Dit is de toets van 19-09-1997

Toets Biologische Chemie Biochemiedeel (BIC 10306), vrijdag 7 juli 2006
Begin met het invullen van je naam en registratienummer op het antwoordformulier. De eerste tien vragen
dienen met juist/onjuist beantwoord te worden. Je mag je antwoord toelichten. Bij de resterende vier
vragen moet één antwoord worden ingevuld. De berekening hoeft niet te worden opgeschreven. Rond pas
aan het eind van de berekening af en niet tussendoor.
Veel succes!
Algemene opmerking: bij de extinctiemetingen is steeds gebruik gemaakt van cuvetten met een lichtweg
van 1 cm.
1.
Men heeft de kristalstructuur van lactaat dehydrogenase met behulp van het programma Swiss PDB
viewer bestudeerd. Het blijkt dat Asp166 binnen 3 Å van His193 aanwezig is. Wanneer Asp166 via
plaatsgerichte mutagenese veranderd wordt in een Asn zal de pKa van His193 afnemen. Er is een
tabel met de structuurformules van de aminozuren toegevoegd.
2.
Bij de in vivo fluorescentiemeting van NADH in gistcellen worden oscillaties van de NADH
fluorescentie waargenomen. De reden is de regulatie van fosfofructokinase door de veranderende
'energy charge' in de cel.
3.
Een zuurstofelektrode meet de zuurstofconcentratie in een oplossing. Om het zuurstofgebruik uit te
kunnen rekenen moeten de luchtdruk en temperatuur bekend zijn. Daarnaast moet het volume van het
reactiemengsel bekend zijn voor de berekening van het zuurstofgebruik.
4.
In de gel waarmee een isoelectrisch focuseringsexperiment wordt uitgevoerd, moet voldoende SDS
aanwezig zijn om de eiwitten goed te denaturenen anders wordt het isoelectrisch punt niet bereikt.
5.
Als een extinctie van 0.41 wordt gemeten, wordt 59 % van de oorspronkelijke lichtintensiteit door
de fotomultipier geregistreerd. De wet van Lambert-Beer is: log(Ibl/Im ) = .c. Ibl = de lichtsterkte van
blanco, Im van de meting. Let op er wordt niet naar het geabsorbeerde licht gevraagd.
6.
De toename van de NADH fluorescentie bij toenemende concentraties is niet lineair omdat NADH
licht absorbeert.
7.
Uit het remmingspercentage van één activiteitsmeting van lactaat dehydrogenase met en zonder
oxamaat, kan men niet bepalen of oxamaat competitief of non-competitief remt ten opzichte van
pyruvaat.
8.
Het isoelectrisch punt van een eiwit is pH afhankelijk.
9.
In het -glucuronidase experiment moest de Km van het enzympreparaat bepaald worden. Dit is
uitgevoerd door een grafiek te maken waarbij de gemeten v tegen de verschillende
substraatconcentraties is uitgezet. Via een computerprogramma dat een extrapolatie van een
Lineweaver Burk plot uitvoert, wordt de maximale snelheid geschat. De helft van de maximale
snelheid is de Km voor het betreffende enzympreparaat.
10. De onderdelen van een werkzame fluorimeter staan in de juiste volgorde: lamp, monochromator,
fotomultiplier, cuvettenhouder met filters, lineaire versterker en recorder of afleeseenheid.
-1-
11. De activiteit van lactaat dehydrogenase is gemeten. De volgende toevoegingen zijn gedaan. 1.0 mL
fosfaatbuffer (Pi). Met set ref is de uitlezing van de spectrofotometer op nul gezet. Vervolgens zijn 0.01
mL 10 mM NADH en 0.02 mL 0.4 mg/mL LDH toegevoegd. Er werd geen afname van de NADH
concentratie waargenomen. Na het toevoegen van 0.03 mL 10 mM pyruvaat wordt er wel een afname van
de NADH concentratie waargenomen. De raaklijn aan de curve gaf aan dat de extinctie 0.4 per 30
seconden daalde. Let op het volume van het cuvet is geen 1 mL.
De molaire extinctie coëfficiënt van NADH is 6300 M-1.cm-1.
Gevraagd wordt de activiteit van LDH in mol . s-1. mg LDH-1 onder bovenstaande condities uit te
rekenen.
12. De activiteit van het reporterenzym ß-glucuronidase wordt in een transgene plant gemeten. Het
enzym katalyseert (o.a.) de volgende omzetting:
4-methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide + H2O
4-methylumbelliferon + D-glucuronzuur
Onder de gegeven proefomstandigheden (pH=8.5) is 4-methylumbelliferon de enige stof in bovenstaande
reactievergelijking, die fluorescentie vertoont.
- Vooraf is de fluorimeter geijkt. Dit is gedaan door de fluorescentie van een 4-methylumbelliferon
(MUB) oplossing te meten. 10 μL van een 15 μM MUB oplossing werd toegevoegd aan reactiebuffer
met 25 µL extract. Het volume werd door de MUB toevoeging 1.08 mL. Deze toevoeging gaf een
uitslag van 37 schaaldelen. Het bladextract quenchte de fluorescentie niet.
- Het toevoegen van 25 μL van het extract aan reactiebuffer met 1 mM MUG (het totale volume is 1.15
mL), leidde tot een uitslag van 23 schaaldelen per minuut.
- Het extract is gemaakt door 12 mg plantmateriaal fijn te wrijven in extractiebuffer. Het extract had
een volume van 150 μL.
Gevraagd: Bereken de specifieke enzymactiviteit uitgedrukt in pmol.min-1.mg plantmateriaal -1.
Eén pmol=10-12 mol.
13)
Er is een ELISA bepaling van een hormoon in een weefselpreparaat uitgevoerd. De experimenten
waarbij de titer van het antilichaampreparaat werd bepaald gaven aan dat een verdunning van 105
maal goede extinctiewaarden gaf. Deze antilichaamverdunningen zijn bij de bepaling van het
antigeen in het weefselpreparaat ook gebruikt. 2.5 L biotine-Ag en 100 L Ag van verschillende
verdunningen van het uitgangspreparaat (1mg/mL) zijn gebruikt bij het bepalen van de ijklijn.
Vervolgens zijn de onderstaande verdunningen van het weefselpreparaat de extincties gemeten en
via de ijklijn zijn de aangegeven pg per 100 L gevonden.
Verdunning X maal
2500
2500
2500
2500
7500
7500
7500
7500
Extinctie
0.895
0.869
1.003
0.915
1.690
1.526
1.747
1.772
-2-
pg/100 µL
228.69
228.77
228.78
228.76
76.20
76.21
76.24
76.09
Bereken de hoeveelheid hormoon (antigeen) in het onverdunde weefselpreparaat. Je moet ook de
eenheden aangeven. Bijvoorbeeld pg/mL of ng/mL etc.
14)
De bindingsconstante van NADH aan LDH is met behulp van fluorescentie bepaald. Uit de grafiek
van de fluorescentietoename tegen de toegevoegde LDH wordt een maximale fluorescentie van
325 geschat. Wanneer 2.136 M LDH was toegevoegd was de fluorescentietoename 167. De
NADH concentratie was in de metingen steeds 4 M. De dissociatieconstante van het LDHNADH complex is: Kd = ([LDH]vrij*[NADH]vrij)/[LDH-NADH]complex
Bereken uit de bovenstaande gegevens de Kd.
-3-
Antwoordenformulier Toets Biologische Chemie Biochemiedeel 7 juli 2006
Naam
Registratienummer
Handtekening
:
:
:
Maak per vraag slechts een vakje zwart! Als je je antwoord wilt toelichten mag dat.
1)
O
juist
O
onjuist
2)
O
juist
O
onjuist
3)
O
juist
O
onjuist
4)
O
juist
O
onjuist
5)
O
juist
O
onjuist
6)
O
juist
O
onjuist
7)
O
juist
O
onjuist
8)
O
juist
O
onjuist
9)
O
juist
O
onjuist
10)
O
juist
O
onjuist
11)
De activiteit van LDH is
mol . s-1. mg LDH-1
12)
De specifieke enzymactiviteit is
pmol.min-1.mg plantmateriaal -1.
13)
De concentratie hormoon is
14)
De Kd is
?g/mL.
M.
-4-
Uitwerking 7 juli 2006. Opmerkingen over de ja/nee vragen:
1
2
3
4
5
6
7
8.
9
10.
Dit is juist. De pKa neemt af omdat de negatieve lading die zorgde voor een stabilisatie van de
geprotoneerde vorm van His (Computer Graphics) wordt verwijderd.
Juist. Bij de overgang van een aëroob naar een anaëroob metabolisme wordt de snelheid van de glycolyse
door veranderende ATP concentraties versneld en afgeremd. Het sleutelenzym is fosfofructokinase.
Juist. De zuurstofelektrode meet de zuurstofconcentratie in de oplossing vergelijkbaar met een
spectrofotometer waarbij de concentratie van een lichtabsorberend molecuul wordt gemeten. De
oplosbaarheid (= concentratie) van zuurstof hangt af van de temperatuur en druk. Zuurstofverbruik in een
reactie is een concentratieverandering die via het volume kan worden omgezet in een absolute hoeveelheid.
Het volume van het reactiemengsel is nodig voor berekeningen.
Onjuist. In een IEF experiment wordt voordat de eiwitten worden opgebracht eerst de pH gradiënt ingesteld
door de focusing van de amfolieten die in de gel aanwezig zijn. Vervolgens worden de eiwitten opgebracht
en bewegen in de pH gradiënt naar hun pI. SDS ontvouwt eiwitten en geeft ze een grootte afhankelijke
negatieve lading.
Onjuist. Een extinctie van 0.41 betekent log (Ibl/Im) = c = 0.41. Ibl = Im x 100.41. Ib/I= 2.57 Im. Im = 0.389
Ibl. Er wordt dus 38.9 % van de oorspronkelijke intensiteit geregistreerd.
Dit is juist. Zie blok 2 ‘zelfqueching’.
De stelling is correct. Dit is met één experiment niet mogelijk. Bij een vaste hoeveelheid remmer moet de
substraatconcentratie worden gevarieerd. Haal je de VMAX die ook zonder remmer wordt bereikt dan is er
sprake van competitieve remming. Is de KM gelijk dan wordt er non-competitief geremd.
Onjuist. De lading van een eiwit is pH afhankelijk niet de pI. Deze wordt door de chemische samenstelling
(aminozuren) bepaald.
Onjuist. De Km is de substraatconcentratie waarbij de helft van de maximale snelheid wordt gemeten en
niet de halve snelheid zelf.
Onjuist. De fotomultipier moet achter het cuvet met filters staan.
Summiere uitwerking berekeningen
11
0.4/(6.3 x 30) mM/s x 1.06 mL/(0.02 x 0.4) mg = 0.265 mol.s-1.mg-1 LDH. Het getal 0.250 is fout omdat
men dan 1.06 mL is vergeten en bovendien een factor 103 weggemoffeld heeft, of te wel de omrekening
van concentratie naar absolute hoeveelheden is compleet fout gegaan.
12
Ijking: 37 sd ~ 10 x 15/1080 (pmol/L) = 0.139 μM MUB; 1 sd ~ 3.754 nM
Activiteit: 23/1 x 3.754 = 86.336 nM/min; per cuvet dus maal 1.15 mL = 99.287 pmol/min MUB gevormd.
In het cuvet zat (25/150) x 12 = 2.000 mg plantmateriaal. De gevraagde activiteit is 49.643 pmol
MUB/min/mg
13
228.75 x 2500*10 = 5.719 g/mL
76.185 x 7500*10 = 5.714 g/mL
Beide getallen of hun gemiddelde zijn goed.
14
(167/325) x 4 = 2.055 M complex. Kd = (4 – 2.055) x (2.136 - 2.055)/2.055 = 0.076 M
Berekening cijfer
Voor elke juist/onjuist vraag 2 punten (gokscore 1 punt), voor rekenvraag 6 punten (geen gokscore).
Maximaal aantal punten is 44, gokscore is 10 punten. Het cijfer wordt dan ((punten-10)/(44-10)) x 9 + 1.
Een 5.5 is het minimum cijfer om de toets te halen.
-5-