Interacties: de volgende generatie sensoren
advertisement
Magnetische deeltjes in biosensoren Leo van IJzendoorn Moleculaire Biosensoren voor medische diagnostiek Faculteit Technische Natuurkunde Inhoud Introductie •Point-of-Care biosensoren Immunoassay’s • antilichamen en de zwangerschaptest • problemen bij lage concentraties NLT module biosensoren Superparamagnetische deeltjes Detectieprincipes • magnetisch of optisch Het meten van interacties: een nieuwe generatie sensoren TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 1 Point of Care Biosensors Snelle en gevoelige detectie van biomarkers in een druppel lichaamsvloeistof glucose mM μM hormonen eiwitten nM pM fM M = mol/L TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 2 Point of Care Biosensors Biologische herkenning: van elektrochemie naar immunoassays Glucosemeter: incubatie OH meetprocedure O H OH H H O + 2H++2e- 2 Fe(CN6)3+ 2e- HO H OH D-glucono-1,5-lactone enzym glucose oxidase OH O OH H OH oxidatie ferrocyanide (meting stroom) H H HO H H OH -D-glucose 2 Fe(CN6)4ferrocyanide biologische herkenning alleen voor hoge concentraties TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 3 Immunoassays Biologische herkenning: van elektrochemie naar immunoassays sensor oppervlak 1 sample met biomarker 15 nm sensor oppervlak antilichaam / antistof 450 aminoacids artificial production in lab Nobelprijs 1984 TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors 2 detectie sensor oppervlak 3 PAGE 4 Immunoassays: zwangerschapstest meten van human Chorionic Hormone (concentratie in nM regime) - deel: 92 aminozuren; ook in: - Thyroid Stimulating Hormone (TSH) - Luteinizing Hormone (LH) - Follicle Stimulating Hormone (FSH) - deel: 145 aminozuren is uniek for hCG Ab* Ab sandwich test principe gebruikt beiden: urine muis antilichaam - dye conjugate bind aan -subunit TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors transport test line gebonden muis antilichaam tegen -deel control line gebonden muis antilichaam tegen Ab* PAGE 5 Immunoassays na hoeveel tijd meet ik een betrouwbaar signaal? reactie-evenwicht Ag sAb k on sAgAb k off tijdsafhankelijkheid bezetting d k on Ag1 k of f dt Ag koff kon sAb sensor oppervlak 1- leeg bezet aannames: - diffusie speelt geen rol - geen uitputting van de concentratie oplossing voor bezettingsgraad: (t) optimistische schatting voor lage concentraties TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 6 Immunoassays na hoeveel tijd meet ik een betrouwbaar signaal? oplossing simpele differentiaalvergelijking is uitdaging voor scholieren (altijd verificatie oplossing mogelijk door invullen) herschrijf: d (k on Ag k of f ) k on Ag p q dt d( p q) d p p p q dt dt oplossing: ln p q pt A hoe vinden we C? invullen: t00 d p q pdt p q p q Cept Cq q 1 e pt p k on Ag 1 exp k on Ag k of f t k on Ag k of f TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 7 Immunoassays na hoeveel tijd meet ik een betrouwbaar signaal? k on Ag 1 exp k on Ag k of f t k on Ag k of f t 12 0.693 k on Ag k of f typische waarden: kon = 104 - 107 M-1s-1 koff = 10-4 - 10-6 s-1 TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors conc (pM) t 12 (uur ) 100 0.5 9.6 10 0.091 17.5 1 0.01 19.1 0.1 0.001 19.2 ? PAGE 8 Uitdagingen voor POC eiwit sensor met pM gevoeligheid - technologie die gevoeligheid verbeterd - kwantitatieve uitlezing (niet alleen drempelwaarde) - bereiken van stabiel signaal in minuten pM conc en typische k’s t½~ hours !! - overwinnen van diffusie limitering (typically 10-20 minutes) - onderdrukken van niet-specifieke absorptie Magnetic particle labels can meet this challenge ! - magneetveld om deeltjes naar sensor te trekken - magnetische of optische detectie van deeltjes - voorkom vorming aggregaten 24-7-2017 PAGE 9 Superparamagnetische deeltjes Wat is paramagnetisme? geisoleerde spins die uitlijnen in magnetisch veld: Langevin: = susceptibiliteit (helling) n 2 0H M H 3kT ideaal paramagnetisch materiaal: niet-magnetisch zonder veld TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 10 Superparamagnetische deeltjes KVgrain kT kunstmatig paramagnetische deeltje: m 0 exp plastic matrix ijzeroxyde nanodeeltjes grain size 5-15 nm bead diameter 100 nm - 3μm 2 superparamagnetisch TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 11 Magnetische actuatie in een immunoassay antistof magnetisch deeltje biomarker Mogelijkheden: 1. antistoffen eerst verzamelen op deeltjes sensor oppervlak 2. reactie versnellen door aantrekken ([Ag] + diffusie beperking opheffen) 3. niet specifiek gebonden deeltjes lostrekken TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 12 Magnetische detectie Magnetische momenten: 300 nm bead: 3 10-17 Am2 ferritine: 3 10-21 Am2 Zeer lage achtergrond (1 deeltje meetbaar !) 20 nm Au chip met stroomdraad genereert lokaal magnetisch veld TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors GMR (giant magneto resistance) magnetoweerstand PAGE 13 Magnetische detectie prototype sensor 100m wire GMR 1mm TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors chip in cartridge PAGE 14 Magnetische detectie voorbeeld magnetisch “wassen” Parathyroid Hormone (PTH) assay GMR signal ( % ) 1 uur incubatie 50 4 nM 40 30 20 0.5 nM 10 0 nM 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 time ( min ) TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 15 Magnetische detectie voorbeeld verhoging gevoeligheid PTH sandwich assay in 4 minuten (!) : ruim 2 orden gevoeliger door magnetische actuatie 100.0% met magnetische aantrekking GMR signal 10.0% blank 1.0% blank zonder magnetische krachten 0.1% 1 10 100 1000 10000 PTH concentration ( pmol/L ) TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 16 Optische detectie uitkoppeling licht door deeltjes bij totale interne reflectie lokale verandering brekingsindex door aanwezigheid deeltjes bij oppervlak TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 17 Optische detectie frustrated total internal reflection groter detectie oppervlak en goedkopere technologie TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 18 Optische detectie voorbeeld cadiac troponine sandwich assay signal change (%) 50 40 30 10 pM 20 10 0 pM 0 0 1 2 3 4 5 t (min) TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 19 Interacties: de volgende generatie sensoren trekkrachten Magnetische krachten bindingssterkte te meten dissociatie zonder kracht k of f 1 t of f 1 t attempt exp Eb / kT dissociatie met kracht k of f 1 t of f 1 t attempt exp (Eb Fx) / kT meet dissociatie als functie van de kracht: en plot logaritme van k tegen de kracht x positie energiebarriere k(0) biologische relevante k TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 20 Interacties: de volgende generatie sensoren trekkrachten Microscope Sample Holder Force up to 100 pN Magnetic system TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors Force uniform within 2% over 150 m x 150 m 24-7-2017 PAGE 21 Interacties: de volgende generatie sensoren trekkrachten dissociatie snelheid hangt van dichtheid antistof op de bead af ! 100 Number of beads [%] 90 80 70 60 50 40 Fm 30 20 10 0 0 50 100 150 200 Time [s] 250 biotin – anti-biotin system blocking with caseine alle metingen gedaan kracht van 30 pN TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 22 Interacties: de volgende generatie sensoren trekkrachten meten als functie van de kracht: kracht [pN] 0 10 20 30 40 50 60 0 -0,5 ln(koff) -1 -1,5 -2 -2,5 -3 -3,5 -4 ln(koff)=ln(k0)+(x/kT).F Quantificeren van binding en dissociatie mechanismen TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors 4 k of f (0) 1 10 s 1 PAGE 23 x 0.88 nm PAGE 23 Interacties: de volgende generatie sensoren het uitoefenen van een draaimoment Roterende magneet • DNA uncoiling by topoisomerase • Number of rotations Magnetic bead • Distance between bead and surface Enzym DNA molecuul Oorzaak bead rotatie ?? Objective Koster et. al. Nature 2007 TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 24 Interacties: de volgende generatie sensoren het uitoefenen van een draaimoment uniform roterend magnetisch veld TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 25 Interacties: de volgende generatie sensoren torsie door middel van een draaimoment niet gebonden deeltje in roterend magnetisch veld rotatie veld 2 Hz rotatie deeltje 2 Hz TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 26 Interacties: de volgende generatie sensoren het uitoefenen van een draaimoment niet gebonden deeltje in roterend magnetisch veld rotatie veld 6 Hz gemiddelde rotatie frequentie deeltje 1.2Hz TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 27 Interacties: de volgende generatie sensoren het uitoefenen van een draaimoment model: balans tussen magnetische and hydrodynamische torque d B sinf ieldt 8R dt 3 max 12 Break down frequency 8 Break down frequency [Hz] Bead Frequency [Hz] 10 8 6 4 2 6 Field-independent moment 4 max= B 2 0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0.4 Field frequency [Hz] magnetic torque: = B sin B 0.8 1.2 1.6 2.0 B [mT] Janssen, Bios.Bioel. 2008 torque: 2.10-18 Nm over 10° ~ 180 kJ/mol TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 28 Interacties: de volgende generatie sensoren het uitoefenen van een draaimoment torderen van moleculair antistof – eiwit complex met bekende torque spanning in molecuul loopt op en veert weer terug vergelijkbaar met het opdraaien van een veer TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 29 Interacties: de volgende generatie sensoren het uitoefenen van een draaimoment een eenvoudig fysisch model: verhouding torsie moduli DNA/eiwit 100 – 200 gemeten verhouding 150 momenteel onderzoek aan verschillende complexen TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 30 Samenvatting • Magnetische deeltjes maken snelle gevoelige sensors mogelijk - deeltjes actuatie verkorte tijd tot evenwicht diffusie beperkingen opgeheven - magnetisch wassen geeft lage achtergrond • Onderzoek naar interactie voor volgende generatie sensoren zowel trekkrachten als draaimomenten geven informatie multifunctionele biosensoren TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 31 Acknowledgement Menno Prins (Philips Research) Arthur de Jong Asha Jacob Xander Janssen Joost van Noorloos Ben de Clerq Alexander van Reenen TUe / Applied Physics / Molecular Biosensors PAGE 32
