Dit is de toets van 19-09-1997

Toets Biologische Chemie Biochemiedeel (BIC 10304), 27 februari 2003
Begin met het invullen van je naam en registratienummer op het antwoordformulier. De eerste tien vragen
dienen met juist/onjuist beantwoord te worden. Bij de resterende vier vragen moet één antwoord worden
ingevuld. Rond pas aan het eind van de berekening af.
Veel succes!
Algemene opmerking: bij de extinctiemetingen is steeds gebruik gemaakt van cuvetten met een lichtweg
van 1 cm.
1.
Men heeft de kristalstructuur van lactaat dehydrogenase met behulp van het programma Swiss PDB
viewer bestudeerd. De kristallen waren gemaakt in af- en aanwezigheid van NADH en oxamaat.
Door het vergelijken van structuren met en zonder oxamaat en NADH is het mogelijk de opbouw van
het katalytisch centrum te bestuderen.
2.
Bij de in vivo fluorescentie meting van gistcellen wordt de oscillatie in de NADH fluorescentie
veroorzaakt door een wisselende snelheid van de glycolyse.
3.
Om een zuurstofelectrode te ijken is het voldoende als men de temperatuur en de luchtdruk weet.
4.
Na het uitvoeren van SDS-gel electroforese is het niet meer mogelijk de activiteit van een enzym in
de gel te meten.
5.
Als bij een extinctiemeting 65% van de lichtintensiteit van de lichtbundel geabsorbeerd wordt, meet
men een extinctie van 0.456 (=c). De wet van Lambert-Beer is: Ibl/Im = 10c.
6.
Bij het uitrekenen van de bindingsconstante van NADH aan LDH besluit een 'slimme' student niet de
laatste waarde van de titratie te gebruiken om de relatie fluorescentie-toename door binding en de
concentratie van het NADH-LDH complex uit te rekenen. Hij neemt een waarde die iets groter is.
Zijn argument is dat er bij de laatste waarde 55.54 μM LDH aanwezig is, dat is wel veel ten opzichte
van de 4 µM NADH, maar dit betekent niet dat alle NADH dan ook gebonden is. Dit is pas het geval
bij een oneindige LDH concentratie. Is dit een slimme student, ja (juist) of nee (onjuist)?
7.
De GOT activiteit wordt gemeten door de NADH oxidatie door oxaloacetaat te volgen met aspartaat
en α-ketoglutaraat.
aspartaat + α-ketoglutaraat (GOT)
oxaloacetaat + glutamaat
oxaloacetaat + NADH (MDH)
malaat + NAD+.
De GOT meting is uitvoerd met 12 units malaat dehydrogenase en er wordt berekend dat er 12 units
GOT in het cuvet aanwezig moeten zijn geweest. Is deze meting meting van de activiteit van GOT in
het serum juist geweest of niet?
8.
Het isoelectrisch punt van een eiwit is pH afhankelijk.
9.
In een isoelectrisch focusseringsexperiment worden met behulp van een pH gradient in de gel
isoenzymen van elkaar scheiden op basis van verschillen in pI.
10. De onderdelen van een werkzame spectrofotometer staan in de juiste volgorde: lamp,
monochromator, fotomultiplier, cuvettenhouder met eventuele filters, logaritmische versterker en
recorder of afleeseenheid.
11.
De activiteit van lactaat dehydrogenase is gemeten. De resultaten van deze meting staan op de
recorderrol. De volgende toevoegingen zijn gedaan. 1 ml fosfaatbuffer (Pi), 0.01 ml 10 mM oxamaat. Met
set ref is de uitlezing van de spectrofotometer op nul gezet. 0.01 ml 10 mM NADH is toegevoegd, daarna
is 0.01 ml 0.25 mg/ml LDH toegevoegd. Nog steeds geen activiteit. Na het toevoegen van 0.01 ml 10 mM
pyruvaat wordt er een afname van de NADH concentratie waargenomen. Let op het volume van het cuvet
is geen 1 ml. De raaklijn aan de curve is reeds getrokken.
Gevraagd wordt de activiteit van LDH in mol . s-1. mg LDH-1 onder bovenstaande condities uit te
rekenen. De recorderuitslag van 0 naar 100 komt overeen met een extinctieverschil van 1. 1 cm komt
overeen met 1 minuut. Dit is de afstand tussen twee lijnen die op afstanden van 1 min van links naar
rechts getrokken zijn (het figuur is verkleind ten opzichte van de echte recorderrol). De molaire extinctie
coefficient van NADH is 6300 M-1.cm-1.
12. De activiteit van het reporter-enzym ß-glucuronidase wordt in een transgene plant gemeten. Het
enzym katalyseert (o.a.) de volgende omzetting:
4-methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide + H2O
4-methylumbelliferon + D-glucuronzuur
Onder de gegeven proefomstandigheden (pH=8.5) is 4-methylumbelliferon de enige stof in bovenstaande
reactievergelijking, die fluorescentie vertoont.
- Het extract is gemaakt door 15 mg plantmateriaal fijn te wrijven in extractie-buffer. Het extract had
een volume van 120 μl.
- Het toevoegen van 10 μl van het extract aan reactiebuffer met 1 mM MUG (het volume was 1.13 ml),
leidde tot een uitslag van 39 schaaldelen in 4 minuten.
- Om de juiste waarde aan de fluorescentie te kunnen toekennen, werd de fluorescentie van een 4methylumbelliferon (MUB) oplossing bepaald. 10 μl van een 10 μM MUB oplossing werd
toegevoegd aan reactiebuffer met 10 µl extract. Het volume werd door de MUB toevoeging 1.0 ml.
Deze toevoeging gaf een uitslag van 59 schaaldelen. Het bladextract quenchte de fluorescentie niet.
Gevraagd: Bereken de specifieke enzymactiviteit uitgedrukt in pmol.min-1.mg plantmateriaal -1.
Eén pmol=10-12 mol.
13) Men heeft een GOT en GPT activiteitsbepaling uitgevoerd.
De GOT activiteitsmeting, vastgelegd via de afname van de NADH concentratie, gaf een afname
van de extinctie bij 340 nm van 0.35 per 2.5 minuten te zien. De GOT meting was uitgevoerd met
0.23 ml serum dat voor de meting vijf maal verdund was. Het totale volume van het cuvet tijdens de
meting was 1.115 ml.
De molaire extinctie coëfficiënt van NADH bij 340 nm is 6300 M-1.cm-1.
Bereken de GOT activiteit in mol per min per liter onverdund serum.
Er is een ELISA bepaling
uitgevoerd. De experimenten
2.5
waarbij de titer van het
antilichaampreparaat werd bepaald
2
gaven aan dat een verdunning van
1.5
105 maal goede extinctie waarden
gaf. Deze
1
antilichaamverdunningen zijn bij
de bepaling van het antigeen in het
0.5
weefselpreparaat ook gebruikt. 2.5
l biotine-Ag en 100 l Ag van de
0
aangegeven verdunningen zijn
0.00E+00 5.00E+02 1.00E+03 1.50E+03 2.00E+03 2.50E+03 3.00E+03
gebruikt bij het bepalen van de
pg/100 ul
ijklijn. Het onverdunde
antigeenpreparaat bevat 1 mg/ml
antigeen. De resultaten van de uitgevoerde ijking staan in de grafiek.
extinctie
14)
Vervolgens zijn de onderstaande verdunningen van het weefselpreparaat de extincties gemeten en via de
ijklijn zijn de aangegeven pg per 100 l gevonden.
Verdunning
3200 x
3200 x
3200 x
3200 x
6400 x
6400 x
6400 x
6400 x
Extinctie
0.562
0.548
0.608
0.676
1.171
1.198
1.166
1.179
pg/100 l
1152.07
1161.32
1078.04
976.25
550.59
541.33
551.33
545.96
Bereken de hoeveelheid antigeen in het onverdunde weefselpreparaat. Je moet ook de eenheden aangeven.
Bijvoorbeeld pg/ml of ng/ml.
Antwoordenformulier Toets Biologische Chemie Biochemie deel 27 februari 2003
Naam
Registratienummer
Handtekening
:
:
:
Maak per vraag slechts een vakje zwart! Als je je antwoord wilt toelichten mag dat.
1)
O
juist
O
onjuist
2)
O
juist
O
onjuist
3)
O
juist
O
onjuist
4)
O
juist
O
onjuist
5)
O
juist
O
onjuist
6)
O
juist
O
onjuist
7)
O
juist
O
onjuist
8)
O
juist
O
onjuist
9)
O
juist
O
onjuist
10)
O
juist
O
onjuist
11)
De activiteit van LDH is
mol . s-1. mg LDH-1
12)
De specifieke enzymactiviteit is
pmol.min-1.mg plantmateriaal -1.
13)
De GOT activiteit is
mol. min-1. l-1
14)
De concentratie antigeen in het onverdunde preparaat is
?g / ml
Uitwerking 27 februari 2003. Opmerkingen over de ja/nee vragen:
1
2
3
4
5
6
7
8.
9
10.
Juist, de structuur van een enzym wordt in veel gevallen veranderd door de binding van coenzymen en
substraten en producten. Zie de structuur van LDH1 en LDH2 (Computer Graphics)
Juist. Bij de overganf van een aeroob naar een anaeroob metabolisme wordt de snelheid van de glycolyse
door veranderende ATP concentraties versneld en afgeremd.
De oplosbaarheid van zuurstof hangt af van de temperatuur en druk.
SDS denatureert eiwitten. Hierdoor verliezen de enzymen hun biologische activiteit.
Deze vraag is juist. 65% absorptie betekent dat er 35% van het licht over is ten opzichte van de hoeveelheid
licht die bij de blanco-meting de fotomultiplier bereikt. Deze waarde is 100%. In formules uitgedrukt wordt
het verhaal: Log (Ibl/Im) = c = extinctie. Log (Ibl/0.35Ibl) = log 2.857 = 0.456.
Dit is juist. Pas bij een oneindige concentratie LDH is alle NADH gebonden. Men moet dus zeker een
waarde iets boven de laatste waarde van de titratie kiezen.
De gemeten activiteit is gelijk aan de units van het detectie-enzym. De GOT activiteit kan dus hoger zijn.
Het is geen goede meting. Je moet het preparaat tenminste twee keer verdunnen.
Onjuist. De overall lading van een eiwit is pH afhankelijk niet de pI die wordt door de chemische
samenstelling (aminozuren) bepaald.
Via de electrische spanning wordt een pH gradiënt gevormd en worden enzymen op basis van hun pI's in de
pH gradiënt in de gel gescheiden. Nadat alle eiwitten op hun pI zijn aangekomen bewegen ze niet meer en
wordt er op activiteit gedetecteerd.
De fotomultiplier moet achter het cuvet aanwezig zijn om de lichtintensiteit na absorptie te kunnen
detecteren.
Summiere uitwerking berekeningen
11
(0.75/6.3*60)*1.04/0.0025 = 0.825 mol.s-1.mg-1 LDH. Het getal 0.793 is fout omdat men dan 1.04 ml is
vergeten.
Als men 1 cm in het figuur heeft uitgemeten dan is de A/min(cm) 0.75/0.8=0.938/min
(0.938/6.3*60)*1.04/0.0025 = 1.032 mol.s-1.mg-1 LDH. Het getal 0.992 is fout omdat men dan 1.04 ml is
vergeten.
12
Ijking: 59 sd ~ 10*10/1000 = 0.1 μM MUB; 1 sd ~ 1.6949 nM
Activiteit: 39/4*1.6949 = 16.525 nM; per cuvet dus 16.525*1.13 = 18.674 pmol/min MUB gevormd.
In het cuvet zat 10/120*15 mg plantmateriaal. De gevraagde activiteit is 14.939 pmol MUB/min/mg
13
GOT, μmol/min/ml onverdund serum: (((0.35/6.3)/2.5)*1.115/0.23)*5*1000 = 538.647
14
1091.920*3200*10 = 34.94 g/ml
547.303 * 6400*10 = 35.027 g/ml
Berekening cijfer: voor elke juist/onjuist vraag 2 punten (gokscore 1 punt), voor elke zevenkeuze vraag 6 punten
(geen gokscore ).
Maximaal aantal punten is 44, gokscore is 10 punten.
cijfer = ((punten-10)/(44-10))*9 + 1
5.5 is voldoende.