Woord vooraf - Howest DSpace
advertisement
GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Woord vooraf Dit eindwerk is tot stand gekomen dankzij de hulp van heel wat personen. Ten eerst bedank ik ten volste Dr. M. Haspeslagh en Dr. E. Steenkiste om mij de kans te geven onder hun leiding, een onderzoek uit te voeren in hun labo en daarbij gebruik te maken van de nodige apparatuur en toebehoren. Ze hebben mij meer dan voldoende bijgestaan om dit eindwerk te kunnen realiseren. De collega’s van het labo wil ik eveneens bedanken voor de goede raad, de leuke samenwerking en het respect die ik kreeg als studente. Op de tweede plaats wil ik mijn promotor de heer P. Dedeckere bedanken voor de steun en de moeite die hij gedaan heeft om dit eindwerk tot een mooi geheel te brengen. Eveneens bedankt aan het hele team van de Hogeschool West-Vlaanderen, departement Simon Stevin te Brugge. 1 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Samenvatting Wanneer een tumor wordt vastgesteld in het lichaam wil men weten waar de tumor zich bevindt en of de tumor afkomstig is van een metastase van een primaire tumor. Voor het onderzoek naar metastaseringen van borstcarcinoma’s wordt, tijdens dit onderzoek, gebruik gemaakt van het antigen GCDFP-15 dat voorkomt in klieren met apocriene differentiatie. Om GCDFP-15 te kunnen aantonen in weefsels wordt een immunohistochemische kleuring uitgevoerd. Deze kleuring moet eerst op punt worden gesteld zodat storende achterkleuring kan worden gereduceerd. Het op punt stellen gebeurt door het aankleuren van positieve controles met verschillende concentraties van de antistof, namelijk 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 en 1/320. Men besluit om verder te werken met de 1/160 verdunde antistof. Na het op punt stellen van de kleuring wordt in een tweede stap de bruikbaarheid van GCDFP-15 onderzocht bij verschillende subtypes van borsttumoren, namelijk ductaal, tubulair, lobulair en medullair subtype. Er worden een aantal subtypes van borstcarcinoma’s gekleurd en microscopisch bekeken in welke subtypes aankleuring te zien is. Dit gebeurd om later de kleuring eventueel te gebruiken als merker van borstorigine bij metastasen van ongekende primair origine. In de laatste stap wordt kwaadaardig prostaatweefsel gekleurd en de bruikbaarheid van GCDFP-15 als een merker voor kwaadaardigheid in prostaatweefsel onderzocht. 2 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Lijst met afkortingen en symbolen Ab antilichaam of antistof A.D. Gedemineraliseerd water Ag antigen AMACR Alpha-methylacyl-CoA racemase DAB 3,3’-diaminobenzidine DCIS Ductaal carcinoma in situ GCDFP-15 Gross Cystic Disease Fluip Protein (15 kD) Ig immunoglobuline IHC immunohistochemie kD kilodalton LCIS Lobulair carcinoma in situ mRNA messenger RNA NK-cellen Natural Killer cellen NOS Not Otherwise Specified, terug te vinden bij invasief ductaal carcinoma PSA Prostaat Specifiek Antigen TTF-1 Thyroid Transcription Factor-1 VC Vriescoupe 3 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Verklarende woordenlijst Adenocarcinoma carcinoom dat ontstaat in klierweefsel (adeno-) AIDS Acquired immuno-deficiency syndrome Eiwit dat helpt bij de metabolisatie van verschillende AMACR vetzuren in het lichaam. Studies vertellen ons dat AMACR kan gebruikt worden als een prostaatkanker biomarker. Synoniem: P504S Androgenen Apocriene of eccriene klieren Carcinoom, carcinoma Celdifferentiatie Mannelijke hormonen, bij de vrouw belangrijk als bouwstenen van oestrogenen vochtafscheidende klieren bijvoorbeeld melkklieren, zweetklieren in de oksel en speekselklieren kwaadaardige kanker van epitheliaal weefsel rijping van cellen naar een volwassen cel zonder celdeling Celproliferatie vermeerdering van cellen door celdeling en celgroei Commensale flora of commen- biologische organismen die voorkomen en leven in de salen mens, zonder schade te veroorzaken Cyste blaas of holte met vloeibare, stroperige of taaie inhoud het deel van de cel buiten de kern en binnen de cel- Cytoplasma wand, slijmachtig en bestaande uit eiwitten, koolhydraten, vet en water Ductaal borstcarcinoma Specifiek subtype van borstkanker Ductaal, ductus kanaal, lozingsgang Dysplasie abnormale groei en vorming van weefsel 4 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Elektron zeer klein elementair deeltje met een negatieve lading dat om de positieve atoomkern cirkelt Elektronenacceptor neemt elektronen, afkomstig van elektronendonor, op Elektronendonor geeft elektronen af aan een elektronenacceptor bovenste laag van de huid en slijmvliezen, bedekt het Epithiaal weefsel, epitheel uitwendige oppervlakte van het lichaam en vele lichaamsholten Epitoop of determinant herkenningsplaats op het Ag dat specifiek kan worden herkend door Ab, die zich eraan binden een blaasje in het cytoplasma van de cel versmelt met Exocytose het celmembraan waardoor de inhoud van het blaasje uit de cel kan Exogene stof lichaamsvreemde stof, ontstaat buiten het lichaam, tegengestelde van endogeen Fibrose toename van bindweefsel in een orgaan Fylogenese het ontstaan en de ontwikkeling van een soort of ras de meeste antistoffen die zich na inenting of infectie Gammaglobuline vormen, bevinden zich in deze fractie van het bloedserum GCDFP-15/gp17 Gecoate objectglaasjes Globuline Glycoproteïnen Granulocyt eiwit van GCDF dat wordt gesecreteerd door apocriene borsttumorcellen objectglaasje bedekt met een bepaalde stof bijvoorbeeld sylaan, specifieke antistoffen enzovoort eiwitachtige stof in het bloedplasma, spieren enzovoort eiwitmolecule (proteïne) waaraan een suikerketen (glyco-) is gebonden gekorrelde witte bloedcel, wordt onderscheiden in eosinofielen, neutrofielen en basofielen 5 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Gross Immunoglobuline met het blote oog zichtbaar zodat er macroscopisch kan worden onderzocht gammaglobulines in het bloedserum die als antilichamen aanwezig zijn in het lichaam In situ ter plaatse Intracellulair in de cel, tegengestelde van extracellulair Invasief verspreiding in het omringend gezond weefsel Lobulair kwabje, lobje Lobulair carcinoom Specifiek subtype van borstkanker Lokaal plaatselijk Maligne tumor kwaadaardige tumor, tegengestelde van benigne tumor Mammectomie of mastectomie borstamputatie Medullair carcinoom Specifiek subtype van borstkanker Metastase, metastasering uitzaaiing Monoklonaal antilichaam Mucineus, mucus Nevus sebaceus antilichaam dat een specifiek epitoop bindt op een antigen slijm Goedaardige huidtumor onder andere gekenmerkt door talgklierweefsel Paget’s disease type borstkanker dat zich vormt in of rond de tepel Pathologie, pathologisch ziekteleer; ziekelijk, afwijkend Plasma bloed zonder rode bloedcellen 6 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Polyklonaal antilichaam antilichaam dat verschillende epitopen bindt op een antigen de verbinding van moleculen van dezelfde soort tot Polymerisatie of polymeer één structuur zonder verandering van de bouw van de elementaire moleculen Progressie de vooruitgang van een aandoening PSA eiwit gevormd in het klierweefsel van de prostaat Ribosoom zorgt voor de aanmaak van eiwitten (eiwitsynthese) Sclerose verharding van bindweefsel bestaat voornamelijk uit bloedserum, door ontsteking Sereus vocht gevormde of op andere wijze uitgezwete waterige vloeistof Serum Transcriptie bloed zonder stollingsfactoren kopiëren van DNA naar mRNA door het enzym RNApolymerase Translatie het vertalen van RNA in eiwitten Tubulus buisje Tubulair carcinoom specifiek subtype van borstkanker 7 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Lijst van tabellen en figuren Tabellen Tabel 1 - Immunohistochemie van GCDFP-15 .............................................................. 18 Tabel 2 - Positieve immunohistochemie voor AR ........................................................ 19 Tabel 3 - Vergelijking resultaten RT-PCR en immunohistochemie ............................. 21 Tabel 4 - Gebruikte reagentia ......................................................................................... 26 Tabel 5 - Gebruikte reagentia en antilichamen voor de kleuringen met de Autostainer Plus ............................................................................................... 33 Tabel 6 - Gebruikte reagentia en antilichamen voor de kleuring (verdunning 1/160) van tumorale borstweefsels met de Autostainer Plus ....................... 35 Tabel 7 - Samenvattende tabel met de resultaten van de borstcarcinoma’s ............. 40 Tabel 8 - Gebruikte reagentia en antilichamen voor de kleuring (verdunning 1/160) van prostaatweefsel met de Autostainer Plus .................................... 41 Tabel 9 - Samenvattende tabel met de resultaten van de prostaatcarcinoma's ........ 42 Figuren Figuur 1 - Enzymgeconjugeerde immunohistochemie ................................................ 14 Figuur 2 - Werking EnVision® ........................................................................................ 15 Figuur 3 - Het Golgi-apparaat ......................................................................................... 16 Figuur 4 - Eiwitsynthese ................................................................................................. 20 Figuur 5 - Cassette met deksel ....................................................................................... 22 Figuur 6 - Microm HMP 110............................................................................................. 23 Figuur 7 - Medite medizintechnik ................................................................................... 23 Figuur 8 - Microm HM 350 S............................................................................................ 24 Figuur 9 - Dako Autostainer Plus ................................................................................... 24 Figuur 10 - Shandon Varistain 24/4 ................................................................................ 25 Figuur 11 - Zones op een draagglaasje ......................................................................... 28 8 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Figuur 12 - Microscopisch beeld van een speekselklier bij concentratie 1/20 (100x) ..................................................................................................... 34 Figuur 13 - Microscopisch beeld van een ductaal borstcarcinoma (100x) ................ 35 Figuur 14 - Microscopisch beeld van een lobulair borstcarcinoma (400x) ................ 36 Figuur 15 - Microscopisch beeld van een tubulair borstcarcinoma (400x) ................ 38 Figuur 16 - Microscopisch beeld van een medullair borstcarcinoma (100x) ............. 38 Figuur 17 - Microscopisch beeld van een prostaattumor (400x) ................................. 42 9 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Inhoudsopgave Woord vooraf ..................................................................................................................... 1 Samenvatting ..................................................................................................................... 2 Lijst met afkortingen en symbolen .................................................................................. 3 Verklarende woordenlijst .................................................................................................. 4 Lijst van tabellen en figuren ............................................................................................. 8 Inhoudsopgave ................................................................................................................ 10 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling ............................................................... 13 2 Literatuurstudie ............................................................................................................ 14 2.1 2.2 2.3 Immunologie ........................................................................................................ 14 2.1.1 Aangeboren aspecifieke immuniteit.......................................................... 14 2.1.2 Verworven specifieke immuniteit .............................................................. 15 Immunohistochemie ............................................................................................. 16 2.2.1 Enzymgeconjugeerde immunohistochemie .............................................. 16 2.2.2 Gebruik van EnVision® ............................................................................ 17 GCDFP-15 ........................................................................................................... 18 2.3.1 Voorkomen ............................................................................................... 18 2.3.2 Aantonen .................................................................................................. 19 2.3.3 Resultaten uit enkele onderzoeken .......................................................... 19 10 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren 3 Materiaal en methode ...................................................................................................... 24 3.1 GCDFP-15: op punt stellen van de immunohistochemische kleuring .................. 24 3.2 Materialen ............................................................................................................ 24 3.3 3.2.1 Apparatuur en benodigdheden ................................................................. 24 3.2.2 Reagentia ................................................................................................. 27 Methoden ............................................................................................................. 28 3.3.1 Bewerking van het staal ........................................................................... 28 3.3.2 Immunohistochemie ................................................................................. 29 3.3.3 Tegenkleuren............................................................................................ 31 4 Onderzoeken en resultaten ............................................................................................. 33 4.1 Inleiding: de resultaten worden bekomen in drie stappen ................................... 33 4.2 Voorstelling van het resultaat .............................................................................. 33 4.3 Onderzoek en resultaten ..................................................................................... 34 4.3.1 Immunohistochemische kleuring op punt stellen ...................................... 34 4.3.2 Immunohistochemische kleuring van tumorweefsel afkomstig van de borst .......................................................................................................... 37 4.3.3 Immunohistochemische kleuring van prostaattumoren ............................ 42 5 Discussie ....................................................................................................................... 45 6 Conclusie....................................................................................................................... 48 Literatuurlijst .................................................................................................................... 49 Boeken................................................................................................................. 49 Internet................................................................................................................. 50 Bijsluiter ............................................................................................................... 54 11 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Bijlagen ............................................................................................................................. 55 Bijlage 1 – Bijsluiter DakoCytomation EnVision®+ Dual Link System-HRP ........ 56 Bijlage 2 – Bijsluiter DakoCytomation Liquid DAB+ Substrate Chromogen System ............................................................................................... 57 Bijlage 3 – Bijsluiter NCL-L-GCDFP-15 (kloon 23A3) ......................................... 58 Bijlage 4 - Bijsluiter DakoCytomation Peroxidase Blocking Reagent Ready-to-Use code S2001 ................................................................. 60 Voor akkoord verklaring ................................................................................................. 61 12 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Inleiding 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling Het onderzoek werd uitgevoerd in het labo anatomie-pathologie in het Stedelijk Ziekenhuis te Roeselare. Dit werd met zorg begeleid door Dr. M. Haspeslagh en Dr. E. Steenkiste. Het onderzoek naar tumoren is sterk geëvolueerd. Het stellen van de diagnose vraagt steeds verdere verfijning. Specifieke kleurtechnieken waarbij gebruik gemaakt wordt van antigenen (immunohistochemie) zijn hierbij een goede hulp. Recent werd de immuunkleuring GCDFP-15 aangekocht door het labo voor het onderzoek naar metastaseringen van borstcarcinoma’s en eventueel gebruik bij prostaattumoren. De kleuring diende nog op punt te worden gesteld door middel van positieve controles. Speciale aandacht gaat naar storende achtergrondkleuring. Na het op punt stellen van de kleuring werd in een tweede stap de bruikbaarheid van GCDFP-15 onderzocht bij verschillende subtypes van borsttumoren. Er werden een aantal subtypes borstcarcinoma’s gekleurd en microscopisch bekeken in welke subtypes eventueel aankleuring te zien was. Dit gebeurde om later de kleuring eventueel te gebruiken als merker van borstorigine bij metastasen van ongekend primair origine. In de laatste stap werd kwaadaardig prostaatweefsel gekleurd en de bruikbaarheid van GCDFP-15 als een merker voor kwaadaardigheid in prostaatweefsel onderzocht. 13 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Literatuurstudie 2 Literatuurstudie 2.1 Immunologie Bij inenting en bij infectie, door een virus bijvoorbeeld, komen exogene stoffen het lichaam binnen. Deze lichaamsvreemde stoffen worden antigenen genoemd en komen voor in virussen, bacteriën, weefsels... Antigenen hebben het vermogen om beschermende antistoffen of immunoglobulines (Ig) in het lichaam op te wekken en met deze een specifieke binding aan te gaan. Met specifiek bedoelt men dat een immunoglobuline gericht is tegen één bepaald antigen en dus één antigen bindt. Dit wordt de afweer- of immuunreactie genoemd. Het resultaat is dat de antigenen worden verwijderd zodat bijvoorbeeld de infectie voorbij is. Algemeen is de belangrijkste functie van het immuunsysteem het lichaam te verdedigen tegen infecties. Immuniteit is dus het in een bepaalde mate beschermd zijn van het organisme tegen invloeden van buitenaf. De immuniteit kan ofwel aangeboren ofwel verworven zijn. Beide systemen werken samen. 2.1.1 Aangeboren aspecifieke immuniteit Deze onvatbaarheid voor infecties is aangeboren. Dit wil zeggen dat elke persoon vanaf de geboorte immuun is, niet voor één maar een hele groep micro-organismen en dit voor het hele leven. Enkele beschermende barrières van het lichaam zijn: • de huid die, indien intact, de meeste micro-organismen tegenhoudt; • het zuur maagsap dat bacteriën doodt; • de commensale flora, die de groei van pathogene bacteriën en schimmels onderdrukken. In lichaamsvochten komen stoffen voor die helpen het lichaam te beschermen. Voorbeelden hiervan zijn: • Lysozymen die de glycoproteïnen in de celwand van bacteriën aanvallen; 14 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Literatuurstudie • Acute fase eiwitten. Hun concentratie stijgt bij infecties. Een voorbeeld is interferon, dat geproduceerd wordt door viraal geïnfecteerde cellen en de naburige cellen beschermd tegen intracellulaire virale replicatie. In het lichaam komt er een proces voor dat zorgt voor de opname en vertering van microorganismen. Het heet fagocytose en komt tot stand door twee belangrijke celtypes, namelijk granulocyten en macrofagen. Granulocyten vormen een circulerend verdedigingssysteem en zijn vooral actief tegen ettervormende bacteriën. Macrofagen zorgen voor de lokale verdediging door hun aanwezigheid in weefsels en zijn vooral actief in de strijd tegen bacteriën en virussen die intracellulair kunnen leven. Een laatste bescherming gebeurt met de hulp van Natural Killer cellen (NK-cellen). Deze cellen zijn dodelijk voor viraal geïnfecteerde cellen en tumorcellen. De natuurlijke, niet-specifieke immuniteit zorgt voor tijdswinst die nodig is om de verworven, specifieke immuunreactie op gang te laten komen.1 2.1.2 Verworven specifieke immuniteit De verworven, specifieke immuniteit volgt na de aangeboren, aspecifieke verdediging en verhoogt de efficiëntie van het niet-specifieke immuunsysteem. Wanneer het lichaam voor de eerste maal geïnfecteerd wordt, komen vreemde antigenen het lichaam binnen en vormt het organisme antilichamen tegen deze antigenen. Een eerste contact met een lichaamsvreemd antigen laat een herinnering na. Bij een volgend contact met hetzelfde antigen zal dit leiden tot een snellere en sterkere reactie van het lichaam. Lichaamseigen stoffen worden normaal niet aangevallen. Bij auto-immuniteit reageert het immuunsysteem overactief, waarbij het lichaam antistoffen vormt, gericht tegen de eigen lichaamsweefsels.1 1 Referentie 4 en 8 in literatuurlijst 15 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Literatuurstudie 2.2 2.2.1 Immunohistochemie Enzymgeconjugeerde immunohistochemie Tijdens een immunohistochemische kleuring bindt een primair antilichaam op specifieke antigenen aanwezig in het weefselpreparaat. Een secundair antilichaam bindt op het primair antilichaam. Als secundair antilichaam wordt een monomeer immunoglobuline of een polymeer (zie 2.2.2 Gebruik van EnVision®) gebruikt. Aan dit secundaire antilichaam wordt een enzymcomplex met een chromogeen substraat gebonden. Telkens worden verschillende wasstappen tussenin uitgevoerd om niet gebonden antilichamen en reagentia weg te wassen. De enzymatische activiteit van het chromogeen resulteert in een zichtbare reactie op de plaats van het antigen (zie figuur 1). De verkregen resultaten worden onder de lichtmicroscoop door een patholoog geïnterpreteerd en dienen als hulp bij de diagnose van pathologische processen in het onderzochte biopt.2 Figuur 1 Enzymgeconjugeerde immunohistochemie3 2 Referentie 37 in literatuurlijst 3 Referentie 3 in literatuurlijst 16 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Literatuurstudie 2.2.2 Gebruik van EnVision® Tijdens de immunohistochemische kleuring wordt een primair antilichaam gebonden op de antigenen aanwezig in het weefselpreparaat. Als secundair antilichaam wordt gebruik gemaakt van EnVision®. Dit is een enzymgeconjugeerd polymeer dat secundaire antilichamen draagt (zie figuur 2). Figuur 2 Werking EnVision®4 Als enzym draagt het polymeer Horseradish Peroxidase (HRP), dat uit mierikswortel wordt bereid. Detectie van dit enzym gebeurt met diaminobenzidine (DAB) en H2O2. DAB dient als elektronendonor voor HRP. Het enzym HRP draagt de gekregen elektronen over aan H2O2. Door deze elektronenoverdracht wordt DAB gepolymeriseerd tot een onoplosbare bruine neerslag die met een lichtmicroscoop gemakkelijk te detecteren is.5 4 Referentie 3 in literatuurlijst 5 Referentie 3, 34 en 35 in literatuurlijst 17 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Literatuurstudie 2.3 2.3.1 GCDFP-15 Voorkomen Gross Cystic Disease Fluid (GCDF) is een secretie afkomstig van apocriene klieren in onder andere de borst. Het secreet bestaat uit verschillende glycoproteïnen (antigenen) waaronder GCDFP-15. GCDFP-15 is een monomeer eiwit met een moleculair gewicht van vijftien kilodalton (kD). Het werd ongeveer dertig jaar geleden geïdentificeerd door Haagensen en collega’s.6 Vaak wordt in plaats van GCDFP-15, over PIP gesproken, wat staat voor prolactin-inducible protein. Het wordt teruggevonden in het Golgi-apparaat en cytoplasmatische granules van cellen. Het Golgi-apparaat komt voor in het cytoplasma van een cel en kan stoffen produceren waarna deze uitgescheiden worden door de cel (zie figuur 3). Figuur 3 Het Golgi-apparaat7 Transportblaasjes met eiwitten, gemaakt door ribosomen, worden vervoerd naar de ciszijde van het Golgi-apparaat. Aan deze zijde geven de blaasjes hun eiwitten af binnen het Golgi-apparaat. Ze worden er bewerkt tot een eindproduct. Hierna bereiken de eiwitten de trans-kant van het Golgi-apparaat. Ze vormen blaasjes die als secreetkorrels richting het celmembraan getransporteerd worden. Wanneer de blaasjes versmelten met het celmembraan komen de eiwitten vrij, buiten de cel (exocytose). In kliercellen is het Golgi- 6 Referentie 5 in literatuurlijst 7 Referentie 17 in literatuurlijst 18 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Literatuurstudie apparaat doorgaans goed ontwikkeld. Vooral de cellen van secretie-organen zullen veel Golgi-apparaten bezitten.8 2.3.2 Aantonen GCDFP-15 kan worden aangetoond via een immunohistochemische kleuring op formol gefixeerde, paraffine ingebedde weefsels (zie 2.2 Immunohistochemie). 2.3.3 Resultaten uit enkele onderzoeken In normaal borstweefsel is er een positieve reactie voor GCDFP-15 in de epitheelcellen van blaasjes (lobulair) en smalle kanalen (tubulair). Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat GCDFP-15 een specifieke merker is voor apocriene differentiatie, wat onder meer kan worden waargenomen in de borstklieren.9 2.3.3.1 Onderzoek 1 In het onderzoek 10 kleurden veertien van dertig borstcarcinoma’s positief voor GCDFP- 15. Van zestien carcinoma’s met apocriene oorsprong kleurden er twaalf positief (zie tabel 1). De cijfers van immunohistochemische aankleuring variëren in de literatuur van ongeveer 50% tot 90% voor borstcarcinomen11. Benigne en maligne regio’s van andere weefsels (colon, maag enzovoort) vertoonden geen immunoreactiviteit. De enige cellen die afkomstig zijn van niet-apocrien weefsel en GCDFP-15 bevatten, zijn sereuze cellen van de slijm- en speekselklieren in de mond en keel, klieren in het bindweefsel van de bronchi en traanklieren. Deze weefsels hebben fylogenetische gelijkenissen met apocriene klieren. Dit onderzoek leidt tot het besluit dat GCDFP-15 als een weefselspecifieke merker 8 Referentie 8 in literatuurlijst 9 Referentie 11, 17 en 30 in literatuurlijst 10 Referentie 21 in literatuurlijst 11 Referentie 6 in literatuurlijst 19 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Literatuurstudie voor apocrien epitheel kan gebruikt worden. Recent werd ook positiviteit aangetoond in een subgroep van longcarcinomen.12 Aantal positieve stalen voor GCDFP-15 Soort weefsel 14/30 Borstcarcinoma’s 12/16 Apocriene borstcarcinoma’s Positiviteit in weefsel met fylogenetische gelijkenissen als deze van apocriene klieren Andere weefsels vertoonden geen positiviteit Tabel 1 Immunohistochemie van GCDFP-15 2.3.3.2 Onderzoek 2 Voor een onderzoek 13 naar het voorkomen van antilichamen tegen GCDFP-15/gp17, werden drie soorten stalen van vrouwen onderzocht: • borstcarcinoma’s; • benigne borstaandoeningen bij gezonde vrouwen; • tumoren met een ander origine dan de borst. De hoogste concentratie anti-GCDFP-15/gp17 antilichamen werd terug gevonden bij patienten met hoog kwaadaardige ductale of lobulaire carcinoma’s van de borst en bij patiënten met fibrocystische veranderingen (fibreuze dysplasie). Er is geen verband tussen het voorkomen van het antilichaam en de grootte van de tumor of de leeftijd van de patiënt. Het besluit van dit onderzoek is dat er mogelijkheid is dat de anti-GCDFP-15/gp17 immuunreactie als hulpmiddel kan worden gebruikt bij onderzoek van de progressie van borstaandoeningen.14 12 Referentie 6 in literatuurlijst 13 Referentie 23 in literatuurlijst 14 Referentie 23 in literatuurlijst 20 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Literatuurstudie 2.3.3.3 Onderzoek 3 Een ander onderzoek 15 gaat over de expressie van GCDFP-15 in borsttumoren met co- expressie van androgeen receptor (AR) en prostaat specifiek antigen (PSA) expressie. Androgenen reguleren via AR-gemedieerde mechanismen de proliferatie van borsttumorcellen. Tijdens het onderzoek werden 72 primaire borsttumoren immunohistochemisch gekleurd en werd gekeken naar de expressie van AR en twee androgeen-gereguleerde eiwitten, namelijk PSA en GCDFP-15. AR immunoreactiviteit wordt teruggevonden in de kernen van borsttumorcellen en wordt in verband gebracht met oestrogeen receptor (ER) en progesteron receptor (PR). PSA en GCDFP-15 worden teruggevonden in het cytoplasma van tumorcellen. 85% van de borsttumoren vertoonden positiviteit voor AR. 98% van de PSA-positieve tumoren en 92% van de GCDFP-15-positieve tumoren waren ook positief voor AR (zie tabel 2). Soort weefsel positief voor AR Procent Borsttumoren 85 % PSA-positieve tumoren 98% GCDFP-15-positieve tumoren 92% Tabel 2 Positieve immunohistochemie voor AR Een positieve reactie voor PSA in de prostaat en GCDFP-15 in borsttumoren is sterk afhankelijk van AR, maar onafhankelijk van de leeftijd de patiënt, ER en PR. PSA immunoreactiviteit wordt meer bemerkt in sterk gedifferentieerde tumoren en is geassocieerd met GCDFP-15 immunoreactiviteit. Als besluit wordt aangenomen dat de PSA en GCDFP-15 immunoreactiviteit afhankelijk is van het voorkomen van AR, maar niet van ER of PR in primaire borsttumoren.16 15 Referentie 19 in literatuurlijst 16 Referentie 19 in literatuurlijst 21 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Literatuurstudie 2.3.3.4 Onderzoek 4 In een laatste onderzoek 17 wordt de expressie van PIP (GCDFP-15) nagegaan, op RNA niveau, in benigne epitheelweefsel en adenocarcinoma van de prostaat. Er wordt gebruik gemaakt van de Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Hierbij wordt een kleine hoeveelheid DNA of mRNA via PCR vermeerderd. DNA bestaat uit nucleotiden. Tijdens de eiwitsynthese (zie figuur 4) wordt de code van de genen overgeschreven naar messenger RNA (mRNA). Dit heet transcriptie en vindt plaats in de kern. Het mRNA wordt door ribosomen afgelezen. Drie nucleotiden (codon) worden vertaald naar één aminozuur. Een reeks verbonden aminozuren vormen een eiwit. Door het gebruik van RT-PCR kan men een grotere hoeveelheid mRNA aanmaken waardoor deze hoeveelheid detecteerbaar is.18 Figuur 4 Eiwitsynthese18 De dectectie vindt plaats met behulp van fluorescentie. Tijdens het onderzoek wordt, met behulp van RT-PCR, een kleine hoeveelheid (6%) aan PIP mRNA teruggevonden in het normale prostaatweefsel. Indirecte immunohistochemie, waarbij gebruik gemaakt wordt 17 Referentie 29 in literatuurlijst 18 Referentie 24 in literatuurlijst 22 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Literatuurstudie van een monoklonaal antilichaam 3E7, vertoonde positiviteit voor het benigne epitheelweefsel in 29,6%. Hoewel, bij het gebruik van de indirecte methode (immunohistochemie) bij primaire prostaatcarcinoma’s steeg het percentage naar 56,1%. Kwantitatieve RT-PCR toonde aan dat de graad aan PIP-transcriptie hoger was in tumorweefsel, in vergelijking met normaal prostaatweefsel (zie tabel 3). Normaal prostaatweefsel PIP mRNA (RT-PCR) 6% 3E7 (immunohistochemie) 29,6 % Prostaatcarcinoma > 6% 56,1 % Tabel 3 Vergelijking resultaten RT-PCR en immunohistochemie Als besluit werd gesteld dat benigne prostaatepitheel weinig PIP tot expressie brengt, in vergelijking met prostaatcarcinoma’s die PIP teveel tot expressie brengen.16 23 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Materiaal en methode 3 Materiaal en methode 3.1 GCDFP-15: op punt stellen van de immunohistochemische kleuring De eerste stap in dit onderzoek is de expressie van GCDFP-15 nagaan in normaal weefsel dat het antigen tot expressie brengt. De gebruikte immunohistochemische kleuringtechniek wordt hiermee op punt gesteld. Er wordt gezorgd dat de achtergrondkleuring minimaal is door aanpassen van de concentratie van het antilichaam (1/20, 1/40, 1/80, 1/160 en 1/320) en er enkel kleuring is waar GCDFP-15 aanwezig is in het biopt met de sterkst mogelijke intensiteit. Drie stalen, waarvan men weet dat het weefsels zijn die GCDFP-15 tot expressie brengen, worden gebruikt als positieve controles voor de kleuring. Ten tweede wordt nagegaan welke subtypes van borsttumoren GCDFP-15 tot expressie brengen. De verschillende onderzochte subtypes zijn ductale, lobulaire, tubulaire en medullaire carcinomen. Hiervoor worden verschillende stalen behandeld met anti-GCDFP-15 (NCL-L-GCDFP-15) en wordt microscopisch gekeken of er al dan niet kleuring te zien is. Uit dit onderzoek besluit men welke borstcarcinoma’s al dan niet positief kleuren en of er eventueel een patroon kan worden herkend. Een derde stap is nagaan of anti-GCDFP-15 kan gebruikt worden als merker voor maligniteit in prostaatweefsels. Er worden enkele stalen, afkomstig van de prostaat met normaal en kwaadaardig weefsel, immunohistochemisch gekleurd en daarna bekeken. Men besluit of GCDFP-15 wel of niet kan gebruikt worden bij onderzoek naar prostaattumoren. 3.2 3.2.1 Materialen Apparatuur en benodigdheden • Cassettes en bijhorende dekseltjes Figuur 5 Cassette met deksel 24 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Materiaal en methode • Microm HMP 110 Paraffinetoestel waarin de cassettes worden geparaffineerd. Figuur 6 Microm HMP 110 • Medite medizintechnik Met dit toestel worden de biopten vanuit de cassettes manueel ingebed in vloeibare paraffine en ondergaan stolling op de koelplaat waardoor een paraffineblokje gevormd wordt. Figuur 7 Medite medizintechnik • Microm HM 350 S Met de hulp van dit automatisch toestel (microtoom) worden van de paraffineblokjes coupes gesneden met een dikte van ongeveer 5 μm. Figuur 8 Microm HM 350 S 25 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Materiaal en methode • Gecoate draagglaasje en dekglaasjes (24 x 32mm) Product Merk Lotnr. Ref.nr. Vervaldatum Silanized Slides DakoCytomation 00009242 S3003 2012-04 • Verwarmplaat op ongeveer 37 °C • Microgolf op 360 Watt of 600 Watt • Droogstoof op ongeveer 60 °C • Dako Autostainer Plus Toestel en de bijhorende software die instaan voor de immunohistochemische kleuring van draagglaasjes. Serial no. S38-7146 Firma: DakoCytomation Figuur 9 Dako Autostainer Plus • Shandon Varistain 24-4 Dit toestel kan verschillende programmaties bevatten, zoals kleuren waar een volledige cyclus wordt doorlopen, maar ook deparaffineren waar enkel de eerste zes stadia worden uitgevoerd (zie figuur 10). 26 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Materiaal en methode Figuur 10 Shandon Varistain 24/4 3.2.2 Reagentia Product Methanol Merk Brenntag Lotnummer 1230 Ref. nr. Vervaldatum / / Gevaarssymbool Licht ontvlambaar/ giftig Tolueen (Toluol) Brenntag 1294 / / Paraffine Labonord 700914 6148431 2012-03 Formaldehyde 35 % VWR 71250502 902.409. 010 2010-09 Stick-on Labonord 23461001 1104760 8 0 2005-01 Ethanol 99% Klinipath KP 72920202 RS04834 5 0043 2009-11 07H02/V2 756D419 8552 F11 2010-07 07F19/V2 756D967 8216 F11 2010-06 Licht ontvlambaar/schadelijk Alcohol 90 % Alochol 70% Conforma Conforma Giftig / Licht ontvlambaar Licht ontvlambaar Licht ontvlambaar 27 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Materiaal en methode Ammoniak VWR 07C2005 10 11.331.0 00 2009-03 HCl min. 37% UCB 01C1300 25 / 2006-02 Dako REAL™ Antibody Diluent Dako Wash Buffer 10 Dako REAL™ Target Retrieval Solution (10x), pH 6 Dako Target Retrieval Solution, pH 9 (10x) Corrosief/ Schadelijk voor het milieu Corrosief Dako 00039006 S2022 2009-06 / Dako 00037563 S3006 2008-09 / Dako 00035900 S2031 2008-07 / Dako 00040234 s2367 2009-01 / Canadabalsem VWR 07/12050 6 2012-09 Hematoxyline Eosine Wordt zelf gemaakt Wordt zelf gemaakt 21.776.1 83 Ontvlambaar Tabel 4 Gebruikte reagentia 3.3 3.3.1 Methoden Bewerking van het staal Biopsies, die in 3,5% formol gefixeerd zijn, worden macroscopisch bekeken. Indien nodig worden stukken versneden tot een maximale dikte van 3-4 mm zodat ze in cassettes passen. Dit wordt afgesloten met een dekseltje en terug in 3,5% formol gebracht. Hierna volgt het automatisch paraffineren in de Microm HMP 110: • Zes bakjes met methanol, telkens gedurende 1u • Eén bakje met methanol, gedurende 1u30 • Twee bakjes met toluol, telkens gedurende 1u 28 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Materiaal en methode • Eén bakje met toluol, gedurende 1u30 • Twee bakjes met paraffine (60°C), telkens gedurende 2u De geparaffineerde cassettes worden ingebed in paraffine. Zo komt men tot een paraffineblokje waarin het te onderzoeken biopt aanwezig is. Van deze blokjes worden coupes gesneden op een dikte van 6 μm met behulp van de microtoom en met Stick-on geplakt op een draagglaasje. Dit draagglaasje wordt op een verwarmplaat van ongeveer 37°C gelegd waardoor de coupe zich zal strekken. Indien nodig worden plooien in de coupe rechtgetrokken door de laborant. Daarna worden de coupes gedroogd in de microgolf gedurende zeven minuten bij 360 Watt en extra gedroogd in een droogstoof bij ongeveer 60 °C, over nacht. De volgende dag worden de draagglaasjes gedeparaffineerd in de Shandon Varistain: • Twee bakjes met toluol, telkens gedurende 4 minuten • Eén bakje met ethanol 99%, gedurende 4 minuten • Eén bakje met alcohol 90%, gedurende 4 minuten • Eén bakje met alcohol 70% met ammoniak NH3, gedurende 4 minuten Na het deparaffineren worden de draagglaasjes terug in gedemineraliseerd water (A.D.) gebracht. Vanuit A.D. worden ze in een 10 maal verdunde buffer geplaatst, ofwel bij pH 6 ofwel pH 9 (afhankelijk van de te gebruiken antistof) en tweemaal 5 minuten verwarmd bij 600 Watt. Na het verwarmen laat men de draagglaasjes 20 minuten rusten in de warme buffer. Hierna worden ze gedurende 10 minuten overgebracht in een buffer die 0,05% Tween 20 bevat. Na deze stap zijn de draagglaasjes klaar om immunohistochemisch gekleurd te worden. 3.3.2 Immunohistochemie Voor de immunohistochemische kleuring wordt gebruik gemaakt van de Autostainer Plus. Het aantal stalen dat moet worden gekleurd wordt in het software programma van de Autostainer Plus ingegeven, zo ook de nodige antistoffen. Bij elk staal moeten de zones op 29 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Materiaal en methode de draagglaasjes worden aangeduid, waar men wil dat het toestel deze zone besprenkeld met reagentia (zie figuur 10). Figuur 11 Zones op een draagglaasje Hierna worden etiketten afgedrukt met het nummer van het staal en de bijhorende antistof en op de draagglaasjes gekleefd. Wanneer de antistoffen zijn ingegeven, verkrijgt men een lijst met de antistoffen en hun nodige volumes, zo ook het volume dat nodig is van Peroxidase Blocking Reagens, EnVision® en DAB+: • Peroxidase Blocking Reagens, onderdrukt de aspecifieke kleuring van endogeen peroxidase in weefsels, die bloedeiwitten bevatten, tijdens de op peroxidase gebaseerde kleuringen. Deze stof wordt aangekocht.19 • EnVision® wordt aangekocht20 • DAB+ wordt steeds vers bereid 21 : 1 druppel DAB+ Chromogeen per mL DAB+ Substraat buffer • Antistoffen worden verdund met Dako REAL™ Antibody Diluent Op deze manier worden de reagentia klaargemaakt en in het toestel geplaatst. Steeds moet worden gezorgd voor een bepaald volume aan A.D. en een buffer die 0,05% Tween 20 bevat. 19 Referentie 36 in literatuurlijst 20 Referentie 34 in literatuurlijst 21 Referentie 35 in literatuurlijst 30 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Materiaal en methode De draagglaasjes worden in het toestel geplaatst. De cyclus wordt vanaf hier automatisch doorlopen. Het toestel scant de etiketten en de immunohistochemische kleuring wordt gestart: • Zuiveren probe • Voorspoelen van de draagglaasjes met buffer • Blazen en behandelen met HRP Blocking (S2001) • Na 10 minuten incubatie wordt de probe gezuiverd. De draagglaasjes worden opnieuw gespoeld met buffer • Blazen en behandelen met de gevraagde antistof • Na enige incubatietijd (afhankelijk van de gebruikte antistof) spoelen van de draagglaasjes met buffer • Blazen en behandelen met EnVision® Dual Link (K4061) • Na 30 minuten incubatie wordt de probe gezuiverd. De draagglaasjes worden gespoeld met buffer • Blazen en behandelen met DAB+ (3468) • Na 10 minuten incubatie wordt de probe gezuiverd. De draagglaasjes worden gespoeld met A.D. Wanneer dit proces beëindigd is worden de draagglaasjes uit het toestel gehaald, in A.D. gebracht en tegengekleurd. 3.3.3 Tegenkleuren Na de immunohistochemische kleuring worden de draagglaasjes tegengekleurd. Dit gebeurt op de volgende wijze: • Hematoxyline gedurende 4 minuten (kernkleuring) • Spoelen in water 31 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Materiaal en methode • Kort dompelen in alcohol 70% + HCl (differentiatie) • Spoelen in water • Dompelen in water met ammoniak NH3 (opblauwen) • Spoelen in water • Dompelen in twee bakjes met alcohol 90% (dehydrateren) • Dompelen in alcohol 99% (dehydrateren) • Dompelen in twee bakjes met toluol Vanuit de toluol worden de draagglaasjes gemonteerd met behulp van Canadabalsem. 32 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Resultaten 4 Onderzoeken en resultaten 4.1 Inleiding: de resultaten worden bekomen in drie stappen Ten eerste wordt de expressie van GCDFP-15 nagegaan in normaal weefsel en wordt de immunohistochemische kleuring op punt gezet zodat de achtergrondkleuring minimaal is. Om dit te bereiken worden van drie paraffineblokjes, elk met een verschillende apocriene oorsprong (huid, borst en speekselklier), coupes gemaakt en op verschillende wijzen gekleurd waarbij de concentratie van de antistof (NCL-L-GCDFP-15) wordt aangepast. De gebruikte concentraties zijn 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 en 1/320. Er wordt één concentratie gekozen waarbij de kleuring aan de gewenste resultaten voldoet. Daarna gaat men verder met de tweede stap in het onderzoek. De tweede stap is nagaan of GCDFP-15 diagnostisch bruikbaar is bij de verschillende types van borstcarcinoma’s. Hiervoor worden van verschillende paraffineblokjes met een verschillend subtype van borsttumor (namelijk ductaal, lobulair, tubulair en medullair) coupes gemaakt en gekleurd met de immunohistochemische techniek die op punt werd gesteld. Na de kleuring worden de preparaten bekeken met de lichtmicroscoop en kijkt men of er al dan niet kleuring te zien is in de tumor. Als laatste wil men nagegaan of de kleuring met anti-GCDFP-15 kan worden gebruikt bij de diagnose van prostaattumoren. Er worden zes preparaten van prostaatcarcinoma’s immunohistochemisch gekleurd en lichtmicroscopisch bekeken of kleuring te zien is in de tumor. Hieruit wordt een besluit getrokken of anti-GCDFP-15 al dan niet kan worden gebruikt bij de diagnose van kwaadaardige prostaatletsels. 4.2 Voorstelling van het resultaat In normaal weefsel wordt GCDFP-15 gedetecteerd in het cytoplasma van apocrien epitheelweefsel in bijvoorbeeld huid of borst en sereuze cellen van de bronchiale klieren en speekselafscheidende klieren onder de tong. 33 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Resultaten In tumorweefsel worden, volgens een onderzoek dat staat beschreven in de bijsluiter van NCL-L-GCDFP-1522 , 28/55 borstcarcinoma’s, 1/1 Pagets aandoeningen en ¼ prostaat carcinoma’s gekleurd. Verschillende andere tumoren, zoals coloncarcinoma’s, lymfoma’s en andere, werden niet gekleurd. NCL-L-GCDFP-15 kan dus worden gebruikt bij de kwalitatieve identificatie van de humane GCDFP-15-molecule, met andere woorden waar zal het antigen voorkomen in het normale of tumorale weefsel en waar zal hierdoor kleuring te zien zijn. 4.3 4.3.1 Onderzoek en resultaten Immunohistochemische kleuring op punt stellen Drie stalen, afkomstig van huid (staalnummer E65268), borst (staalnummer E63321) en speekselklier (staalnummer E60336) en allen positief voor GCDFP-15, worden vijf maal immunohistochemisch gekleurd met anti-GCDFP-15 (NCL-L-GCDFP-15 kloon 23A3) met een verschillende concentratie (1/20, 1/40, 1/80, 1/160 en 1/320), tegengekleurd met haematoxyline en daarna met een lichtmicroscoop bekeken. 22 Referentie 37 in literatuurlijst 34 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Resultaten Reagentia Naam Peroxidase blocking Reagent EnVision® + Dual Link System Peroxidase Liquid DAB+ Substrate Chromogen System NCL-L-GCDFP-15 (kloon 23A3) Merk Lotnummer Referentienr. Vervaldatum Dako 10012810 S2001 2008-09 Dako 10012710 K4061 2008-09 Dako 10012180 K3468 2009-07 Novocastra L135024 JR01.07.05 2009-12 Tabel 5 Gebruikte reagentia en antilichamen voor de kleuringen met de Autostainer Plus Resultaat: o Huid (E65268)= nevus sebaceus met apocriene klieren 1/20: grof korrelige, sterke cytoplasmatische positiviteit (bruin) in de apocriene klieren. 1/40 en 1/80: hetzelfde is te zien zoals bij 1/20, enkel de achtergrondkleuring is verminderd. 1/160: blijvende cytoplasmatische positiviteit in de apocriene klieren en verminderde achtergrondpositiviteit. 1/320: verminderde positieve aankleuring in de apocriene klieren. Besluit: verdunning 1/160 geeft een aanvaardbare kleuring. o Borst (E63321)= fibrocystische veranderingen met apocriene cysten 1/20: sterke cytoplasmatische en membranaire aankleuring in het apocrien epitheel maar met veel achtergrondkleuring. 35 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Resultaten 1/40 en 1/80: cytoplasmatische en membranaire positiviteit. De achtergrondkleuring is verminderd. 1/160: hetzelfde is te zien als bij 1/40 en 1/80. Er is ook korreling aanwezig in het cytoplasma. De achtergrondkleuring is gereduceerd tot een aanvaardbaar niveau. 1/320: de cytoplasmatische kleuring is bijna weg. Er is enkel nog membranaire positiviteit te zien. Besluit: verdunning 1/160 geeft een aanvaardbare kleuring. o Speekselklier (E60336)= gemengd seromucineus 1/20 en 1/40: cytoplasmatische positiviteit in de sereuze cellen maar er is discrete positiviteit in de mucineuze cellen (zie figuur 12) Dit is het microscopisch beeld (vergroting 100x) van de speekselklier, aangekleurd met de 1/20 verdunde concentratie van antistof NCL-L- GCDFP-15. We zien positieve afvoerkanalen (aangeduid met de pijl) die normaal negatief moeten zijn voor de kleuring. Figuur 12 Microscopisch beeld van de speekselklier bij concentratie 1/20 (100x) 1/80: de positiviteit in de mucineuze cellen is verminderd 1/160 en 1/320: de mucineuze cellen zijn volledig negatief. De sereuze cellen zijn sterker aangekleurd Besluit: verdunning 1/160 en 1/320 worden aanvaard met een voorkeur voor de verdunning 1/160. 36 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Resultaten Algemeen besluit Na drie controlestalen met verschillende concentraties te kleuren besloot men om met verdunning 1/160 verder te werken (zie 4.3.2). Indien men met verdunning 1/20, 1/40 of 1/80 zou werken, zou teveel achtergrondkleuring aanwezig zijn. Indien men met verdunning 1/320 zou verder werken, zou de kleuring teveel gereduceerd zijn waardoor de aankleuring in de cellen mogelijks nog moeilijk te zien zou zijn. 4.3.2 Immunohistochemische kleuring van tumorweefsel afkomstig van de borst De immunohistochemische kleuring werd op punt gesteld (zie 4.3.1) en er werd besloten om verder te werken met verdunning 1/160 van de antistof NCL-L-GCDFP15 (kloon 23A3). Coupes van verschillende patiënten met verschillende subtypes van borstcarcinomen (ductaal, lobulair, tubulair en medullair), worden immunohistochemisch gekleurd met NCL-L-GCDFP-15 die 1/160 verdund is. Alle stalen worden op dezelfde manier gekleurd. Reagentia Naam Peroxidase blocking Reagent EnVision® + Dual Link System Peroxidase Liquid DAB+ Substrate Chromogen System NCL-L-GCDFP-15 1/160 (kloon 23A3) Merk Lotnummer Referentienr. Vervaldatum Dako 10012810 S2001 2008-09 Dako 10012708 K4061 2008-08 Dako 10012180 K3468 2009-07 Novocastra L135024 JR01.07.05 2009-12 Tabel 6 Gebruikte reagentia en antilichamen voor de kleuring (verdunning 1/160) van tumorale borstweefsels met de Autostainer Plus 37 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Resultaten Resultaat: o Ductaal subtype E664292: negatief, geen aankleuring te zien in het tumorweefsel E663282: focale cytoplasmatische kleuring en membranaire positiviteit DCIS: fijn korrelige cytoplasmatische positiviteit E653883: focale cytoplasmatische positiviteit E651491: zeer zeldzame cytoplasmatische positiviteit (< 1%) E650021: multifocale cytoplasmatische matig tot sterke positiviteit in de tumor Besluit: 4/5 van de ductale preparaten toonden positiviteit. Het betreft voornamelijk focale cytoplasmatische positiviteit met zeldzaam geassocieerde membranaire aankleuring (zie figuur 13). Het microscopisch beeld (vergroting 100x) toont ons ongeveer 30 % positiviteit (bruine aankleuring van de positieve cellen). Figuur 13 Microscopisch beeld van een ductaal borstcarcinoma (100x) o Lobulair subtype E646723: focale matige cytoplasmatische positiviteit in de tumor (± 5%) E622022: focale cytoplasmatische positiviteit E620252: negatief in de tumor met positieve interne controle (apocriene cysten) E606261: negatief 38 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Resultaten E579241b: negatief Besluit: 2/5 van de lobulaire tumoren kleuren focaal cytoplasmatisch aan (zie figuur 14). Het microscopisch beeld (vergroting 400x) toont ons positieve cellen voor GCDFP-15 in het lobulair borstcarcinoma. Figuur 14 Microscopisch beeld van een lobulair borstcarcinoma (400x) o Tubulair subtype ( = goed gedifferentieerd ductaal carcinoom) E639891: een zeldzaam aantal cytoplasmatisch positieve cellen (± 5%) E323172: negatieve tumor met positieve interne secretoire controle E16136: negatieve tumor met positieve interne secretoire controle E6481: zeldzame positiviteit in enkele cellen (± 5%) B71176: negatieve tumor met positieve interne secretoire controle Besluit: 2/5 tumorcellen kleuren positief maar dit in slechts een klein procent van de tumorcellen (zie figuur 15). 39 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Resultaten Op het microscopisch beeld (vergroting 400x) toont de pijl ons een positief klierkanaal in een tubulair borstcarcinoom. Figuur 15 Microscopisch beeld van een tubulair borstcarcinoma (400x) o Medullair subtype E669794: negatief B54899VC: negatief E442922: negatief Besluit: geen enkel staal toont enige positiviteit in de tumorcellen (zie figuur 16). Op het microscopisch beeld (vergroting 100x) zien we blekere zones die tumorcellen bevatten (zie pijl). Deze cellen negatief voor de immunohistochemische aankleuring waarbij gebruik gemaakt wordt van GCDFP-15 in het weefsel. Figuur 16 Microscopisch beeld van een medullair borstcarcinoom (100x) 40 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Resultaten Samenvattende tabel van de resultaten Staalnr. Ductaal subtype Histologisch type GCDFP-15 E66429/2 Weinig gedifferentieerd Neg. E66328/2 Weinig gedifferentieerd Pos. E65388/3 Weinig gedifferentieerd Pos. E65149/1 E65002/1 Klassiek NOS type, Graad III (weinig gedifferentieerd) Weinig gedifferentieerd Pos. Pos. Invasief lobulair carcinoma, pleioLobulair subtype E64672/3 morf subtype. Weinig gedifferenti- Pos. eerd E62202/2 E62025/2 Pleiomorf lobulaire type. Graad III (weinig gedifferentieerd) Invasief adenocarcinoma, klassiek lobulair type. Matig gedifferentieerd Pos. Neg. Invasief adenocarcinoma van het E60626/1 klassiek lobulair type. Matig gediffe- Neg. rentieerd Invasief adenocarcinoma van het E57924/1b klassiek lobulair type. Graad II (ma- Neg. tig gedifferentieerd) Tubulair subtype E63989/1 Goed gedifferentieerd. Pos. E32317/2 Goed gedifferentieerd. Neg. E16136 Goed gedifferentieerd. Neg. E6481 Goed gedifferentieerd. Pos. B71176 Goed gedifferentieerd. Neg. 41 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Resultaten Medullair subtype E66979/4 Invasief adenocarcinoma van het medullaire type. Graad III Neg. B54899/VC Weinig gedifferentieerd. Graad III Neg. E44292/2 Invasief adenocarcinoma. Graad III Neg. Tabel 7 Samenvattende tabel met de resultaten van de borstcarcinoma’s Algemeen besluit Met behulp van de antistof NCL-L-GCDFP15 (kloon 23A3) kleurden tijdens de immunohistochemische kleuring 4/5 ductale, 2/5 lobulaire en 2/5 tubulaire borstcarcinoma’s positief. In de medullaire borsttumoren was geen positiviteit te zien. Het tubulair subtype is een goed gedifferentieerd subtype van het ductaal carcinoma. Hogere positiviteit (4/5 preparaten) wordt terug gevonden bij de weinig gedifferentieerde ductale carcinomen, dan bij de goed gedifferentieerde carcinomen. Doch is er ook positiviteit bij de goed gedifferentieerde carcinoma’s van het tubulaire subtype (2/5 preparaten). Bij het lobulaire subtype kleuren twee van de vijf preparaten positief. Het betreft enkel de weinig gedifferentieerde carcinoma’s. De andere drie preparaten van het lobulaire borstcarcinoom zijn matig gedifferentieerd. Hier is geen aankleuring met NCL-L-GCDFP-15 te zien. 4.3.3 Immunohistochemische kleuring van prostaattumoren Zes stalen afkomstig van prostaatcarcinomen met omgevend normaal parenchym (staalnummers E669389, E667479, E6674711, E6641810, E657605 en E6483410) worden immunohistochemisch gekleurd met NCL-L-GCDFP-15 dat 1/160 verdund is. Er wordt nagegaan of al dan niet kleuring te zien is in het tumorweefsel. 42 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Resultaten Reagentia Naam Merk Lotnummer Referentienr. Vervaldatum Dako 10012810 S2001 2008-09 Dako 10012708 K4061 2008-08 Dako 10012180 K3468 2009-07 Novocastra L135024 JR01.07.05 2009-12 Peroxidase blocking Reagent EnVision® + Dual Link System Peroxidase Liquid DAB+ Substrate Chromogen System NCL-L-GCDFP-15 1/160 (kloon 23A3) Tabel 8 Gebruikte reagentia en antilichaam voor de kleuring (verdunning 1/160) van prostaatweefsel met de Autostainer Plus Resultaten Staalnr. Histologisch type GCDFP-15 E669389 Matig gedifferentieerd invasief prostaatcarcinoom Neg. E667479 Weinig gedifferentieerd invasief prostaatcarcinoom Neg. focale cytoplasmati- E6674711 Weinig gedifferentieerd invasief prostaatcarcinoom sche positiviteit in het tumorweefsel E6641810 E657605 Matig gedifferentieerd invasief prostaatcarcinoom Eerder matig gedifferentieerd invasief prostaatcarcinoom Neg. Neg. 43 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Resultaten E6483410 Matig tot weinig gedifferentieerd invasief prostaatcar- Neg. cinoom Tabel 7 Samenvattende tabel met de resultaten van de prostaatcarcinoma's Algemeen besluit Één van de zes preparaten van de prostaattumoren vertoont positiviteit, bestaande uit enkele gebieden waar lichte aankleuring te zien is (zie figuur 17). Op het microscopisch beeld (vergroting 400x) zien we een lichte cytoplasmatische aankleuring. Links zien we vier enkelvoudige positieve cellen en rechts een positieve klierbuis. Figuur 17 Microscopisch beeld van een prostaattumor (400x) 44 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Discussie 5 Discussie Gross Cystic Disease Fluid (GCDF) is een secretie afkomstig van apocriene klieren in onder andere de borst. Het secreet bestaat uit verschillende glycoproteïnen (Ag) waaronder GCDFP-15. Het werd ongeveer dertig jaar geleden geïdentificeerd door Haagensen en collega’s.23 Vaak wordt in plaats van GCDFP-15, over PIP gesproken, wat staat voor prolactin-inducible-protein. Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat GCDFP-15 een specifieke merker is voor apocriene differentiatie, wat onder meer kan worden waargenomen in de borstklieren24. Het betreft hier goedaardige apocriene cysten of kwaadaardige tumoren met deels apocriene differentiatie. GCDFP-15 kan worden aangetoond via een immunohistochemische kleuring op formol gefixeerde, paraffine ingebedde weefsels. Een bruine aankleuring is te zien in de positieve weefsels. De detectie gebeurt via een lichtmicroscoop.25 Immunohistochemische positiviteit voor GCDFP-15 is te zien in het cytoplasma van tumorcellen met apocriene differentiatie en dit voornamelijk in het Golgi-apparaat. Apocriene klieren bevatten cellen met een goed ontwikkeld Golgi-apparaat waardoor in deze cellen aankleuring makkelijker zal te zien zijn.26 Uit de uitgevoerde onderzoeken kunnen we besluiten dat immunohistochemische aankleuring met NCL-L-GCDFP-15 vooral te zien is in de weinig gedifferentieerde borstcarcinoma’s. Deze omvatten 4/5 van de ductale en 2/5 van de lobulaire borstcarcinoma’s. De overige preparaten met beter gedifferentieerde borstweefsels vertonen minder aankleu- 23 Referentie 5 in literatuurlijst 24 Referentie 11, 17 en 30 in literatuurlijst 25 Referentie 3 en 33 in literatuurlijst 26 Referentie 8 in literatuurlijst 45 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Discussie ring, namelijk 2/5 van de tubulaire borsttumoren. Tubulaire carcinomen zijn een subtype van goed gedifferentieerde ductale adenocarcinoma’s. Wanneer we de verkregen resultaten in verband met borstcarcinoma’s vergelijken met resultaten uit de literatuurstudie, zien we verschillende overeenkomsten. In ‘Onderzoek 1’27 kleurden 12/16 borstcarcinomen met apocriene oorsprong positief. Dit komt ongeveer overeen met de verkregen resultaten uit het uitgevoerde onderzoek, namelijk positiviteit in acht van de vijftien preparaten. De borsttumoren in onze studiegroep werden echter niet vooraf gescreend op ‘apocriene differentiatie’ waardoor de positiviteit dan ook wat lager uitvalt. In ‘Onderzoek 2’28 vond men de hoogste concentratie aan anti-GCDFP-15 antilichamen bij patiënten met hoog kwaadaardige ductale of lobulaire borstcarcinoma’s. Ook deze bevinding kan in onze beperkte studiepopulatie worden weerhouden. In zekere zin kan de immunohistochemische kleuring dan ook worden gebruikt bij het onderzoek naar metastasen van ongekende primair origine. Bij een positieve kleuring dient rekening te worden gehouden met het feit dat zeldzame primaire tumoren, niet in de borst gelegen, eveneens GCDFP-15 kunnen tot expressie brengen. Recent werd dit immers beschreven in de long29. Bij een negatieve kleuring voor GCDFP-15 wijst dit niet op de afwezigheid van een tumor, maar enkel op de afwezigheid van een carcinoma met apocriene differentiatie. Gezien de lage sensitiviteit (53,3 %) sluit een negatief resultaat een primaire borsttumor niet uit. Daarvoor wordt steeds een panel van toepasselijke kleuringen uitgevoerd die mee helpen bepalen waar het primair carcinoom zich bevindt en naar waar eventuele metastasen zijn uitgezaaid, bijvoorbeeld de kleuring, gebruik makende van TTF-1, die voornamelijk primaire longcarcinomen aankleurt. 27 Referentie 21 in literatuurlijst 28 Referentie 36 in literatuurlijst 29 Referentie 6 in literatuurlijst 46 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Discussie Het onderzoek naar immunohistochemische aankleuring met NCL-L-GCDFP-15 in maligne prostaatweefsels leverde één positief gekleurd preparaat op, van de zes onderzochte prostaatcarcinoma’s. Deze kleuring was niet sterk en zeer focaal. In ‘Onderzoek 4’30 onderzocht men de expressie van GCDFP-15 (PIP) in normaal epitheelweefsel en adenocarcinoma’s van de prostaat. Dit gebeurde op RNA-niveau. Hierbij vond men een hoger percentage (56,1 %) aan PIP mRNA terug in de prostaattumoren dan in de benigne prostaatweefsels (29,6 %). Wanneer men kijkt naar de gevonden resultaten in verband met immunohistochemische positiviteit voor GCDFP-15 in prostaattumoren, kan men stellen dat het aantal positieve kwaadaardige prostaattumoren slechts een klein percentage inhoudt. Dit is te wijten aan de processen tijdens de eiwitsynthese waarbij verschillende stappen kunnen worden geïnhibeerd of veranderd waardoor de eiwitsynthese niet doorgaat of waardoor de zogezegd foutief gevormde nucleotidenreeksen worden herkend als DNA-schade en wordt geëlimineerd. Het kan ook zijn dat het RNA tot expressie wordt gebracht maar op een niet detecteerbaar niveau. In de bijsluiter van de gebruikte antistof NCL-L-GCDFP-1531 vinden we terug dat ¼ van de prostaatcarcinomen positief kleurt. Dit wijst er nogmaals op dat het aantal positieve preparaten eerder laag is en GCDFP-15 niet adequaat kan worden gebruikt bij de diagnose van maligne prostaattumoren, en dit wegens een te lage sensitiviteit. Anderzijds bestaat er immers in de praktijk een veel betere immuunhistochemische kleuring met een veel hogere sensitiviteit, met name AMACR (p504S), die wel in deze context in het labo gebruikt wordt. 30 Referentie 29 in literatuurlijst 31 Referentie 37 in literatuurlijst 47 GCDFP-15 expressie in normale weefsels en diagnostische bruikbaarheid bij borst- en prostaattumoren Conclusie 6 Conclusie Als besluit kunnen we aannemen dat de op punt gestelde kleuring, gebruik makend van de aanwezigheid van GCDFP-15 in apocriene weefsels, kan gebruikt worden bij het onderzoek naar het primair origine van metastasen. Hierbij dient opgemerkt te worden dat enkel een positief resultaat, namelijk focale aankleuring in de tumoren, waarde heeft en met de nodige voorzichtigheid dient te worden geïnterpreteerd. Aangezien slechts een klein percentage van de prostaattumoren positief kleurt, kan deze kleurtechniek niet worden gebruikt bij de diagnose van maligne prostaattumoren. 48 Literatuurlijst • Boeken 1) Boenisch, T. (2001). Handbook Immunochemical Staining Methods. Carpinteria, California USA: DAKO Corporation 2) Callens, W. Immunohistochemische bepaling van EGFR-overexpressie in tumoren. 3) Catalog 2007 Products & Services. Dako 4) Coëlho, M.B. (1988). Zakwoordenboek der geneeskunde. 24e druk, 2e oplage. Amsterdam: Elsevier 5) Haagensen D E Jr, Mazoujiam, G., Holder W D (1977). Evaluation of a breast cyst fluid protein detectable in the plasma of breast carcinoma patients. Annals of Surgery, 3, 279-285 6) Joan, M., Striebel, BA., Sanja Dacic, MD, PhD, Samuel, A. Yousem, MD (2008). Gross Cystic Disease Fluid Protein – (GCDFP-15). Expression in Primary Lung Adenocarcinoma. The American Journal of Surgical Pathology, 3, 426-427 7) Kellner, N., Quartier, B. (2006). Immunohistochemie. Brugge 8) Kellner, N., Quartier, B. (2006). Immunologie. Brugge 9) Mazoujian, G., Warhol, MJ., Haagensen D E Jr. (1984). The ultastructural localization of gross cystic disease fluid protein (GCDFP-15) in breast epithelium. American Journal of Pathology, 116, 305-310 49 10) Merlevede, D. (2001). DAKO Autostainer Universal Staining System. Nederlandse vertaling van de ‘Users Guide’. Dako 11) Stevens, A., Lowe, JS., Young, B. (1996). Wheater’s Basic Histopathology. Breast, 216-223. Churchill Livingstone. 12) Wick, MR., Lillemoe, TJ., Copland, GT., Swanson PE., Manivel JC., Kiang, DT., (1989). Gross cystic disease fluid protein-15 as a marker of breast cancer: immunohistochemical analysis of 690 human neoplasms and comparison with alphalactabumin. Human Pathology Volume 20, 3, 281-287. • Internet 13) Augros, M., Buénerd, A., Devouassoux-Shisheboran, M., Berger, G., Infiltrating lobular carcinoma of the breast with histiocytoid features: three cases [www], juni 2004, PubMed. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15480261 Gezien d.d. 15 februari 2008 14) Bhargava, R., Beriwal, S., Dabbs, DJ., Mammaglobin vs GCDFP-15: an immunohistologic validation survey for sensitivity and specificity [www], januari 2007, PubMed URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17145637 Gezien d.d. 15 februari 2008 15) Breast Cancer Information [www] URL: http://www.y-me.org/information/default.php Gezien d.d. 13 april 2008 50 16) CancerCareAfrica [www]. URL: http://www.cancercareafrica.org/breast_cancer.html Gezien d.d. 3 april 2008 17) Golgi Apparatus – Packing Things Up [www] URL: http://www.biology4kids.com/files/cell_golgi.html Gezien d.d. 20 april 2008 18) Gross Cystic Disease Fluid Protein-15 (GCDFP-15) (Brst-2) Description [www], Biocare Medical LLC. URL: http://www.biocaremed.com/antibodies/Gross_Cystic_Disease_Fluid_Protein_15__G CDFP_15___Brst_2_.html Gezien d.d. 19 februari 2008 19) Hall, RE., Clements, JA., Birrell, SN., Tilley, WD., Prostate-specific antigen and gross cystic disease fluid protein-15 are co-expressed in androgen receptor-positive breast tumours [www], augustus 1998, PubMed. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed&uid=9703283&cmd=showdetail view&indexed=google Gezien d.d. 15 februari 2008 20) Honma, N., Takubo, K., Akiyama, F., Sawabe, M., Arai, T., Younes, M., Kasumi, F., Sakamoto, G., Expression of GCDFP-15 and AR decreases in larger of node-positive apocrine carcinoma’s of the breast [www], augustus 2005, PubMed. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16045781 Gezien d.d. 15 februari 2008 51 21) Matsuoka, K., Ohsumi, S., Takashima, S., Saeki, T., Aogi, K., Mandai, K., Occult breast carcinoma presenting with axillary lympf node metastases: follow-up of eleven patients [www], 2003, PubMed. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14634511 Gezien d.d. 15 februari 2008 22) Mazoujian, G., Pinkus, GS., Davis, S., DE Haagensen, Jr., Immunohistochemistry of a gross cystic disease fluid protein (GCDFP-15) of the breast. A marker of apocrine epithelium and breast carcinoma’s with apocrine features [www], februari 1983, PubMed Central. URL: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1916150 Gezien d.d. 19 februari 2008 23) Pasquinelli, R., Barba, P., Capasso, I., D’Aiuto, M., D’Aiuto, G., Anzisi, AM., De Berardinis, P., Guardiola, J., Circulating antibodies against the breast tumor marker GCDFP-15/gp17 in mammary carcinoma patients and in patients carrying benign breast conditions [www], 1999, John Guardiola. URL: http://www3.interscience.wiley.com/cgibin/abstract/67000096/ABSTRACT?CRETRY=1&SRETRY=0 Gezien d.d. 15 februari 2008 24) Pihlajamaa, L., 10 voor biologie [www], November 2007. URL: http://www.10voorbiologie.nl/index.php?cat=1 Gezien d.d. 20 mei 2008 25) Raju, U., Ma, CK., Shaw, A., Signet ring variant of lobular carcinoma of the breast: a clinicopathologic and immunohistochemical study [www], September 1993, PubMed. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8248106 Gezien d.d. 25 maart 2008 52 26) Sapino, A., Cassoni, P., Bussolati, G., Gross cystic disease fluid protein (GCDFP-15) in the breast: past and present [www], oktober-december 2000, PubMed. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11215813 Gezien d.d. 15 februari 2008 27) Satoh, F., Umemura, S., Osamura, RY., Immunohistochemical analysis of GCDFP-15 and GCDFP-24 in mammary and non-mammary tissue [www], januari 2000, PubMed. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11029771?dopt=AbstractPlus Gezien d.d. 15 februari 2008 28) Soorten borstkanker [www], 30 november 2007, Borstkanker Informatiepagina’s. URL: http://www.borstkanker.net/hoofdframe.html?types.html&2 Gezien d.d. 3 april 2008 29) Tion, W., Osawa, M., Horiuchi, H., Tomita, Y., Expression of the prolactin-inducible protein (PIP/GCDFP15) gene in benign epithelium and adenocarcinoma of the prostate [www], juni 2004, Blackwell Synergy. URL: http://www.blackwell-synergy.com/doi/abs/10.1111/j.1349-7006.2004.tb03238.x Gezien d.d. 28 maart 2008 30) Tornos, C., Soslow, R., Chen, S., Akram, M., Hummer, AJ., Abu-Rustum, N., Norton, L., Tan, LK., Expression of WT1, Ca125 and GCDFP-15 as useful markers in the differential diagnosis of primary ovarian carcinoma’s versus metastatic breast cancer to the ovary [www], november 2005, PubMed. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16224215 Gezien d.d. 15 februari 2008 53 31) Viacava, P., Naccarato, AG., Bevilacque, G., Spectrum of GCDFP-15 expression in human fetal adult normal tissues [www], maart 1998, PubMed. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed&uid=9532005&cmd=showdetail view&indexed=google Gezien d.d. 3 december 2007 • Bijsluiter 32) Dako REAL™ Antibody Diluent Code S2022 33) Dako Wash Buffer 10x Code S3006 34) DakoCytomation EnVision® + Dual Link System-HRP Code K4061 (zie bijlage nr. 1) 35) DakoCytomation Liquid DAB+ Substrate Chromogen System Code K3468 (zie bijlage nr. 2) 36) DakoCytomation Peroxidase Blocking Reagent Ready-to-Use code S2001 (zie bijlage nr. 4) 37) Instructions for Use. Gross Cystic Disease Fluid Protein-15. Novocastra Laboratories Ltd. (zie bijlage nr. 3) 54 Bijlagen 55 Bijlage 1 – Bijsluiter DakoCytomation EnVision®+ Dual Link System-HRP Dako EnVision™+ Dual Link System-HRP ENGLISH Code K4063 15 mL Code K4061 10x11 mL Ready-to-use Intended use For In Vitro Diagnostic Use. EnVision+ Dual Link System-HRP has been optimally diluted for use with primary antibodies from mouse and rabbit in immunohistochemical procedures based on the Labelled Polymer method. Summary and explanation The EnVision+ Dual Link System-HRP is a two-step IHC staining technique. This system is based on an HRP labelled polymer which is conjugated with secondary antibodies. The labelled polymer does not contain avidin or biotin. Consequently, nonspecific staining resulting from endogenous avidin-biotin activity in liver, kidney, lymphoid tissues and cryostat sections is eliminated or significantly reduced. Reagent provided This reagent contains goat anti-mouse and anti-rabbit immunoglobulins (Ig) conjugated to peroxidase-labelled polymer in Tris-HCl buffer containing stabilizing protein and an anti-microbial agent. Precautions 1. For professional users. 2. Minimize microbial contamination of reagents or increase in nonspecific staining may occur. 3. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used. 4. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin. 5. Unused solution should be disposed of according to local, State and Federal regulations. 6. Safety data sheet available for professional users on request. Storage Store at 2–8 °C. Specimen preparation Prior to IHC staining, tissues must be fixed and processed. Fixation prevents autolysis and putrefaction of excised tissues, preserves antigenicity, enhances the refractive index of tissue constituents and increases the resistance of cellular elements to tissue processing. Tissue processing includes dehydration, clearing of dehydrating agents, infiltration of embedding media, embedding and sectioning of tissues. These are guidelines only. Optimal procedures must be determined and verified by the user. Performance characteristics The antibodies contained in this product have been solid-phased absorbed to remove crossreacting antibodies to human immunoglobulins. The goat anti-mouse and anti-rabbit Ig have been affinity-purified on a column with mouse Ig and rabbit Ig respectively. The goat anti-mouse Ig present on the polymer reacts with all mouse IgG subclasses and with mouse IgM. Crossreactivity with other mouse immunoglobulins may occur via light chains. The goat anti-rabbit Ig present on the polymer reacts with rabbit immunoglobulins. As determined by ELISA, this product reacts minimally with human Ig; however, cross-reactivity with Ig from other species may be present. The peroxidase present on the polymer was prepared from horseradish peroxidase of high specific activity. Unconjugated enzyme was removed by gel filtration chromatography. Application This reagent is well suited for two-step immunohistochemistry procedures. EnVision+ Dual Link System-HRP is provided ready to use. EnVision+ Dual Link is intended to be used with Dako ready-to-use primary antibodies or user optimized concentrates. Specimens Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections as well as frozen tissue sections and cell smears. 56 Bijlage 2 – Bijsluiter DakoCytomation Liquid DAB+ Substrate Chromogen System DakoCytomation Liquid DAB+ Substrate Chromogen System Code K3468 English Intended use For In Vitro diagnostic use. This substrate-chromogen system is a high-sensitivity DAB system suitable for use in peroxidase-based immunohistochemical (IHC) and in situ hybridization (ISH) staining methods. Upon oxidation, DAB forms a brown end-product at the site of the target antigen or nucleic acid. Precautions 1. The DAB Substrate-Chromogen and Substrate Buffer are sensitive to contamination from a variety of oxidizing agents such as metals, bacteria, dust and commonly used laboratory glassware. To avoid contamination and premature expiration, avoid exposing the DAB solution to any potential source of contamination and never pipette directly from the bottle. Pour out required amount into a clean container and pipette from it. Do not return excess DAB solution to the primary storage container. 2. Do not store the DAB components or perform staining in strong light, such as direct sunlight. 3. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin. Unused solution should be disposed of according to local, State, and Federal regulations. 4. Safety Data Sheet available for professional users on request. Risk and Safety Statements DAB+ Chromogen R 40 Limited evidence of a carcinogenic effect. R43 May cause sensitization by skin contact. R68 Possible risk of irreversible effects. S35 This material and its container must be disposed of in a safe way. S 36/37 Wear suitable protective clothing and gloves. Storage Store DAB Substrate-Chromogen system in original container at 2–8°C. Reagent preparation Add 1 drop (or 20 μL) of the DAB Chromogen per mL of Substrate Buffer. Mix well. Unused working DAB solution is stable for up to two weeks if stored at 2–8°C. Results In IHC and ISH procedures, the DAB Substrate-Chromogen yields a brown reaction end-product at the site of the target antigen or nucleic acid. For proper interpretation, positive and negative controls should accompany each staining run. Positive controls serve as indicators that specimen processing and handling were carried out correctly. Negative controls are useful for assessing nonspecific staining. Nonspecific staining, if present, is rather diffuse in appearance. Limitations Endogenous peroxidase or pseudoperoxidase activity, found in hemoproteins such as hemoglobin, myoglobin, cytochrome and catalase, as well as in eosinophils, may yield false-positive results. In formalin-fixed tissue this activity can be inhibited by incubating the tissue in 3% hydrogen peroxide for five minutes prior to the application of primary antibody or probe. Blood, bone marrow smears and frozen tissue sections can be treated with Peroxidase Blocking Reagent (code S2001). However, this procedure does not abolish the reddish-brown pigment of hemoproteins. A solution of methanol-hydrogen peroxide can also be used, however, some antigens may become denatured with this procedure. 57 Bijlage 3 – Bijsluiter NCL-L-GCDFP-15 (kloon 23A3) Gross Cystic Disease Fluid Protein-15 Liquid Mouse Monoclonal Antibody Product Code: NCL-L-GCDFP-15 Intended Use For in vitro diagnostic use NCL-GCDFP-15 is intended for the qualitative identification by light microscopy of the human gross cystic disease fluid protein (15kD). Principle of Procedure IHC staining techniques allow for the visualization of antigens via the sequential application of a specific antibody to the antigen (primary antibody), a secondary antibody to the primary antibody and an enzyme complex with a chromogenic substrate with interposed washing steps. The enzymatic activation of the chromogen results in a visible reaction product at the antigen site. The specimen may then be counterstained and coverslipped. Results are interpreted using a light microscope and aid in the differential diagnosis of pathophysiological processes, which may or may not be associated with a particular antigen. Clone 23A3 Immunogen Recombinant prokaryotic protein corresponding to the excreted domain of the GCDFP-15 molecule. Specificity Human gross cystic disease fluid protein (15kD) Total Protein Concentration 1.0– 8.0 g/L Antibody Concentration Greater than or equal to 120.6 mg/L as determined by ELISA. Recommendations On Use IHC on paraffin sections. Suggested dilution: 1:20 – 1:40 for 60 minutes at 25°C. High temperature antigen retrieval using 0.01 M citrate retrieval solution (pH 60) is recommended. This is provided as a guide and users should determine their own optimal working dilutions. Storage and Stability Store at 2-8°C. Do not freeze. Return to 2-8°C immediately after use. Do not use after expiration date indicated on the vial label. Specimen Preparation The recommended fixative is 10% neutral-buffered formalin for paraffin-embedded tissue sections. Warning en Precautings This reagent has been prepared from the supernatant of cell culture. As it is a biological product, reasonable care should be taken when handling it. Specimens, before and after fixation, and all materials exposed to them, should be handled as if capable of transmitting infection and disposed of with proper precautions. Never pipette reagents by mouth and avoid contacting the skin and mucous membranes with reagents and specimens. If reagents or specimens come in contact with sensitive areas, wash with copious amounts of water. Seek medical advice. Incubation times or temperatures, other than those specified, may give erroneous results. Any such changes must be validated by the user. Quality Control Differneces in tissue processing and technical procedures in the user’s laboratory may produce significant variability in results, necessitating regular performance of in-house controls in addition to the following procedures. Controls should be fresh autopsy/biopsy/surgical specimens, formalin-fixed, processed and paraffin wax-embedded as soon as possible in the same manner as the patient samples(s). 58 Positive Tissue Control Used to indicate correctly prepared tissues and proper staining techniques. One positive tissue control should be included for each set of test conditions in each staining run. A tissue with weak positive staining is more suitable than a tissue with strong positive staining for optimal quality control and to detect minor levels of reagent degradation. Recommended positive control tissue is skin-sweat glands. If the positive tissue control fails to demonstrate positive staining, results with the test specimens should be considered invalid. Negative Tissue Control Should be examined after the positive tissue control to verify the specificity of the labelling of the target antigen by the primary antibody. Recommended negative control tissue is tonsil. Negative Reagent Control Use a non-specific negative reagent control in place of the primary antibody with a section of each patient specimen to evaluate non-specific staining and allow better interpretation of specific staining at the antigen site. Patient Tissue Examine patient specimens stained with NCL-L-GCDFP-15 last. Positive staining intensity should be assessed within the context of any non-specific background staining of the negative reagent control. As with any IHC test, a negative result means that the antigen was not detected, not that the antigen was absent in the cells/tissue assayed. Results Expected Normal Tissues Clone 23A3 detected the GCDFP-15 in the cytoplasm of specific elements of normal tissues including apocriene epthelia and numerous serous cells of the brochial glands and sublingual salivary glands. In normal breast, only a few individual epithelial cells within obules and small ducts stain. Tumor Tissues Clone 23A3 stained 28/55 breast carcinoma’s, 2/2 fibrocystic disease of the breast, 1/1 Paget’s disease, ¼ prostate carcinoma’s. No staining was evident in a veriety of other tumors, including lung carcinoma’s, ovarian carcinoma’s, colon adenocarcinoma’s, sarcomas, leiomyosarcomas, endometrial carcinoma’s, Wilm’s tumours, melanomas, anaplastic lymphoma and lymphomas. NCL-L-GCDFP15 is recommended for the identification of breast carcinoma’s and apocriene epithelia. General Limitations IHC is a multistep diagnostic process that consists of specialized training in the selection of the appropriate reagents; tissue selection, fixation, and processing; preparation of the IHC slide; and interpretation of the staining results Tissue staining is dependent on the handling and processing of the tissue prior to staining. Improper fixation, freezing, thawing, washing, drying, results may be due to variations in fixation and embedding methods, or to inherent irregularities within the tissue. Excessive or incomplete counterstaining may compromise proper interpretation of results. The clinical interpretation of any staining or its absence should be complemented by morphological studies using proper controls and should be evaluated within the context of the patient’s clinical history and other diagnostic tests by a qualified pathologist. Antibodies from Novocastra™ Laboratories Ltd are for use, as indicated, on either frozen or paraffin-embedded sections with specific fixation requirements. Unexprected antigen expression may occus, especially in neoplasms. The clinical interpretation of any stained tissue section must include morphological analysis and the evaluation of appropriate controls. Date of Issue 3rd November 2003 (NCL-L-GCDFP15/CE/UK), (From 767 rev-5/08/03). 59 Bijlage 4 - Bijsluiter DakoCytomation Peroxidase Blocking Reagent Ready-to-Use code S2001 DakoCytomation Peroxidase Blocking Reagent Ready-to-Use Code S2001 Intended use For In Vitro diagnostic use. This product is intended for use in peroxidase-based immunohistochemical (IHC) staining procedures on cell preparations, frozen tissue sections, and paraffin-embedded tissue sections. This product suppresses nonspecific staining due to endogenous peroxidase and pseudoperoxidase activity in peroxidase-based IHC staining procedures. Description Peroxidase Blocking Reagent: Peroxidase inhibitor containing hydrogen peroxide and 0.031 mol/L sodium azide. Risk and Safety Statements Peroxidase Block R 22 Harmful if swallowed. Storage Store at 2–8°C. Do not freeze. Reactivity In immunoperoxidase procedures endogenous peroxidase and pseudoperoxidase activity within tissues is frequently observed. Tissue elements most commonly affected are hemoproteins such as hemoglobin in red blood cells, myoglobin in muscle cells, cytochrome in granulocytes, and monocytes as well as catalases in the liver and kidney. In the evaluation of specimens labelled in immunoperoxidase methods, the presence of endogenous enzyme can obscure the specific staining of the target antigen. In paraffin-embedded tissue sections, endogenous peroxidase activity can be suppressed by incubating specimens with 3% hydrogen peroxide prior to application of the primary antibody. However, this procedure cannot be applied to frozen tissue sections or cell preparations. Endogenous peroxidase and pseudoperoxidase activity can be suppressed by a ratio of hydrogen peroxide and sodium azide without significantly compromising antigenic sites or tissue morphology.2 Peroxidase Blocking Reagent containing hydrogen peroxide and sodium azide suppresses endogenous peroxidase and pseudoperoxidase activity in cell preparations, frozen tissue sections, and paraffin-embedded tissue sections. Specimens Frozen tissue sections and cell preparations such as smears of peripheral blood, bone marrow, and other body fluids containing a large number of hematopoietic cells. For frozen tissue sections, fixation in acetone is recommended. For smears of blood and bone marrow, fixation in acetone/methanol is recommended. When specimens are fixed as recommended, this product will prevent the lysis of erythrocytes that may occur when using aminoethylcarbazole (AEC) chromogen on blood smears and bone marrow smears. Procedure Specimens are incubated with the Peroxidase Blocking Reagent for 5 to 10 minutes at room temperature and rinsed with water or a suitable wash buffer such as Tris buffer, PBS, or TBS (code S3001) before application of primary antibody. Limitations Hemoglobin present in red blood cells may be visible as reddish-brown pigments. These pigments may still be present after the use of Peroxidase Blocking Reagent and should not be confused with endogenous peroxidase activity or specific peroxidase staining. For proper interpretation the use of an appropriate negative control is recommended. Specimen staining is dependent on the handling and processing of the tissue prior to staining. Improper fixation, freezing, thawing, washing, drying, heating, or sectioning may produce artifacts, antibody trapping, or falsepositive results. False-positive staining may also be caused by cross-reactivity of other IHC staining reagents to e.g. endogenous avidin-binding activity or nonspecific reaction with necrotic or degenerated cells. 60 Voor akkoord verklaring Marc Haspeslagh Stagementor Piet Dedeckere Stagebegeleider 61
