Inleiding - Universiteit Utrecht

Onwikkeling van een serodiagnostische
cathepsine B-ELISA voor de detectie van
Fasciola hepatica bij het paard.
Drs. A. Tromp
Begeleidster: D.C.K. van Doorn
Inhoudsopgave
Samenvatting
Inleiding
Cyclus
Natuurlijke weerstand
Verschijnselen van een F. hepatica infectie
ELISA test
Enzym activiteit bij een F. hepatica infectie
Behandeling
Materiaal en methode
Faeces
Coprologisch onderzoek
Bloed
Enzymatisch onderzoek
Pathologie levers
Enquête
ELISA test
Resultaten
Faeces- en bloed onderzoek
Enquête
ELISA test
Discussie
ELISA
Coprologisch onderzoek
Enzymen
Preventie
Acknowledgement
Literatuurlijst
Bijlage 1 - McMaster protocol
Bijlage 2 - Zeef en schud methode protocol
Bijlage 3 - Enquête eigenaren geïnfecteerde paarden
Bijlage 4 - Resultaten feces onderzoek
Bijlage 5 - resultaten ELISA test
2
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
Pag.
3
4
5
6
7
8
8
9
10
10
11
11
11
11
12
12
14
14
15
15
18
18
20
22
22
23
24
27
28
29
33
35
Samenvatting
Fascilosis komt veel voor bij herkauwers en zorgt bij deze diersoort voor veel
economische schade. Wereldwijd is er literatuur over fasciolosis bij paarden, het
blijkt dat de incidentie zeer laag is in vergelijking met runderen en schapen.
Runderen en schapen spelen een zeer grote rol in de epidemiologie van F.
hepatica infecties bij het paard.
De diagnostiek van een F. hepatica infectie bij het paard is erg lastig, om dit
probleem op te lossen is er in dit onderzoek de in Gent, voor het paard,
ontwikkelde ELISA test in het veld getoetst. Hiervoor zijn er 230 faecale monsters
verzameld en via de zeef en schudmethode onderzocht op F. hepatica eieren.
Hiervan waren er 14 positief. Van de coprologisch positieve samples is het
strongylus EPG bepaald en is de sedimentatie flotatie methode toegepast. Dit om
een eventuele kruisreactiviteit vast te stellen in de ELISA test. Van de positieve
dieren is er bloed afgenomen, ook van een deel van de coprologisch negatieven
paarden is er bloed afgenomen. Van de positieven dieren zijn de leverwaarde YGT
en LDH bepaald. Er is een correlatie van 27% gevonden tussen de YGT waarden
en het aantal uitgescheiden F. hepatica eieren. Uit de in totaal 156 onderzochte
serologisch monsters, zijn er 21 samples negatief, de overige 135 samples zijn
positief. Er is een correlatie van 24% gevonden tussen de OD-waarde en het
aantal strongylus eieren. Ook is er te zien dat naarmate de leeftijd stijgt, het
aantal uitgescheiden F. hepatica eieren daalt.
Abstract
Fasciolosis is common in ruminants and cause much economic loss.
Worldwide there are several studies about fasciolosis in horses, these studies
show a low incidence in horses compared with cattle and sheep. Cattle and sheep
have a very important role in the epidemiology of the F. hepatica infection in
horses.
The diagnosis of a F. hepatica infection in horses is very difficult, for this problem
there is developed an ELISA test in Ghent, and this ELISA is in this study tested
in the field. In total there are 230 faecal samples collected and examined on F.
hepatica eggs through the sieve and shake device method. 14 faecal samples
contained F. hepatica eggs.
In the positive faeces samples the strongylid eggs per gram faeces (EPG) are
determined using the McMaster method, this positive samples are also
investigated through the sedimentation flotation method. The strongylid eggs are
determined for a possible cross reactivity in the ELISA.
There is taking blood from the positive animals and from some of the coprology’s
negative animals. From the positive animals there is determined the liver
enzymes YGT and LDH. There is found a correlation of 27% between the YGT
values and the number of F. hepatica excreted eggs. 21 samples from the 156
examined serological samples were negative, the other 35 samples were positive.
There is a correlation of 24% between the OD-value and the number of strongylid
eggs. Ass the age increases, the number of F. hepatica excreted eggs decreases.
3
Inleiding
Fasciolosis is een parasitaire aandoening en deze zorgt wereldwijd voor veel
economische schade (Claxton et al., 1997).
De parasiet behoord tot de familie fasciolidea, klasse trematoda en het genus
fasciola. De twee meest voorkomende species van Fasciola zijn Fasciola hepatica
en Fasciola gigantica. F. hepatica komt voornamelijk voor in gematigde gebieden,
in tegenstelling tot F. gigantica die vooral wordt gezien in tropische gebieden. De
leverbot problemen die gezien worden in Nederland worden dus veroorzaakt door
F. hepatica (Mc Can et. al., 2010; Piedrafita et al., 2010).
Vele zoogdier species, voornamelijk herbivoren, kunnen als gastheer dienen voor
F. hepatica. De belangrijkste gastheren zijn runderen en schapen, maar ook
paarden kunnen geïnfecteerd worden door deze parasiet (Bossaert et al., 2000).
Geïnfecteerde paarden vertonen zelden klinische verschijnselen, er ontwikkeld
zich vaak een chronische of subacute infectie (Samson-Himmelstjerna, 2006).
Indien er toch verschijnselen optreden zijn deze vaak erg aspecifiek (laber,
1971).
Wereldwijd is de ELISA test de meest gebruikte methode om een F. hepatica
infectie te diagnosticeren (Gonzalo-Orden et. al., 2003). Antigenen van Fasciola
kunnen via de ELISA test in faeces, serum melk of gal worden gedetecteerd
(Mezo et al., 2010).
De diagnostiek bij het paard is erg lastig, omdat er nauwelijks eieren in de faeces
te detecteren zijn (Nansen et. al., 1975). De diagnose wordt vaak gesteld door
uitsluiting van andere oorzaken of door het instellen van een behandeling om te
zien of het paard er van opknapt. Een enkele keer wordt er coprologisch
onderzoek gedaan (Nelis et. al., 2010). Het nadeel van coprologisch onderzoek is
dat prepatent/latent geïnfecteerde dieren niet gedetecteerd kunnen worden met
deze test methode. Op deze manier kan de diagnose pas laat gesteld worden,
terwijl de schade dan al aangericht is in het leverparenchym door de migratie van
de juveniele stadia (Salimi-Bejestani et al., 2005).
Om dit probleem op te lossen is er een ELISA test in ontwikkeling om via
serologie de diagnose te kunnen stellen. Het blijkt bij onderzoek onder runderen
dat een serodiagnostische test een veel hoger percentage geïnfecteerde dieren
aantoont dan met coprologische onderzoek (Munguía-Xóchihua et al., 2007).
Een vroege detectie zorgt er voor dat de dieren eerder behandeld kunnen
worden, maar een positieve serologische test wil niet altijd zeggen dat het dier
leidt aan een patente infectie, het kunnen ook antilichamen zijn van een al
geëlimineerde infectie (Munguía-Xóchihua et al., 2007; Salimi-Bejestani et al.,
2005).
Een vroege detectie zorgt er niet alleen voor dat de dieren eerder behandeld
kunnen worden, het voorkomt ten dele ook dat er blind behandeld wordt bij
dieren die verdacht worden van een infectie. Tegenwoordig wordt er op basis van
symptomatiek een off label behandeling bij verdachte paarden uitgevoerd, zonder
dat eigenlijk is aangetoond dat het dier werkelijk geïnfecteerd is met F. hepatica.
Wanneer alleen gediagnosticeerde positieven paarden behandeld zouden worden,
worden er geen dieren onnodig blootgesteld aan het middel.
4
Cyclus
F. hepatica kent een complexe levenscyclus en bevat één intermediaire
tussengastheer. De cyclus bestaat uit een vrijlevend- en een parasitair deel (Fried
et. al., 1977).
De levenscyclus bestaat uit verschillende fases (zie figuur 1). De adulte F.
hepatica, die zich in de galgangen van de eindgastheer bevinden, scheidden
eieren uit, die via de gal in de digestietractus terecht komen en met de faeces
worden uitgescheiden (Andrews, 1999).
In de eieren ontwikkeld zich een miracidia, dit is een gecilieerde larve. Deze
ontwikkeling is afhankelijk van de temperatuur, vochtigheid en zuurstof. De
ontwikkeling is sneller bij een hogere temperatuur, een voldoende hoge
vochtigheidsgraad en zuurstof (Andrews, 1999). Bij een gemiddelde temperatuur
van 21°C neemt de ontwikkeling tot miracidia ongeveer twee weken in beslag, bij
een hogere temperatuur vindt de ontwikkeling sneller plaats (Kassai, 1999).
De miracidiae kunnen zich in het water voortbewegen om op zoek te gaan naar
een intermediaire gastheer en deze te penetreren. Dit proces is wederom
temperatuur afhankelijk, bij een temperatuur beneden de 6 graden is bewegen
onmogelijk. Ook moet er voldoende zuurstof aanwezig zijn. Wanneer binnen 24
uur de intermediaire gastheer niet is gepenetreerd gaat de larve dood (Andrews,
1999; Fried et. al., 1977).
De intermediaire gastheer is de zoetwaterslak Galba truncatula, deze speelt een
sleutelrol bij de transmissie van de infectie, doordat de geïnfecteerde slakken 100
tot zelfs 1000den cercariae kunnen uitscheiden per dag.
Er zijn verschillende theorieën over het vinden van de Galba truncatula door de
miracidia. Een waarschijnlijk theorie is de afgifte van bepaalde substanties door
de slakken, welke in het water komen en een aantrekkingskracht op de
miracidiae hebben (Fried et. al., 1977).
Nadat de miracidia Galba truncatula heeft gepenetreerd ontwikkeld de miracidia
zich tot een sporocyst. In de sporocyst ontwikkelen vele rediae. Uit de rediae
ontwikkelt zich uiteindelijk het laatste larvale stadia, de cercariae. Deze verlaten
de tussengastheer en ondergaan een embryonisatie tot metacercariae cysten. De
ontwikkeling van de verschillende larvale stadia in Galba truncatula nemen
minimaal twee maanden in beslag. De omgevingstemperatuur moet minimaal 10
°C zijn om de ontwikkeling in de tussengastheer plaats te laten vinden (Andrews,
1999; Kassai, 1999).
De metacercariae bezetten verschillende grassprieten en worden via het grazen
door de eindgastheer opgenomen. Ze zijn behoorlijk immuun en kunnen in de
zomer een paar weken overleven, dit is afhankelijk van de temperatuur en
vochtigheidsgraad. Uit onderzoek blijkt dat de metacercariae soms één jaar in
leven kunnen blijven onder de juiste omstandigheden (nat en warm). Bij een
temperatuur onder de 0 graden en bij droge omstandigheden treedt er snel
sterfte op. In de winter overleven de metacercariae soms enkele maanden en
enkele halen zelfs het voorjaar. Op deze manier kunnen de dieren die dan weer
naar buiten gaan meteen besmet worden (Andrews, 1999).
Eenmaal in de digestietractus van de eindgastheer aangekomen, excysteerd de
metacercaria tot juveniele F.hepatica. Deze juveniele stadia penetreren de
darmwand om zo in de abdominale holte te komen en de lever te penetreren.
In de lever vindt een migratie van de juveniele stadia plaats, wat leidt tot
bloedingen en fibrosering. Na ongeveer 7-9 weken komen de juveniele stadia aan
in de galwegen en worden adulte stadia die tot ei productie in staat zijn. De
prepatent periode bij herkauwers kan variëren van 6-12 weken (Andrews, 1999;
5
Kassai, 1999;Gonzalo-Orden et. al., 2003; Bossaert et. al., 2000; Ferre et. al.,
1997). Bij paarden kan deze periode 8-22 weken in beslag nemen (Nelis et al.,
2010).
De totale cyclus neemt 4-6 maanden in beslag, dit is afhankelijk van de
temperatuur en de snelheid waarmee metacercariae opgenomen worden door een
eindgastheer. In totaal vindt er maximaal één cyclus per jaar plaats.
Figuur 1: de verschillende fases van de levenscyclus van F. hepatica
Natuurlijke weerstand
Het blijkt dat paarden een natuurlijke weerstand ontwikkelen tegen een F.
hepatica infectie die veroorzaakt wordt door meerdere mechanismen die plaats
vinden op verschillende plaatsen in de migratie route. Waarschijnlijk wordt de
weerstand al vroeg in de infectie verkregen, paarden zijn in staat om de parasiet
te immobiliseren en te elimineren (Nansen et al., 1975).
Uit verschillende literatuurstudies blijkt het dat jonge dieren gevoeliger zijn voor
een infectie met F. hepatica. Uit een veldstudie van Fischer et al., uit 1983 bleek
dat in de groep met veulens 43.3% was besmet, terwijl in de groep paarden >3
jaar 20% van de dieren geinfecteerd was met Fasciola (Fischer et al., 1983). Ook
het onderzoek van Samson-Himmelstjerna, uit 2006, toont aan dat volwassen
paarden minder gevoelig zijn voor een infectie dan jongere dieren. Na
experimentele infectie bedroeg de prepatent periode van F. hepatica bij veulens 8
weken en bij 1-4 jaar oude dieren 13 weken. Niet alle geïnfecteerde dieren
scheidden uiteindelijk eieren uit in de faeces. Het blijkt dus dat jonge dieren
minder goed in staat zijn de parasiet te elimineren en immobiliseren dan de
oudere dieren, omdat er te zien is dat bij veulens de infectie sneller tot een
patente infectie leidt dan bij de oudere dieren.
In de studie van Nansen et al.,uit (1975) zijn er 5 paarden oraal geïnfecteerd met
400-, 3 met 800- en 2 met 500 metacercariae. Twee paarden zijn
intraperitoneaal geïnfecteerd met 50 en 100 metacercariae. Vervolgens werden
de paarden die geïnfecteerd waren met 800 metacercariae op een weide gezet die
ernstig besmet was met metacercariae. De andere paarden werden binnen of op
een niet geïnfecteerde weide gehuisvest. Van de 10 paarden, die oraal
geïnfecteerd zijn, waren er maar in één lever adulte F. hepatica te vinden. Dit
dier was blootgesteld aan 500 metacercariae. De dieren die intraperitoneaal
6
geïnfecteerd zijn, hadden beiden adulte F. hepatica in de lever (Nansen et al.,
1975).
Het blijkt uit verschillende onderzoeken dat er in endemische gebieden een hoge
prevalentie van eier uitscheidende paarden te vinden is. In een studie onder 2
paarden populaties in Duitsland, scheidde 38% en 71% van de dieren in de
populatie F. hepatica eieren uit in de faeces (Samson-Himmelstjerna, 2006). In
een andere paarden populatie in Duitsland werden de dieren op met
metacercariae besmet land gezet. In de eerste groep was 38.5% eieren aan het
uitscheiden en in de tweede groep 70.7%. De dieren hadden ondanks de infectie
geen problemen met de gezondheid, ontwikkeling en fertiliteit (Fischer et al.,
1983).
Bij een experiment van Grelck et. al. uit (1977) zijn de dieren experimenteel
geïnfecteerd met metacercariae. De dieren zijn na een aantal weken geslacht,
waarbij de levers onderzocht werden op juveniele en adulte F. hepatica. Ook is
het darmkanaal onderzocht op de aanwezigheid van Strongyliden. Paarden met
een hoog aantal strongyliden bleken veel hogere aantallen F. hepatica te
bevatten. In de dieren waar bij nauwelijks strongyliden te vinden waren, zijn
geen tot weinig F. hepatica gevonden in de lever. Ook bij ezels kwam dit naar
voren. Dieren die ernstiger geïnfecteerd waren met strongyliden en dictyocaulus
bleken hogere aantallen F. hepatica in de lever te hebben (Grelck et. al. 1977).
Verschijnselen van een F. hepatica infectie
Door de natuurlijke weerstand die paarden ontwikkelen tegen een F. hepatica
infectie zijn er vaak geen duidelijke klinische verschijnselen waar te nemen.
Wanneer deze toch ontstaan zijn deze aspecifiek. Indien er toch verschijnselen
optreden, treedt er vaak vermagering, anorexie, doffe vacht, diarree, anemie,
sloomheid en vermindert presteren op. In een volgend stadium van de infectie
kan icterus, oedeem en soms peritonitis ontstaan (laber, 1971).
Er zijn enkele casuïstieken beschreven van F. hepatica infecties bij het paard.
Op de Faculteit diergeneeskunde aan de universiteit Utrecht werd er in april 2009
een negen maanden oud New Forest hengstveulen aangeboden. Het dier
vertoonde anorexie, sloomheid, en bleef achter in groei. Het dier was vermagerd,
zat slecht in het haar en was sterk anemisch. Bij het bloedonderzoek bleek het
dier te leiden aan een milde leucocytose en een zeer sterk verlaagd totaal eiwit.
Het dier werd geëuthanaseerd en voor pathologie aangeboden, hier bleek het dier
te leiden aan een F. hepatica infectie. De andere 8 pony’s, waarmee dit veulen
gehuisvest werd, hadden geen specifieke klinische lever klachten wel waren er
enkele dieren wat mager en hadden een doffe vacht. Van alle acht dieren is
bloedonderzoek gedaan. Alle dieren hadden een verhoogde LDH waarden, zeven
pony’s lieten een verhoogd γGT zien. Na 3 negatieve monsters met de
sedimentatie flotatie methode zijn de andere 5 faeces monsters onderzocht via de
zeef en schud methode, deze bleken allen positief te zijn. De eerste drie konden,
achteraf gezien, ook weleens positief zijn geweest.
De gehele kudde is behandeld met triclabendazol. Op het weiland van deze dieren
werden een paar jaar voor deze casus wat schapen gehouden. De schapen
hebben waarschijnlijk gezorgd voor de infectie op het land en de paarden hebben
deze infectie zelf, de jaren erna, in stand gehouden (A.J.Spierenburg, personal
communications, 2009).
Ook in Oostenrijk is er een casus bekend van een 4 jaar oude Pinto hengst. Deze
hengst werd aangeboden in juni 1971 in een slechte algemene toestand. Het dier
vertoonde sterke vermagering, zat ruig in het haar, was anemisch en vertoonde
lichte apathie. Ondanks deze klachten vertoonde hij geen anorexie. Bij
bloedonderzoek had dit paard licht verhoogde leverwaarden, eosinofilie en
7
leucocytopenie. Door de slechte algemene toestand was de behandeling gericht
om deze kritiek toestand te verbeteren en daarnaast werd er ook behandeld
tegen de F. hepatica infectie met het middel Hetol®. Dit middel bevat
trichlomethylbenzol en is werkzaam tegen trematoden en nematoden (Laber,
1971).
In Ethiopië is de prevalentie van F. hepatica onder ezels 72%. De dieren zijn vaak
chronisch of sub-klinisch geïnfecteerd en vertonen nauwelijks verschijnselen.
Ondanks dat de dieren weinig verschijnselen laten zien heeft een infectie wel
degelijk invloed op bloed verlies, productie en prestatie. Subklinisch geïnfecteerde
ezels bleken in deze studie geen afwijkende leverenzymen te hebben (Trawford et
al., 2008).
Uit bovenstaande casuïstieken kan geconcludeerd worden dat geïnfecteerde
paarden nauwelijks verschijnselen vertonen. Wanneer er toch verschijnselen
getoond worden zijn deze vaak aspecifiek. De bepaling van de leverwaarden kan
een hulpmiddel zijn bij het stellen van de diagnose, maar subklinische
geïnfecteerde ezels blijken geen afwijkende leverwaarden hebben (Trawford et
al., 2008).
ELISA test
Er zijn vele antigenen beschikbaar om een F. hepatica infectie via een ELISA test
te diagnosticeren. De meest gebruikte zijn de cysteine proteinases, deze worden
geëxcreteerd door zowel juveniele als adulte stadia. Zoogdieren die geïnfecteerd
zijn met een F. hepatica infectie hebben een stijging van anti-Fas2 IgG
antilichamen (Espinoza et al., 2005). Het antigen wat in velen F. hepatica ELISA
tests gebruikt wordt is het eiwit cathepsine L cysteine. Dit antigen wordt gebruikt
in humane, lama’s, runderen en schapen ELISA tests. Wel moet het dier ook
onderzocht worden op maagdarm wormen, om crossreactiviteit uit te sluiten
(Coles et al., 2010; Cornelissen et al., 1999).
Een recente studie heeft aangetoond dat er ook antigenen via de feces worden
uitgescheiden, copro-antigenen. Er is een ELISA test beschikbaar die cathepsine L
in de feces van F. gigantica geïnfecteerde runderen en schapen kan detecteren.
Ook deze test diagnosticeert een infectie in de pre-patent periode (Piedrafita et
al., 2010).
In het onderzoek van Estuningsih et al., uit (2009) zijn de sensitiviteit en de
specificiteit van respectievelijk de fecale en de serum ELISA test met elkaar
vergeleken. Het bleek dat de fecale test een hogere sensitiviteit en specificiteit
had dan de serum ELISA test (Estuningsih et al., 2009). De reden dat er toch
gewerkt wordt aan een serum ELISA is, omdat deze test een infectie eerder kan
detecteren dan een faecale test. De serum ELISA kan de diagnose vanaf de
eerste week post infectieus detecteren, terwijl de fecale ELISA de diagnose maar
een paar weken voor ei-uitscheiding kan detecteren (Espino et al., 1997).
Wanneer er een nieuwe ELISA-test ontwikkeld wordt, moet er bepaald worden
waarmee de plaat gecoat gaat worden. De coating kan met een antilichaam of
met een antigen plaatsvinden. De coating van de plaat is afhankelijk van het type
ELISA test wat gebruikt gaat worden. Bij de directe- en indirecte ELISA-test
wordt de plaat gecoat met een antigen. Bij de sandwich- en competitieve ELISA
wordt de coating gevormd door antilichamen (Thermo, 2008).
In dit onderzoek werd er een indirecte ELISA test gebruikt en de plaat wordt
gecoat met het antigen cathepsine B.
Enzym activiteit bij een F. hepatica infectie
Een stijging van het enzym GLDH vindt plaats bij de trektocht van juveniele F.
hepatica stadia door het leverparenchym, waarbij ontsteking en weefsel
destructie optreedt. Een stijging van γGT ontstaat als er volwassen stadia in de
8
galgangen aanwezig zijn (Bossaert et al., 2000; Ferre et. al., 1997; GonzaloOrden et. al., 2003).
Experimenteel geïnfecteerde schapen laten vier weken post infectieus een stijging
zien van het enzym GLDH. Het enzym γGT laat pas 9 weken postinfectieus een
stijging zien, en bleef tot 18 weken verhoogd. Nadat de juveniele stadia
aangekomen zijn in de galgangen en zich ontwikkelen tot adulte stadia, dalen de
leverenzymen snel naar hun normaal waarden, het leverparenchym laat dus een
regeneratie zien. De γGT waarden daalt na een aantal weken, terwijl er dan nog
wel adulte stadia in de galwegen aanwezig zijn. Hieruit kan geconcludeerd
worden dat persisterende adulte stadia niet zo schadelijk zijn voor de galwegen.
Ook is het een mogelijkheid dat de adulte stadia uiteindelijk verdwijnen uit de
galgangen (Gonzalo-Orden et. al., 2003).
In het onderzoek van Bossaert et. al., uit (2000) is er, nadat runderen
experimenteel blootgesteld zijn aan metacercariae, 3-4 weken post infectieus een
stijging te zien van GLDH, γGT liet 10-11 weken post infectieus een significante
stijging zien. Uit het onderzoek bleek ook dat hoe hoger de dosis aan toegediende
metacercariae, hoe hoger de leverwaarden. Dus hoe hoger de leverwaarden hoe
ernstiger het dier geïnfecteerd is met de infectie. Maar uit het onderzoek blijkt
ook dat leverenzym waarden niet gecorreleerd zijn aan het aantal gevonden
laesies in de lever en galgangen bij pathologie. Het is dus dier specifiek hoe
ernstig de reactie is op een infectie (Bossaert et. al., 2000).
Het enzym gamma glutamyltransferase (γGT) komt bij paarden voor in de lever,
pancreas en in de nieren. Een stijging van het serum γGT is onveranderlijk
geassocieerd met lever ziekten/afwijkingen. Bij zowel chronische als acute lever
ziekten is er een stijging te zien van het enzym. Er is ook een stijging te zien bij
pancreatitis, maar dit komt zelden voor bij paarden. Ook het enzym LDH laat een
stijging zien bij leverziekten (Taylor et. al., 1997).
Er zijn vele studies uitgevoerd waarin de relatie tussen een LDH stijging en een F.
hepatica infectie onderzocht zijn. Er zijn rapportages over een stijging van LDH
bij een F. hepatica infectie (Donat et al., 1990). Deze stijging kan niet blindelings
toegeschreven worden aan een F. hepatica infectie, omdat dit enzym niet lever
specifiek is (Donat et al., 1990; Nelis et al., 2010).
Het enzym γGT blijkt bij het paard in de meeste gevallen te stijgen bij de
aanwezigheid van adulte stadia in de galgangen, maar dit is niet zo duidelijk als
bij herkauwers (Nelis et al., 2010).
Behandeling
Voor de behandeling van F. hepatica zijn er verschillende middelen beschikbaar,
die alleen geregistreerd zijn voor runderen en schapen (Fidin repertorium).
Hierdoor kan er alleen een ‘off label ’ behandeling worden ingesteld bij paarden.
Het middel wat voornamelijk gebruikt wordt bij de behandeling van F. hepatica bij
het paard is triclabendazol in een dosis van 12 mg/kg (Adams et. al. 2001;
Radostits et. al. 1999; Samson-Himmelstjerna, 2006). Uit een studie onder ezels
is gebleken dat het middel triclabendazol goed werkt tegen een F. hepatica
infectie. Bij de behandelde groep met dieren waren er 18 dagen na de eerste
behandeling al geen F. hepatica eieren meer in de faeces aantoonbaar Vervolgens
is er maandelijks coprologisch onderzoek gedaan bij deze dieren, 4 maanden na
de behandeling waren er bij geen enkel dier eieren in de faeces aanwezig
(Trawford et. al. 1996). Samson-Himmelstjerna suggereert in 2006 dat
triclabendazol goed werkzaam is tegen adulte stadia van F. hepatica, maar dat
het niet altijd volledig de juveniele stadia elimineert. Volgens de studie van
Andrews, uit (1999) is het anthelmintica juist zeer effectief tegen zowel juveniele
als adulte stadia van F. hepatica. Omdat de literatuur hier niet eenduidig over is,
wordt aangeraden om de behandeling met triclabendazol na 6 weken te herhalen.
In deze tijd hebben de juveniele stadia, die bij de eerst behandeling niet zijn
geëlimineerd, zich tot adulte stadia ontwikkeld. Deze worden bij een tweede
9
behandeling wel geëlimineerd. Een voorwaarde is dat de dieren zich niet opnieuw
besmetten met metacercariae.
Een andere behandel mogelijkheid is closantel, ook dit middel is niet
geregistreerd voor gebruik bij het paard. In de literatuur worden paarden
behandeld met dit middel in een dosis van 10mg/kg. Closantel kan, in
tegenstelling tot triclabendazol, bijwerkingen geven bij het paard. In sommige
gevallen ontstaat er anorexie en diarree (Fischer et al., 1983; SamsonHimmelstjerna, 2006).
Wereldwijd blijkt er steeds meer resistentie te ontstaan tegen triclabendazol
(Fairweather et al., 1999). Nederland is een van de landen waar resistente F.
hepatica stammen voorkomen. In de provincie Noord-Holland zijn Fasciola
geïnfecteerde schapen beschreven die ondanks vier maal behandelen met
triclabendazol toch stierven (Moll et al., 2000).
In het onderzoek van Moll et al.,uit (2000) zijn er schapen en runderen, in het
gebied met triclabendazol resistentie, behandeld met closantel of clorsulon. Deze
middelen bleken te werken tegen de resistente vormen van F. hepatica (Moll et
al., 2000).
Om verdere uitbreiding van resistente gebieden in Nederland tegen te gaan moet
er in de risico gebieden strategisch behandeld worden. Dit houdt in dat de
behandel frequentie naar een minimum teruggebracht moet worden. Er moet op
het juiste moment van het jaar behandeld worden in de juiste dosering.
Ook combinatie preparaten met anthelmintica met verschillende
werkingsmechanismen kunnen gebruikt worden om een synergetisch effect op te
wekken. Zo is er van beide middelen minder nodig. Het blijkt dat triclabendazol
gecombineerd met closantel zowel gebruikt kan worden als preventie tegen de
resistentie ontwikkeling als tegen resistente F. hepatica stammen (Gaasenbeek et
al., 2001; Fairweather et al., 1999).
De afweging moet dus wel gemaakt worden of paarden in triclabendazol
resistente gebieden behandeld moeten worden met closantel. Een optie zou zijn
om de behandeling af te laten hangen van de leverwaarden van het dier.
Wanneer deze sterk verhoogd zijn duidt dit op flinke leverschade door de F.
hepatica infectie. Wanneer de leverwaarde sterk verhoogd zijn is ons advies om
toch te behandelen. Er zou als eerste gekozen kunnen worden voor een middel
wat triclabendazol bevat, wanneer de leverwaarden onvoldoende verbeteren, kan
er uiteindelijk gekozen worden voor closantel, met in het achterhoofd de
eventuele bijwerkingen ervan (Samson-Himmelstjern, 2006).
Materiaal en methode
Faeces en bloed monsters
Faeces
Om de in Gent voor het paard ontwikkelde ELISA test in het veld te toetsen was
er faeces en serum nodig van door F. hepatica geïnfecteerde paarden. In de
periode november 2010 tot en met maart 2011 zijn in totaal 230 faeces monsters
verzameld. Het materiaal kwam van paarden die in de leverbot gebieden in de
provincies Noord-Holland, Gelderland, Utrecht en Zuid-Holland gehuisvest waren.
Daartoe werd er ook veel materiaal verzameld van paarden die geweid werden op
land dat ook door runderen en/of schapen begraasd werd die regelmatig
behandeld werden tegen F. hepatica. Wanneer het om melkvee ging, waren deze
in de meeste gevallen tankmelkpositief voor F. hepatica.
Enkele monsters waren afkomstig van dieren met vage klinische klachten, die
verdacht werden van een F. hepatica infectie.
Paarden werden geclassificeerd als positieve dieren wanneer er eieren in de
faeces werden gedetecteerd via de zeef en schud methode (zie bijlage 2).
10
Er is ongeveer 70 gram faeces geraapt uit de stal van elk paard, het monster is
zo vers mogelijk genomen, de faeces werd gekoeld bewaard in een plastic
handschoen.
Coprologisch onderzoek
De faeces werd onderzocht op F. hepatica eieren met behulp van de zeef- en
schudmethode (Gundlach, 1980).
De zeven die gebruikt zijn hadden een doorlaatdiameter van 2000m, 1000m,
300m, 150m, 106m en 63m (zie bijlag 2).
Voor deze methode is er 50 gram faeces gesuspendeerd in 150 ml water.
Het materiaal uit de verzamelzeef (63m) is opgevangen in een maatbeker en
verdeeld over twee centrifuge buizen voor de sedimentatie flotatie techniek. Bij
deze techniek werd er gebruik gemaakt van een suikeroplossing met een
soortelijk gewicht van 1.3 g/cm3 in plaats van een verzadigde zoutoplossing. Dit
was zo gekozen omdat het soortelijk gewicht van F. hepatica eieren tussen de 1.2
en de 1.3 g/cm3 ligt.
Wanneer het faeces monster positief was werd ook het strongylus EPG met
behulp van de McMaster methode bepaald. Ook werd de sedimentatie flotatie
techniek toegepast met een verzadigde zoutoplossing om andere maagdarm
parasieten te detecteren. De uitslag van de sedimentatie flotatie techniek werd
uitgedrukt in cijfers: 1=negatief, 2= redelijk positief en 3=zwaar positief op
strongylus eieren. Deze testen werden gedaan om een eventuele kruisreactiviteit
vast te kunnen stellen in de ELISA test.
Bloed
Het bloed werd afgenomen uit de v. jugularis door gebruik van een vacutainer
systeem, het bloed werd opgevangen in serum buizen, die vervolgens vijf
minuten gecentrifugeerd werden op een snelheid van 3000 toeren, waarna het
serum over gepipetteerd werd in kleine falcon buizen en opgeslagen werden bij
een temperatuur van -20 °C.
In totaal zijn 156 serum samples verzameld om te gebruiken voor de validatie
voor de ELISA test en voor de bepaling van de leverenzymen.
9 van de 156 bloed samples kwamen van dieren die behandeld zijn met
triclabendazol. Bij deze behandelde dieren is de diagnose alleen klinisch gesteld,
ze hadden wat vage klachten, bij bloedonderzoek waren de leverenzymen YGT en
LDH wat verhoogd. Van deze dieren is er geen coprologisch onderzoek gedaan,
omdat uit de studie van Trawfort et al. uit (1996) blijkt dat F. hepatica
geïnfecteerde ezels 18 dagen na behandeling met triclabendazol geen eiuitscheiding meer hebben (Trawfort et al. 1996). De negen paarden, in deze
studie, waren allen al minimaal 6 weken geleden behandeld, vandaar dat er geen
coprologisch onderzoek meer gedaan is.
Enzymatisch onderzoek
Het bloed van de positieven dieren is ingestuurd om de leverenzymen, gammaglutamyltransferase (γGT) en lactate dehydrogenase (LDH) te bepalen. Deze
enzymen zijn bepaald om te kijken of het dier leverschade opgelopen heeft
(Taylor et. al., 1997).
Pathologie levers
Op het slachthuis zijn er 9 paarden onderzocht op een F. hepatica infectie. Aan de
slachtlijn is er bloed afgenomen en de lever werd macroscopisch beoordeeld op
de aanwezigheid van F. hepatica. De herkomst van deze dieren was onbekend.
11
Enquête
Wanneer dieren positief bevonden werden via het coporologisch onderzoek werd
er een enquête afgenomen van de eigenaar. Deze zijn opgenomen in bijlage 3.
ELISA-test
De gebruikte ELISA test voor de diagnostiek van F. hepatica infecties bij paarden
was een indirecte ELISA test. Er werd gebruik gemaakt van ‘Nunc Maxisorp flat
bottomed 96 well plates’. Deze platen werden gecoat met een E/S antigen
geïsoleerd uit levers van slachtrunderen.
De ELISA platen werden gecoat met 100µl/well 5µl/10ml van het E/S antigen in
0.05M carbonaat/bicarbonaat buffer. De plaat werd afgedekt met een sealing en
een uur geïncubeerd bij kamer temperatuur.
Na een incubatie bij 4 °C overnacht werd de plaat geleegd en vervolgens 5 maal
gewassen met PBS buffer wat 0.05% Tween-20 bevatten (PBS/T) PH 7.2. Na de
laatste wasstap werd de plaat uitgeklopt op een tissue om achtergebleven vocht
en luchtbellen te verwijderen. Vervolgens werden de non-specifieke
bindingsplaatsen in elke well geblokkeerd met 100µl 2% magere koemelk van
Marvel in PBST (2 gram koemelk in 100ml PBS/T). De plaat werd afgedekt met
sealing en een uur geïncubeerd in 37°C. Vervolgens werden de platen gewassen
volgens hetzelfde protocol als in de stap hiervoor
Na het blokkeren en wassen, werd er 100µl van het sera, 1:400 verdund in PBS/T
(1µl sample in 399µl PBS/T), in elke well gedaan, met uitzondering van well F1 en
F12. In well F1, F2, F11 en F12 werd alleen PBS/T buffer gedaan, deze werden
gebruikt voor conjugaat en substraat controle. De plaat werd vervolgens afgedekt
met sealing en een uur geïncubeerd bij 37°C vervolgens werd de plaat gewassen
zoals bovengenoemd.
Het conjugaat was een opgelost konijnen anti-paard IgG conjugaat in peroxidase
(Sigma-Aldrich) en 1:5000 verdund in PBS/T (2µl in 10ml PBS/T). In elke well
werd 100 µl/well conjugaat gedaan, met uitzondering van well F1 en F12, in deze
substraat controles werd alleen PBS/T buffer gedaan. De plaat werd afgedekt en
voor een uur geïncubeerd bij 37°C, vervolgens werd de plaat gewassen zoals
hiervoor.
Tijdens de incubatie tijd van het conjugaat werd de substraat oplossing, 1 OPD
tablet (Sigma, P-5412) in 20 ml citroenzuur/fosfaat buffer (PH 5.2), bereid in een
donkere fles. Nadat de tablet volledig was opgelost werd 10 µl hydrogeen
peroxidase toegevoegd. Elke well werd gevuld met 100µl substraat oplossing, na
exact 10 minuten incubatie in een donkere ruimte werd de reactie gestopt door
de toevoeging van 50 µl ‘stop oplossing’ die bestaat uit 2.5M HCL.
Vervolgens kon de plaat afgelezen worden op de ELISA reader bij een golflengte
van 492 nm.
Op elke plaat werd er een substraat-, conjugaat-, positieve-, en negatieve
controle gedaan. De positieve controle bestond uit serum van paarden die positief
zijn bevonden via coprologisch onderzoek. De negatieve controle was serum van
veulens die nog geen biest op hadden, dus nog geen antilichamen via de moeder
binnen hadden gekregen. Ook zijn deze veulens niet buiten geweest, zodat er
geen opname van metacercariae plaats heeft gevonden.
De uitgevoerde test via bovengenoemd protocol gaf geen interpreteerbare
resultaten, om dit te verbeteren zijn er enkele aanpassingen gedaan.
Aanpassing 1
Om bacteriële contaminatie uit te sluiten zijn er nieuwe negatieve- en positieve
controle samples uit de -80°C vriezer gehaald. Deze zijn in Gent verzameld en
werden gebruikt als controle samples. In het originele protocol waren deze
controles al een paar dagen opgeslagen bij een temperatuur van ongeveer 4°C.
Een andere oorzaak voor het probleem zou kunnen zijn dat er gebruik werd
gemaakt van een verkeerde conjugaat concentratie. Om te achterhalen of het
12
probleem hier zat is er een proefplaat uitgevoerd met vier verschillende
verdunningen van het conjugaat. De concentraties waar gebruik van gemaakt
was zijn 1/1250, 1/2500, 1/5000 en 1/10000. Oorspronkelijk werd er gebruik
gemaakt van een verdunning van 1/5000. Ook was er op de plaat een scheiding
gemaakt tussen het oude en nieuwe conjugaat, dit om eventuele bacteriële
contaminatie uit te sluiten.
Bij geen enkele verdunning is er een juiste conjugaat controle uit gekomen. Ook
de negatieve- en positieve controles lieten bij alle vier concentraties een te hoge
waarden zien.
Op boven genoemde proefplaat is er gebruik gemaakt van buffers die de dagen
ervoor ook gebruikt zijn. Om uit te sluiten dat het probleem aan de buffers ligt,
zijn deze alle drie opnieuw aangemaakt en gecontroleerd op de juiste PH.
Nadat de plaat in het donker is geïncubeerd was er al te zien dat er aspecifieke
binding opgetreden was, doordat de plaat een gele kleuring had, hieruit kan
geconcludeerd worden dat er in de voorgaande stappen iets mis is gegaan. Het
probleem ligt dus niet in de laatste stap, de toevoeging van de stop oplossing,
daarom was er geen nieuwe stop oplossing aangemaakt.
Ook is er nieuwe doos OPD tabletten (Sigma, P-5412) gebruikt, om uit te sluiten
dat er met de oude wat aan de hand kon zijn.
Er vond ergens aspecifieke binding plaats. Een reden voor dit probleem kan zijn
dat de non-specifieke bindingsplaatsen te weinig geblokkeerd werden door de
2% magere koemelk Marvel/PBST. Er is daarom gekozen om een proefplaat in te
zetten waarin een deel van de wells geblokkeerd werd met 2% Marvel/PBST en
een deel met foetaal kalf serum. Met beiden blok buffers is er te veel aspecifieke
binding, alle waarden zijn veel te hoog en de conjugaat controle heeft wederom
een veel te hoge waarden. Het probleem kon nog steeds in het blokken zitten,
daarom is er op de volgende plaat gekozen voor een 5% magere koemelk
Marvel/PBST oplossing. Ook is er op deze plaat een sterkere verdunning van het
conjugaat getest, ook zijn de samples verdund. Dit is gedaan om uit te testen wat
de juiste verdunning moest zijn van zowel het conjungaat als de samples. De
concentraties conjugaat waar gebruik van gemaakt is zijn 1/5000, 1/10000,
1/15000 en 1/20000. De concentraties van de samples zijn 1/400, 1/800 en
1/1200. Resultaat; alle conjugaat controles hadden een veel te hoge waarden en
ook de waarden van de negatieven- en positieven controle waren veel te hoog.
Ook via de nieuwe aanpassingen kwam het wederom niet tot interpreteerbare
resultaten, wederom zijn er aanpassingen gedaan. Hieruit kwamen wel
interpreteerbare resultaten, hieronder staat het vernieuwde protocol.
Vernieuwd protocol
Er is een nieuw protocol opgesteld met gewijzigde concentraties ten opzichte van
het oorspronkelijke protocol. De coating van de plaat bleef hetzelfde als in het
oorspronkelijke protocol. Er is een hogere concentratie aan blok buffer gebruikt,
8% magere koemelk van Marvel in PBST (8 gram koemelk in 100ml PBS/T). De
verdunning van de samples bleef zoals in het oorspronkelijke protocol. Het
conjugaat werd 1:2000 verdund in PBS/T buffer (5µl in 10 ml PBS/T). Bij de
aanmaak van het substraat zijn er nieuwe producten gebruikt: nieuwe buffer,
OPD tablet (Sigma, P-5412) en hydrogeen peroxidase. De incubatie tijd van het
substraat was verlengd met 10 minuten, de totale incubatie tijd werd dus 20
minuten.
De ELISA test die ontwikkeld is om positieven paarden te detecteren is
gekalibreerd en getest met serum van positieven en negatieven dieren. De test
heeft goed gewerkt en er is toen bepaald welke OD waarde een negatief en welke
een positief sample heeft. Een negatief sample heeft een OD waarde <0.37 en
een positief sample >0.6. De OD waarden tussen de 0.37 en de 0.6 was een
waarden waarover nog niet gezegd kon worden of het een negatief of een positief
13
sample betreft. Om hier meer duidelijkheid over te krijgen moesten er meer
positieven en negatieven samples getest worden om te bekijken of die waarden
dichter bij elkaar konden komen. Er is een proefplaat gedaan met 8 negatieve
monsters (veulens die nog geen biest op hadden) die alle minimaal 4 maal zijn
herhaald op de plaat. Op dezelfde plaat zijn er 2 positieven monsters (eiuitscheiders) getest die 7 maal zijn herhaald. Via deze proefplaat is bepaald dat
de OD waarden voor negatieve samples <0.378 ligt, alle waardes hierboven
werden als positieven samples aangeduid.
Resultaten
Faeces- en bloed onderzoek
Uit de in totaal 230 onderzochte faecale monsters waren 14 dieren positief op F.
hepatica eieren. (zie tabel 1 en bijlage 3). Van deze geïnfecteerde dieren zijn de
bloedwaarden LDH en γGT bepaald. In tabel 1 is een overzicht gegeven van de F.
hepatica geïnfecteerde paarden, waarin leeftijd, aantal F. hepatica uitgescheiden
eieren, strongylus EPG, sedimentatie flotatie uitslag en de leverwaarden YGT en
LDH zijn weergegeven.
De paarden die op het slachthuis zijn onderzocht op F. hepatica infecties, waren
alle negatief. Bij geen enkel dier was de lever geïnfecteerd.
Nummer
dier
Leeftijd
(in jaren)
EPG
Sedimentatieflotatie
0
+
0
+
0
-
6
Aantal F.
hepatica
eieren in
faeces
67 in jan
8 in febr
67 in jan
8 in febr
15 in jan
38 in febr
3
5
2
6
3
7
13
30
0
+
31
3
64
650
+++
32
11
2
0
-
60
8
5
0
-
77
2
27
0
+++
156
2
3
900
++
165
7
1
0
-
166
1
1
0
-
169
22
1
0
-
209
14
1
0
+
228
3
5
0
+
Leverwaarden
Referentiewaarden:
LDH (150-420)
γGT (<20)
LDH:543
γGT:34
LDH:470
γGT:20
LDH:590
γGT:12
LDH:450
γGT:23
LDH:576
γGT:22
LDH:596
γGT:16
LDH:onbekend
γGT:onbekend
LDH:665
γGT:25
LDH:400
γGT:17
LDH:705
γGT:17
LDH:768
γGT:18
LDH:369
γGT:12
LDH:737
γGT:26
LDH:onbekend
γGT:onbekend
Tabel 1: uitslagen F. hepatica geïnfecteerde dieren waarin leeftijd, aantal
F. hepatica eieren, EPG, sedimentatie-flotatie en de leverwaarden zijn
aangeven
14
Er is gekeken naar de correlatie tussen het aantal uitgescheiden F. hepatica
eieren en de leverenzymen LDH en YGT. Er is geen correlatie tussen het aantal
uitgescheiden eieren en de LDH waarde, bij YGT is er een correlatie van 27% (zie
figuur 2).
40
35
YGT (U/L)
30
R2 = 0,2747
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
F. hepatica eieren
Figuur 2: correlatie tussen het aantal F. hepatica eieren en YGT
Enquête
Uit de enquête gehouden onder de eigenaren van de positief geteste dieren bleek
dat er enkele dieren waren die wat klachten hadden. Er was een dier wat
achterbleef in groei. Een ander dier vertoonde vermagering, waarschijnlijk was er
wat mis met het gebit. De meeste dieren vertoonden geen verschijnselen, de
eigenaar kon in ieder geval niet aangeven dat het dier klinische klachten had.
ELISA-test
Via het oorspronkelijke protocol zijn er geen interpreteerbare resultaten uit de
ELISA gekomen. Bij alle testen had de conjugaat controle een veel te hoge ODwaarden. De conjugaat controle moet altijd een getal zijn met 0.0 gevolgd door
enkele cijfers. Er is dus ergens niet-specifieke binding opgetreden van het
conjungaat. Dit was over de gehele plaat terug te zien. Alle well’s hadden veel te
hoge OD waardes
Ook de resultaten na de eerste aanpassingen zijn niet te interpreteren, er was
wederom teveel niet-specifieke binding en alle well’s hadden veel te hoge OD
waardes.
De resultaten die verkregen zijn via het vernieuwde protocol zijn wel gebruikt
worden voor interpretatie. Uit de in totaal 156 onderzochte serologisch monsters,
zijn er 21 samples met een OD waarde <0.378, de overige 135 samples liggen
hoger en noemen we positief. Van de in totaal 156 serologische monsters zijn er
9 positief bevonden via coprologisch onderzoek. Serum van paard nummer 32,
die positief was via coprologisch onderzoek, bleek negatief te zijn met behulp van
serologisch onderzoek. De overige coprologisch positieve monsters hadden alle 8
15
een OD waarde >0.378 en waren dus ook positief getest met behulp van de
ELISA.
In bijlage 5 is de tabel te zien van alle 156 serologische monsters met OD
waardes en de hoeveelheid ei-uitscheiding. Van de 9 dieren, die behandeld zijn
met triclabendzol, waren er 2 negatief via de ELISA test.
Om te kijken of er een correlatie was tussen de ei-uitscheiding en de ODwaarden, zijn deze tegen elkaar afgezet, er is geen correlatie gevonden. Erg veel
dieren die via coprologisch onderzoek negatief waren, hebben een positieve OD
waarde.
1,2
R2 = 0,1923
ELISA OD waarde
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
200
600
400
800
1000
Strongylus EPG
Figuur 3: correlatie tussen het strongylus EPG en OD waarde
In figuur 3 is te zien dat de variatie in het strongylus EPG voor 19% te verklaren
is door de variatie in de OD waarde.
16
1,2
R2 = 0,241
ELISA OD waarde
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Sedimentatie flotatie (strongylus eieren)
Figuur 4: correlatie tussen sedimentatie/flotatie techniek en OD waarde
In figuur 4 is te zien dat de er een correlatie is van 24% tussen het aantal
strongylus eieren wat via de sedimentatie flotatie methode is gevonden en de OD
waarde.
80
70
60
2
R = 0,1785
F. hepatica eieren
50
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
-10
-20
Leeftijd (in jaren)
Figuur 5: correlatie tussen leeftijd en het aantal uitgescheiden F.
hepatica eieren
17
Figuur 5 laat zien dat er een correlatie is van 18% tussen de leeftijd en de ei
uitscheiding. Wanneer de leeftijd stijgt, is er een daling te zien in het aantal
uitgescheiden eieren.
Wanneer er bij F. hepatica eieren uitscheidende dieren gekeken wordt naar de
uitscheiding van strongylus type eieren valt het op dat er bij de sedimentatie
flotatie techniek een correlatie is van 23% (zie figuur 6). Wanneer er naar de
correlatie gekeken wordt van het strongylus EPG, bepaald wordt via de McMaster
methode, en het aantal uitgescheiden F. hepatica eieren is er geen correlatie te
vinden.
Sedimentatie/flotatie (strongylus type eieren)
3,5
3
R2 = 0,2325
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
20
40
60
80
F. hepatica eieren
Figuur 6: correlatie tussen aantal uitgescheiden F. hepatica eieren en
sedimentatie flotatie techniek (strongylus type eieren)
Discussie
ELISA
Een voordeel van een serodiagnostische test ten opzichte van de coprologische
test is dat prepatent/latent geïnfecteerde dieren gedetecteerd kunnen worden
(Salimi-Bejestani et al., 2005). In dit onderzoek blijkt dit ook zo te zijn, 87% van
de paarden is positief in het serologisch onderzoek, dit aantal ligt vele malen
hoger dan met coprologisch onderzoek werd gevonden (6%). Ook MunguíaXóchihua et al., uit (2007) toonde aan dat een ELISA test veel meer
geïnfecteerde dieren detecteert dan wanneer de diagnose gesteld werd via
coprologisch onderzoek.
Er is alleen geen correlatie gevonden tussen ei-uitscheiding en de OD-waarde. Er
zijn heel veel positieven via de ELISA test, terwijl deze dieren geen eieren
uitscheidden. Dit kan bijvoorbeeld verklaard worden doordat er een cross-reactie
opgetreden is met andere parasitaire infecties. Het kan ook zijn dat al de dieren
met een positieve OD waarde ook daadwerkelijk in contact zijn geweest met F.
hepatica en immuniteit hebben opgebouwd. Deze dieren scheiden geen eieren uit.
Dit roept dan de vraag op of paarden wel echt zo gevoelig zijn voor de infectie,
18
omdat er in dit onderzoek van de 156 dieren, maar 9 eieren uitscheiden en in
totaal waren er 135 positief via de ELISA test.
Ook kan de OD-waarde van een antilichaam Elisa als positief worden beoordeeld
terwijl de dieren maanden geleden een infectie hebben doorgemaakt, waarvan de
antilichamen nog in het bloed aanwezig zijn. Ook in dit laatste geval is het dan de
vraag of de paarden last hebben van de infectie, want er zijn maar bij 9 van de
156 dieren wat vage klinische klachten waargenomen en deze zijn toen
behandeld met triclabendazol. Van deze 9 dieren zijn er 2 negatief via de ELISA
test, de overige hebben allemaal antilichamen in het bloed. Er moet dus bij de
interpretatie van de ELISA uitslagen aan gedacht worden dat de aanwezigheid
van antilichamen niet altijd wil zeggen dat het dier aan een actieve F. hepatica
infectie leidt (Munguía-Xóchihua et al., 2007). Uit onderzoek bij runderen blijkt
dat na een behandeling met het middel triclabendazol de antilichamen 7 maanden
daarna nog detecteerbaar zijn met behulp van een ELISA test. Een positief test
resultaat kan duiden op een infectie of op een infectie die in het verleden is
opgedaan (Salimi-Bejestani et al., 2005).
Bij runderen kunnen 2-4 weken postinfectieus antilichamen worden aangetoond
tegen een F. hepatica infectie (Bossaert et al., 2000; Ferre et. al., 1997; GonzaloOrden et al., 2003; Munguía-Xóchihua et al., 2007). Dit kan mogelijk ook bij
paarden zo zijn. Er kunnen in dit onderzoek ook dieren tussen zitten die
prepatent/latent geïnfecteerd zijn en wel een immuun respons hebben tegen de
infectie, terwijl er (nog) geen ei uitscheiding plaats vindt. Via coprologisch
onderzoek kan de diagnose pas gesteld worden wanneer er adulte stadia in de
galgangen aanwezig zijn, dit is pas het geval 8-12 weken postinfectieus (Bossaert
et al., 2000; Munguía-Xóchihua et al., 2007).
Paard nummer 32 kan een negatieve OD waarde hebben doordat het dier pas een
immuniteit respons heeft als er adulte stadia in de lever aanwezig zijn. Dit kan
variëren van dier tot dier.
Om verder de immuniteit opbouw tegen een F. hepatica infectie bij paarden beter
te kunnen onderzoeken, moet er gekeken worden naar het type antilichaam
respons wat paarden hebben op een infectie. In verschillende onderzoeken onder
runderen en schapen is er gekeken naar de IgG1 en IgG2 respons.
Bij een F. hepatica infectie in chronische en naïeve geïnfecteerde runderen is er
vooral een IgG1 reactie op te wekken, terwijl de IgG2 respons nauwelijks een
stijging laat zien (Bossaert et al., 2000; Phiri et al., 2006).
De IgG2 respons komt later op gang dan een IgG1 respons, maar deze respons
zorgt voor de opbouw van immuniteit, zodat runderen de parasiet kunnen
elimineren uit de lever. Bij schapen is er nauwelijks een IgG2 reactie waar te
nemen, dit past ook bij het beeld dat schapen slecht in staat zijn om weerstand
te ontwikkelen tegen een F. hepatica infectie (Clery et al., 1996; Phiri et al.,
2006).
In de studie van Bossaert et al., uit (2000) is er gekeken naar de antilichaam
respons bij runderen die geïnfecteerd zijn met metacercariae. Ook in dit
onderzoek blijkt dat er een duidelijk verschil te zien is tussen de IgG1 en IgG2
respons. De IgG1 waarden waren constant hoger dan de IgG2 waarden, ondanks
de flinke stijging in IgG1 waarden geeft het nauwelijks bescherming bij een
infectie (Bossaert et al., 2000). In de studie van Bossaert et al.,uit (2000) zijn de
runderen na 6-8 weken nogmaals geïnfecteerd met metacercariae, er was geen
antilichaam respons waar te nemen na een her-infectie. De verklaring van de
onderzoekers was dat dit veroorzaakt werd door de aanwezigheid van adulte
trematoden in de galgangen, waardoor een antilichaam respons onderdrukt
wordt. Ook bij schapen wordt een antilichaam reactie onderdrukt door de
aanwezigheid van adulte stadia in de galgangen. De weerstand of vatbaarheid
van de gastheer voor de infectie is dus ongerelateerd aan de antilichaam respons
(Bossaert et al., 2000).
19
In het onderzoek van Clery et al., uit (1996) is er gekeken naar de antilichaam
respons nadat runderen meerdere keren bloot gesteld werden aan een
superinfectie. Na 2 superinfecties is er geen stijging van IgG1 waar te nemen, er
is een plateau fase bereikt (Clery et al., 1996). Bij geïnfecteerde schapen was er
twee weken postinfectieus een stijging te zien van de IgG, na acht weken waren
de hoogste waarden bereikt, waarna er een daling te zien was (Ferre et. al.,
1997). Bij runderen is er, in tegenstelling met schapen, resistentie opbouw tegen
een her-infectie doordat er een plateau fase bereikt wordt, terwijl er bij schapen
na acht weken een daling van de antilichamen te zien is (Clery et al., 1996).
In het onderzoek van Munguía-Xóchihua et al., uit (2007) is er gekeken naar F.
hepatica infectie in geiten, schapen en runderen. Het bleek dat schapen
geïnfecteerd waren met een veel hoger aantal volwassen F. hepatica dan
runderen en geiten (schapen hadden hogere aantallen eieren in faeces). Dit kan
verklaard worden doordat schapen geen effectieve immuun respons hebben tegen
een infectie met F. hepatica (Munguía-Xóchihua et al., 2007).
Het blijkt uit bovenstaande studies dat een IgG2 reactie belangrijk is voor
immuniteit opbouw. Bij paarden zijn er geen literatuur studies bekend over de
immuun respons op een F. hepatica infectie. Wanneer de reactie op een infectie
vergeleken wordt tussen paarden, runderen en schapen, dan lijkt de reactie van
het paard dichterbij het rund dan bij het schaap te liggen. De verschijnselen bij
runderen zijn, net als bij paarden, aspecifiek; gewichtsverlies, slechte conditie en
verminderde productie. Bij ernstige infecties is er anemie, oedeem en ascites te
zien, dit komt voornamelijk voor bij kalveren die nog geen immuniteit opgebouwd
hebben tegen de infectie (Blowey et. al. 2000; Kaplan et. al., 2008). In het
schaap zijn de verschijnselen ernstiger dan bij runderen en paarden. Bij een
acute infectie treedt er sterfte op binnen 24-48 uur na de eerste zichtbare
verschijnselen. Dit wordt voornamelijk gezien onder lammeren. Chronisch
geïnfecteerde schapen hebben gewichtsverlies, zwakte, submandibulair oedeem,
ascites en bleke slijmvliezen. Sterfte treedt op in gemiddelde tot zware infecties,
maar sommige overleven het (Brightling et. al., 1988; Kaplan et. al., 2008).
Een infectie bij het paard, lijkt qua verschijnselen erg op die van het rund. Het
zou kunnen dat de antilichaam respons ook vergelijkbaar is met die van het rund.
Bij paarden blijkt F.hepatica niet vaak tot een patente infectie te leiden, dit kan
mogelijk verklaard worden doordat paarden, net als runderen, een hoge IgG2
respons hebben op een infectie.
Coprologisch onderzoek
In dit onderzoek is het percentage F. hepatica eieren uitscheidende dieren 6%.
Dit is een erg laag percentage. De onderzochte dieren komen alle uit gebieden
waar F. hepatica een groot probleem is onder herkauwers. Veel dieren worden
ook geweid op land wat ook door herkauwers begraasd wordt. De studies van
Fischer et al., uit (1983) en Samson-Himmelstjerna uit (2006) hadden al
aangetoond dat er in endemische gebieden wel degelijk paarden zijn die F.
hepatica eieren uitscheiden. Ondanks de hoge prevalentie in een van deze
paarden populaties, waren er geen verschijnselen waar te nemen bij de dieren
(Fischer et al., 1983).
Dit geeft aan dat er in endemische gebieden waarschijnlijk veel paarden besmet
zijn met de infectie, maar dat dit niet wordt waargenomen doordat de dieren
geen verschijnselen vertonen. In dit onderzoek is een enquête uitgevoerd onder
de paardeneigenaren van de geïnfecteerde dieren, hier is uit gebleken dat er
enkele dieren zijn die toch wel wat problemen hebben, maar de meeste dieren
hebben geen klachten. Dit roept de vraag op of de infectie bij paarden wel zo
schadelijk is.
Ondanks de boven genoemde onderzoeken die suggereren dat er wel degelijk een
hoge besmettingsgraad voorkomt bij paarden in endemische gebieden, zijn er
maar 14 eieruitscheiders gevonden. Het percentage in dit onderzoek ligt een stuk
20
lager als in de studies van Fischer et al., uit (1983), dit kan komen doordat er in
deze studie alleen maar natuurlijk geïnfecteerde dieren zijn bemonsterd, terwijl
er in de studie van Fischer et al., uit (1983) paarden op bewust geïnfecteerd land
zijn gezet.
Het lage percentage eieren uitscheidende dieren in dit onderzoek is deels te
verklaren doordat een F. hepatica infectie niet bij alle paarden tot een patente
infectie leidt door de weerstand die opgebouwd wordt voor deze infectie (Nansen
et al., 1975; Samson-Himmelstjerna, 2006). Deze weerstand opbouw is
leeftijdsafhankelijk. De studies van Nansen et al., uit (1975) en SamsonHimmelstjerna et al., uit (2006) tonen aan dat de infectie onder jonge paarden
veel frequenter voorkomt dan bij oudere dieren.
Als er naar de leeftijd gekeken wordt, in deze studie, is 50% onder de 3 jaar. De
geïnfecteerde dieren die niet tot deze leeftijdscategorie behoren zijn bijna
allemaal onder de 10 jaar oud. Wanneer de correlatie tussen de leeftijd en de ei
uitscheiding bekeken wordt is er te zien dat hoe hoger de leeftijd, hoe minder eiuitscheiders er te zien zijn. Dit kan verklaard worden door de leeftijdsweerstand
die opgebouwd wordt.
Een andere oorzaak voor het lage percentage positieven paarden kan de tijd van
het jaar zijn. Wanneer er naar de cyclus van F. hepatica gekeken wordt start deze
in het voorjaar wanneer de temperatuur stijgt. De gehele cyclus neemt gemiddeld
4-6 maanden in beslag. Vanaf eind augustus worden er door geïnfecteerde
eindgastheren eieren uitgescheiden op het land. De verschijnselen van een
infectie kunnen waargenomen worden in de zomer en in de herfst, wanneer er F.
hepatica in de lever aanwezig is. In de winter neemt het aantal infecties af,
doordat er geen opname plaats vindt van metacercariae (Andrews, 1999).
Een studie van Claxton et. al., uit (1997) geeft ook aan dat er in de winterperiode
minder ei-uitscheiding plaats vindt. Er is gekeken naar het aantal eieren wat
uitgescheiden werd in faeces van natuurlijk besmette runderen. Wanneer de
infectie druk op het land groot is, wat inhoud dat er veel metacercariae op het
land aanwezig zijn, is er een paar weken later een stijging te zien in de eiuitscheiding. Wanneer het aantal metacercariae, door dalende temperaturen, op
het land afneemt, daalt de infectie druk, er is dan een daling te zien van het
aantal uitgescheiden eieren (Andrews, 1999; Claxton et. al., 1997).
Dit onderzoek is gestart in november en liep tot half maart. In deze periode vindt
er geen of zeer weinig opname plaats van metacercariae. Wanneer dit onderzoek
in de herfst gedaan zou zijn, zouden er mogelijk meer positieven paarden
gevonden zijn.
Maar bij paarden worden voornamelijk chronische infecties gezien, dus dan is het
maar de vraag of er bij de aanwezigheid van vele metacercariae ook
daadwerkelijk meer eieren uitscheidende paarden gevonden waren (Nelis et. al.,
2010).
Bij herkauwers worden de eieren intermitterend met de gal uitgescheiden
(Andrews, 1999). Paarden hebben geen galblaas en de eieren worden dus niet
intermitterend uitgescheiden, dan kan er verwacht worden dat de eieren beter te
detecteren zijn dan bij herkauwers. Maar de eieren komen in het caecum en het
colon terecht, die een erg groot volume in beslag nemen. Daarbij is het zo dat er
een fermentatie proces plaatsvindt in deze darmdelen, dit kan ook wel eens van
invloed zijn op het aantal uitgescheiden eieren. Bij herkauwers vindt dit proces
namelijk plaats in de pens, en de eieren worden pas in het duodenum
uitgescheiden met de gal. Daarbij worden er, door geïnfecteerde paarden, maar
weinig eieren uitgescheiden bij een infectie (Nansen et. al., 1975). Dit alles bij
elkaar kan de reden zijn dat er nauwelijks eieren te detecteren zijn bij paarden.
Er is gekeken of er een correlatie is tussen het aantal uitgescheiden strongylus
type eieren en de OD-waarde. Er is een correlatie, maar alleen wanneer het
aantal strongylus type eieren bepaald werd met de sedimentatie flotatie methode.
21
Dit kan verklaard worden doordat de sedimentatie flotatie techniek een hogere ei
opbrengst geeft dan de EPG bepaling via de McMaster methode. Het lijkt erop dat
dieren die strongylus type eieren in de faeces uitscheidde ook een hogere ODwaarde hebben. Dit kan verklaard worden doordat er een kruisreactiviteit
optreedt. Een andere reden kan zijn dat dieren die besmet zijn met strongylus
type eieren gevoeliger zijn voor een F. hepatica infectie. Grelck et al., uit (1977)
laat zien dat dieren met hogere wormbesmetting en een slechte conditie eerder
met F. hepatica geïnfecteerd kunnen worden dan dieren in een goede conditie en
een laag aantal andere maagdarm parasieten. Hier speelt de immuniteitsstatus
van het dier een rol. Wanneer het dier in een wat slechtere conditie is, is de
immuniteit wat verlaagd, hierdoor kan een F. hepatica infectie sneller aanslaan
dan wanneer de immuniteit optimaal is (Grelck et. al. 1977).
Enzymen
Bij runderen en schapen blijken YGT en LDH wel degelijk een parameter voor het
vaststellen van een F. hepatica infectie. Bij paarden is bekend dat een stijging
van de enzymen YGT en LDH toe te schrijven zijn aan galweg problemen en
leverschade, maar het wil niet zeggen dat dit veroorzaakt wordt door een F.
hepatica infectie (Nelis, et al., 2010). Uit de resultaten van dit onderzoek kwam
niet naar voren dat alle geïnfecteerde dieren verhoogde leverwaarden hebben.
Zelfs een zeer ernstig geïnfecteerd paard met groeivertraging had nog waarden
die maar net buiten de referentiewaarden lagen (zie tabel 1). Het is dus de vraag
of de leverenzymen wel een betrouwbare parameter zijn voor de indicatie van F.
hepatica. De correlatie, die gevonden werd in deze studie, tussen het aantal
uitgescheiden eieren en de YGT waarde is 27%, dit lijkt erop dat YGT wel degelijk
een stijging laat zien bij F. hepatica geïnfecteerde paarden. De LDH waarde liet
geen correlatie zien, deze parameter blijkt in dit onderzoek niet te stijgen bij
geïnfecteerde dieren. Om meer te kunnen zeggen of de leverwaarden gebruikt
kunnen worden als parameter bij F. hepatica geïnfecteerde paarden moeten er
ook leverwaarden bepaald worden van niet geïnfecteerde paarden.
Het was mogelijk beter geweest als er ook naar andere parameters in het bloed
was gekeken. Totaal eiwit, eosinofielen en neutrofielen kunnen misschien
gebruikt worden als parameter bij een F. hepatica infectie.
Preventie
Om preventieve maatregelen te nemen tegen een F. hepatica infectie moet de
cyclus doorbroken worden. Dit kan op verschillende punten in de levenscyclus
(Fried et. al., 1977).
Voorkom opname van metacercariae. De galba truncatula is te vinden op drassige
plekken in de weide, dus langs de slootkant en langs greppels. De metacercariae
besmetten vooral op deze plaatsen het gras (Andrews, 1999). Er moet
voorkomen worden dat de dieren in de slootkant en langs greppels kunnen
grazen. Zorg dat de runderen en schapen waarmee ze op de weide staan
onderzocht zijn op F. hepatica en indien nodig behandeld. Zo scheiden ze geen
nieuwe eieren uit en zonder eieren kan de cyclus niet plaatsvinden. Schapen
kunnen het gehele jaar door behandeld worden, maar melkgevend rundvee mag
alleen in de droogstand behandeld worden. Dit maakt het wel lastig om het land
vrij te houden van eieren wanneer de runderen niet behandeld mogen worden.
Een ander manier om de cyclus te doorbreken is om de slakken stand zo laag
mogelijk te houden. Dit kan gerealiseerd worden door een droger weiland waar
de slakken slecht kunnen overleven. Door weinig vocht op het weiland zal er
minder algengroei zijn. Algen dienen als voedselbron voor de Galba truncatula,
wanneer algen niet aanwezig zijn zal de slakkenpopulatie afnemen (Nelis et al.,
2010). Zorg daarom voor een goed afwatersysteem, zodat er geen plassen
blijven staan op de weide. Dit is in Nederland in sommige gebieden moeilijk te
22
realiseren doordat er veel minder wordt drooggemalen om bv vermoerassing van
natuurgebieden te creëren.
Uit onderzoek blijkt dat een F. hepatica infectie eerder patent wordt wanneer het
dier ernstig besmet is met andere maagdarm parasieten (Grelck et. al. 1977).
Daarom moet er voorkomen worden dat paarden zwaar besmet worden, door
geregeld faeces onderzoek te laten doen om te achterhalen of ontwormen
noodzakelijk is.
Zoals aan het begin genoemd is kunnen ook hazen en konijnen besmet worden
met F. hepatica en kunnen de infectie in stand houden. Het beste is om de
wildstand zo laag mogelijk te houden op het land, maar dit is maar in een
bepaalde periode van het jaar toegestaan. Maar deze dieren hebben niet alleen
maar nadelen, deze dieren zorgen ook voor refugia op het land en dragen op
deze manier bij aan het voorkomen van triclabendazol resistentie (Walker et al.,
2010).
Wanneer weiland zeer zwaar geïnfecteerd is kan er beter voor gekozen worden
om het land eerst te hooien voordat er dieren op gezet worden (Kassai,1999). In
hooi en kuilgras treedt er namelijk sterfte op van de metacercariae (Andrews,
1999; Nelis et. al., 2010).
Acknowlekgements
Mijn dank gaat uit naar Drs. D.C.K. van Doorn voor de goede begeleiding en hulp
tijdens deze studie.
Ook gaat mijn dank uit naar Drs. B. Blankenstijn voor het opstellen van het zeef
en schud protocol.
23
Literatuurlijst
Reinemeyer, C.R., Courtney, C.H. (2001) Anticestodal and antitrematodal drugs
In: Veterinary pharmacology and therapeutics. Adams, H.R., Blackwell publishing
professional, Iowa, pp. 989
Andrews, S.J. (1999) The life cycle of Fasciola hepatica In: Fasciolosis. Dalton,
J.P. CAB International, Oxon. pp. 6-19, 228-229
Arosalo, B.M., Raekallio, M., Rajamäki, M., Holopainen, E., Kastevaara, T.,
Salonen, H., Sankari, S. (2007) Detecting early kidney damage in horses with
colic by measuring matrix metalloproteinase -9 and -2, other enzymes, urinary
glucose and total proteins. Acta Vet Scand., Vol 49: 4
Blowey, R.W. (2000) Rearing the diary heifer In: The health of dairy cattle.
Andrews, A.H., Blackwell Science Ltd, Oxford, pp.35
Bossaert, K., Farnir, F., Leclipteux, T., Protz, M., Lonneux, J.F., Losson, B. (2000)
Humoral immune response in calves to single-dose, trickle and challenge
infections with Fasciola hepatica. Veterinary Parasitology, Vol 87: 103-123
Braun, J.P., Benard, P., Burgat, V., Rico, A.G. (1983) Gamma Glutamyl
Transferase in domestic animals. Vet Res Commun. Vol 6: 77-90.
Brightling, A. (1988) Liver Fluke In: Sheep diseases. Brightling, A., Inkata Press,
Melbourne, pp. 80-82
Claxton, J.R., Zambrano, H., Ortiz, P., Amoros, C., Delgado, E., Escurra, E.,
Clarkson, M.J. (1997) The epidemiology of fasciolosis in the inter-Andean of
Cajamarca, Peru valley. Parasitology International, Vol 46: 281-288
Clery, D., Torgerson, P., Mulcahy, G. (1996) Immune responses of chronically
infected adult cattle to Fasciola hepatica. Veterinary Parasitology, Vol 62: 71-82
Coles, G., Stafford, K. (2010) Seroprevalence of Fasciola hepatica in dairy
herds. Veterinary Record, Vol 166: 765
Cornelissen, J.B.W.J., Gaasenbeek, C.P.H., Boersma, W., Borgsteede, F.H.M., van
Milligen, F.J. (1999) Use of a pre-selected epitope of cathepsin-L1 in a
highlyspecific peptide-based immunoassay for the diagnosis of Fasciola hepatica
infections in cattle. International Journal for Parasitology, Vol 29: 685-696
Donat, F., Ducos de Lahitte, J., Braun, J.P., Thouvenot, J.P., Krahe, B., Dorchin,
P. (1990). Variations biochimiques observées chez le poney après une infestation
expérimentale par Fascioloa hepatica. Revue de Médecine Vétérinaire, Vol 141 :
557-563
Espino, A.M., Marcet, R., Finlay, C.M. (1997) Fasciola hepatica: Detection of
antigenemia and coproantigens in experimentally infected rats. Experimental
Parasitolgy, Vol 85: 117–120
Espinoza, J.R., Timoteo, O., Herrera-Velit, P. (2005) Fas2-ELISA in the detection
of human infection by Fasciola hepatica. J Helminthol. Vol 79: 235-40.
Estuningsih, E., Spithill, T., Raadsma, H., Law, R., Adiwinata, G., Meeusen, E.,
Piedrafita, D. (2009) Development and application of a fecal antigen diagnostic
24
sandwich ELISA for estimating prevalence of Fasciola gigantica in cattle in central
Java, Indonesia. Journal of Parasitology, Vol 95: 450-455
Fairweather, I., Boray, J.C. 1999 Fasciolicides: efficacy, actions, resistance and its
management. The Veterinary Journal, Vol 158: 81-112
Ferre, I., Ortega-Mora, L.M., Rojo-Vazquez, F.A. (1997) Serum and bile antibody
responses (IgG and IgA) during subclinical Fasciola hepatica infection in sheep.
Veterinary Parasitology, Vol 68: 261-267
Fidin Repertorium. http://www.fidin.nl/273/Informatie-diergeneesmiddelen.html
Fischer, K., Stoye, M. (1983) Occurrence, importance and control of Fasciola
hepatica infections in horses. Fortschritte der Veterinarmedizin, Vol 37: 268-279
Gundlach, J.A. (1980) shaker mechanisme for a stack of sieve trays. United
states patent, pp 1-7
Haseeb, M.A., Fried, B. (1977) Modes of transmission of trematode infections and
their control. In: Trematode biology, Fried, B., Graczyk, T.K. CRC Press LLC, New
York, pp.32-40
Grelck von, H., Horchner, F., Wohrl, H. (1977) Zur experimentellen infektion des
pferdes mit Fasciola hepatica. Berl. Munch. Tierarztl. Wschr. Vol 90: 371-373
Gaasenbeek, C.P.H., Moll, L., Cornelissen, J.B.W.J., Vellema, P., Borgsteede,
F.H.M. 2001 An experimental study on triclabendazole resistance of Fasciola
hepatica in sheep. Veterinary Parasitology, Vol 95: 37-43
Gonzalo-Orden, M., Millan, L., Alvarez, M., Sanchez-Campos, S., Jimenez, R.,
Gonzalez-Gallego, J., Tunon, M.J. (2003) Diagnostic imaging in sheep hepatic
fascioliasis: ultrasound, computer tomography and magnetic resonance findings.
Parasitol Res, Vol 90: 359–364
Kaplan, R.M., Tyler, J.W. (2008) Fascioliasis (liver fluke) In: Blackwell’s fiveminute veterinary consult: ruminant. Haskell, S.R.R., Wiley-blackwell, Iowa, pp.
346-349
Kassai, T. (1999) Phylum: Platyhelminthes Flatworms In: Veterinary
helminthology, Kassai, T. Elsevier, Budapest, pp. 3-10
Laber von, G. (1971) Ein fall von chronischer Fasciolose beim pferd. Wien.
Tierarzte Mschr. Vol 85: 432-434
Mc. Cann, C.M., Bavlis, M., Williams, D.J.L. (2010) The development of linear
regression models using environmental variables to explain the spatial
distribution of Fasciola hepatica infection in dairy herds in England and Wales.
International Journal for Parasitology, Vol 40: 1021-1028
Mezo, M., González-Warleta, M., Castro-Hermida, J.A., Carro, C., Ubeira, F.M.
(2010) Kinetics of anti-Fasciola IgG antibodies in serum and milk from dairy cows
during lactation, and in serum from calves after feeding colostrum from infected
dams. Vet Parasitol. Vol 168: 36-44.
Moll, L., Gaasenbeek, C.P.H., Vellema, P., Borgsteede, F.H.M. 2000 Resistance of
Fasciola hepatica against triclabendazole in cattle and sheep in The Netherlands.
Veterinary Parasitology, Vol 91: Issues 1-2, 153-158
25
Munguía-Xóchihua, J.A., Ibarra-Velarde, F., Ducoing-Watty, A., MontenegroCristino, N., Quiroz-Romero, H. (2007) Prevalence of Fasciola hepatica (ELISA
and fecal analysis) in ruminants from a semi-desert area in the northwest of
Mexico. Parasitol Res, Vol 101: 127–130
Nansen, B. Andersen, S. Hesselholt, M. (1975) Experimental infection of the
horse with Fasciola hepatica. Experimental Parasitolgy, Vol. 37: 15-19
Nelis, H., Geurden, T., Deprez, P. (2010) Fasciola hepatica bij het paard. Vlaams
diergeneeskundig tijdschrift, Vol 79: 436-444
Ortiz, P.L., Claxton, J.R., Clarkson, M.J., McGarry, J., Wiliams, D.J.L. (2000) The
specificity of antibody responses in cattle naturally exposed to Fasciola hepatica.
Veterinary Parasitology, Vol 93: 121-134
Phiri, I.K., Phiri, A.M., Harrison, L.J.S. (2006) Serum antibody isotype responses
of Fasciola-infected sheep and cattle to excretory and secretory products of
Fasciola species. Veterinary Parasitology, Vol 141: 234–242
Piedrafita, D., Spithill, T.W., Smith, R.E., Raadsma, H.W. (2010) Improving
animal and human health through understanding liver fluke immunology. Parasite
Immunology, Vol 32, 572-581
Radostits, O.M., Gay, C.C., Blood, D.C., Hinchcliff, K.W. (1999) Diseases caused
by helminth parasites. In: Veterinary medicine a tekstbook of the diseases of
cattle, sheep, pigs, goats and horses. Radostits, O.M., Gay, C.C., Blood, D.C.,
Hinchcliff, K.W. Elsevier, Philadelphia, pp.1381
Salimi-Bejestani, M.R., McGarry, J.W., Felstead, S., Ortiz, P., Akca, A., Wiliams,
D.J.L. (2005) Development of an antibody-detection ELISA for Fasciola hepatica
and its evaluation against a commercially available test. Research in Veterinary
Science, Vol 78: 177-181
Samson-Himmelstjerna, G. (2006) Helminthosen der Equiden In:
Veterinarmedizinische parasitologie. Schnieder, T. Paray, Hannover, pp. 303-305
Taylor, F.G.R., Hillyer, M.H. (1997) H1:submission of samples and interpretation
of results, H2:liver diseases, H3: urinary diseases. In: Diagnostic techniques in
equine medicine. Taylor, F.G.R., Hillyer, M.H. Saunders company, Bristol, pp: 14,
73, 104-105
Thermo scientific pierces (2008) Assay development Technical handbook.
Thermo Fisher Scientific Inc. UK. Pp: 4-5
http://www.piercenet.com/files/16014567_AssayDevHB_Intl.pdf
Trawford, A., Mulugeta, G. (2008) Parasites. In: Professional handbook of the
donkey. Duncan, J., Emeritus, Whittet Books, Sidmouth UK, pp: 96
Trawford, A.F., Tremlett, J.G. (1996) Efficacy of triclabendazol against Fasciola
hepatica in the donkey (Equus asinus). Veterinary record Vol 139: 142-143
Wintzer, H.J. (1999) Krankheiten des verdauungsapparates In: Krankheiten des
pferdes. Wintzer, H.J., Kraft, W. Blackwell Wissenschafts-Verlag, Berlin, pp. 229
26
Bijlage 1
McMaster protocol
Benodigdheden












Snelweger, die minstens tot 0.1 g nauwkeurig kan afwegen
Spatel
Dispensor met verzadigde NaCl oplossing (dichtheid ca 1,17-1,20 g/cm3;
360 g NaCl op 1 l water)
Opm.: Sommigen gebruiken ook wel een verzadigde suikeroplossing.
Suiker is erg plakkerig en wordt daarom niet standaard aangeraden. De
dichtheid van een verzadigde NaCl suspensie is bovendien bij grazers
doorgaans voldoende om de meeste relevante ei-typen te kunnen vinden,
met uitzondering van leverboteieren.
Afsluitbare plastic container van ca 30 ml of vergelijkbaar alternatief
Mortier met vijzel
Falconbuis van 50 ml die op tafel gezet kan worden, met schroefdop
Cylinder of bakje met voldoende doorsnede en inhoud om daarboven een
faecessuspensie te zeven
Cylinder en grove zeef (ca 3 mm maaswijdte)
Pasteurse pipet
McMaster telkamer
Microscoop met een vergroting van ca 40x (6,3 x 6,3; 4 x 10) tot 100x
Biechtteller (om tellen van de eieren makkelijker te maken, maar het kan
ook zonder)
Uitvoering










Weeg 3 gram faeces af in een falconbuis
Doe vanuit dispensor 42 ml verzadigde NaCl in de 50 ml falconbuis.
Zwenk langurig, niet schudden dan komen er erg veel luchtbellen in.
Giet inhoud mortier over zeef in cylinder of bakje. Pers met stamper
voorzichtig de vloeistof uit faecesmassa op zeef.
Giet inhoud cylinder of bakje terug in falconbuis.
Sluit falconbuis goed af, zwenk stevig, zodanig dat de buis steeds
ondersteboven en weer terug gaat. Eventueel aanwezige eieren worden zo
homogeen verdeeld over de gehele inhoud.
Verwijder dop, zuig pasteurse pipet vol uit midden van falconbuis en vul
compartiment van de McMaster telkamer. Werk zo snel mogelijk.
Sluit falconbuis opnieuw af, schud opnieuw en vul tweede compartiment.
Leg telkamer bij microscoop en wacht enkele minuten (eieren moeten
gaan drijven) voor met kleine vergroting gedifferentieerde eitelling gedaan
wordt. Hierbij scherp stellen op lijnen van het kader of op de altijd
aanwezig zijnde luchtbelletjes. Onder het kader of raster is het volume
0,15 ml.
Bereken het EPG door het aantal getelde eieren, uit beide kamers, met 50
te vermenigvuldigen.
27
Bijlage 2
Zeef en schud methode protocol
Benodigdheden







Weegschaal
Plastic maatbeker van 500 ml
Zeef- en schudapparaat met metalen zeven met doorlaatdiameters van
2000-, 1000-, 300-, 160-, 90- en 63 µm als onderste opvangzeef
Apparaat is aangesloten op kw. Kraan en afvoerspoelblok.
Centrifuge
Spatel, centrifugebuisjes (volume 12 ml), voorwerpglaasjes, dekglaasjes
18x18 mm, microscoop
Afvalcontainer
Uitvoering















Stapelvolgorde van de zeven van boven naar beneden; 2000- en 1000 µm
(alleen nodig bij paardenmest met resp. 50 en 40 gram mest), dan de
300-, 160-, 90 µm en de 63 µm als onderste opvang/verzamelzeef.
Suspendeer max. 50 gram paardenmest in circa 150 ml water.
De verkregen suspensie uitgieten over de bovenste zeef van het
schudapparaat.
De watertoevoerkop bovenop plaatsen en de moeren stevig aandraaien,
een doek over de kop hangen i.v.m. eventueel lekkage.
Op de waterkraan, zet het apparaat aan op schudstand 8-10 en stel timer
in op 10 min.
Na 10 min. Kraan dichtdraaien maar het apparaat pas uitzetten als er
geen waterdoorloop meer zichtbaar is in de doorzichtige afvoerslang.
Alle zeven, behalve de onderste 63 µm, leegkloppen in afvalcontainer of
wandspoelblok, daarna goed uitspoelen met heet water en zonder de
rubberen afdichtringen in de vaatbak doen. NB. De 63 µm is kwetsbaar!
De inhoud van de onderste zeef m.b.v. een koude kraanwaterstraal
voorzichtig overbrengen in een 500 ml maatbeker en deze al
rondmengend uitgieten over twee centrifugebuisjes, buitenkanten
afspoelen en in centrifuge plaatsen.
1 min. Centrifugeren bij 3000 g (ca. 4000. r.p.m.) om sedimenten te
verkrijgen.
Hierna het supernatant afgieten.
Buisjes aanvullen met suikeroplossing met een dichtheid van 1.3 g/m 3 en
mengen op vortex, daarna verder aanvullen tot net onder de bovenrand
en terug plaatsen in de centrifuge.
M.b.v. een druppelflesje met suiker oplossing buisje voorzichtig aanvullen
tot een bollen meniscus net zichtbaar wordt, hierop een dekglaasje
leggen, het glaasje zuigt zich nu vast (voorkom luchtbellen).
Wederom centrifugeren maar nu 3 min. bij 3000 g (ca. 4000. r.p.m.).
Dekglaasjes rechtstandig (horizontaal) overbrengen naar een
voorwerpglaasje.
Voorwerpglaasje bekijken onder microscoop, vergroting van ca. 50-125 x
volstaat. Zoek naar de goudgele Fasciola eieren.
De uitslag luidt altijd:
Verzamel-zeefmethode was positief of negatief t.a.v. lintworm- / leverbot /
etc. eieren.
28
Bijlage 3
Enquête eigenaren geïnfecteerde paarden
Dier nummer: 156 (Silas)
Leeftijd: 2 jaar
Klachten
Vacht: g.b.
Groei: goed, zeer goede bespiering voor een 2 jarige
Lichaamsconditie: goed
Werklust: doet nog niets, maar is actief genoeg, in de weide is hij altijd
aan het spelen met de ander dieren, hij lijkt dan onvermoeidbaar.
Infecties (mok/verbranding op de neus): geen
Voedselopname: goed
Mest: goed
Wat voor weide (sloten eromheen, greppels, schapen/runderen erop):
om het hele perceel zijn sloten aanwezig, ook zijn er greppels in de weide. Geen
schapen en runderen op de weide.
Hoeveel weidegenoten: 3
Waar komt het dier vandaan/geschiedenis: geboren op dit bedrijf
Runderen/schapen/geschiedenis bedrijf: nee, 4-5 jaar geleden liepen er wel
schapen en runderen, maar daarna nooit meer. Nu alleen nog maar paarden.
Behandeling runderen/schapen tegen F. hepatica: n.v.t.
Dier nummer: 77 (Voita)
Leeftijd: 2 jaar
Klachten
Vacht: g.b. staat 24/7 buiten, dus heeft een hele dikke vacht
Groei: g.b.
Lichaamsconditie: ernstig overgewicht
Werklust: stapt af en toe aan de hand, heeft niet altijd even veel zin. Kan
soms sloom zijn.
Infecties (mok/verbranding op de neus): heeft paar maanden
geleden cyatostominose gehad. Is toen behandeld met ivermectine/moxidectine
combi preparaat. Paard hoest nu wel.
Voedselopname: zeer goed, eet altijd en alles lust hij.
Mest: g.b.
Wat voor weide (sloten eromheen, greppels, schapen/runderen erop): Op
een weide die omringt wordt door sloten en de greppels bevat die bijna altijd vol
staan met water
Hoeveel weidegenoten: staat samen in de weide met Moos (diernr: 75),
Touran (diernr: 73), Kolfaxi (diernr: 74) en Calim (diernr: 76).
Bij de ander 4 dieren heb ik geen F. hepatica eieren in de faeces kunnen vinden.
Touran en Moos liepen op moment van mestname in dezelfde stal als voita, maar
gezien de leverwaarde, lijkt het erop dat de mest bij Voita hoort.
Moos is twee weken geleden naar de kliniek gegaan waar er een compleet
bloedbeeld gedaan is: leverwaarden waren goed, alleen iets verhoogde waarden
die duidden op een parasitaire infectie (B globuline of eo’s? eigenaar wist het
niet). Moos is ook getest op cuching, deze test was negatief.
29
Gezien het bovenstaande verhaal zou het dan moeten gaan om Touran of Voita,
gezien de bloedwaarden lijkt het er op dat het om Voita gaat. Touran heeft gaan
verhoogde GGT.
Van calim is er geen mest.
Waar komt het dier vandaan/geschiedenis: eind juni 2010 gekomen op dit
bedrijf
Runderen/schapen/geschiedenis bedrijf: geen herkauwers op dit bedrijf, wel
heeft dit groepje paarden vorig jaar achter een groep runderen aan gegraasd. Het
bedrijf is op de marienwaerd, hier komen veel reeën voor, deze kunnen ook de
cyclus in stand houden.
Behandeling runderen/schapen tegen F. hepatica: niet van toepassing hier,
de behandeling van de runderen is onbekend bij de eigenaar.
Diernummer: 31 (Dunja) en 30 (Zoe)
Leeftijd: 3 en 6 jaar oud
Klachten
Vacht: g.b.
Groei: Dunja blijft achter in groei
Lichaamsconditie: g.b.
Werklust: g.b.
Infecties (mok/verbranding op de neus): geen
Voedselopname: Dunja eet erg veel, eet ook veel stro
Mest: g.b.
Wat voor weide (sloten eromheen, greppels, schapen/runderen erop): De
paarden hebben beschikking over 2 weitjes. Er zitten greppels in. Geen schapen,
af en toe lopen er runderen.
Hoeveel weidegenoten: 2
Waar komt het dier vandaan/geschiedenis: Zoe onbekend, Dunja is geboren
op dit bedrijf.
Runderen/schapen/geschiedenis bedrijf: Runderbedrijf, geen schapen.
Runderen gaan in de herfst naar binnen. Hebben in principe eigen weides.
Behandeling runderen/schapen tegen F. hepatica: In de droogstand worden
de runderen standaard behandeld met Fasinex.
Diernummer: 32 (Sunlight)
Leeftijd: 11 jaar
Klachten
Vacht: slecht in de vacht, lange openstaande vacht. Paard is geschoren.
Groei: Is al een half jaar mager, ze voeren hem flink bij, maar wil maar
niet aankomen.
Lichaamsconditie: mager, ribben zijn te voelen. 2 uit 5
Werklust: slecht, is snel moe bij arbeid.
Infecties (mok/verbranding op de neus): geen
Voedselopname: goed, maar waarschijnlijk een slecht gebit, waardoor
die het voedsel niet optimaal kan benutten. De F. hepatica infectie speelt een rol,
maar ook zeker het gebit.
Mest: g.b.
30
Wat voor weide (sloten eromheen, greppels, schapen/runderen erop): de
helft van het perceel wordt omgeven door een sloot. Af en toe staan er runderen
op.
Hoeveel weidegenoten: 1 shetlander (diernr: 33), die negatief was.
Waar komt het dier vandaan/geschiedenis: 2 jaar geleden aangekocht.
Runderen/schapen/geschiedenis bedrijf: Rundveebedrijf en enkele schapen.
Behandeling runderen/schapen tegen F. hepatica: standaard in de
droogstand. De schapen worden ook behandeld met Fasinex.
Diernummer: 6 (Bont1), 5 (Bont2), 7 (Floraidh), 60 (Neejan), 228 (Megan)
Leeftijd: 3, 2, 15, 7, 9
Klachten
Vacht: alle dieren zien er goed uit, geen afwijkingen in de vacht
Groei: g.b. Ook de jonge dieren blijven niet achter in groei
Lichaamsconditie: goed, ze zijn niet mager
Werklust: ze zijn alle actief en eigenaar merkt niets aan het dier qua
conditie
Infecties (mok/verbranding op de neus): Heeft eigenaar nooit gezien
Voedselopname: g.b.
Mest: g.b. vast mooie keutels
Wat voor weide (sloten eromheen, greppels, schapen/runderen erop): De
weide is nat, rondom omringt door sloten, ook zijn er greppels aanwezig. Vroeger
is dit een runderbedrijf geweest, nu is het een grote pension stal. Er staan nog
wel enkele vleeskalveren op het bedrijf, maar die lopen niet op de grote
paardenweides.
Hoeveel weidegenoten: de paarden staan met vele op de weide, ze hebben
niet allemaal een eigen stukje land.
Waar komt het dier vandaan/geschiedenis: Bont 1 en Bont2 zijn op de
markt gekocht en worden opgefokt en ingereden en weer verkocht, herkomst is
onbekend. De ander dieren staan al jaren op dit bedrijf.
Runderen/schapen/geschiedenis bedrijf: Jaren geleden is dit een
runderbedrijf geweest
Behandeling runderen/schapen tegen F. hepatica: De kalveren worden
weleens behandeld.
Diernummer: 169 (Hilgona), 165 (shet bont) en 166 (shet zwart)
Leeftijd: 22, 7, 1
Klachten:
Vacht: g.b.
Groei: goed
Lichaamsconditie: goed
Werklust: werken niet, Hilgona is drachtig. Maar eigenaar vindt ze niet
sloom.
Infecties (mok/verbranding op de neus): niet
Voedselopname: goed
Mest: niet afwijkend
31
Wat voor weide (sloten eromheen, greppels, schapen/runderen erop): De
weides zijn omringt door sloten en er zijn greppels, waar meestal water in staat.
De paarden staan op een runderbedrijf, de paarden lopen ook op de weide waar
de runderen ook lopen.
Hoeveel weidegenoten: 6 andere paarden die er ook op lopen
Waar komt het dier vandaan/geschiedenis: Hilgona is aangekocht als jong
dier en de bonte shet ook, de zwarte shet is het veulen van de bonte.
Runderen/schapen/geschiedenis bedrijf: Runderbedrijf
Behandeling runderen/schapen tegen F. hepatica: Standaard in de
droogstand.
Diernummer: 209 (Pocahontas)
Leeftijd: 14
Klachten:
Vacht: g.b.
Groei: goed
Lichaamsconditie: goed
Werklust: Het lijkt erop dat die toch niet helemaal lekker in zijn vel zit.
Paard is niet sloom, maar in de wedstrijden heeft die het beter gedaan.
Infecties (mok/verbranding op de neus): niet
Voedselopname: goed
Mest: niet afwijkend
Wat voor weide (sloten eromheen, greppels, schapen/runderen erop): De
weides zijn omringt door sloten en er zijn greppels, waar meestal water in staat.
De paarden staan op een runderbedrijf, de paarden lopen ook op de weide waar
de runderen ook lopen.
Hoeveel weidegenoten: 4 andere paarden die er ook op lopen
Waar komt het dier vandaan/geschiedenis: aangekocht en gebruikt als
fokmerrie en komt op wedstrijden uit.
Runderen/schapen/geschiedenis bedrijf: Runderbedrijf en enkele schapen
Behandeling runderen/schapen tegen F. hepatica: Standaard in de
droogstand.
32
Bijlage 4
Resultaten feces onderzoek
Dier
nummer
1-3
4-11, 60-63,
211-230
12-15
16
17-21
Plaats
Stal
Castricum
Castricum
Stal A
Stal B
F. hepatica eieren
uitscheidende dieren
5-7, 60, 228
Castricum
Castricum
Castricum
Stal C
Stal D
Stal E
-
163, 164
165-170
171
172, 183-185
173
174
175
176-178
179, 208-210
180-182
186, 187
188-207
22
23, 27
24
25
26
28, 29
Meerkerk
Meerkerk
Meerkerk
Meerkerk
Meerkerk
Meerkerk
Meerkerk
Meerkerk
Meerkerk
Meerkerk
Meerkerk
Meerkerk
Meerkerk
Meerkerk
Meerkerk
Meerkerk
Meerkerk
Meerkerk
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
P
Q
R
165, 166, 169
209
-
30, 31
32, 33
34
35, 36
37-41
42-59, 73-77,
156
Meteren
Meteren
Meteren
Meteren
Meteren
Meteren
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
A
B
C
D
E
F
30, 31
32
77, 156
157, 158
159
119-125
126-130
131
Utrecht
Utrecht
Utrecht
Utrecht
Utrecht
Stal
Stal
Stal
Stal
Stal
A
B
C
D
E
-
160-162
132-138
139-155
Hoornaar
Hoornaar
Hoornaar
Stal A
Stal B
Stal C
-
118
Bodegraven
Stal A
-
72
78-117
Woerden
Woerden
Stal A
Stal B
-
64-71
Onbekend
-
33
(slachthuis)
34
Bijlage 5
Resultaten ELISA test
De geelgekleurde nummers zijn F. hepatica eieren uitscheidende dieren.
1ste OD
Diernummer waarde
2de OD waarde
F. hepatica
eieren
Gem. OD
waarde
1
0,636
0,669
0
0,653
2
0,461
0,475
0
0,468
3
0,361
0,414
0
0,388
4
1,136
1,16
0
1,148
5
0,659
0,661
67
0,660
6
0,648
0,64
67
0,644
7
1,057
1,083
15
1,070
8
1,021
1,06
0
1,041
9
0,454
0,45
0
0,452
10
1,453
1,455
0
1,454
11
1,283
1,249
0
1,266
12
0,662
0,649
0
0,656
13
0,305
0,301
0
0,303
14
0,655
0,659
0
0,657
15
0,353
0,379
0
0,366
16
0,924
0,911
0
0,918
17
0,477
0,489
0
0,483
18
1,555
1,389
0
1,472
19
0,493
0,511
0
0,502
20
0,901
0,912
0
0,907
21
0,735
0,758
0
0,747
22
0,616
0,658
0
0,637
23
0,377
0,385
0
0,381
24
0,811
0,816
0
0,814
25
0,381
0,369
0
0,375
26
0,604
0,606
0
0,605
27
0,398
0,429
0
0,414
28
0,374
0,425
0
0,400
29
0,531
0,552
0
0,542
30
0,859
0,877
3
0,868
31
0,95
1,032
64
0,991
32
0,3
0,305
2
0,303
33
1,141
1,232
0
1,187
34
0,348
0,401
0
0,375
35
1,25
1,404
0
1,327
36
1,03
1,08
0
1,055
37
0,517
0,575
0
0,546
38
0,486
0,558
0
0,522
35
39
0,786
0,827
0
0,807
40
0,477
0,552
0
0,515
41
0,621
0,673
0
0,647
42
0,896
0,9
0
0,898
43
0,877
0
0,877
44
0,732
0
0,732
45
0,615
0
0,615
46
1,074
1,246
0
1,160
47
0,595
0,733
0
0,664
48
0,59
0,65
0
0,620
49
0,702
0,804
0
0,753
50
0,68
0,818
0
0,749
51
0,989
1,188
0
1,089
52
0,947
1,022
0
0,985
53
0,6
0,763
0
0,682
54
0,621
0,649
0
0,635
55
1,01
1,092
0
1,051
56
0,554
0,631
0
0,593
57
0,729
0,796
0
0,763
58
0,556
0,585
0
0,571
59
0,765
0,919
0
0,842
60
0,448
0,48
5
0,464
61
1,104
1,104
0
1,104
62
0,604
0,726
0
0,665
63
1,375
1,54
0
1,458
64
1,281
1,245
0
1,263
65
0,321
0,398
0
0,360
66
1,129
1,205
0
1,167
67
0,352
0,468
0
0,410
68
0,969
1,445
0
1,207
69
0,597
0,558
0
0,578
70
0,748
0,781
0
0,765
71
0,483
0,467
0
0,475
72
0,328
0,411
0
0,370
73
0,418
0,488
0
0,453
74
0,759
0,827
0
0,793
75
0,899
1,046
0
0,973
76
1,202
1,289
0
1,246
77
0,759
0,865
27
0,812
78
0,346
0,239
0
0,293
79
0,626
0,475
0
0,551
80
0,61
0,505
0
0,558
81
0,955
1,02
0
0,988
82
0,28
0,413
0
0,347
36
83
0,362
0,372
0
0,367
84
0,565
0,488
0
0,527
85
0,442
0,664
0
0,553
86
0,637
0,724
0
0,681
87
0,685
0,711
0
0,698
88
0,813
0,867
0
0,840
89
0,51
0,483
0
0,497
90
0,569
0,626
0
0,598
91
0,486
0,515
0
0,501
92
0,718
0,454
0
0,586
93
0,478
0,492
0
0,485
94
0,758
0,772
0
0,765
95
0,389
0,409
0
0,399
96
0,484
0,534
0
0,509
97
0,669
0,74
0
0,705
98
0,975
1,057
0
1,016
99
0,738
0,877
0
0,808
100
0,406
0,446
0
0,426
101
1,114
1,256
0
1,185
102
0,379
0,47
0
0,425
103
0,722
0,821
0
0,772
104
0,449
0,534
0
0,492
105
0,535
0,591
0
0,563
106
0,334
0,443
0
0,389
107
0,818
0,807
0
0,813
108
0,911
0,925
0
0,918
109
0,637
0,796
0
0,717
110
1,051
1,208
0
1,130
111
0,581
0,697
0
0,639
112
0,632
0,705
0
0,669
113
0,405
0,418
0
0,412
114
1,088
1,101
0
1,095
115
0,594
0,667
0
0,631
116
1,125
1,139
0
1,132
117
0,883
0,983
0
0,933
118
1,031
1,103
0
1,067
119
0,861
0,973
0
0,917
120
0,47
0,485
0
0,478
121
1,57
1,375
0
1,473
122
1,368
1,364
0
1,366
123
0,854
0,833
0
0,844
124
0,664
0,669
0
0,667
125
0,592
0,616
0
0,604
126
0,614
0,782
0
0,698
37
127
0,49
0,536
0
0,342
128
0,422
0,41
0
0,277
129
0,515
0,557
0
0,357
130
0,531
0,586
0
0,372
131
0,617
0,652
0
0,423
132
0,7
0,671
0
0,457
133
0,526
0,563
0
0,363
134
0,704
0,739
0
0,481
135
0,846
0,889
0
0,578
136
0,978
1,033
0
0,670
137
0,718
0,714
0
0,477
138
0,614
0,619
0
0,411
139
0,444
0,511
0
0,318
140
0,512
0,539
0
0,350
141
0,192
0,226
0
0,139
142
0,199
0,255
0
0,151
143
0,427
0,54
0
0,322
144
0,259
0,275
0
0,178
145
0,583
0,726
0
0,436
146
0,293
0,322
0
0,205
147
0,34
0,39
0
0,243
148
0,34
0,4
0
0,247
149
0,389
0,403
0
0,264
150
0,251
0,314
0
0,188
151
0,259
0,322
0
0,194
152
0,421
0,499
0
0,307
153
0,444
0,484
0
0,309
154
0,271
0,314
0
0,195
155
0,275
0,3
0
0,192
156
0,88
0,941
3
1,607
38