en bijgevolg een lichte stijging in het aandeel van CuCO3
(aq) merkbaar.
en CuCO3 (aq) in functie van de pHFiguur 3.19: Gemiddeld percentage Cu(CO3 )2−
2
behandeling 8.1 en 7.8 bij 0 h en 48 h
Op Figuur 3.20 wordt de logaritme van de activiteit van de vijf belangrijkste koperspecies
bij pH 8.1 op 0 h weergegeven. De logaritme van de activiteit nam steeds lineair toe met
toenemende koperconcentratie. De activiteit was het hoogst voor Cu(CO3 )2−
2 en het laagst
2+
voor Cu . Voor pH-behandeling 8.1 bij 48 h en pH-behandeling 7.8 bij 0 h en 48 h werden
dezelfde verdeling en hetzelfde verloop van de activiteit als in Figuur 3.20 waargenomen.
Figuur 3.20: Logaritme van de activiteit van de vijf belangrijkste koperspecies in functie van
de koperbehandeling bij pH 8.1 op 0 h. De log(activiteit) voor 0 µg Cu L−1
bedraagt 0 en wordt niet weergegeven op de figuur
De activiteit van Cu(CO3 )2−
2 verschilde niet tussen de vier behandelingen zoals weergegeven
68
HOOFDSTUK 3. RESULTATEN EN DISCUSSIE
op Figuur 3.21. Bij pH 7.8 was de activiteit van Cu2+ hoger dan bij pH 8.1 (Figuur 3.22). De
activiteit nam bovendien toe na 48 h. Voor de andere vier koperspecies werd een gelijkaardig
patroon vastgesteld.
Figuur 3.21: Logaritme van de activiteit van Cu(CO3 )2−
2 in functie van de koperbehandeling
voor pH-behandeling 8.1 en 7.8 bij 0 h en 48 h. De log(activiteit) voor 0 µg Cu
L−1 bedraagt 0 en wordt niet weergegeven op de figuur
Figuur 3.22: Logaritme van de activiteit van Cu2+ in functie van de koperbehandeling voor
pH-behandeling 8.1 en 7.8 bij 0 h en 48 h. De log(activiteit) voor 0 µg Cu L−1
bedraagt 0 en wordt niet weergegeven op de figuur
Vervolgens werd de koperspeciatie berekend bij de geschatte EC50’s voor normaliteit en
onvolledige ontwikkeling. De EC50 voor normaliteit bedroeg 4.67 µg Cu L−1 bij pH 8.1 en
18.65 µg Cu L−1 bij pH 7.8. Voor het eindpunt onvolledige ontwikkeling werden EC50’s van
6.81 µg Cu L−1 en 31.22 µg L−1 berekend bij respectievelijk pH 8.1 en 7.8. Uit Tabel 3.1
3.4. BLOOTSTELLING LARVEN AAN KOPERSTRESS EN OCEAANVERZURING 69
blijkt dat de concentratie aan Cu(CO3 )2−
2 beduidend hoger was dan de concentratie van de
2+
andere species. De concentratie aan Cu was voor beide eindpunten tien keer hoger bij pH
7.8 dan bij pH 8.1.
Tabel 3.1: Concentratie van de vijf belangrijkste koperspecies voor de berekende EC50’s
van de eindpunten normaliteit en onvolledige ontwikkeling in functie van de pHbehandeling
concentratie Cu-species (mol L−1 )
eindpunt
pHbeh.
Cu
(µg L−1 )
Cu(CO3 )2−
2
CuCO3 (aq)
CuHCO+
3
Cu2+
CuOH+
normaliteit
normaliteit
8.1
7.8
4.67
18.65
7.27E −08
2.88E −07
7.45E −10
5.32E −09
1.88E −12
2.69E −11
1.60E −13
2.02E −12
1.78E −13
1.12E −12
onv. ontw.
onv. ontw.
8.1
7.8
6.81
31.22
1.06E −07
4.82E −07
1.09E −09
8.90E −09
2.74E −12
4.50E −11
2.33E −13
3.38E −12
2.60E −13
1.87E −12
In Tabel 3.2 wordt de procentuele verdeling van de koperspecies weergegeven. Het aandeel
van Cu(CO3 )2−
2 was steeds groter dan het percentage CuCO3 (aq) en was bovendien hoger
bij pH 8.1.
Tabel 3.2: Procentueel aandeel van Cu(CO3 )2−
2 en CuCO3 (aq) voor de berekende EC50’s
van de eindpunten normaliteit en onvolledige ontwikkeling in functie van de pHbehandeling
% Cu-species
eindpunt
pHbehandeling
Cu
(µg L−1 )
Cu(CO3 )2−
2
CuCO3 (aq)
normaliteit
normaliteit
8.1
7.8
4.67
18.65
98.98
98.18
1.01
1.81
onv. ontw.
onv. ontw.
8.1
7.8
6.81
31.22
98.98
98.18
1.01
1.81
Het koperspecies Cu(CO3 )2−
2 had de hoogste activiteit terwijl de activiteit het kleinst was
voor Cu2+ . Zowel voor het eindpunt normaliteit als onvolledige ontwikkeling was de activiteit
van het Cu2+ -species groter bij pH-behandeling 7.8 dan bij 8.1 (Figuur 3.23 en Figuur 3.24).
Discussie van de eindpunten en de koperspeciatie
Invloed van blootstelling aan oceaanverzuring
Het percentage normale larven bij de controle koperbehandeling (0 µg Cu L−1 ) was significant lager bij pH 7.8 dan bij pH 8.1. Daaruit blijkt dat er een effect was van oceaanverzuring
op de ontwikkelende embryo’s dat leidde tot hogere percentages aan abnormale larven en
70
HOOFDSTUK 3. RESULTATEN EN DISCUSSIE
Figuur 3.23: De activiteit van Cu2+ bij de EC50 voor het eindpunt normaliteit, voor de
pH-behandelingen 8.1 en 7.8
Figuur 3.24: De activiteit van Cu2+ bij de EC50 voor het eindpunt onvolledige ontwikkeling,
voor de pH-behandelingen 8.1 en 7.8
meer onvolledige ontwikkeling. Er werd geen invloed op de mortaliteit waargenomen. Deze
effecten werden reeds in vorige onderzoeken met larven van M. galloprovincialis (Kurihara
et al., 2009) en M. edulis (Gazeau et al., 2010) geobserveerd.
Bij dalende pH daalde de concentratie aan OH− en CO2−
3 (Millero et al., 2009). Bovendien
trad de geobserveerde ontwikkelingsvertraging op vanaf het trochofore stadium. Dit is het
moment waarop de secretie van de eerste larvale schaal, die uit CaCO3 bestaat, begint.
Daaruit wordt geconcludeerd dat de verzuring vooral interfereerde met de synthese van de
larvale schaal.
3.4. BLOOTSTELLING LARVEN AAN KOPERSTRESS EN OCEAANVERZURING 71
In het onderzoek van Kurihara et al. (2009) en Gazeau et al. (2010) was het zeewater ondergesatureerd voor aragoniet en calciet. Er werd gesuggereerd dat de larvale schaal, zelfs
indien de synthese normaal gebeurde, oploste onder invloed van deze ondersaturatie. Bovendien produceren de larven gedurende de eerste 2 à 3 dagen van de ontwikkeling vooral amorf
CaCO3 en pas later start de productie van aragoniet. Vermits de oplosbaarheid van amorf
CaCO3 veel groter is dan deze van aragoniet zijn de larven extra gevoelig voor dissolutie van
de schaal door ondersaturatie (Medakovic, 2000, Kurihara et al., 2007).
In ons geval waren Ωcalciet en Ωaragoniet steeds groter dan één. Dit wijst erop dat het zeewater
niet ondergesatureerd was en dat bovenvermelde dissolutie van de larvale schaal niet kon optreden. De geobserveerde effecten waren dus vermoedelijk het gevolg van de directe invloed
van de verzuring op de synthese van het CaCO3 . Het is eveneens mogelijk dat er interferentie
optrad van de verzuring met de normale homeostasefuncties.
Invloed van blootstelling aan koperstress
Wanneer de larven van de mossel M. edulis blootgesteld werden aan een range van koperconcentraties bij de normale pH 8.1, werd zowel een effect op de mortaliteit als op de normaliteit
geobserveerd. De koperstress had echter een veel groter effect op het eindpunt normaliteit
vermits de NOEC en LOEC voor dit eindpunt beduidend lager waren dan voor het eindpunt mortaliteit. De berekende 48 h EC50 voor normaliteit bedroeg 4.67 µg Cu L−1 . Deze
waarde ligt binnen de range van natuurlijk voorkomende koperconcentraties van 2 - 5 µg Cu
L−1 (Davenport & Redpath, 1984). Dit wijst erop dat aquatische organismen zelfs onder
onvervuilde condities toch toxische stress door koper kunnen ondervinden.
De EC50 van 4.67 µg Cu L−1 voor normaliteit ligt in dezelfde grootteorde als deze die
gerapporteerd worden voor M. edulis in de literatuur (Tabel 3.3). De waarden uit de literatuur
voor de EC50 voor de mossel M. galloprovincialis liggen beduidend hoger (Tabel 3.4). Daaruit
blijkt dat M. edulis gevoeliger is voor koperstress dan M. galloprovincialis en dat er dus
onderlinge verschillen bestaan tussen de soorten.
Tabel 3.3: Overzicht van 48 h EC50’s uit de literatuur voor het eindpunt normale embryonale
ontwikkeling bij de mossel M. edulis
EC50
(µg Cu L−1 )
Referentie
5.8
7.9
5.8
Martin et al., 1981
Barnes, 1989
His et al., 2000
72
HOOFDSTUK 3. RESULTATEN EN DISCUSSIE
Tabel 3.4: Overzicht van 48 h EC50’s uit de literatuur voor het eindpunt normale embryonale
ontwikkeling bij de mossel M. galloprovincialis
EC50
(µg Cu L−1 )
Referentie
24
15.1
10
40
His et al., 2000
Losso et al., 2004
Beiras & Albentosa, 2004
Prato & Biandolino, 2007
Er moet wel opgemerkt worden dat het vergelijken van EC50’s moeilijk is doordat de kopertoxiciteit afhankelijk is van de condities waaronder de organismen blootgesteld worden. Er
moet daarom aandacht besteed worden aan o.a. de saliniteit, de temperatuur en de concentratie aan DOC waarbij het experiment uitgevoerd wordt. De metaalspeciatie wordt namelijk
beı̈nvloed doordat koper complexen vormt met DOC, waardoor de biobeschikbaarheid en de
toxiciteit van het metaal voor aquatische organismen vermindert (Arnold, 2005, Arnold et
al., 2010).
Vanaf een koperconcentratie van 4 µg Cu L−1 (LOEC) werden significante abnormaliteiten
en onvolledig ontwikkelde larven geobserveerd. Het ontstaan van deze effecten kan op een
aantal manieren verklaard worden. Aangezien de larven tijdens het experiment niet gevoed
werden, wordt de mogelijkheid van blootstelling via de voeding geëlimineerd. Het koper kan
enerzijds directe toxische effecten veroorzaken en anderzijds de homeostatische mechanismen,
zoals het immuunsysteem, beı̈nvloeden. Bovendien zijn ontwikkelende embryo’s metabolisch
actief en kunnen wijzigingen in de enzymactiviteit en membraanpermeabiliteit toxische effecten veroorzaken (Fitzpatrick et al., 2008).
Invloed van gecombineerde blootstelling aan oceaanverzuring en koperstress
De eigenschappen van zeewater, waaronder de zuurtegraad, beı̈nvloeden de chemische speciatie of dus de chemische vorm van koper. De speciatie van koper beı̈nvloedt op haar beurt
de biobeschikbaarheid en de toxiciteit van het metaal voor aquatische organismen, in dit
geval mossellarven. De hypothese werd getest dat koper meer toxisch is onder condities van
oceaanverzuring (zie sectie 1.5).
Wanneer larven van de mossel M. edulis blootgesteld werden aan verschillende koperconcentraties onder condities van oceaanverzuring (pH 7.8), werd een sterker effect op de mortaliteit
waargenomen dan bij de normale pH 8.1 vermits de NOEC en LOEC lager waren. Het effect
van de koperstress was wel groter voor het eindpunt normaliteit dan voor mortaliteit, vermits
de NOEC en LOEC veel lager waren voor normaliteit.
3.4. BLOOTSTELLING LARVEN AAN KOPERSTRESS EN OCEAANVERZURING 73
De EC50 voor het eindpunt normaliteit onder condities van verzuring bedroeg 18.65 µg Cu
L−1 . Dit is beduidend hoger dan de waarde van de EC50 bij pH 8.1, wat erop wijst dat koper
op het vlak van normaliteit minder toxisch was voor mossellarven bij lagere pH. Dit effect
werd vooral geobserveerd op het vlak van onvolledige ontwikkeling.
De hypothese dat de toxiciteit van koper sterker is onder condities van oceaanverzuring wordt
dus bevestigd voor het eindpunt mortaliteit maar niet voor het eindpunt normaliteit.
In studies waarbij zoetwateralgen (Chlorella sp. en Pseudokirchneriella subcapitata) blootgesteld werden aan koper bij verschillende pH-waarden, werd bovenstaande hypothese eveneens niet bevestigd (De Schamphelaere et al., 2005, De Schamphelaere et al., 2003, Heijerick
et al., 2005, Wilde et al., 2006). Bij lagere pH was koper namelijk minder toxisch voor de
algen en trad er dus een schijnbaar beschermend effect op van H+ ionen op de metaaltoxiciteit. Er werd gesuggereerd dat competitie tussen waterstofionen en vrije metaalionen voor
bindingssites op het algenoppervlak verantwoordelijk zou zijn voor deze effecten. Daarenboven werd geobserveerd dat er bij hogere pH meer CuOH+ en CuCO3 aanwezig was. Het is
mogelijk dat deze koperspecies, naast Cu2+ , ook toxisch zijn voor de algen.
Ondanks het feit dat bij blootstelling van mossellarven aan lagere pH een hogere activiteit van
het toxische Cu2+ ion geobserveerd werd, bleek koper onder deze condities toch minder toxisch
te zijn op het vlak van normaliteit. Bij lagere pH was procentueel minder Cu(CO3 )2−
2 en
meer CuCO3 aanwezig. Dit komt overeen met de waarden uit de literatuur (Tabel 1.3). Het is
mogelijk dat de kopertoxiciteit niet enkel bepaald wordt door de activiteit van het vrije Cu2+
ion, maar dat de koperspecies Cu(CO3 )2−
2 en CuCO3 ook biobeschikbaar zijn en bijdragen tot
de toxiciteit. Naast de speciatie kan ook competitie tussen ionen de geobserveerde effecten
verklaren. Verzuring leidt namelijk tot een toegenomen concentratie aan H+ ionen. Daardoor
stijgt de competitie tussen H+ ionen en koperionen en kunnen meer H+ ionen en minder
toxische koperionen binden op de interactiesite.
Hoofdstuk 4
Algemene conclusie
In een eerste deel van deze thesis werden twee technieken uitgetest voor de manipulatie van
het carbonaatsysteem van zeewater. Door deze manipulaties kunnen de verwachte condities van oceaanverzuring gesimuleerd worden tijdens experimenten met mariene mosselen.
Een eerste techniek omvatte de doorborreling van het zeewater met CO2 -gas. Het gewenste
verzuringsevenwicht werd in dit geval enkel bereikt met een zeer hoge stroomsnelheid aan
CO2 -gas. Bovendien werd dit initieel ingestelde evenwicht sterk verstoord door de activiteit
van de aanwezige adulte mosselen. Omdat deze techniek dus praktisch niet toepasbaar was,
kon geen oceaanverzuringsexperiment met adulte mosselen uitgevoerd worden.
De tweede techniek hield de toevoeging in van NaHCO3 en HCl aan een klein volume zeewater. Op deze manier konden de voorspelde veranderingen in pCO2 , pH, alkaliniteit en DIC
zeer nauwkeurig nagebootst worden. Deze techniek werd gebruikt bij het experiment met de
larvale stadia van Mytilus edulis.
In een volgend onderdeel werden adulte mosselen gedurende 14 dagen blootgesteld aan een
reeks van koperconcentraties onder normale verzuringscondities. De invloed van de koperstress op de organismen werd gekwantificeerd met behulp van twee biomarkers. Toepassing
van de biomarker Cellular Energy Allocation (CEA) toonde aan dat er een afname was van
de reserves aan proteı̈nen en koolhydraten bij de mosselen die blootgesteld werden aan 32 en
100 µg Cu L−1 . Het energieverbruik van de mosselen werd niet significant beı̈nvloed.
Met behulp van de biomarker Lysosomal Membrane Stability (LMS) werd een destabilisatie van de lysosomale membranen geobserveerd bij blootstelling aan 100 µg Cu L−1 . Als
gevolg van de destabilisatie kunnen schadelijke hydrolytische enzymen vrijgesteld worden in
het cytosol. De resultaten van dit experiment tonen aan dat de toxische effecten van koper
op mariene mosselen zich op verschillende vlakken kunnen manifesteren. Biomarkers blijken
goede methoden te zijn om deze negatieve effecten reeds in een vroeg stadium te detecteren.
Het laatste onderdeel van deze thesis omvatte 48 h durende experimenten met pas bevruchte
75
76
HOOFDSTUK 4. ALGEMENE CONCLUSIE
mosselembryo’s. Blootstelling van de vroege ontwikkelingsstadia aan oceaanverzuring (pH
7.8) resulteerde in een hoger gehalte aan abnormale en onvolledig ontwikkelde larven dan
bij de controlebehandeling (pH 8.1). Er werd gesuggereerd dat de oceaanverzuring vooral
interfereerde met de synthese van de larvale schaal. In een ander experiment werd het effect
van koperstress op vroege larvale stadia bij normale pH onderzocht. Blootstelling van de
larven aan een range van koperconcentraties veroorzaakte significante negatieve effecten op
de eindpunten mortaliteit en normaliteit. De mortaliteit werd echter in veel mindere mate
beı̈nvloed dan de normaliteit. De 48 h EC50 voor het eindpunt normaliteit bedroeg 4.67 µg
Cu L−1 . Tot slot werd de hypothese getest dat koper meer toxisch zou zijn voor de larvale
stadia onder condities van oceaanverzuring dan bij normale omstandigheden. Voor het eindpunt mortaliteit werd inderdaad een sterker effect waargenomen van de koperstress bij pH 7.8
dan bij pH 8.1. De 48 h EC50 voor het eindpunt normaliteit bedroeg 18.65 µg Cu L−1 . Voor
dit eindpunt was koper dus minder toxisch bij lagere pH en werd de hypothese bijgevolg niet
bevestigd. Nochtans werd er een hogere activiteit van het toxische Cu2+ ion geobserveerd
bij pH 7.8. Mogelijk dragen ook andere koperspecies bij tot de toxiciteit en zorgt competitie
tussen de ionen voor de reductie in toxiciteit onder condities van oceaanverzuring.
Uit de resultaten van deze experimenten kan geconcludeerd worden dat larvale stadia van
mosselen gevoelig zijn voor zowel oceaanverzuring als voor koperstress. Dit is belangrijk
vermits wijzigingen in de vroege ontwikkelingsstadia de grootte en de samenstelling van de
adulte populatie kunnen beı̈nvloeden en bijgevolg nadelige effecten kunnen veroorzaken voor
het gehele ecosysteem.
Als algemene conclusie kan gesteld worden dat er voldoende bewijzen beschikbaar zijn om met
zekerheid te stellen dat schadelijke impacten op mariene mosselen ten gevolge van oceaanverzuring en koperstress onvermijdelijk zijn. Tegen het einde van de eeuw zullen daardoor
aanzienlijke wijzigingen optreden in mariene ecosystemen. Om te ontrafelen volgens welke
mechanismen de metaaltoxiciteit beı̈nvloed wordt door oceaanverzuring is verder onderzoek
aan de hand van een multidisciplinaire aanpak absoluut noodzakelijk.
Hoofdstuk 5
Ideeën voor verder onderzoek
Het voorbije decennium zijn het aantal publicaties en het aantal wetenschappelijke onderzoekers binnen het domein van de oceaanverzuring sterk toegenomen. In de wetenschappelijke
gemeenschap bestaat er sindsdien een consensus over de ernst van de nadelige effecten van
oceaanverzuring voor mariene ecosystemen. Toch blijven er nog een aantal belangrijke vragen
onbeantwoord. Verder onderzoek zou zich in de toekomst moeten toespitsen op de invloed
van oceaanverzuring op een aantal andere processen, zoals de vervuiling door zware metalen.
In deze thesis werd het effect van oceaanverzuring op de speciatie en de toxiciteit van koper
onderzocht. Gelijkaardige studies kunnen uitgevoerd worden met een reeks andere zware
metalen, zoals cadmium, zink en lood. Ook voor andere mariene vervuilingsbronnen kan dit
interessant zijn, zoals voor een aantal Persistente Organische Polluenten (POP). Het effect
van de verzuring kan zowel onder acute als onder chronische condities onderzocht worden op
adulte en larvale stadia. De kennis die op deze manier vergaard wordt omtrent de invloed
van de waterchemie op deze polluenten zou gebruikt kunnen worden bij het opstellen van
specifieke zoutwatercriteria.
Om de variaties in responsen tussen de species in kaart te brengen, kunnen naast mosselen
ook een aantal andere mariene organismen onderzocht worden (bv. crustacea, echinodermata
of coccolithophora). Het is bij dergelijke onderzoeken belangrijk dat de organismen blootgesteld worden aan de condities van oceaanverzuring die voorspeld worden tegen het einde
van de eeuw. Vaak worden experimenten namelijk uitgevoerd bij zeer lage pH’s die niet realistisch zijn.
Om de potentiële effecten van oceaanverzuring en van de contaminanten op adulte organismen
te voorspellen, wordt best een multi-biomarker analyse gebruikt. Daarbij wordt de invloed
op verschillende niveaus van de biologische organisatie onderzocht. Er kunnen biomarkers gebruikt worden die gevoelig zijn voor moleculaire en cellulaire stress en biomarkers die werken
77
op het niveau van de weefsels en van het gehele organisme. De invloed op de vroege ontwikkelingsstadia kan gekarakteriseerd worden door de volledige larvale cyclus, van fertilisatie tot
metamorfose, te bestuderen.
Het is mogelijk dat bepaalde mariene organismen zich zullen aanpassen aan de verzurende
omstandigheden door bijvoorbeeld genetische responsen. Om deze mogelijke adaptatie te observeren is het noodzakelijk om experimenten uit te voeren op zeer lange termijn (maanden
tot jaren). Ook potentiële synergistische effecten van oceaanverzuring met de temperatuur
vragen verder onderzoek. De stijging in de atmosferische CO2 -concentratie veroorzaakt immers ook een toename van de temperatuur van het zeewater. Er werd reeds aangetoond
dat een verhoging van de pCO2 in combinatie met een temperatuurstijging de calcificatiesnelheid van de koraal Stylophora pistillata synergistisch reduceerde (Reynaud et al., 2003).
Voor de oesters Saccostrea glomerata en Crassostrea gigas werden synergistische effecten van
oceaanverzuring en temperatuur op de fertilisatie en de embryonale ontwikkeling geobserveerd
(Parker et al., 2009, Parker et al., 2010).
Tot slot kan alle kennis over de impact van oceaanverzuring op mariene ecosystemen geı̈ntegreerd worden in zogenaamde gekoppelde oceaan-klimaat modellen. Op die manier kunnen
de responsen van de ecosystemen op oceaanverzuring beter in kaart gebracht en voorspeld
worden. Het European Project on Ocean Acidification (EPOCA), dat in juni 2008 gelanceerd
werd, heeft hiertoe reeds een eerste aanzet gegeven.
Referenties
Allen, H.E., Hall, R.H. & Brisbin, T.D. (1980). Metal speciation - effects on aquatic toxicity.
Environmental science and technology, 14(4), 441-443.
Arnold, W.R. (2005). Effects of dissolved organic carbon on copper toxicity: implications for
saltwater copper criteria. Integrated environmental assessment and management, 1(1), 34-39.
Arnold, W.R., Cotsifas, J.S., Ogle, R.S., DePalma, S.G.S. & Smith, D.S. (2010). A comparison of the copper sensitivity of six invertebrate species in ambient salt water of varying
dissolved organic matter concentrations. Environmental toxicology and chemistry, 29(2), 311319.
Arnold, W.R., Cotsifas, J.S., Smith, D.S., Le Page, S. & Gruenthal, K.M. (2009). A comparison of the copper sensitivity of two economically important saltwater mussel species and
a review of previously reported copper toxicity data for mussels: important implications for
determining future ambient copper saltwater criteria in the USA. Environmental toxicology,
24(6), 618-628.
ASTM (2004). Standard guide for conducting static acute toxicity tests starting with embryos of four species of saltwater bivalve molluscs. Methode E724 - 98. ASTM International,
West Conshohocken, PA.
Barnes, D.A. (1989). The effects of initial egg density and added copper concentration on
the development of early larval stages of the mussel Mytilus edulis. M.Sc. thesis, University
of Wales, Bangor.
Bayne, B.L. (1976). Marine mussels: their ecology and physiology. Cambridge, Cambridge
University Press, 506 p.
Bayne, B.L. (1973). The responses of three species of bivalve mollusc to declining oxygen
tension at reduced salinity. Comparative biochemistry and physiology Part A, 45(3), 793-806.
79
Bayne, B.L. & Thompson, R.J. (1970). Some physiological consequences of keeping Mytilus
edulis in laboratory. Helgolander wissenschaftliche Meeresuntersuchungen, 20(1-4), 528-552.
Beesley, A., Lowe, D.M., Pascoe, C.K. & Widdicombe, S. (2008). Effects of CO2 -induced
seawater acidification on the health of Mytilus edulis. Climate research, 37(2-3), 215-225.
Beiras, R. & Albentosa, M. (2004). Inhibition of embryo development of the commercial
bivalves Ruditapes decussatus and Mytilus galloprovincialis by trace metals; implications for
the implementation of seawater quality criteria. Aquaculture, 230(1-4), 205-213.
Beiras, R. & His, E. (1995). Effects of dissolved mercury on embryogenesis, survival and
growth of Mytilus galloprovincialis mussel larvae. Marine ecology-progress series, 126(1-3),
185-189.
Berge, J.A., Bjerkeng, B., Pettersen, O., Schaanning, M.T. & Øxnevad, S. (2006). Effects of
increased sea water concentrations of CO2 on growth of the bivalve Mytilus edulis L. Chemosphere, 62(4), 681-687.
Bibby, R., Widdicombe, S., Parry, H., Spicer, J. & Pipe, R. (2008). Effects of ocean acidification on the immune response of the blue mussel Mytilus edulis. Aquatic biology, 2(1), 67-74.
Brown, R.J., Galloway, T.S., Lowe, D., Browne, M.A., Dissanayake, A., Jones, M.B. &
Depledge, M.H. (2004). Differential sensitivity of three marine invertebrates to copper assessed using multiple biomarkers. Aquatic toxicology, 66(3), 267-278.
Burlando, B., Bonomo, M., Capri, F., Mancinelli, G., Ponsa, G. & Viarengo, A. (2004).
Different effects of Hg2+ and Cu2+ on mussel (Mytilus galloprovincialis) plasma membrane
Ca2+ -ATPase: Hg2+ induction of protein expression. Comparative biochemistry and physiology C-toxicology & pharmacology, 139(4), 201-207.
Burlando, B., Marchi, B., Panfoli, I. & Viarengo, A. (2002). Essential role of Ca2+ -dependent
phospholipase A(2) in estradiol-induced lysosome activation. American journal of physiologycell physiology, 283(5), C1461-C1468.
Caldeira, K. & Wickett, M.E. (2003). Anthropogenic carbon and ocean pH. Nature, 425(6956),
365-365.
Cammen, L.M., Corwin, S. & Christensen, J.P. (1990). Electron-transport system (ETS)
activity as a measure of benthic macrofaunal metabolism. Marine ecology-progress series,
65(2), 171-182.
Castro, M., Santos, M.M., Monteiro, N.M. & Vieira, N. (2004). Measuring lysosomal stability as an effective tool for marine coastal environmental monitoring. Marine environmental
research, 58(2-5), 741-745.
Claessens, M. (2008). 24 h larval development test with Crassostrea gigas. Protocol.
Coates, D. (2009). Pollution in coastal harbours, application of biomarkers and biometric characteristics in Mytilus edulis cage experiments. Thesis, Universiteit Gent, Faculteit
Wetenschappen, 22 p.
Coles, J.A., Farley, S.R. & Pipe, R.K. (1995). Alteration of the immune-response of the common marine mussel Mytilus edulis resulting from exposure to cadmium. Diseases of aquatic
organisms, 22(1), 59-65.
Davenport, J. & Redpath, K.J. (1984). Copper and the mussel Mytilus edulis L. Toxins,
drugs and pollutants in marine animals. Springer-Verlag, Berlin, 176-189.
De Clerck, J. (2008). Determination of energy available (protein, carbohydrate and lipids)
and energy consumption (ETS activity). CEA protocol.
De Coen, W.M. & Janssen, C.R. (2003). The missing biomarker link: relationships between
effects on the cellular energy allocation biomarker of toxicant-stressed Daphnia magna and
corresponding population characteristics. Environmental toxicology and chemistry, 22(7),
1632-1641.
Dedourge-Geffard, O., Palais, F., Biagianti-Risbourg, S., Geffard, O. & Geffard, A. (2009).
Effects of metals on feeding rate and digestive enzymes in Gammarus fossarum: an in situ
experiment. Chemosphere, 77(11), 1569-1576.
De Schamphelaere, K.A.C., Stauber, J.L., Wilde, K.L., Markich, S.J., Brown, P.L., Franklin,
N., Creighton, N. & Janssen, C.R. (2005). Toward a biotic ligand model for freshwater green
algae: Surface-bound and internal copper are better predictors of toxicity than free Cu2+ -ion
activity when pH is varied. Environmental science and technology, 39(7), 2067-2072.
De Schamphelaere, K.A.C., Vasconcelos, F.M., Heijerick, D.G., Tack, F.M.G., Delbeke, K.,
Allen, H.E. & Janssen, C.R. (2003). Development and field validation of a predictive copper
toxicity model for the green alga Pseudokirchneriella subcapitata. Environmental toxicology
and chemistry, 22(10), 2454-2465.
Dickson, A.G. (1990). Standard potential of the reaction: AgCl(s) + 1/2H2 (g) = Ag(s)
+ HCl(aq), and the standard acidity constant of the ion HSO4 in synthetic sea water from
273.15 to 318.15 K. Journal of chemical thermodynamics, 22(2), 113-127.
Dickson, A.G., Sabine, C.L. & Christian, J.R. (2007). Guide to best practices for ocean CO2
measurements. PICES Special Publication 3, 191 p.
Dupont, S. & Thorndyke, M.C. (2009). Impact of CO2 -driven ocean acidification on invertebrates early life-history - what we know, what we need to know and what we can do.
Biogeosciences discussion, 6, 3109-3131.
Eertman, R.H.M., Groenink, C.L.F.M., Sandee, B. & Hummel, H. (1995). Response of the
blue mussel Mytilus edulis L. following exposure to PAHs or contaminated sediment. Marine
environmental research, 39(1-4), 169-173.
Fabry, V.J., Seibel, B.A., Feely, R.A. & Orr, J.C. (2008). Impacts of ocean acidification on
marine fauna and ecosystem processes. Ices journal of marine science, 65(3), 414-432.
Fanslow, D.L., Nalepa, T.F. & Johengen, T.H. (2001). Seasonal changes in the respiratory
electron transport system (ETS) and respiration of the zebra mussel, Dreissena polymorpha
in Saginaw Bay, Lake Huron. Hydrobiologia, 448(1-3), 61-70.
Ferrando, M.D. & Andreu, E. (1993). Feeding-behavior as an index of copper stress in
Daphnia-magna and Brachionus-calyciflorus. Comparative biochemistry and physiology Cpharmacology toxicology & endocrinology, 106(2), 327-331.
Findlay, H.S., Wood, H.L., Kendall, M.A., Spicer, J.I., Twitchett, R.J. & Widdicombe, S.
(2009). Calcification, a physiological process to be considered in the context of the whole
organism. Biogeosciences discussion, 6, 2267-2284.
Fitzpatrick, J.L., Nadella, S., Bucking, C., Balshine, S. & Wood, C.M. (2008). The relative sensitivity of sperm, eggs and embryos to copper in the blue mussel (Mytilus trossulus).
Comparative biochemistry and physiology C-toxicology & pharmacology, 147(4), 441-449.
Galley, T.H., Batista, F.M., Braithwaite, R., King, J. & Beaumont, A.R. (2010). Optimisation of larval culture of the mussel Mytilus edulis (L.). Aquaculture international, 18(3),
315-325.
Gazeau, F., Gattuso, J.-P., Dawber, C., Pronker, A.E., Peene, F., Peene, J., Heip, C.H.R.
& Middelburg, J.J. (2010). Effect of ocean acidification on the early life stages of the blue
mussel Mytilus edulis. Biogeosciences, 7(7), 2051-2060.
Gazeau, F., Quiblier, C., Jansen, J.M., Gattuso, J.-P., Middelburg, J.J. & Heip, C.H.R.
(2007). Impact of elevated CO2 on shellfish calcification. Geophysical research letters, 34(7),
L07603.
Geffard, A., Geffard, O., His, E. & Amiard, J.-C. (2002). Relationships between metal
bioaccumulation and metallothionein levels in larvae of Mytilus galloprovincialis exposed to
contaminated estuarine sediment elutriate. Marine ecology-progress series, 233, 131-142.
Gosling, E.M. (2003). Bivalve molluscs: biology, ecology and culture. Oxford, Fishing New
Books, 443 p.
Gosling, E.M. (1992). The mussel Mytilus: ecology, physiology, genetics and culture. Amsterdam, Elsevier, 602 p.
Gustafsson, J.P. (2010). Visual MINTEQ 3.0 beta. Department of Land and Water Resources Engineering, Royal Institute of Technology, Stockholm, Sweden. Online beschikbaar.
http://www2.lwr.kth.se/English/OurSoftware/vminteq/download.html
Gutierrez, J.L., Jones, C.G., Strayer, D.L. & Iribarne, O.O. (2003). Mollusks as ecosystem
engineers: the role of shell production in aquatic habitats. Oikos, 101(1), 79-90.
Hamilton, M.A., Russo, R.C. & Thurston, R.V. (1977). Trimmed Spearman-Karber method
for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environmental science and
technology, 11(7), 714-719.
Heijerick, D.G., Bossuyt, B.T.A., De Schamphelaere, K.A.C., Indeherberg, M., Mingazzini,
M. & Janssen, C.R. (2005). Effect of varying physicochemistry of European surface waters on
the copper toxicity to the green alga Pseudokirchneriella subcapitata. Ecotoxicology, 14(6),
661-670.
Hirose, K. (2006). Chemical speciation of trace metals in seawater: a review. Analytical
sciences, 22(8), 1055-1063.
His, E., Beiras, R. & Seaman, M.N.L. (2000). The assessment of aquatic contamination:
bioassays with bivalve larvae. Advances in marine biology, 37, 1-178.
Hoare, K., Davenport, J. & Beaumont, A.R. (1995). Effects of exposure and previous exposure to copper on growth of veliger larvae and survivorship of Mytilus-edulis juveniles.
Marine ecology-progress series, 120(1-3), 163-168.
Hole, L.M., Moore, M.N. & Bellamy, D. (1993). Age-related cellular reactions to copper in
the marine mussel Mytilus-edulis. Marine ecology-progress series, 94(2), 175-179.
ISO 9963-1 (1994). Water quality - Determination of alkalinity - part 1: Determination of
total and composite alkalinity. European Committee for Standardisation, Brussels, Belgium.
Kurihara, H., Asai, T., Kato, S. & Ishimatsu, A. (2009). Effects of elevated pCO(2) on early
development in the mussel Mytilus galloprovincialis. Aquatic biology, 4(3), 225-233.
Kurihara, H., Kato, S. & Ishimatsu, A. (2007). Effects of increased seawater pCO(2) on early
development of the oyster Crassostrea gigas. Aquatic biology, 1(1), 91-98.
Lavens, P. & Sorgeloos, P. (1996). Manual on the production and use of live food for aquaculture. Laboratory of Aquaculture and Artemia Reference Center, University of Ghent, Ghent,
Belgium. Online beschikbaar.
http://www.fao.org/docrep/003/w3732e/w3732e00.htm
Lavigne, H., Proye, A. & Gattuso, J.-P. (2008). Seacarb 2.0, an R package to calculate parameters of the seawater carbonate system. Online beschikbaar.
http://cran.r-project.org/web/packages/seacarb/index.html
Lorenzo, J.I., Beiras, R., Mubiana, V.K. & Blust, R. (2005). Copper uptake by Mytilus edulis
in the presence of humic acids. Environmental toxicology and chemistry, 24(4), 973-980.
Losso, C., His, E., Ghetti, P.F. & Volpi Ghirardini, A. (2004). Sensitivity of embryotoxicity
test with Mytilus galloprovincialis (LMK) towards some compounds of environmental interest
(copper and pesticides). Environmental technology, 25(7), 841-846.
Lueker, T.J., Dickson, A.G. & Keeling, C.D. (2000). Ocean pCO2 calculated from dissolved
inorganic carbon, alkalinity, and equations for K1 and K2: validation based on laboratory
measurements of CO2 in gas and seawater at equilibrium. Marine chemistry, 70(1-3), 105-119.
Marchi, B., Burlando, B., Moore, M.N. & Viarengo, A. (2004). Mercury- and copper-induced
lysosomal membrane destabilisation depends on [Ca2+ ](i) dependent phospholipase A2 activation. Aquatic toxicology, 66(2), 197-204.
Marigomez, I., Soto, M., Cajaraville, M.P., Angulo, E. & Giamberini, L. (2002). Cellular
and subcellular distribution of metals in molluscs. Microscopy research and technique, 56(5),
358-392.
Martin, M., Osborn, K.E., Billig, P. & Glickstein, N. (1981). Toxicities of 10 metals to
Crassostrea gigas and Mytilus edulis embryos and cancer magister larvae. Marine pollution
bulletin, 12(9), 305-308.
Martinez-Gomez, C., Benedicto, J., Campillo, J.A. & Moore, M. (2008). Application and
evaluation of the neutral red retention (NRR) assay for lysosomal stability in mussel populations along the Iberian Mediterranean coast. Journal of environmental monitoring, 10(4),
490-499.
Mason, A.Z. & Jenkins, K.D. (1995). Metal detoxification in aquatic organisms. In: Tessier,
A., Turner, D.R. (eds.). Metal speciation and bioavailability in aquatic systems. John Wiley
& Sons, New York, U.S.A., 479-608.
Medakovic, D. (2000). Carbonic anhydrase activity and biomineralization process in embryos, larvae and adult blue mussels Mytilus edulis L. Helgoland marine research, 54(1), 1-6.
Michaelidis, B., Ouzounis, C., Paleras, A. & Pörtner, H.O. (2005). Effects of long-term
moderate hypercapnia on acid-base balance and growth rate in marine mussels Mytilus galloprovincialis. Marine ecology-progress series, 293, 109-118.
Millero, F.J., Woosley, R., Ditrolio, B. & Waters, J. (2009). Effect of ocean acidification on
the speciation of metals in seawater. Oceanography, 22(4), 72-85.
Moore, M.N., Allen, J.I. & McVeigh, A. (2006). Environmental prognostics: an integrated
model supporting lysosomal stress responses as predictive biomarkers of animal health status.
Marine environmental research, 61(3), 278-304.
Moore, M.N., Lowe, D. & Köhler, A. (2004). Biological effects of contaminants: measurement
of lysosomal membrane stability. ICES techniques in marine environmental sciences, 36, 31 p.
Murakami, M. & Kudo, I. (2002). Phospholipase A(2). Journal of biochemistry, 131(3),
285-292.
OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance
to application. Organization for Economical Cooperation and Development, Paris, France.
Packard, T.T. (1971). Measurement of respiratory electron transport activity in marine phytoplankton. Journal of marine research, 29(3), 235-244.
Parker, L.M., Ross, P.M. & O’Connor, W.A. (2010). Comparing the effect of elevated pCO(2)
and temperature on the fertilization and early development of two species of oysters. Marine
biology, 157(11), 2435-2452.
Parker, L.M., Ross, P.M. & O’Connor, W.A. (2009). The effect of ocean acidification and
temperature on the fertilization and embryonic development of the Sydney rock oyster Saccostrea glomerata (Gould 1850). Global change biology, 15(9), 2123-2136.
Parry, H.E. & Pipe, R.K. (2004). Interactive effects of temperature and copper on immunocompetence and disease susceptibility in mussels (Mytilus edulis). Aquatic toxicology, 69(4),
311-325.
Pascal, P.Y., Fleeger, J.W., Galvez, F. & Carman, K.R. (2010). The toxicological interaction
between ocean acidity and metals in coastal meiobenthic copepods. Marine pollution bulletin,
60(12), 2201-2208.
Perez, F.F. & Fraga, F. (1987). Association constant of fluoride and hydrogen ions in seawater. Marine chemistry, 21(2), 161-168.
Pipe, R.K., Coles, J.A., Carissan, F.M.M. & Ramanathan, K. (1999). Copper induced immunomodulation in the marine mussel, Mytilus edulis. Aquatic toxicology, 46(1), 43-54.
Portner, H.O., Langenbuch, M. & Reipschlager, A. (2004). Biological impact of elevated
ocean CO2 concentrations: lessons from animal physiology and earth history. Journal of
oceanography, 60(4), 705-718.
Prato, E. & Biandolino, F. (2007). Combined toxicity of mercury, copper and cadmium on
embryogenesis and early stages of the Mytilus galloprovincialis. Environmental technology,
28(8), 915-920.
Reynaud, S., Leclercq, N., Romaine-Lioud, S., Ferrier-Pagès, C., Jaubert, J. & Gattuso, J.-P.
(2003). Interacting effects of CO2 partial pressure and temperature on photosynthesis and
calcification in a scleractinian coral. Global change biology, 9(11), 1660-1668.
Riebesell, U., Fabry, V.J., Hansson, L. & Gattuso, J.-P. (2010). EPOCA Guide for best
practices in ocean acidification research and data reporting. Website.
http://www.epoca-project.eu/index.php/Home/Guide-to-OA-Research/ (gelezen 26 augustus 2010).
Ries, J.B., Cohen, A.L. & McCorkle, D.C. (2009). Marine calcifiers exhibit mixed responses
to CO2 -induced ocean acidification. Geology, 37(12), 1131-1134.
Robins, R.G., Berg, R.B., Dysinger, D.K., Duaime, T.E., Metesh, J.J., Diebold, F.E.,
Twidwell, L.G., Mitman, G.G., Chatham, W.H., Huang, H.H. & Young, C.A. (1997). Chemical, physical and biological interactions at the Berkeley Pit, Butte, Montana. Tailings and
Mine Waste 97. Bakeman, Rotterdam.
Rost, B., Zondervan, I. & Wolf-Gladrow, D. (2008). Sensitivity of phytoplankton to future
changes in ocean carbonate chemistry: current knowledge, contradictions and research directions. Marine ecology-progress series, 373, 227-237.
Seibel, B.A. & Walsh, P.J. (2003). Biological impacts of deep-sea carbon dioxide injection
inferred from indices of physiological performance. Journal of experimental biology, 206(4),
641-650.
Smolders, R., Bervoets, L., De Coen, W. & Blust, R. (2004). Cellular energy allocation in
zebra mussels exposed along a pollution gradient: linking cellular effects to higher levels of
biological organization. Environmental pollution, 129(1), 99-112.
Thoenen, T. & Hummel, W. (2000). Application of the Brønstedt-Guggenheim-Scatchard
specific ion interaction theory to the concentration dependence of complexation constants in
NaCl solutions up to the saturation of halite. Journal of conference abstracts, 5(2), 997.
Thomsen, J., Gutowska, M.A., Saphörster, J., Heinemann, A., Trübenbach, K., Fietzke, J.,
Hiebenthal, C., Eisenhauer, A., Körtzinger, A., Wahl, M. & Melzner, F. (2010). Calcifying
invertebrates succeed in a naturally CO2 enriched coastal habitat but are threatened by high
levels of future acidification. Biogeosciences discussion, 7, 5119-5156.
Thomsen, J. & Melzner, F. (2010). Moderate seawater acidification does not elicit long-term
metabolic depression in the blue mussel Mytilus edulis. Marine biology, 157(12), 2667-2676.
Vahl, O. (1973). Pumping and oxygen consumption rates of Mytilus edulis L. of different
sizes. Ophelia, 12, 45-52.
Verweij, W., Glazewski, R. & Dehaan, H. (1992). Speciation of copper in relation to its
bioavailability. Chemical speciation and bioavailability, 4(2), 43-51.
Viarengo, A., Marro, A., Marchi, B. & Burlando, B. (2000). Single and combined effects
of heavy metals and hormones on lysosomes of haemolymph cells from the mussel Mytilus
galloprovincialis. Marine biology, 137(5-6), 907-912.
Viarengo, A., Pertica, M., Mancinelli, G., Burlundo, B., Canesi, J.L. & Orunesu, M. (1996).
In vivo effects of copper on the calcium homeostasis mechanisms of mussel gill cell plasma
membranes. Comparative biochemistry and physiology C-pharmacology toxicology & endocrinology, 113(3), 421-425.
Weiss, I.M., Tuross, N., Addadi, L. & Weiner, S. (2002). Mollusc larval shell formation:
Amorphous calcium carbonate is a precursor phase for aragonite. Journal of experimental
zoology, 293(5), 478-491.
Wilde, K.L., Stauber, J.L., Markich, S.J., Franklin, N.M. & Brown, P.L. (2006). The effect
of pH on the uptake and toxicity of copper and zinc in a tropical freshwater alga (Chlorella
sp.). Archives of environmental contamination and toxicology, 51(2), 174-185.
Wilt, F.H. (2005). Developmental biology meets materials science: morphogenesis of biomineralized structures. Developmental biology, 280(1), 15-25.
Zaroogian, G.E., Pesch, G. & Morrison, G. (1969). Formulation of an artificial sea water
media suitable for oyster larvae development. American zoologist, 9(4), 1144.
Zeebe, R.E. & Wolf-Gladrow, D. (2001). CO2 in seawater: equilibrium, kinetics, isotopes.
Amsterdam, Elsevier, 346 p.
Bijlage A
Blootstelling van adulte mosselen
aan koperstress
89
Tabel A.1: Gemiddelden en standaardafwijkingen over 14 d van de gemeten waterkwaliteitsparameters (pH, saliniteit, geleidbaarheid,
alkaliniteit, O2 , DOC, temperatuur en NH3 ) voor elk testaquarium per koperbehandeling
Cu
(µg L−1 )
aquarium
(-)
pH
(-)
saliniteit
(-)
geleidbaarheid
(mS cm−1 )
alkaliniteit
(µmol kg−1 )
O2
(mg L−1 )
DOC
(ppm)
temperatuur
(◦ C)
NH3
(mg NH4 N L−1 )
0
0
10
10
32
32
100
100
7
8
1
6
4
5
2
3
7.94 ± 0.18
7.96 ± 0.17
7.94 ± 0.12
7.92 ± 0.17
7.96 ± 0.17
7.96 ± 0.19
7.95 ± 0.13
7.95 ± 0.13
30.4 ± 1.1
30.2 ± 0.9
30.7 ± 0.7
30.8 ± 0.7
30.8 ± 0.8
30.9 ± 0.8
30.4 ± 0.4
30.4 ± 0.3
42.9 ± 1.3
42.6 ± 1.2
43.3 ± 0.9
43.1 ± 1.0
43.3 ± 1.0
43.5 ± 1.0
42.9 ± 0.5
42.9 ± 0.4
2967 ± 253
3006 ± 242
3113 ± 227
3045 ± 276
3131 ± 201
3108 ± 209
3108 ± 207
3084 ± 204
7.98 ± 0.57
7.94 ± 0.56
7.97 ± 0.53
7.86 ± 0.53
7.87 ± 0.58
7.93 ± 0.56
7.73 ± 0.52
7.91 ± 0.55
5.35 ± 2.65
4.58 ± 1.62
5.29 ± 2.68
5.32 ± 3.18
5.80 ± 2.86
4.78 ± 1.67
6.12 ± 1.57
5.79 ± 3.26
12.1 ± 0.1
12.1 ± 0.1
11.6 ± 0.1
12.3 ± 0.1
12.3 ± 0.1
12.2 ± 0.1
12.0 ± 0.1
12.2 ± 0.1
1.09 ± 0.43
0.92 ± 0.37
1.08 ± 0.34
0.94 ± 0.25
1.00 ± 0.38
0.75 ± 0.22
1.63 ± 0.71
1.12 ± 0.35
Tabel A.2: Gemiddelden over 14 d van de berekende waterkwaliteitsparameters (DIC, pCO2 , Ωcalciet en Ωaragoniet ) voor elk testaquarium
per koperbehandeling
Cu
(µg L−1 )
aquarium
(-)
DIC
(µmol kg−1 )
pCO2
(ppm)
Ωcalciet
(-)
Ωaragoniet
(-)
0
0
10
10
32
32
100
100
7
8
1
6
4
5
2
3
2812
2842
2955
2893
2957
2935
2944
2920
707
682
739
762
707
701
722
717
3.35
3.53
3.48
3.35
3.74
3.70
3.58
3.57
2.12
2.23
2.20
2.12
2.37
2.34
2.26
2.26
Figuur A.1: Gemiddelde energie in de vorm van proteı̈nen bij 0 µg Cu L−1 op 0 d, in functie
van het onderzochte aquarium. De foutenbalken geven de gemiddelde standaardafwijking weer van drie replica’s per aquarium
Figuur A.2: Gemiddelde energie in de vorm van proteı̈nen in functie van de koperconcentratie
op 14 d. De gegevenslabels geven telkens het nummer van het onderzochte
aquarium weer en de foutenbalken stellen de gemiddelde standaardafwijking van
drie replica’s per aquarium voor
Figuur A.3: Gemiddelde energie in de vorm van koolhydraten bij 0 µg Cu L−1 op 0 d, in
functie van het onderzochte aquarium. De foutenbalken geven de gemiddelde
standaardafwijking weer van drie replica’s per aquarium
Figuur A.4: Gemiddelde energie in de vorm van koolhydraten in functie van de koperconcentratie op 14 d. De gegevenslabels geven telkens het nummer van het onderzochte
aquarium weer. De foutenbalken stellen de gemiddelde standaardafwijking van
drie replica’s per aquarium voor en de sterretjes geven significante verschillen in
energie tussen de aquariums onderling weer
Figuur A.5: Gemiddelde energie in de vorm van lipiden bij 0 µg Cu L−1 op 0 d, in functie van
het onderzochte aquarium. De foutenbalken geven de gemiddelde standaardafwijking weer van drie replica’s per aquarium
Figuur A.6: Gemiddelde energie in de vorm van lipiden in functie van de koperconcentratie
op 14 d. De gegevenslabels geven telkens het nummer van het onderzochte
aquarium weer en de foutenbalken stellen de gemiddelde standaardafwijking van
drie replica’s per aquarium voor
Figuur A.7: Gemiddeld energieverbruik bij 0 µg Cu L−1 op 0 d, in functie van het onderzochte
aquarium. De foutenbalken geven de gemiddelde standaardafwijking weer van
drie replica’s per aquarium
Figuur A.8: Gemiddeld energieverbruik in functie van de koperconcentratie op 14 d. De
gegevenslabels geven telkens het nummer van het onderzochte aquarium weer.
De foutenbalken stellen de gemiddelde standaardafwijking van drie replica’s per
aquarium voor en de sterretjes geven significante verschillen in energieverbruik
tussen de aquariums onderling weer
Figuur A.9: Gemiddelde retentietijd bij 0 µg Cu L−1 op 0 d, in functie van het onderzochte
aquarium. De foutenbalken geven de gemiddelde standaardafwijking weer van
zes replica’s per aquarium
Figuur A.10: Gemiddelde retentietijd in functie van de koperconcentratie op 14 d. De
gegevenslabels geven telkens het nummer van het onderzochte aquarium weer.
De foutenbalken stellen de gemiddelde standaardafwijking van zes replica’s
per aquarium voor en de sterretjes geven significante verschillen in retentietijd
tussen de aquariums onderling weer
Bijlage B
Blootstelling van mossellarven aan
koperstress in combinatie met
oceaanverzuring
97
Tabel B.1: Waarden voor de gemeten en berekende waterkwaliteitsparameters in functie van het tijdstip van analyse, de pH-behandeling
en de koperconcentratie
tijd
Cu
pH
(h)
pH-behandeling
(-)
geleidbaarheid
(mS cm−1 )
alkaliniteit
(µmol kg−1 )
O2
DIC
pCO2
Ωcalciet
Ωaragoniet
(-)
saliniteit
(-)
(µg L−1 )
(mg L−1 )
(µmol kg−1 )
(ppm)
(-)
(-)
0
0
0
0
0
0
0
8.1
8.1
8.1
8.1
8.1
8.1
8.1
0
1
2
4
8
16
32
8.11
8.11
8.11
8.11
8.09
8.11
8.11
33.3
33.3
33.3
33.4
33.3
33.3
33.3
46.7
46.6
46.6
46.7
46.6
46.7
46.7
2344
2306
2269
2306
2269
2269
2306
7.28
7.42
7.36
7.58
7.46
7.48
7.63
2101
2066
2032
2066
2042
2032
2066
348
343
337
342
356
337
343
4.24
4.17
4.10
4.17
3.95
4.10
4.17
2.71
2.67
2.62
2.67
2.53
2.62
2.67
48
48
48
48
48
48
48
8.1
8.1
8.1
8.1
8.1
8.1
8.1
0
1
2
4
8
16
32
7.94
7.97
7.94
7.96
7.97
7.99
7.97
33.1
33.1
33.1
33.1
33.2
33.1
33.1
45.9
46.0
46.0
46.1
46.2
46.0
46.1
2269
2158
2120
2195
2232
2269
2232
7.54
7.60
7.28
7.26
7.36
7.12
7.65
2110
1992
1968
2031
2062
2089
2062
531
466
495
487
482
465
482
2.94
2.96
2.74
2.96
3.07
3.25
3.07
1.88
1.90
1.75
1.89
1.97
2.08
1.96
0
0
0
0
0
0
0
7.8
7.8
7.8
7.8
7.8
7.8
7.8
0
1
2
4
8
16
32
7.79
7.80
7.82
7.80
7.80
7.80
7.80
33.2
33.3
33.3
33.3
33.2
33.3
33.3
46.5
46.6
46.6
46.6
46.6
46.7
46.7
2325
2325
2325
2325
2325
2326
2326
7.50
7.29
7.57
7.54
7.60
7.26
7.64
2221
2217
2210
2217
2217
2218
2218
799
779
740
779
779
779
779
2.22
2.27
2.37
2.27
2.27
2.27
2.27
1.42
1.46
1.52
1.46
1.45
1.46
1.46
Tabel B.2: Waarden voor de gemeten en berekende waterkwaliteitsparameters in functie van het tijdstip van analyse, de pH-behandeling
en de koperconcentratie (Vervolg)
tijd
Cu
pH
(h)
pH-behandeling
(-)
geleidbaarheid
(mS cm−1 )
alkaliniteit
(µmol kg−1 )
O2
DIC
pCO2
Ωcalciet
Ωaragoniet
(-)
saliniteit
(-)
(µg L−1 )
(mg L−1 )
(µmol kg−1 )
(ppm)
(-)
(-)
48
48
48
48
48
48
48
7.8
7.8
7.8
7.8
7.8
7.8
7.8
0
1
2
4
8
16
32
7.65
7.63
7.70
7.69
7.69
7.63
7.69
33.1
33.0
33.1
33.0
33.1
33.0
33.0
46.0
46.0
46.0
46.0
46.0
45.9
45.9
2269
2195
2232
2306
2306
2418
2418
7.26
7.34
7.28
6.95
6.96
7.45
7.29
2213
2145
2160
2237
2237
2367
2347
1106
1124
961
1019
1019
1240
1069
1.61
1.49
1.76
1.78
1.78
1.64
1.87
1.03
1.04
1.13
1.14
1.14
1.05
1.20
Tabel B.3: Aantal dode en levende larven voor de pH-behandeling 8.1 na 48 h. Er zijn vijf
replica’s per koperbehandeling en uit elke replica werden drie stalen van elk 1 mL
genomen
staal 1
staal 2
staal 3
replica
Cu
(µg L−1 )
] dode
D-larven
] levende
D-larven
] dode
D-larven
] levende
D-larven
] dode
D-larven
] levende
D-larven
67
68
69
70
71
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
16
38
35
33
36
0
0
0
0
0
27
24
33
42
32
0
0
0
0
0
40
29
31
29
37
78
79
80
81
82
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
30
14
32
41
34
0
0
0
0
0
30
17
32
48
35
0
0
0
0
0
27
28
27
33
42
83
84
85
86
87
2
2
2
2
2
0
0
0
0
0
40
49
42
37
45
0
0
0
0
0
55
46
62
41
59
0
0
0
0
0
41
52
35
45
43
88
89
90
91
92
4
4
4
4
4
0
0
0
0
0
20
32
42
36
32
0
0
0
0
0
25
44
34
39
48
0
0
0
0
0
32
46
38
31
45
93
94
95
96
97
8
8
8
8
8
0
0
0
0
1
35
33
36
44
28
0
0
2
0
0
48
46
43
36
32
0
0
0
0
0
47
40
31
36
44
98
99
100
101
102
16
16
16
16
16
0
3
1
0
0
37
40
35
30
29
0
1
0
0
0
32
26
40
20
34
0
0
1
0
0
29
25
22
36
30
103
104
105
106
107
32
32
32
32
32
0
0
0
1
1
25
29
46
24
58
0
1
0
1
0
18
20
20
25
59
1
0
0
0
0
24
16
31
28
50
Tabel B.4: Aantal dode en levende larven voor de pH-behandeling 7.8 na 48 h. Er zijn vijf
replica’s per koperbehandeling en uit elke replica werden drie stalen van elk 1 mL
genomen
staal 1
staal 2
staal 3
replica
Cu
(µg L−1 )
] dode
D-larven
] levende
D-larven
] dode
D-larven
] levende
D-larven
] dode
D-larven
] levende
D-larven
108
109
110
111
112
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
42
41
33
35
27
0
0
0
0
0
45
42
45
52
54
0
0
0
0
0
47
46
52
47
42
113
114
115
116
117
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
20
43
36
41
54
0
0
0
0
0
55
68
40
62
46
0
0
1
0
0
46
48
49
58
47
118
119
120
121
122
2
2
2
2
2
0
0
1
0
0
31
30
41
44
32
0
0
0
0
0
30
28
43
41
58
0
0
0
0
0
49
20
28
40
27
123
124
125
126
127
4
4
4
4
4
0
0
0
0
0
30
44
41
40
40
0
0
0
0
0
42
49
53
51
94
0
0
0
0
0
36
44
62
41
40
128
129
130
131
132
8
8
8
8
8
0
1
0
1
0
73
39
33
33
31
0
0
0
0
0
39
43
69
57
57
0
0
0
1
0
35
36
54
42
42
133
134
135
136
137
16
16
16
16
16
0
0
0
1
2
28
46
38
33
39
0
0
1
0
0
46
78
43
39
26
2
0
1
1
0
52
42
44
40
55
138
139
140
141
142
32
32
32
32
32
0
0
0
0
0
21
46
33
22
30
0
0
1
1
0
23
23
41
16
25
0
1
0
0
1
31
26
62
38
28
Tabel B.5: Aantal normale, abnormale en onvolledig ontwikkelde larven voor de pH-behandeling 8.1 na 48 h. Er zijn vijf replica’s per
koperbehandeling en uit elke replica werden drie stalen van elk 1 mL genomen
staal 1
staal 2
staal 3
replica
Cu
(µg L−1 )
] normale
D-larven
] abnormale
D-larven
] onvol.
ont. larven
] normale
D-larven
] abnormale
D-larven
] onvol.
ont. larven
] normale
D-larven
] abnormale
D-larven
] onvol.
ont. larven
67
68
69
70
71
0
0
0
0
0
50
37
46
51
48
2
3
1
0
1
3
0
1
2
1
53
52
34
46
59
5
0
1
1
1
3
0
3
2
2
54
46
54
65
87
1
0
1
1
2
2
2
3
4
2
78
79
80
81
82
1
1
1
1
1
53
45
31
79
67
0
0
1
1
1
3
1
2
5
3
77
41
48
46
53
1
2
2
1
2
4
3
1
5
3
48
45
44
46
48
0
0
0
1
1
3
2
1
2
2
83
84
85
86
87
2
2
2
2
2
45
61
29
50
84
0
2
1
0
2
5
5
0
1
3
50
51
53
68
54
3
1
0
0
0
10
2
1
6
3
40
46
68
59
51
1
1
2
1
1
4
7
3
2
2
88
89
90
91
92
4
4
4
4
4
33
44
20
31
36
3
4
8
10
3
11
10
15
15
14
17
40
29
31
16
3
5
3
6
5
10
21
10
16
14
33
36
22
19
23
4
3
7
4
6
20
15
15
20
16
93
94
95
96
97
8
8
8
8
8
29
9
5
9
7
14
13
10
13
6
47
31
31
18
16
9
7
8
8
10
9
5
5
6
6
30
16
28
33
17
7
14
9
4
6
5
6
5
10
11
28
24
32
18
13
Tabel B.6: Aantal normale, abnormale en onvolledig ontwikkelde larven voor de pH-behandeling 8.1 na 48 h. Er zijn vijf replica’s per
koperbehandeling en uit elke replica werden drie stalen van elk 1 mL genomen (Vervolg)
staal 1
staal 2
staal 3
replica
Cu
(µg L−1 )
] normale
D-larven
] abnormale
D-larven
] onvol.
ont. larven
] normale
D-larven
] abnormale
D-larven
] onvol.
ont. larven
] normale
D-larven
] abnormale
D-larven
] onvol.
ont. larven
98
99
100
101
102
16
16
16
16
16
1
0
0
1
1
6
6
5
3
6
28
24
19
29
20
1
0
1
1
2
13
7
9
5
7
15
30
24
23
25
1
1
0
0
0
6
9
9
6
11
25
20
31
19
23
103
104
105
106
107
32
32
32
32
32
0
0
0
0
0
8
6
11
9
16
30
23
24
20
27
0
0
0
0
0
10
10
12
10
16
21
34
20
16
32
0
0
0
0
0
6
7
6
10
15
27
27
15
22
33
Tabel B.7: Aantal normale, abnormale en onvolledig ontwikkelde larven voor de pH-behandeling 7.8 na 48 h. Er zijn vijf replica’s per
koperbehandeling en uit elke replica werden drie stalen van elk 1 mL genomen
staal 1
staal 2
staal 3
replica
Cu
(µg L−1 )
] normale
D-larven
] abnormale
D-larven
] onvol.
ont. larven
] normale
D-larven
] abnormale
D-larven
] onvol.
ont. larven
] normale
D-larven
] abnormale
D-larven
] onvol.
ont. larven
108
109
110
111
112
0
0
0
0
0
61
42
47
54
67
2
1
1
1
1
4
7
1
3
4
68
47
30
45
41
2
3
1
3
1
7
0
2
4
4
37
59
48
50
32
1
1
2
0
2
4
3
2
1
4
113
114
115
116
117
1
1
1
1
1
48
40
50
59
61
0
1
1
1
0
7
2
3
0
1
49
54
59
60
49
0
2
0
4
0
5
1
6
3
3
39
46
50
45
35
1
1
0
2
0
3
2
2
2
3
118
119
120
121
122
2
2
2
2
2
47
55
40
40
37
0
0
1
1
1
3
4
6
2
3
38
40
60
57
48
1
0
2
0
0
3
3
4
3
2
49
37
57
46
41
2
1
3
2
1
3
2
6
3
5
123
124
125
126
127
4
4
4
4
4
31
53
48
41
40
1
2
3
3
7
4
7
2
10
6
35
71
44
63
52
5
6
5
5
7
4
6
4
7
1
37
45
42
50
46
2
1
6
11
3
3
10
4
3
5
128
129
130
131
132
8
8
8
8
8
30
24
35
33
25
10
9
11
10
12
1
4
8
8
5
38
27
32
36
38
5
14
17
8
5
8
4
3
11
8
37
37
44
26
42
9
9
5
11
15
6
4
5
7
7
Tabel B.8: Aantal normale, abnormale en onvolledig ontwikkelde larven voor de pH-behandeling 7.8 na 48 h. Er zijn vijf replica’s per
koperbehandeling en uit elke replica werden drie stalen van elk 1 mL genomen (Vervolg)
staal 1
staal 2
staal 3
replica
Cu
(µg L−1 )
] normale
D-larven
] abnormale
D-larven
] onvol.
ont. larven
] normale
D-larven
] abnormale
D-larven
] onvol.
ont. larven
] normale
D-larven
] abnormale
D-larven
] onvol.
ont. larven
133
134
135
136
137
16
16
16
16
16
43
47
40
46
35
1
5
3
2
10
2
1
5
2
4
55
40
34
49
41
7
7
3
5
2
1
7
3
4
6
52
45
38
33
38
3
4
4
9
4
1
7
3
2
4
138
139
140
141
142
32
32
32
32
32
0
1
19
0
0
3
9
20
13
13
24
23
8
22
12
2
0
33
0
0
6
13
16
15
8
27
34
12
17
14
0
0
21
0
0
6
5
18
14
6
17
20
4
13
11
Tabel B.9: Concentratie van de vijf belangrijkste koperspecies in functie van het tijdstip van
analyse, de pH-behandeling en de koperbehandeling
concentratie Cu-species (mol L−1 )
tijd
(h)
pHbeh.
Cu
(µg L−1 )
Cu(CO3 )2−
2
CuCO3 (aq)
CuHCO+
3
Cu2+
CuOH+
0
0
0
0
0
0
0
8.1
8.1
8.1
8.1
8.1
8.1
8.1
0
1
2
4
8
16
32
0.00E 00
1.56E 08
3.11E 08
6.23E 08
1.25E 07
2.49E 07
4.98E 07
0.00E 00
1.60E 10
3.27E 10
6.41E 10
1.36E 09
2.61E 09
5.13E 09
0.00E 00
4.04E 13
8.26E 13
1.62E 12
3.58E 12
6.61E 12
1.29E 11
0.00E 00
3.44E 14
7.16E 14
1.38E 13
3.08E 13
5.73E 13
1.10E 12
0.00E 00
3.85E 14
7.99E 14
1.54E 13
3.28E 13
6.39E 13
1.23E 12
48
48
48
48
48
48
48
8.1
8.1
8.1
8.1
8.1
8.1
8.1
0
1
2
4
8
16
32
0.00E 00
1.55E 08
3.10E 08
6.20E 08
1.24E 07
2.49E 07
4.97E 07
0.00E 00
2.25E 10
4.86E 10
8.98E 10
1.73E 09
3.26E 09
6.91E 09
0.00E 00
7.83E 13
1.82E 12
3.19E 12
6.00E 12
1.08E 11
2.40E 11
0.00E 00
6.77E 14
1.58E 13
2.70E 13
4.99E 13
8.88E 13
1.99E 12
0.00E 00
5.47E 14
1.19E 13
2.14E 13
4.05E 13
7.55E 13
1.62E 12
0
0
0
0
0
0
0
7.8
7.8
7.8
7.8
7.8
7.8
7.8
0
1
2
4
8
16
32
0.00E 00
1.54E 08
3.09E 08
6.18E 08
1.24E 07
2.47E 07
4.94E 07
0.00E 00
2.87E 10
5.51E 10
1.15E 09
2.29E 09
4.59E 09
9.17E 09
0.00E 00
1.45E 12
2.67E 12
5.80E 12
1.16E 11
2.32E 11
4.64E 11
0.00E 00
1.09E 13
2.02E 13
4.37E 13
8.73E 13
1.75E 12
3.50E 12
0.00E 00
6.07E 14
1.17E 13
2.43E 13
4.85E 13
9.70E 13
1.94E 12
48
48
48
48
48
48
48
7.8
7.8
7.8
7.8
7.8
7.8
7.8
0
1
2
4
8
16
32
0.00E 00
1.53E 08
3.07E 08
6.15E 08
1.23E 07
2.46E 07
4.93E 07
0.00E 00
4.31E 10
7.35E 10
1.44E 09
2.88E 09
6.15E 09
1.09E 08
0.00E 00
3.22E 12
4.68E 12
9.34E 12
1.87E 11
4.53E 11
7.01E 11
0.00E 00
2.48E 13
3.59E 13
6.89E 13
1.38E 12
3.12E 12
4.90E 12
0.00E 00
9.31E 14
1.58E 13
2.98E 13
5.97E 13
1.19E 12
2.14E 12

De impact van oceaanverzuring in combinatie met chemische stress

Related documents

Products

Support

De impact van oceaanverzuring in combinatie met chemische stress

Related documents

Add this document to collection(s)

Add this document to saved

Suggest us how to improve StudyLib