hPT-MAX - DNA Genotek

Beoogd gebruik
prepIT•MAX is bedoeld voor het zuiveren van DNA uit sputum
verkregen uit behandelingen met OMNIgene•SPUTUM of NaOH/
NALC, om het maximale DNA te extraheren uit Mycobacterium
tuberculosis (MTb).
voor TB
hPT-MAX
Laboratoriumprotocol voor handmatige zuivering
van DNA uit sputum
Het volgende protocol is een zuiveringsmethode voor chemische
lysis van genomisch DNA uit sedimentmonsters die verkregen zijn
met behulp van OMNIgene•SPUTUM of NaOH/NALC
Samenvatting en uitleg van het reagens
prepIT•MAX is een eenvoudige en snelle exctractiemethode die de
MTb DNA opbrengst verhoogt zonder de noodzaak voor bead-beating
of sonificatie.
Hoeveelheid
prepIT•MAX is leverbaar is verschillende formaten.
Product
Let op: Dit protocol beschrijft een methode voor het zuiveren van
DNA uit 200 µL sediment. De volumes kunnen worden aangepast
voor grotere monstergroottes.
PT-MAX-25
(25 prep.)
Andere talen beschikbaar op www.dnagenotek.com
Componenten
MAX Buffer (5 mL)
Elution Buffer (5 mL)
Product
PT-MAX-250
(250 prep.)
Componenten
MAX Buffer (50 mL)
Elution Buffer (50 mL)
TK Buffer (1 mL)
TK Buffer (10 mL)
MAX Lysis Reagent (1 mL)
MAX Lysis Reagent (10 mL)
Waarschuwingen en voorzorgsmaatregelen
CV
Geproduceerd in Canada
M DNA Genotek Inc.
2 Beaverbrook Road
Ottawa, ON, Canada K2K 1L1
Dochteronderneming van OraSure Technologies, Inc.
Patent (www.dnagenotek.com/legalnotices)
PD-PR-00519 (NL - Dutch) Issue 2/2015-11
15°C l25°C
Uitsluitend voor in vitro diagnostisch gebruik
1.Klinische monsters die Mycobacterium tuberculosis kunnen bevatten,
moeten beschouwd worden als infectieus en behandeld worden
met de juiste voorzorgsmaatregelen en volgens de juiste normen
ten aanzien van bioveiligheid (volg de lokale en/of regionale
regelgeving op, indien van toepassing).
www.dnagenotek.com
Let op: TB bacteriën blijven actief in de OMNIgene•SPUTUM
reagens.
2. NIET gebruiken na de “Uiterste gebruiksdatum” zoals vermeld
op het flesetiket.
Bewaren
prepIT•MAX moet worden bewaard bij kamertemperatuur (15°C-25°C).
Veiligheidsinformatie
Als reagens in contact komt met de ogen of huid, wassen met water.
NIET inslikken.
Veiligheidsinformatieblad (SDS) is beschikbaar op
www.dnagenotek.com
Protocol voor het verwerken van het monster
Inclusief reagentia
•
•
•
•
MAX Buffer
Elution Buffer
TK Buffer
MAX Lysis Reagent
Apparatuur en reagentia geleverd door gebruiker
•
•
•
•
•
Centrifuge die een kracht heeft van 15.000 × g
Microcentrifugebuisjes van 1,5 mL (bijv. Axygen #MCT-150-C)
Waterincubator of hitteblok bij 70°C
Ethanol (95%-100%) op kamertemperatuur
Pipetten en pipetpunten
Vervolg op achterzijde...
www.dnagenotek.com • [email protected] 1
Procedure
Het volgende protocol beschrijft een zuiveringsmethode voor chemische lysis en genomisch DNA uit sputumsedimenten verkregen door behandeling
van OMNIgene•SPUTUM of NaOH/NALC.
Zuiveringsstappen
1. Verwijder een 200 µL aliquot van sputumsediment, geresuspendeerd in steriele
fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of steriel water.
Opmerkingen
Het zuiveringsprotocol ondersteunt een sedimentvolume tot 200 µL in een
microcentrifugebuisje van 1,5 mL en een sedimentvolume van 300 µL in een
microcentrifugebuisje van 2 mL.
Let op: Gebruik van fosfaatbuffer (PB) in plaats van PBS voor resuspensie van
sediment wordt NIET aanbevolen.
2. Voeg een gelijke hoeveelheid MAX Buffer toe.
3. Voeg 40 µL (1/10de volume) MAX Lysis Reagent toe in de microcentrifugebuis en meng
het enkele seconden door te vortexen.
Het 1/10de volume wordt berekend op grond van het totale monstervolume
(bijv. MAX Buffer + sedimentvolume).
4. Verwarm 20 minuten lang bij 70°C.
Een kortere incubatietijd (minimum 5 minuten) is mogelijk, maar de DNA-opbrengst
zal dan minder zijn.
5. Voeg 40 µL (1/10de volume) TK Buffer toe in de microcentrifugebuis en meng
het enkele seconden door te vortexen.
Het monster wordt troebel, omdat onzuiverheden en remmers neerslaan.
Het 1/10de volume wordt berekend op grond van het totale monstervolume
(bijv. MAX Buffer + sedimentvolume).
6. Incubeer op ijs gedurende 10 minuten of gedurende 15 minuten bij 4°C.
7. Centrifugeer bij kamertemperatuur op 15.000 × g gedurende 5 minuten.
8. Breng het heldere supernatant voorzichtig over met een pipetpunt in een schone
microcentrifugebuis; let erop dat u de pellet NIET verstoort. Gooi de pellet met
onzuiverheden weg.
De pellet bevat troebele onzuiverheden. Als de pellet per ongeluk wordt verstoord,
moet de buis weer worden gecentrifugeerd.
9. Voeg 800 µL ethanol op kamertemperatuur (95% tot 100%) toe. Meng voorzichtig
door 20 × om te keren.
Het monster kan tijdens het mengen met ethanol troebel worden omdat het DNA
neerslaat. Zelfs als het monster NIET troebel wordt, wordt het DNA verkregen door
de volgende stappen zorgvuldig uit te voeren.
10.Incubeer monsters 15 minuten bij kamertemperatuur, zodat het DNA volledig
kan neerslaan.
Incubatie bij -20°C wordt NIET aanbevolen omdat onzuiverheden samen met het
DNA kunnen neerslaan.
11.Plaats het buisje in de microcentrifuge in een bekende oriëntatie. Centrifugeer
bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten op 15.000 × g.
Plaats bijvoorbeeld elk buisje in de microcentrifuge zo dat het draaidopje weg
van het midden wijst. Na het centrifugeren zit de pellet in het puntje van het buisje
onder het draaidopje. Soms is de pellet zo klein dat deze moeilijk zichtbaar is.
12.Verwijder het supernatant voorzichtig met een pipet en gooi het weg. Verstoor
de DNA-pellet hierbij niet.
Deze pellet bevat DNA; verlies van de pellet betekent verlies van het DNA.
Let op: De pellet kan groter lijken dan verwacht als gevolg van de aanwezigheid van
restzout. Dit zout vormt GEEN belemmering van verdere moleculaire toepassingen.
Door het buisje zo te draaien dat de pellet aan de bovenkant komt te liggen, kunt
u veilig met een pipet langs de onderkant al het supernatant verwijderen.
Het supernatant kan onzuiverheden bevatten en moet volledig worden verwijderd.
Buitensporig drogen van de pellet maakt het moeilijker het DNA op te lossen.
13.Voeg 100 µL Elution Buffer toe om de DNA pellet op te lossen. Vortex kort om het DNA
volledig te resuspenderen.
Als een hogere concentratie DNA vereist is, moet 50 µL Elution Buffer worden gebruikt.
14.Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur om een volledige rehydratatie van het DNA
te garanderen. Als het DNA NIET direct in oplossing gaat, vortex dan zo nu en dan.
Onvolledige rehydratatie van het DNA kan leiden tot een onnauwkeurige schatting
van de DNA-concentratie en het mislukken van verdere toepassingen zoals PCR.
15.DNA is gereed voor gebruik in verdere toepassingen.
Opslagmogelijkheden van het volledig gerehydrateerde DNA:
a) Gezuiverd DNA kan maximaal 3 maanden worden bewaard bij
kamertemperatuur of 4°C.
b) Gezuiverd DNA kan worden ingevroren in aliquots bij -20°C voor
een langere opslagtijd.
Verzenden
Let op: TB bacteriën blijven actief in OMNIgene•SPUTUM reagens.
Monsters die geoptimaliseerd zijn met behulp van OMNIgene•SPUTUM
reagens moeten beschouwd worden als infectieus/gevaarlijk materiaal
en worden vervoerd als UN3373, Biologische stof, categorie B.
Verpakking en verzending van monsters in OMNIgene•SPUTUM
reagens moet plaatsvinden in overeenstemming met lokale regelgeving
en/of IATA richtlijnen voor het verzenden van biologisch gevaarlijke/
infectueuze monsters.
Afvoeren
Afvoer van dit product moet plaatsvinden conform lokale of
regionale regelgeving.
2 Superieure monsters • Bewezen resultaten
Let op: grote hoeveelheden DNA met hoog moleculair gewicht kunnen langzaam
volledig hydrateren (oplossen).
Technische ondersteuning is beschikbaar van maandag t/m vrijdag
(9.00-17.00 EST):
•
Gratis nummer (vanuit Noord-Amerika): 1.866.813.6354, keuze 6
•
Alle overige landen: +1.613.723.5757, keuze 6
•
E-mail: [email protected]
Sommige DNA Genotek-producten zijn mogelijk niet in alle geografische regio’s verkrijgbaar.
OMNIgene en prepIT zijn gedeponeerde handelsmerken van DNA Genotek Inc.
Alle DNA Genotek producten, technische documentatie en toepassingsaantekeningen,
zijn beschikbaar in het onderdeel ‘support’ van onze website op www.dnagenotek.com.
PEmergo Europe
Molenstraat 15, 2513 BH Den Haag
Nederland
Labelopschrift:
H
Gebruik niet laterdan
CCE-markering
VMedisch hulpmiddel voor
in vitro diagnostiek
h
Catalogusnummer
g
Lotnummer
15:l25:Opslaginstructies
MFabrikant
P
Erkende vertegenwoordiger
© 2015 DNA Genotek Inc., een dochteronderneming van OraSure Technologies, Inc., alle rechten voorbehouden.