De natuurlijke functie van MDR transporteiwitten

University of Groningen
Multidrug resistance in Lactococcus lactis
Bolhuis, Hendrik
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
1996
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Bolhuis, H. (1996). Multidrug resistance in Lactococcus lactis s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
DRUG RESISTENTIE IN BACTERIËN.
SAMENVATTING
Steeds vaker wordt door de media in binnen- en buitenland gesproken over de
gevaren van resistente micro-organismen, welke niet of nauwelijks kunnen worden
bestreden met de ons bekende antibiotica. Resistentie in ziekteverwekkende microorganismen kan dramatische gevolgen hebben, met name in door ondervoeding en slechte
hygiëne geteisterde gebieden. Daarnaast lopen vooral personen met een verzwakt afweer
systeem gevaar, zoals AIDS patiënten en patiënten die een zware operatieve ingreep
hebben ondergaan. In Nederland moest zelfs enige malen worden overgegaan tot het
sluiten van ziekenhuisafdelingen waar deze resistente bacteriën waren aangetroffen.
Ondanks een groot scala aan recent ontwikkelde antibiotica hebben veel microorganismen verschillende strategieën ontwikkeld om bepaalde typen antibiotica
onschadelijk te maken, bijvoorbeeld door afbraak of modificatie van het antibioticum door
specifieke enzymen of door veranderingen aan te brengen in die cel-componenten waar
het antibioticum op aangrijpt. Een ander resistentie mechanisme, dat pas in het afgelopen
decennium aandacht heeft gekregen, wordt veroorzaakt door zogenaamde
transporteiwitten die zich in de celmembraan bevinden. De celmembraan is een dun
“vliesje” dat elke levende cel omsluit en waarin onder andere transport eiwitten zijn
gelegen. Deze transporteiwitten verwijderen de antibiotica uit de cel voordat deze hun
vernietigende werking kunnen uitoefenen.
127
Samenvatting
Multidrugresistentie.
Door het gebruik van antibiotica in verschillende combinaties en toedienings
schema’s leek de bestrijding van ziekteverwekkende micro-organismen lange tijd
succesvol te verlopen. In de afgelopen jaren zijn er echter meer en meer micro-organismen
opgedoken die niet alleen resistent zijn tegen één type antibioticum, maar ook tegen een
scala aan andere typen, niet-gerelateerde verbindingen. Het gevolg van dit fenomeen, dat
wordt aangeduid als multidrugresistentie (MDR), is dat schadelijke organismen niet of
nauwelijks meer kunnen worden bestreden. Verrassend genoeg speelt multidrugresistentie
niet alleen een rol bij resistentie van micro-organismen maar ook bij aanpassingen in
hogere organismen zoals ongeveer twintig jaar geleden bekend werd bij de behandeling
van tumoren in zoogdiercellen. Multidrugresistentie wordt door velen beschouwd als de
hoofdoorzaak van falende chemotherapie bij behandeling van kankercellen en is, samen
met resistentie van bacteriën en andere organismen zoals de malaria parasiet
Plasmodium, verantwoordelijk voor vele duizenden doden per jaar. In veel van deze
gevallen bleek de verwijdering van de verschillende toxische stoffen uit de cel door
transporteiwitten de hoofdoorzaak te zijn van multidrugresistentie. Begin jaren tachtig werd
ontdekt dat slechts één membraangebonden transporteiwit (P-glycoproteine)
verantwoordelijk kan zijn voor multidrugresistentie in kankercellen. Dit is verrassend omdat
de meeste enzymen, waaronder transporteiwitten, een specifieke interactie aangaan met
één of enkele nauwverwante substraten. Daarentegen blijken MDR transporteiwitten in
staat te zijn diverse, totaal verschillende substraten te herkennen en over de membraan
naar buiten te transporteren.
Recentelijk zijn in bacteriën en andere micro-organismen vergelijkbare
transporteiwitten aangetoond die multidrugresistentie kunnen veroorzaken en die identieke
toxische stoffen (waaronder verscheidene bekende chemotherapeutica) kunnen
uitscheiden (zie Hoofdstuk I). Kennis omtrent het werkingsmechanisme van deze MDR
transporteiwitten is van belang om nieuwe antibiotica of chemotherapeutica te ontwikkelen
of om andere strategieën te volgen in de bestrijding van tumoren of bacteriële en
parasitaire infecties.
128
Drug resistentie in bacteriën
Multidrugresistentie in Lactococcus lactis.
Dit proefschrift beschrijft multidrugresistentie in de melkzuurbacterie Lactococcus lactis,
een organisme dat vooral bekend is om zijn wereldwijde toepassing in de melkverwerkende
industrie. Dit organisme is niet ziekteverwekkend en vormt op grond van de beschikbare
genetische, fysiologische en biochemische kennis een ideaal modelsysteem voor de bestudering
van multidrugresistentie. Multidrugresistente mutanten van L. lactis zijn op vrij eenvoudige wijze
te isoleren door ze te kweken in aanwezigheid van toenemende concentraties van een toxische
stof (zie Hoofdstuk II). Mutanten werden geselecteerd die resistent zijn tegen ethidium bromide,
daunomicine en rhodamine 6G. Dit zijn allen positief-geladen substraten die ook door het
menselijk MDR transporteiwit P-glycoproteine worden uitgescheiden. De verkregen mutanten
bleken naast resistentie tegen de gebruikte toxische verbinding ook resistent te zijn tegen andere,
niet gerelateerde toxische verbindingen. Vandaar dat ze geklassificeerd kunnen worden als
multidrugresistent.
Lactococcus lactis bezit verschillende MDR transporteiwitten.
Aan de hand van experimenten, waarbij gekeken is naar transport van toxische verbinding
over de membraan, kon worden vastgesteld dat net als in tumorcellen, multidrugresistentie in
L. lactis wordt veroorzaakt door specifieke transporteiwitten. Doordat bij dit proces een
concentratieverschil wordt aangelegd, met buiten de cel een hogere concentratie van de toxische
verbindingen dan binnen de cel, zullen deze verbindingen de neiging hebben om de cel weer
binnen te gaan. Om toch een concentratieverschil in stand te kunnen houden moet er energie
worden geïnvesteerd. In lactococcen wordt de daarvoor vereiste energie hoofdzakelijk gehaald
uit de afbraak van suikers zoals glucose en lactose. In dit omzettingsproces worden andere
energie-rijke verbindingen zoals ATP gevormd, wat gebruikt kan worden om verschillende
(transport-) processen te drijven. Daarnaast worden er door lactococcen protonen (H +)
uitgescheiden waardoor er een electrochemische gradient van protonen wordt gevormd. Doordat
ook deze protonen weer naar binnen willen ontstaat er een potentiële kracht, de
protonendrijvende kracht, die door bepaalde transporteiwitten gebruikt kan worden om
substraattransport over de membraan te drijven. In hoofdstuk II wordt aangetoond dat beide
energievormen drug transport in L. lactis kan drijven, wat er op wijst dat tenminste twee
verschillende transporteiwitten verantwoordelijk zijn voor het multidrug-resistentie fenotype.
Van bacteriële MDR transporteiwitten, die afhankelijk zijn van de protonendrijvende kracht, zijn meerdere voorbeelden bekend. Het ATP-afhankelijke MDR
transportsysteem is daarentegen uniek en nog niet eerder beschreven voor bacteriën. De
aanwezigheid van twee verschillende MDR transporteiwitten, LmrP en LmrA genaamd, kon
129
Samenvatting
worden bevestigd door analyse van het chromosomale DNA van L. lactis waarop de
genetische informatie voor de eiwitten is vastgelegd (Hoofdstuk III en V). LmrP staat voor
Lactococcus MultidrugResistentie, waarbij de ‘P’ verwijst naar de betrokkenheid van de
Protonendrijvende kracht als energieleverancier voor de transportreactie. Analoog hieraan
werd het ATP-afhankelijke transportsysteem, LmrA genoemd. Vergelijking van de
aminozuurvolgorde van deze eiwitten met al bekende MDR transporteiwitten leert ons dat
LmrP overeenkomt met een drietal bacteriële MDR transporteiwitten. De
aminozuurvolgorde van LmrA daarentegen vertoont een grote overeenkomst met het
menselijk MDR transporteiwit P-glycoproteine. Hiermee is LmrA het eerste en tot op heden
enige bacteriële MDR transporteiwit dat zowel in structuur als functie vergelijkbaar is met
het menselijk MDR systeem. Dit biedt de mogelijkheid om LmrA te gebruiken als
modelsysteem voor de bestudering van multidrugresistentie in zowel kankercellen als
bacteriën.
Het transportmechanisme.
Zoals vermeld is de eigenschap van LmrP en LmrA om meerdere, totaal
verschillende substraten te kunnen transporteren hoogst ongebruikelijk. De enige
gemeenschappelijke eigenschappen van de MDR substraten die konden worden
gevonden betreffen een positieve lading en een hydrofoob (waterafstotend) karakter. Dit
laatste betekent dat deze verbindingen een watervrijmilieu prefereren boven een
waterbevattende omgeving. Het belangrijkste watervrije compartiment in levende cellen is
de al eerder genoemde celmembraan. Het gangbare idee omtrent substraattransport over
de membraan is dat het substraat wordt gebonden door het transporteiwit in de waterfase
en vervolgens over de membraan naar de andere zijde wordt getransporteerd. In de
hoofdstukken IV en VI wordt echter aangetoond dat beide lactococcus MDR
transporteiwitten de toxische verbindingen niet vanuit de waterfase, maar direct vanuit de
binnenste helft van de celmembraan, naar buiten transporteren. Mogelijkerwijs geldt dit
mechanisme ook voor andere MDR transporteiwitten waaronder die welke
verantwoordelijk zijn voor multidrugresistentie in kankercellen. Dit resultaat geeft aan dat
bij de ontwikkeling van nieuwe antibiotica of chemotherapeutica onder andere gelet moet
worden op de oplosbaarheid van deze stoffen in de celmembraan.
De natuurlijke functie van MDR transporteiwitten.
130
Drug resistentie in bacteriën
De belangrijkste functie van de celmembraan is het vormen van een scheiding
tussen het interne celcompartiment, het cytoplasma, en het milieu waardoor waardevolle
voedingsstoffen in de cel blijven terwijl schadelijke stoffen zoveel mogelijk buiten worden
gehouden. Als gevolg hiervan kunnen ook belangrijke biologische parameters zoals
zoutconcentraties en de zuurgraad van het cytoplasma constant worden gehouden.
Daarnaast vormt de celmembraan een matrix voor specifieke membraaneiwitten die
betrokken zijn bij de opname van essentiële voedingsstoffen en bij de uitscheiding van
afvalprodukten.
Hydrofobe toxische verbindingen komen in de vrije natuur maar ook in het menselijk
lichaam veelvuldig en in grote verscheidenheid voor en deze verbindingen kunnen de
functie van de celmembraan negatief beïnvloeden. Een belangrijke functie van MDR
transporteiwitten lijkt dan ook gelegen in het verwijderen van hydrofobe stoffen uit de
membraan, waardoor de biologische functie van de celmembraan optimaal gehandhaafdt
blijft. Deze essentiële functie is waarschijnlijk ook één van de belangrijkste redenen dat
MDR transporteiwitten in bijna elk levend organisme of celtype worden aangetroffen.
Ondanks het feit dat MDR transporteiwitten een nadelig effect kunnen hebben bij de
bestrijding van tumoren en bacteriële infecties moet niet worden vergeten dat deze eiwitten
essentieel zijn voor de levensvatbaarheid van de betreffende cellen.
131