Effecten van de schildklierhormoonstatus op de

Effecten van de
schildklierhormoonstatus op de
lichaamssamenstelling:
Genetische varianten in het
schildklierhormoonmetabolisme
Sara Guillemaere
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. JM Kaufman
Vakgroep Endocrinologie
Academiejaar 2010-2011
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk
ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder
met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het
aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
Datum
(handtekening student)
(Naam student)
(handtekening promotor)
(Naam promotor)
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Inhoudstafel
Samenvatting
1
1. Inleiding
1.1. Situering onderwerp
1.2. Synthese schildklierhormonen
1.3. Regulatie schildklierhormoonstatus
1.4. Schildklierhormoontransporters
1.5. Belang van de deïodinasen
1.6. Effecten van hypo- en hyperthyreose
1.7. Hypothese
2
2
3
5
7
7
9
10
2. Materialen en methoden
2.1. Proefpersonen
2.2. Meten lichaamssamenstelling
2.3. Bepaling schildklierhormoonconcentraties
2.3.1. Op de Modular E170
2.3.2. Met RIA
2.4. Voorbereiding stalen
2.5. Te bepalen SNP‟s
2.6. Bepaling primers
2.7. Bepaling positieve controles
2.7.1. PCR
2.7.2. Agarosegelelektroforese
2.7.3. DNA sequencing
2.8. Taqman PCR : genotypering van de stalen
2.9. Analyse van de bekomen resultaten
2.10.
Kaderen van eigen aandeel
12
12
13
14
14
15
15
16
16
17
17
17
18
18
21
21
3. Resultaten
3.1. Beschrijvende statistiek
3.1.1. Antropometrie, algemene kenmerken en schildklierhormoonparameters
3.1.2. Lichaamssamenstelling
a. DXA
b. pQCT
c. Biodex
3.2. Bepaling SNP‟s
3.2.1. Bepaling primers
3.2.2. Bepaling positieve controles
22
22
22
24
24
25
25
26
26
26
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
3.3. Analyse SNP‟s
3.3.1. Hardy-Weinberg evenwicht
3.3.2. Relatie SNP’s met schildklierhormoonparameters
a. rs7832552
b. rs11206244
c. rs2235544
d. rs225014
3.3.3. Relatie SNP’s met lichaamssamenstelling
a. rs7832552
b. rs11206244
c. rs2235544
d. rs225014
3.3.4. Realtie met andere parameters uit de literatuur
3.3.5. Invloed van SNP’s in het deïodinase 1-gen op de verschillende
lengteparameters
a. rs11206244
b. rs2235544
4. Bespreking
4.1. TRHR
4.1.1. rs7832552
a. Eigen bevindingen
b. Mogelijke verklaringen
c. Vergelijking met bestaande literatuur
4.2. Deïodinase 1
4.2.1. rs11206224
a. Eigen bevindingen
b. Mogelijke verklaringen
c. Vergelijking met bestaande literatuur
4.2.2. rs2235544
a. Eigen bevindingen
b. Mogelijke verklaringen
c. Vergelijking met bestaande literatuur
4.3. Deïodinase 2
4.3.1. rs225014
a. Eigen bevindingen
b. Mogelijke verklaringen
c. Vergelijking met bestaande literatuur
4.4. Invloed SNP2 & 3 op verschillende lengteparameters
27
27
27
27
27
29
30
31
31
32
33
33
34
34
34
35
36
36
36
36
36
37
38
38
38
39
40
41
41
42
42
44
44
44
44
45
46
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
5. Algemeen besluit
46
6. Referentielijst
47
Bijlagen
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Protocols RIA
Protocol DNA-extractie
Protocol PCR : bepaling positieve controles
Protocol agarosegelelektroforese
Protocol Taqman PCR : genotypering stalen
Foto‟s gels positieve controles
Hardy-Weinberg calculators
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
Samenvatting
Bij
gezonde
personen
vertonen
de
serumschildklierparameters
een
belangrijke
interindividuele variatie, terwijl de intra-individuele variatie binnen een nauwe range ligt. De
set-point is afhankelijk van zowel omgevingsfactoren als genetische factoren. Kleine
veranderingen in TH-concentraties kunnen belangrijke gevolgen hebben. SNP‟s in de genen
betrokken bij de schildklierhormoonpathway kunnen resulteren in een gewijzigde THbioactiviteit en geassocieerd zijn met TH gerelateerde eindpunten. In deze masterproef is het
de bedoeling de effecten van de vier gekozen SNP‟s
op schildklierhormoonstatus en
lichaamssamenstelling na te gaan in de Siblos-cohorte. Er werd gekozen om vier SNP‟s te
onderzoeken, meerbepaald één in het TRHR-gen (rs7832552) en drie in de deïodinasegenen
waarvan twee in DiO1 (rs11206244 en rs2235544) en één in DiO2 (rs225014).
De Siblos-cohorte bestaat uit 675 gezonde Caucasische mannen tussen 25 en 45 jaar uit de
omgeving van Gent en werd later nog uitgebreid tot 999 proefpersonen. De mannen
ondergingen
uitgebreide
metingen
van
het
lichaam
(antropometrie)
en
de
lichaamssamenstelling via DXA, pQCT, Biodex en metingen met een handdynamometer.
Verder werden ook de schildklierhormoonconcentraties bepaald. De DNA-stalen van de
proefpersonen werden gegenotypeerd via Taqman-PCR. Vervolgens werd beschrijvende
statistiek
uitgevoerd,
met
rapportering
van
de
lichaamssamenstelling,
schildklierhormoonparameters en frequenties van de genetische varianten. De statische
analyse gebeurde met PASW 18 en Spotfire S+ 8.1.
De SNP in TRHR is significant positief geassocieerd met de lengte en borderline significant
geassocieerd met de LBM. Dit verband is enkel significant voor homozygoot dragers ten
opzichte van niet-dragers. De SNP‟s in het DiO1-gen hebben een invloed op de
schildklierhormoonconcentraties en lichaamssamenstelling. Bij dragers van SNP2 zien we een
significant hogere rT3- en FT4-concentratie. Verder hebben dragers van deze SNP gemiddelde
een groter gestalte. SNP3 daarentegen is geassocieerd met een significant lagere rT3concentratie, een hogere concentratie T3 en een kleinere lichaamslengte. Beide SNP‟s hebben
tegenovergestelde effecten, SNP2 verlaagt de activiteit van D1 terwijl SNP3 de activiteit
verhoogt. De SNP in het DiO2-gen heeft een toegenomen werking van D2 tot gevolg, wat op
zich leidt tot een daling in T4. Verder heeft deze ook een negatieve invloed op de BMD.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
1. Inleiding
1.1. Situering onderwerp
De schildklier is gelegen in de hals anterieur van de trachea en de larynx (zie figuur 1). Het is
de grootste endocriene klier van het lichaam. Microscopisch is de schildklier opgebouwd uit
follikels waarvan het lumen gevuld is met colloïd. Hierin bevindt zich het eiwit
thyroglobuline, dat mede verantwoordelijk is voor de productie van schildklierhormoon of
thyroïd hormoon (TH). TH is essentieel voor de normale groei, de ontwikkeling en het
metabolisme van verschillende weefsels. (1)
De meeste kennis omtrent de werking van het schildklierhormoon is afgeleid vanuit
schildklieraandoeningen, waarbij manifest teveel of te weinig schildklierhormoon in het
lichaam aanwezig is. De regeling van het schildklierhormoonmetabolisme binnen de normale
fysiologische grenzen is onvolledig gekend.
Deze masterproef betreft een onderdeel van een doctoraatstudie waarbij de relatie tussen de
schildklierhormoonstatus en lichaamssamenstelling bij jonge gezonde mannen onderzocht
wordt. In deze masterproef is het de bedoeling de invloed van verschillende genetische
varianten in de deïodinasen en in de thyrotropine releasing hormoonreceptor (TRHR) te
onderzoeken. Via literatuuronderzoek werden verschillende SNP‟s geïdentificeerd die in
andere cohortes bewezen effecten hebben op de schildklierhormoonconcentraties en/of de
lichaamssamenstelling.
Verder in deze inleiding zullen nog de synthese van schildklierhormonen, de regulatie van de
schildklierstatus, de schildklierhormoontransporters, het belang van de deïodinasen en de
effecten van hypo- en hyperthyreose besproken worden.
Figuur 1. De schildklier is gelokaliseerd in de hals anterieur van de trachea en de larynx. (2)
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
1.2
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Synthese van de schildklierhormonen
De folliculaire cellen van de schildklier produceren continu het precursoreiwit thyroglobuline
(TG) en secreteren dit in het colloïd in het centrum van de follikels, voor iodinatie en opslag.
Het jodium, nodig voor de iodinatie, is afkomstig uit het dieet en wordt enkel opgenomen en
gebruikt door de schildklier. Het treedt de schildklier binnen via de Natrium+/Iodiumsymporter of NIS (zie figuur 2). De oxidatie en conjugatie van jodium op de tyrosineresiduen
wordt de organificatie genoemd. De tyrosineresiduen, waaruit TH wordt afgeleid, worden
geïodineerd tot monoiodotyrosine (MIT) en di-iodotyrosine (DIT) door middel van het
enzyme thyroid peroxidase (TPO). In het colloïd gaan MIT en DIT verbindingen aan met
elkaar. Twee DIT‟s vormen samen thyroxine (T 4), één MIT en één DIT vormen 3,3‟,5-triiodothyronine (T3). De schildklier is de enige endocriene klier in het menselijk lichaam die
een grote hoeveelheid hormoon extracellulair opslaat, namelijk in het colloïd. T4 is een
prohormoon met beperkte intrinsieke biologische activiteit, hieruit wordt de actievere vorm T3
afgeleid door deïodinatie (zie verder). De beide TH‟s en het aminozuur tyrosine staan
afgebeeld op figuur 3. (3)
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Figuur 2. NIS (4)
Figuur 3. T3 en T4 worden door iodinatie onder invloed van TPO afgeleid van het aminozuur tyrosine.
(eigen figuur)
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
1.3
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Regulatie van de schildklierstatus
Thyrotropine releasing hormone (TRH) is een tripeptide-hormoon gesecreteerd door de
hypothalamus. Door binding op TRH-receptor (TRHR), aanwezig op de oppervlakte van de
hypofyse, kan het zijn functie uitvoeren. Het voornaamste gevolg van de TRH-TRHR binding
is het stimuleren van de secretie van TSH (of thyroïd stimulerend hormoon) door de hypofyse.
Dit zijn de eerste stappen in de hormonale cascade van de hypothalamo-hypofysaireschildklier-as (hypothalamic-pituitary-thyroid axis of HPTA, zie figuur 4). (5)
De synthese van TH (zie 1.2) en de secretie in het bloed wordt aangestuurd door het thyroïd
stimulerend hormoon (TSH) uit de hypofyse. Hierdoor wordt thyroglobuline (TG), dat
opgeslagen zit in het colloïd, opgenomen door de folliculaire cellen via endocytose.
Vervolgens wordt het TH gekliefd van de TG-moleculen door lysosomale proteolyse via de
thyroïd oxidasen. TH verlaat de folliculaire cellen via diffusie naar de capillairen rond de
follikels. (6)
Het grootste deel van T3 en T4 dat circuleert in de bloedsomloop is gebonden aan plasmaeiwitten zoals TBG (thyroïd-bindend globuline), albumine en transthyretine (of prealbumine). T3 is de meest bioactieve vorm van TH en bindt aan de nucleaire
schildklierhormoonreceptoren, aanwezig in verschillende weefsels. De biologische activiteit
van T3 is afhankelijk van de intracellulaire T 3-concentratie. Dit is op zijn beurt afhankelijk
van de concentratie circulerend T 3, het transport van TH door de celmembraan en de
aanwezigheid van deïodinasen, dit zijn enzymen die TH activeren of inactiveren (7).
TPO (thyroïd peroxidase) is een enzym gemaakt in de schildklier dat belangrijk is in de
productie van TH. Het bevindt zich in de follikelcellen van de schildklier waar het onder
andere T4 omzet in T3. Anti-TPO (ATPO) antilichamen breken TPO af, waardoor er minder
omzetting is van T4 naar T3. Een tweede antilichaam is het anti-thyroglobuline (ATG)
antilichaam dat TG afbreekt. Als gevolg hiervan wordt minder TH gemaakt. De aanwezigheid
van één of beide antilichamen in het bloed wijst op een auto-immune schildklieraandoening,
Hashimoto thyroïditis genaamd, die leidt tot hypothyreose. De antilichamen zijn echter niet de
oorzaak, maar wel het gevolg van auto-immuniteit. (8)
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Figuur 4. De hypothalamo-hypofysaire-schildklier as met detail van één schildklierfollikel (9).
De hypothalamus produceert TRH dat de hypofyse stimuleert om op zijn beurt TSH te produceren. TSH bindt
vervolgens op de TSHR op de schildklier wat zorgt voor de synthese en vrijlating van reeds gevormde TH‟s die
opgeslagen zitten in het colloïd en productie van nieuwe TH‟s. In de schildkliercellen komen T3 en T4 los van
TG en worden ze gesecreteerd in het bloed. Daar binden ze deels aan transporteiwitten, maar het is de vrije
fractie die instaat voor de negatieve feedback naar de hypothalamus en de hypofyse waardoor de pathway
onderdrukt wordt.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
1.4
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Schildklierhormoontransporters
Het TH-metabolisme en de TH-activiteit vinden grotendeels intracellulair plaats. Daarom is er
transport nodig van de iodothyronines door de plasmamembraan. Dit gebeurt via actief
transport aan de hand van transporteiwitten en niet door passief transport, ondanks het feit dat
de iodothyronines lipofiel zijn. Er zijn reeds verschillende transporterfamilies geïdentificeerd.
De 2 belangrijkste families zijn de monocarboxylaat transporter (MCT) familie en de organic
anion transporting polypeptides (OATP) familie. De belangrijkste actieve iodothyronine
transporters uit deze families zijn MCT8, MTC10 en OATP1. (10)
1.5
Belang van de deïodinasen
De schildklier secreteert slechts een klein deel van het aanwezige T 3 in het lichaam. Het
grootste deel wordt gesynthetiseerd door outer ring deiodination (ORD) van T 4 in de weefsels.
T4 en T3 worden beiden geïnactiveerd door inner ring deiodination (IRD) tot respectievelijk
3,3‟,5‟-tri-iodothyronine (reverse T3 of rT3) en 3,3‟-di-iodothyronine (T2). De enzymen
verantwoordelijk voor de ORD en/of IRD van de TH‟s worden de deïodinasen genoemd.
Er zijn 3 deïodinases betrokken bij de enzymatische deïodinatie van TH, namelijk deïodinase
1 (D1), deïodinase 2 (D2) en deïodinase 3 (D3). D1 wordt geëxprimeerd in de lever, nier en
schildklier en heeft zowel ORD als IRD activiteit. Het is vooral belangrijk in de productie van
serum T3 en klaring van serum rT3. D2 wordt geëxprimeerd in de hersenen, de hypofyse, het
bruin vetweefsel, de schildklier, de skeletspieren en het hart. D2 heeft enkel ORD activiteit en
is belangrijk voor de lokale productie van T 3 in de hersenen, de hypofyse en het bruin
vetweefsel. Het is eveneens van belang in de productie van circulerend T 3. D3 wordt
geëxprimeerd in de volwassen hersenen en huid en in verschillende foetale weefsels. Het
heeft enkel IRD activiteit en is belangrijk voor de negatieve controle van lokale en
systemische T3 levels. (10)
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
Figuur 5. Schildklierhormoondeiodinatie : ORD wordt gecatalyseerd door D1 en D2 en activeert het prohormoon
T4, IRD wordt primair gecatalyseerd door D3 en inativeert T3 en T4. (11)
Een grote variatie in de graad van deïodinase-expressie tussen verschillende weefsels
resulteert
in
een
grote
variatie
in
de
relatieve
bijdrage
van
de
serumschildklierhormoonconcentraties aan de lokale schildklierhormoonwerking. Zo draagt
serum T3 bij tot 87% van intracellulair T3 in de nier, maar slechts tot 50% van intracellulair T 3
in de hypofyse en slechts tot 20% van het intracellulair T3 in de cerebrale cortex, waar het
grootste deel van T3 afkomstig is van lokale deïodinatie van T4. Hierdoor heeft variatie in de
ratio T3/T4 in de circulatie verschillende effecten in verschillende weefsels, met een mogelijke
impact op een aantal belangrijke biologische parameters zoals lichaamsgewicht, serumlipiden,
hartritme, botmetabolisme, ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel en psychisch welzijn.
(12)
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
1.6
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Effecten van hypo- en hyperthyreose
Subklinische hypo- en hyperthyreose is een veel voorkomend probleem in de algemene
populatie. De incidentie neemt toe met toenemende leeftijd. De diagnose wordt gedefinieerd
op laboratoriumonderzoek door de aanwezigheid van gestoorde schildklierparameters :
afwijkende TSH-concentraties (normaal: 0,45-4,5mU/L) samen met normale FT4 en FT3
levels bij een intacte HPTA. De meeste patiënten zijn asymptomatisch. Indien er wel
symptomen aanwezig zijn, zijn deze vaak mild en niet-specifiek.
Subklinische hypothyreose is gedefinieerd door gestegen TSH met normale FT 4 waarde. De
meest voorkomende oorzaak is auto-immune thyroïditis (Hashimoto) geassocieerd met
positieve anti-peroxidase (anti-TPO) antilichamen. Patiënten zijn meestal asymptomatisch
maar sommigen vertonen symptomen zoals moeheid, droge huid en constipatie tot cardiale
dysfunctie en neuropsychiatrische symptomen zoals depressie. Eens een gestegen TSH met
normale FT4 gezien wordt, moet dit bevestigd worden na 2 tot 12 weken en dienen anti-TPO
antilichamen gemeten te worden. De behandeling bestaat uit T 4-vervangingstherapie.
Subklinische hyperthyreose wordt gedefinieerd als een verlaagde TSH-concentratie met
normale waarden van FT4 en FT3 levels. De symptomatologie hiervan is enorm variabel. Er
zijn verschillende oorzaken zoals onder andere endogene overproductie bij ziekte van Graves
en overdosering van schildklierhormoontabletten. De meerderheid patiënten met subklinische
hyperthyreose hebben een TSH tussen 0,1 en 0,4 mU/L. Meestal is hier geen behandeling
nodig, enkel monitoring van symptomen en regelmatige schildkliertesten ter controle. De
gevolgen op hart en skelet zijn meer uitgesproken wanneer TSH <0,1 mU/L. De behandeling
hangt af van de symptomen en hun ernst. (13)
Hypo- en hyperthyreose hebben een duidelijk invloed op vetweefsel. Bij hypothyreose is er
een gewichtstoename te zien door toename in vetmassa (fat mass), terwijl er bij hyperthyreose
een gewichtsverlies te zien is te wijten aan toegenomen lipolyse ten gevolge van de hormoonafhankelijke upregulatie van de andrenerge receptoren. Schildklieraandoeningen kunnen ook
de spierfunctie beïnvloeden en hebben dus een invloed op de spiermassa of lean mass.
Hyperthyreose leidt tot verzwakking van de skeletspieren, afbraak van skeletpieren, cardiale
myopathie en hartfalen. Patiënten met hypothyreose ondervinden ook een invloed op de
spieren zoals myalgie, verzwakking en verminderde uithouding bij inspanningen. (13)
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Verder verstoren schildklieraandoeningen ook het evenwicht tussen de osteoblasten en
osteoclasten waardoor het botmetabolisme beïnvloed wordt. Hyperthyreose is geassocieerd
met een reductie in botmassa en dus met osteoporose en verhoogde risico op botfracturen
door het niet-gecompenseerd botverlies. Mogelijks verlaagt het ook de botdensiteit (bone
mineral density of BMD). Hypothyreose heeft ook effect op de gezondheid van het bot en
leidt tot vertraagde groei. De lichaamssamenstelling wordt dus beïnvloedt door de
aanwezigheid van te veel of te weinig schildklierhormoon via effecten op vetweefsel,
spierweefsel en bot. (14)
1.7
Hypothese
Bij
gezonde
personen
vertonen
de
serumschildklierparameters
een
belangrijke
interindividuele variatie, terwijl de intra-individuele variatie binnen een nauwe range ligt.
Naast omgevingsfactoren zoals de voeding, roken of jodiuminname, kunnen genetische
factoren belangrijke bijdragen leveren tot deze variabiliteit, waardoor elk individu een
verschillende setpoint voor de schildklierfunctie heeft. Bevindingen bij patiënten met
subklinische hyper- en hypothyreose illustreren dat zelfs kleine veranderingen in THconcentratie belangrijke gevolgen kunnen hebben voor een groot aantal klinische eindpunten
die
verband
houden
met
de
schildklierhormonen
(vb.
atherosclerose,
hartritme,
botmineraaldensiteit en obesitas). (7)
Polymorfismen zijn genetische varianten die voorkomen bij meer dan 1% van de populatie.
Single nucleotide polymorphisms (SNP‟s) zijn een specifieke vorm van polymorfismen
waarbij er slechts een verandering is van één nucleotide in het DNA. Indien de SNP gelegen
is in een intron van een gen, kan dit leiden tot een verandering in het eiwit waarvoor het DNA
codeert. SNP‟s in de genen betrokken bij de schildklierhormoonpathway kunnen dus mogelijk
resulteren in een gewijzigde TH-bioactiviteit en geassocieerd zijn met TH gerelateerde
eindpunten. SNP‟s in de schildklierhormoonpathway kunnen de biologische systemen op twee
manieren beïnvloeden, ten eerste door wijziging in serum schildklierhormoonconcentraties en
ten tweede door de intracellulaire beschikbaarheid van T 3 te veranderen. Het effect van
genetische variatie blijkt echter in de meeste lichaamssystemen onafhankelijk van de
serumschildklierwaarden, waardoor het belang van lokale regulatie van schildklierhormoon in
weefsels wordt aangetoond.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
In deze masterproef is het de bedoeling de effecten van de vier gekozen SNP‟s op
schildklierhormoonstatus en lichaamssamenstelling na te gaan in de Siblos-cohorte.
Mutaties in TRHR-gen kunnen de affiniteit van TRHR voor TRH verminderen, met centrale
hypothyreose tot gevolg. Voor deze masterproef werd gekozen om één SNP rs7832552 (C/T)
in het TRHR-gen te analyseren. Voor deze SNP werd in een genome wide associatie study
(GWAS) een associatie gevonden met een hogere lean body mass (2,5kg), bij de homo- en
heterozygote SNP-dragers ten opzichte van de dragers van het wild-type. Deze gegevens
werden gerepliceerd in drie onafhankelijke cohortes. (5)
Verder werden drie SNP‟s gekozen in de verschillende deïodinasegenen nl. twee SNP‟s in het
Deïodinase 1 gen (DiO1): rs11206244 en rs 2235544 en één SNP in het Deïodinase 2 gen
(DiO2): rs225014.
Deïodinase 1 (D1) speelt een belangrijke rol in de productie van T 3 uit T4 en in de omzetting
van rT3 naar T2. De eerste SNP (rs11206244: C/T) heeft een verminderde activiteit van D1 tot
gevolg. Dit zou theoretisch moeten leiden tot een stijging in rT3, rT3/T4 en T4 en een daling in
T3/rT3 en T3/T4. Verder werden ook een stijging in lean body mass en een hogere spierkracht
en -massa waargenomen. (15)
De tweede SNP (rs2235544: A/C) is geassocieerd met een toegenomen activiteit van D1.
Hieruit volgt een stijging van T3 en een daling van T4, met een stijging van T3/T4 tot gevolg.
Verder is er ook een daling te zien in rT 3 en dus een stijging in T3/rT3. (12)
Deïodinase 2 (D2) speelt eveneens een rol in de omzetting van T 4 naar T3. De SNP in het
DiO2-gen (rs225014: C/T) is geassocieerd met een verminderde D2-activiteit en dus minder
omzetting van T4 naar T3. Hierdoor is er een verminderde lokale beschikbaarheid van T 3 in
bot en dus een mogelijke invloed op het skeletmetabolisme. (16) Heemstra et al. (17) vonden
een verhoogde botturnover en een 6% lagere botdichtheid ter hoogte van de corticale
femurhals in een populatie patiënten met genezen gedifferentieerd schildkliercarcinoom. Dit
is te wijten aan de verminderde activiteit van D2 waardoor er lokaal in het bot een daling in
het T3-level voorkomt. Eveneens werd bij personen met obesitas en type 2 diabetes een
verband gevonden tussen deze SNP en BMI en insuline resistentie. (16)
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
2. Materialen en methoden
2.1
Proefpersonen
Voor het opstellen van de Siblos-cohorte werden op basis van de bevolkingsregisters alle
mannen met een leeftijd tussen de 25 en 45 jaar uit verschillende randgemeenten van Gent
aangeschreven, meerbepaald Melle, Merelbeke, Lochristi, Drongen, Zwijnaarde en Deinze.
De inclusiecriteria waren naast afkomstig zijn uit de omgeving van Gent en een leeftijd te
hebben tussen 25 en 45 jaar, verkeren in een goede algemene gezondheid en één of meerdere
broers te hebben waarvan het leeftijdsverschil met henzelf kleiner was dan 12 jaar en die
eveneens binnen dezelfde leeftijdscategorie vielen. Identieke tweelingen werden uitgesloten.
De exclusiecriteria waren het hebben van een aandoening of nemen van medicatie die het
botmetabolisme en/of steroïdmetabolisme beïnvloeden. Enkel Caucasische mannen werden
geïncludeerd aangezien onze studie zich wenste te beperken tot het Caucasische ras.
De Siblos-cohorte pool 1 bevat na exclusie gegevens van 675 gezonde mannen. De cohorte
werd verder uitgebreid om een 1000-tal proefpersonen te bekomen (pool 2 bestaat uit 324
proefpersonen). Alle analyses in deze masterproef werden uitgevoerd op pool 1, omdat bij het
schrijven van de masterproef de schildklierparameters in pool 2 nog niet bepaald waren.
Enkel voor rs7832552 werd reeds een database gemaakt voor pool 1 en 2 met een beperkt
aantal gegevens in verband met lichaamssamenstelling.
In totaal werden specifiek voor de studie naar invloed van schildklierhormoonconcentratie op
de lichaamssamenstelling in pool 1 36 studiepersonen geëxcludeerd. Hiervan hadden 2
proefpersonen een duidelijke hyperthyreose met normale perifere TH-waarden maar
onderdrukte TSH-waarden (< 0,04 mU/L) (14). De andere 34 proefpersonen hadden positieve
auto-immuniteit van de schildklier, dit is anti-TPO > 35 U/L en/of anti-TG > 115 U/L (cut-off
waarden voor auto-immuniteit, Roche Modular kit insert). Zij werden uitgesloten aangezien
bij aanwezigheid van auto-immuniteit de kans op abnormale schildklierhormoonwaarden
groot is.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2.2
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Meten lichaamssamenstelling
De lichaamssamenstelling werd bepaald via dual energy X-ray absorptiometry of DXA (QRD
4500 DXA, software version 11.2.1; Hologic Inc., Bedford, MA, USA) (18). Met deze tweedimensionele techniek werden de totale botoppervlakte (in cm2) en botmassa (in g) bepaald
van de heup, de wervelzuil en het volledige lichaam. De bepalingen steunen op het meten van
de absorptie van röntgenstralen door het calcium aanwezig in bot. Verder werd ook de
botdensiteit (BMD of bone mineral density, g/cm²) berekend voor de lumbale wervelzuil, de
heup en de niet-dominante arm door de botmassa te delen door de totale oppervlakte van het
doorstraalde bot. (19)
Uit de whole body meting werd het percentage spier, vet en bot van een persoon bepaald.
Normaal bedraagt de BMC (of bone mineral content) ongeveer 2-4% van het totale
lichaamsgewicht. De gezonde bovengrens voor vetmassa (fat mass) bij mannen is 20% (20).
Via instant vertebral assesment (IVA) werd gecontroleerd op de aanwezigheid van
wervelindeukingen. De reproduceerbaarheid van de alle resultaten bekomen met DXA werd
nagegaan. De variatiecoëfficiënten bekomen uit dagelijkse en wekelijkse fantoommetingen
waren <1%.
Om de beperking van 2-dimensionele beeldvorming bij DXA metingen teniet te doen,
gebeurde ook metingen met de pQCT (XCT2000 scanner, Stratec GmbH, Pforzheim,
Germany) of peripheral quantative computed tomography (21). Hiermee worden doorsnedes
van botweefsels bepaald ter hoogte van de arm en het been, waaruit de kwaliteit van het bot
ter hoogte van de extremiteiten kan worden afgeleid. De volumetric BMD (vBMD) van het
corticaal en trabeculair bot, de geometrie van het corticale bot, de grootte van bot en de
corticale BMC werden bepaald van de dominante voorarm en het dominante onderbeen.
Het bepalen van de spierkracht gebeurde via metingen met een isokinetische dynamometer
(Biodex, New York, USA) (22). De isokinetische spierkracht (peak torque) van de bovenarm
en het bovenbeen werd respectievelijk gemeten ter hoogte van de musculus biceps en
quadriceps van de dominante ledematen (in Nm of Newton meter).
Met een handdynamometer (JAMAR hand dynamometer, Sammons and Preston,
Bolingbrook, IL, USA) (23) werd de grijpkracht (of grip strenght) gemeten (in kg).
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Verder werden ook bloedstalen afgenomen, urinestalen verzameld, vragenlijsten ingevuld en
verschillende lichaamsmetingen (antropometrie) uitgevoerd. Wat betreft de antropometrie
werden de lengte, de sitting height (lengte van staartbeen tot kruin van hoofd), de sternum
height (lengte romp tot bovenkant sternum), de lengte van de voorarm, de calf height (lengte
van het onderbeen), de omtrek van het middel en de heup, de armenspan (armspan) en het
gewicht gemeten. De BMI werd berekend (BMI = gewicht (kg)/lengte(m)²).
2.3
Bepaling schildklierhormoonconcentraties
Binnen onze cohorte werden TSH, FT3, FT4, ATPO, ATG, rT3, TT3, TT4 en TBG bepaald
door middel van immunoassays op humaan serum. TSH, FT 3, FT4, ATPO en ATG werden
bepaald op de Modular E170 (Roche Diagnostics gmbH, Mannheim, Germany) via
elektrochemoluminiscentie (ECLIA of ElektroChemoLuminiscentie ImmunoAssay) en TT3,
TT4, rT3 en TBG werden bepaald door RIA-methodes (RadioImmunoAssay).
2.3.1 Op de Modular E170
De kwantitatieve bepaling van TSH, FT3, FT4, ATPO en ATG gebeurde op de Modular E170,
op automatische wijze.
De test voor de bepaling van TSH is gebaseerd op het sandwich-principe. Tijdens de 1 e
incubatiestap werd het patiëntstaal samen gebracht met 2 verschillende soorten antilichamen
specifiek tegen het te onderzoeken analyt. Het 1e soort antilichamen was gebiotinyleerd en de
2e soort gelabeld met ruthenium. Vervolgens werden paramagnetische micropartikels, gecoat
met streptavidine, toegevoegd. In de 2e incubatiestap werden immuuncomplexen gevormd
tussen de antilichamen en de micropartikels. In de meetcel werden de immuuncomplexen
magnetisch vastgehouden terwijl vrije reagentia werden weggewassen. Tenslotte werd in de
ECL-reactie een hoeveelheid licht geproduceerd die recht-evenredig is met de hoeveelheid
analyt in het patiëntstaal. Via een calibratiecurve werd de concentratie antigen of analyt
berekend.
Het basisprincipe voor de kwantitatieve bepaling van vrij thyroxine (FT4), vrij
triiodothyronine (FT3), anti-thyroid peroxidase (ATPO) en anti-thyroglobuline (ATG) is een
2-staps competitieve immuno-assay techniek. Tijdens de 1e incubatiestap werd het
patiëntstaal samen gebracht met een gelabeld antilichaam specifiek tegen het te onderzoeken
analyt. Vervolgens werden een gekende hoeveelheid van het analyt in gebiotinyleerde vorm
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
toegevoegd samen met streptavidine-gecoate paramagnetische micropartikels. De nog vrije
bindingsplaatsen van de gelabelde antilichamen werden ingenomen, met vorming van een
antilichaam-hapten complex. Het volledige complex bond vervolgens op de micropartikels. In
de meetcel werden immuuncomplexen weerhouden, terwijl ongebonden reagens en staal
werden weggewassen. Tenslotte werd in de ECL-reactie een hoeveelheid licht geproduceerd
die omgekeerd evenredig was met de hoeveelheid antigen aanwezig in het patiëntstaal. Via
een calibratiecurve werd de concentratie antigen of analyt berekend.
2.3.2 Met RIA
Via RadioImmunoAssay (RIA) werden 4 schildklierparameters bepaald, namelijk reverse T3
(rT3), totaal T3 (TT3), totaal T4 (TT4) en thyroïd-bindend globuline (TBG). De protocols voor
deze 4 tests zijn te vinden in bijlage 1.
Voor de kwantitatieve bepaling in een staal wordt een gekende hoeveelheid
analyt
125
I-gelabeld
toegevoegd aan een serumstaal van de proefpersoon. Dit wordt vervolgens 1u
geïncubeerd met anti-analyt antilichamen in een proefbuis. Beide antigenen treden in
competitie voor de anti-analyt antilichamen. De kwantitatieve bepaling via RIA is gebaseerd
op de overblijvende hoeveelheid vrij radioactief-gelabeld antigen.
2.4
Voorbereiding stalen
DNA-extractie en -opzuivering werd uitgevoerd op EDTA bloed (bloed dat behandeld werd
met ethyleen-diamine tetra-azijnzuur) met behulp van een commerciële kit (Puregene DNA
Purification KIT). De extractie was gebaseerd op lyse van de rode bloedcellen, gevolgd door
proteïneprecipitatie. Nadien werd het DNA geprecipiteerd en na de wasstap werd het
geresuspendeerd in DNA hydration solution. Het protocol is te vinden in bijlage 2.
Vervolgens werden voor iedere proefpersoon DNA verdunningen gemaakt van respectievelijk
75 en 9 ng/µl en dit door het toevoegen van DNA hydration solution. Deze verdunningen
werden bewaard in de diepvries bij -18°C.
Per gekozen SNP werden de primers bepaald (zie verder) en besteld bij Eurogentec. Na
levering werden deze geresuspendeerd en verdund naar de gewenste concentratie (30 µM)
voor latere PCR-reacties.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2.5
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Te bepalen SNP‟s
Via literatuurstudie werden de 4 SNP‟s gekozen om te onderzoeken in deze masterproef. Er
werd gekozen voor rs7832552, rs11206244, rs2235544, rs225014 aangezien over deze SNP‟s
de meeste artikels en dus voorgaande studies waren terug gevonden. Hierdoor kan de
reproduceerbaarheid makkelijker worden nagegaan. Er werd geopteerd voor 4 SNP‟s
aangezien de masterproef in beperkte tijd diende uitgevoerd te worden.
2.6
Bepaling primers
Vooreerst werden de te onderzoeken SNP‟s met omliggende sequentie gezocht op de
Ensemble website (http://www.ensembl.org/index.html). Via PrimerExpress® (software v3.0)
(https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=605
537&tab=Overview&catID=605537&tab=Overview) werden mogelijke primers gezocht.
Voor de instelling van de parameters baseerden we ons op de verschillende voorwaarden
waaraan een primer moet voldoen. De voorwaarden zijn : een primerlengte van 9-30
baseparen (optimaal 20bp), smeltemperatuur (Tm) tussen 58 en 60°C, GC-inhoud tussen 30
en 80% (optimaal 50%), maximaal 2 C en/of G basen in de 5 nucleotiden aan 3‟ uiteinde,
geen SNP‟s en geen secundaire structuren in de primersequenties aanwezig. Verder ligt de
ideale ampliconlengte, dit is de afstand tussen forward en reverse primer, tussen 80 en 150
baseparen. Vervolgens werd de sequentie waarin de SNP gelegen is, ingevoerd in
PrimerExpress. Via dit programma werd automatisch op zoek gegaan naar geschikte primers
in de ingegeven sequenties. Via trail&error (inkorten van de sequenties) werden geschikte
primers (forward en reverse) gevonden die voldeden aan de vooraf opgestelde voorwaarden.
Ter
controle
werden
de
primers
geblast
op
de
NCBI
(http://blast.ncbi.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome)
website
om
aanwezigheid elders in het menselijke genoom na te gaan en zo eventuele vorming van een
alternatief PCR-product te vermijden. De gekozen primers werden besteld bij Eurogentec. Na
levering, werd gecontroleerd of ze effectief de sequenties amplificeren die verwacht werden.
Hiervoor werd Taqman-PCR (zie verder) uitgevoerd van de stalen aanwezig in de testplaat.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2.7
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Bepaling positieve controles
2.7.1 PCR
Uit de resultaten bekomen via Taqman-PCR van de testplaat werden per SNP telkens 3 stalen
per genotype gekozen die later dienst zouden doen als positieve controles. Per SNP werd dus
voor 9 stalen de specifieke DNA-sequentie waarin de SNP gelegen is, geamplificeerd via
PCR (AB Veriti Fast Thermal Cycler) in aanwezigheid van de geschikte primers. In de
denaturatiestap (stap 1) werd bij zeer hoge temperaturen (94-96°C) dubbelstrengig DNA
gedenatureerd tot enkelstrengig DNA. Tijdens de stap 2, de hybridisatiestap, gingen beide
primers (reverse en forward) ten gevolge van een temperatuursverlaging (50 tot 65°C)
specifiek binden op het gebied in het enkelstrengig DNA dat complementair was met de
sequentie van de primers. Tijdens de elongatiestap (stap 3) steeg de temperatuur naar het
optimum voor het DNA polymerase (72°C). Hierdoor werden de deoxynucleosidetrifosfaten
(dNTP‟s) aanwezig in het reactiemengsel geïncorporeerd in het zich vormende dubbelstrengig
DNA. Stap 2 en 3 werden 30 keer herhaald. Per cyclus werd DNA verdubbeld, wat leidde tot
de uiteindelijke amplificatie van het DNA. (zie bijlage 3)
2.7.2 Agarosegelelektroforese
Na PCR werd een gelektroforese uitgevoerd om de aanwezige nucleïnezuursequenties te
scheiden op basis van grootte. Hiervoor diende men eerst een agarosegel te gieten en deze in
TBE-buffer (Tris/Boraat/EDTA) te brengen. In de eerste well werd de ladder geladen (2µl
blauwe tracking dye), waardoor na elektroforese een schaal ontstaat waarop de grootte van de
aanwezige DNA-fragmenten kan worden afgelezen. De kleurloze DNA-stalen werden
gekleurd met een oranje kleurstof (loading dye). Hiervoor werd telkens 5µl staal toegevoegd
aan 10µl loading dye. Deze mix werd vervolgens op de gel geladen en de gel werd onder
spanning gebracht (45minuten op 200V).
Van de bekomen gel werd vervolgens, na kleuring met ethidium-bromide (EtBr), een foto
genomen om na te gaan of de PCR reactie gelukt was en of de bekomen amplicons de lengte
hadden die verwacht werden bij de keuze van de primers. (zie bijlage 4).
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
2.7.3 DNA sequenering
De 9 stalen, die dienst zouden doen als positieve controles, werden ter controle gesequeneerd
door de dienst Medische Genetica (MRB, UZ Gent). Sequencen of sequeneren is het bepalen
van de volgorde waarin de vier basen voorkomen in het DNA. Hierdoor kon worden nagegaan
of de DNA-sequenties inderdaad het veronderstelde genotype hadden.
Met het programma CLC sequence viewer 6.4 (http://download.cnet.com/CLC-SequenceViewer/3000-2054_4-10439173.html)
werden
de
resultaten
gecontroleerd.
De
ampliconsequentie die verwacht werd op basis van de gebruikte primers werd gealigneerd met
de bekomen sequenties. Deze zouden moeten overeenkomen behalve op de positie van de
SNP. Verder werd hiermee ook de SNP bevestigd, dus uit welke basen deze bestond.
2.8
Taqman PCR : genotypering van de stalen
De frequentie van de SNP‟s van interesse werden in de onderzoekspopulatie bepaald via
Taqman-PCR (StepOne RT-PCR), en dit voor 44 stalen per plaat. De resultaten waren
verdeeld in 3 clusters, namelijk homozygoot allel 1, heterozygoot en homozygoot allel 2.
Voor toepassen van deze techniek worden verschillende stappen doorlopen. Het volledige
protocol vind je in bijlage 5.
-
Voorbereiding
De assay-mix werd zelf gemaakt, deze bestond uit Taqman Universal PCR (=mastermix),
SNP genotyping assay en water (respectievelijk 5µl, 0.5µl en 3.5µl per te analyseren staal).
Met de Handystep werd 9µl in elke well gedaan van de te onderzoeken 48-well-plaat. Nadien
werd met een multichannel pipet 1µl DNA van de studiepersonen per well toegevoegd. Er
werden telkens ook 3 positieve controles (één van elk genotype) en 1 negatieve controle
meegenomen.
- Thermische cycli
Volgende cycli werden doorlopen:
a. Pre-PCR read : 30sec bij 60°C,
b. Holding stage : 20sec bij 95°C,
c. Cycling stage (40x) : 1sec bij 95°C en 20sec bij 60°C
d. Post-PCR read : 30sec bij 60°C.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Elke Taqman MGB probe bond specifiek aan zijn complementaire sequentie gelegen tussen
de forward en de reverse primer. Indien de probe intact was, werd geen kleursignaal gezien
aangezien de reporter-kleurstof en de quencher zich dicht in elkaars buurt bevonden.
AmpliTaq Gold DNA polymerase verlengde de primers gebonden aan de DNA template en
kliefde de probes die gehybridiseerd zijn aan de target sequentie. Hierdoor werd de quencher
gescheiden van de reporter-kleurstof, waardoor de fluorescentie van de reporter toenam. Het
fluorescentiesignaal dat gegenereerd werd bij PCR-amplificatie gaf aan welke allelen
aanwezig waren in het staal. Het principe is te zien op figuur 6.
Figuur 6. Principe Taqman PCR (24)
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
-
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Aflezen van de resultaten
De genotypes werden uitgezet in een allel-discriminatie plot (figuur 7, uit eigen onderzoek).
Hierbij werden 3 clusters onderscheiden waarbij rood staat voor homozygoot allel 1, blauw
voor homozygoot allel 2 en groen voor heterozygoot. In de multicomponent plot (figuur 8, uit
eigen onderzoek) werd de fluorescentie uitgezet in functie van de doorlopen cycli. Men zag 3
lijnen op de grafiek. De rode, passieve referentie, die constant bleef tijdens het PCR-proces en
de groene en de blauwe die ook eerst constant bleven en nadien een snelle stijging in
fluorescentie vertonen naarmate de amplificatie vorderde. Indien enkel stijging te zien was in
de groene lijn, wees dit op een homozygoot allel 1. Een stijging in de blauwe grafiek wijst op
een homozygoot allel 2. Een stijging in beide grafieken wijst op een heterozygoot allel.
Figuur 7. Allel-discriminantieplot (voorbeeld uit eigen onderzoek)
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
C/C
C/T
T/T
Figuur 8. Multicomponentplot (voorbeeld uit eigen onderzoek)
2.9
Analyse van de bekomen resultaten
Beschrijvende statistiek werd uitgevoerd, met rapportering van de lichaamssamenstelling,
schildklierhormoonparameters en frequenties van de genetische varianten. Het HardyWeinberg evenwicht van de genetische varianten eerst nagegaan aan de hand van de online
calculator (Michael H. Court, 2005-2008
http://www.tufts.edu/~mcourt01/Documents/
Court%20lab%20-%20HW%20calculator.xls). De associaties tussen lichaamssamenstelling,
schildklierhormoonwaarden en SNP‟s in de schildklierhormoonpathways werden bestudeerd
door middel van mixed effects lineaire modellen, teneinde de familiestructuur van onze
populatie in rekening te brengen.
De statische analyse gebeurde met PASW 18 en Spotfire S+ 8.1. Grafieken werden gemaakt
met MedCalc.
2.10 Kaderen eigen aandeel
Voor deze masterproef werden de 2.5 tot en met 2.9 volledig zelfstandig uitgevoerd.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
3. Resultaten
3.1
Beschrijvende statistiek
3.1.1 Antropometrie, algemene kenmerken en schildklierhormoonparameters
De resultaten van de antropometrische bepalingen, enkele algemene kenmerken en de
schildklierhormoonparameters van de 675 gezonde broers staan samengevat in tabel 1.
Tabel 1. Antropometrie en algemene kenmerken
Gemiddelde ± SD
Leeftijd (jaar)
34.5 ± 5.5
Gewicht (kg)
81.3 ± 11.8
Lengte (cm)
179.2 ± 6.4
BMI (kg/m²)
25.3 ± 3.5
Percentage rokers
Activiteitsniveau
volgens Baecke (25):
- Tijdens werk
23%
2.71 ± 0.75
-
Tijdens sport
2.95 ± 0.99
-
Tijdens vrije tijd
2.69 ± 0.58
Handgrijpkracht (kg)
51 ± 8
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
In tabel 2 staan de verschillende schildklierparameters vermeld die bepaald werden op de
Modular en via RIA. Uit de bekomen concentraties werden ook verschillende ratio‟s
berekend. 34 proefpersonen (of 5%) testten positief met betrekking tot auto-immuniteit van de
schildklier. Zij hadden een anti-TPO hoger dan 35 U/l en/of een anti-TG hoger dan 115 U/l.
Tabel 2. Schildklierhormoonparameters
Gemiddelde ± SD
Referentiewaarden
FT3 (ng/dl)
3.92 ± 0.37
2.50 - 4.04
FT4 (ng/dl)
1.45 ± 0.18
0.9 - 1.7
rT3 (ng/ml)
0.30 ± 0.06
0.10 – 0.35
TT3 (ng/dl)
2.3 ± 0.4
1.7 – 2.9
TT4 (ng/dl)
135.0 ± 30.4
60 – 157
TSH (mU/l)
1.78 ± 3.38
0.27 - 4.2
TBG (mg/l)
18.3 ± 3.3
12 - 23
ATPO (U/L) 1
8.6 [7.0-10.9]
0 - 35
ATG (U/L) 1
12.3 [10.0-15.6]
0 - 115
Percentage
auto-immuniteit (in %)
1
in mediaan [Q1-Q3]
5%
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
3.1.2 Lichaamssamenstelling
a. DXA
De resultaten bekomen met DXA (n=675) staan samengevat in tabel 3. Deze zijn
weergegeven in gemiddelde ± SD.
Tabel 3. DXA-metingen en –bepalingen
Gemiddelde ± SD
Totale massa (kg)
81.4 ± 11.5
Totale lean mass (kg)
62.1 ± 6.6
Totale fat mass (kg)
16.4 ± 6.4
Totale oppervlakte (cm²)
- Heup
- Wervelzuil
- Whole body
45.28 ± 4.37
71.60 ± 6.33
2352.59 ± 155.09
BMC (g)
- Heup
- Wervelzuil
- Whole body
48.91 ± 8.03
76.02 ± 12.59
2875.43 ± 374.86
BMD (g/cm2)
- Heup
- Wervelzuil
- Whole body
1.08 ± 0.14
1.06 ± 0.12
1.22 ± 0.10
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
b. pQCT
De resultaten van de pQCT-metingen (n=675) voor radius en tibia staan samengevat in tabel
4. Deze staan vermeld in gemiddelde ± SD.
Tabel 4. pQCT-metingen en -bepalingen
Radius
Tibia
4519 ± 587
8254 ± 1114
Trabeculair BMD
(mg/cm³) (4%)
228 ± 40
Niet bepaald
Corticale botoppervlakte
(mm²) (66%)
101 ± 14
363 ± 48
Corticale botdensiteit
(mg/mm) (66%)
1101 ± 35
1112 ± 24
Perostiale omtrek
(mm) (66%)
48 ± 3.8
95 ± 6.0
Endosteale omtrek
(mm) (66%)
32 ± 4.4
66 ± 6.8
2.52 ± 0.32
4.52 ± 0.56
Oppervlakte spierdoorsnede (mm²) (66%)
Corticale dikte
(mm) 66%
c. Biodex
Met de biodex werd de maximale spierkracht (peak torque) gemeten van de biceps en
quadriceps. Deze was 57.30 (± 10.51) Nm (Newton.meter) voor de biceps en 203.16 (± 41.56)
Nm voor de quadriceps.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
3.2
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Bepaling SNP‟s
3.2.1 Bepaling primers
In tabel 5 zijn de gekozen primers per SNP te vinden zoals bepaald met PrimerExpress®.
Tabel 5. Primers en ampliconlengte per SNP
Forward primer
Reverse primer
Ampliconlengte
rs7832552
TCCCTCAAATAT
CTTGGCTGTTTC
CACCCTTGATCG
ATCCTGTTTAT
205bp
rs11206244
TCTGGAAAAGCTC
CACAGTTAATCT
CTAGGGACACAG
GTCAAGGGTAA
124bp
rs2235544
CATGCTGATGG
CTCCTACACA
ACGAATCAGG
CATTCCCAACT
113bp
rs225014
AGGGCTGGCAA
AGTCAAGAAG
AATTCCAGTGT
GGTGCATGTCT
114bp
3.2.2 Bepaling positieve controles
Voor de SNP rs7832552 hadden alle aanwezige amplicons na PCR een lengte van ongeveer
200bp zoals kon worden afgelezen van de gel (figuur 9). Dit komt overeen met de verwachte
lengte van 205bp. Ook voor alle andere SNP‟s hadden alle amplicons een overeenkomstige
lengte die voldeed aan de verwachtingen. De foto‟s van de gels zijn terug te vinden in bijlage
6.
Figuur 9. Foto gel positieve controles rs7832552
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
3.3
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Analyse SNP‟s
3.3.1 Hardy-Weinberg evenwicht
Het Hardy-Weinberg evenwicht werd berekend met een online calculator (zie bijlage 7).
Hieronder staan de p-waarden voor χ2-test per SNP weergegeven. Alle SNP‟s zijn in HardyWeinberg equilibrium aangezien de p-waarde telkens groter is dan 0.05.
p-waarde voor χ2-test
Aantal mislukte stalen / totaal
rs7832552 (groep 1)
0.778
7/675
rs7832552 (groep 1&2)
0.143
16/990
rs11206224
0.564
2/675
rs2235544
0.525
9/675
rs225014
0.640
7/675
3.3.2 Relatie SNP met schildklierhormoonparameters
a. rs7832552
Wat betreft rs7832552 werd geen invloed gevonden op schildklierhormoonparameters in de
oorspronkelijke studiepopulatie (n=675). In de huidige studiepopulatie (n=999) werden de
schildklierparameters nog niet bepaald, er kon dus nog geen analyse gemaakt worden van
huidige studiepopulatie betreffende de schildklierhormoonparameters.
b. rs11206224
De resultaten van rs11206244 staan samengevat in tabel 7a. We zien een significant verschil
voor de concentratie rT3 bij dragers van de SNP ten opzichte van de wild types. De ANOVA
p-waarde bedraagt 0.0001 wat betekent dat de verschillen tussen de categorieën als significant
kunnen beschouwd worden. Het verschil in concentratie tussen C/C en C/T bedraagt 0.018
ng/ml. De concentratie bij T/T ligt gemiddeld 0.037 ng/ml lager dan bij C/C. (zie figuur 9)
Ook wat betreft FT4 is er significant verschil te zien tussen de verschillende genotypes
onderling (ANOVA p= 0.0299). We zien dat er geen verschil is in concentratie tussen C/C en
C/T genotype, maar T/T ligt gemiddeld wel 0.05 ng/dl hoger dan C/C. (zie figuur 10)
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
Figuur 9. Het effect van de SNP rs11206244 op rT3.
Figuur 10. Het effect van de SNP rs11206244 op de FT4.
Tabel 7a. Invloed SNP rs11206244 op schildklierhormoonconcentraties (in gemiddelde ± SD)
rs11206244
C/C
C/T
T/T
p-waarde
FT3 (ng/dl)
3.93 ± 0.35
3.92 ± 0.39
3.84 ± 0.37
0.4197
FT4 (ng/dl)
1.44 ± 0.18
1.44 ± 0.19
1.49 ± 0.19
0.0299
rT3 (ng/ml)
0.285 ± 0.061
0.303 ± 0.065
0.322 ± 0.062
0.0001
TT3 (ng/dl)
2.29 ± 0.38
2.34 ± 0.39
2.26 ± 0.36
0.251
TT4 (ng/dl)
130.15 ± 30.63
136.61 ± 29.56
137.75 ± 32.70
0.2046
TSH (µU/l)
1.93 ± 5.07
1.67 ± 0.85
1.64 ± 0.60
0.7531
TBG (mg/l)
18.04 ± 3.40
18.71 ± 3.24
18.06 ± 2.98
0.0861
ATPO (U/L)1
8.72
[6.75-11.24]
8.59
[6.81-10.65]
8.38
[7.02-9.88]
0.4933
ATG (U/L)1
12.38
[10.00-15.84]
12.37
[10.00-15.45]
11.83
[10.02-14.76]
0.4436
1
in mediaan [Q1-Q3]
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
c. rs2235544
De resultaten van rs2235544 staan samengevat in tabel 7b. Er werd een uitgesproken
significant verschil bij dragers van de SNP ten opzichte van niet-dragers gezien wat betreft
rT3 met een ANOVA p-waarde van 0.0001. Bij de heterozygote dragers lag de concentratie
rT3 0.22 ng/ml lager dan bij homozygoot WT. Bij homozygote dragers was de concentratie
0.029 ng/ml lager. Ook de concentratie FT3 is significant verschillend maar dit enkel voor
heterozygote dragers ten opzichte van wild type (p= 0.0144). Het verschil bedraagt 0.090
ng/dl. De ANOVA p-waarde is borderline significant (p= 0.0497).
Tabel 7b.Invloed SNP rs2235544 op schildklierhormoonconcentraties
rs2235544
A/A
A/C
C/C
p-waarde
FT3 (ng/dl)
3.86 ± 0.37
3.95 ± 0.39
3.92 ± 0.31
0.0497
FT4 (ng/dl)
1.46 ± 0.19
1.44 ± 0.19
1.43 ± 0.17
0.1441
rT3 (ng/ml)
0.314 ± 0.065
0.292 ± 0.065
0.285 ± 0.058
0.0001
TT3 (ng/dl)
2.28 ± 0.35
2.35 ± 0.40
2.28 ± 0.37
0.1219
TT4 (ng/dl)
136.30 ± 29.91
134.53 ± 30.62
134.58 ± 31.14
0.5827
TSH (µU/l)
1.70 ± 0.85
1.66 ± 0.74
2.20 ± 7.44
0.1796
TBG (mg/l)
18.52 ± 3.13
18.45 ± 3.29
17.91 ± 3.56
0.1799
ATPO (U/L) 1
8.61
[6.85-10.29]
8.55
[6.87-10.75]
8.94
[6.77-11.9]
0.6985
ATG (U/L) 1
11.95
[10.00-14.40]
12.64
[10.00-16.10]
12.70
[10.00-17.19]
0.1905
1
in mediaan [Q1-Q3]
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
Figuur 11. Het effect van de SNP rs2235544 op rT3
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Figuur 12. Het effect van de SNP rs2235544 op FT3
d. rs225014
Bij rs225014 werd geen invloed gezien op de schildklierhormoonparameters. . Een
uitzondering is het significante verschil dat gevonden werd tussen T/T en C/C wat betreft FT 4.
De concentratie ligt bij homozygoot mutanten 9.44 ng/dl lager dan bij homozygoot WT (p=
0.0411). Dit wordt later verder besproken.
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
3.3.3 Relatie SNP‟s met lichaamssamenstelling
a. rs7832552
In de oorspronkelijke studiepopulatie (n=675) werden geen significante resultaten gevonden
voor rs7832552. Er werd reeds een beperkte database opgesteld van de huidige
studiepopulatie (n=999) om de invloed van deze SNP op enkele parameters van
lichaamssamenstelling te kunnen nagaan. In tabel 8a kan je zien het verschil tussen de
categorieën voor geen enkele parameters significant is (ANOVA p-waarde > 0.05). Er is
echter wel een significant verschil tussen C/C en T/T wat betreft lengte en totale spiermassa
(of lean mass). Dit wordt later verder besproken.
Tabel 8a. Invloed rs7832552 op lichaamssamenstelling (in gemiddelde ± SD)
rs7832552
C/C
C/T
T/T
p-waarde
Gewicht (kg)
80.7 ± 11.2
81.1 ± 11.7
81.2 ± 13.9
0.37
Lengte (m)
179.3 ± 6.4
179.8 ± 6.5
180.8 ± 6.2
0.065
BMI (kg/m²)
25.1 ± 3.4
25.1 ± 3.5
24.9 ± 4.3
0.79
Totale lean
mass (kg)
61.6 ± 6.4
61.9 ± 6.8
62.5 ± 7.5
0.14
Totale fat mass
(kg)
16.3 ± 6.4
16.3 ± 6.3
15.8 ± 7.8
0.96
% fat mass
19.7 ± 5.4
19.6 ± 5.4
18.7 ± 6.0
0.62
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
b. rs11206244
Ook voor rs11206244 werd een significante invloed gezien op de lengte. De heterozygote
dragers van de SNP zijn gemiddeld 1.7 cm groter en de homozygote dragers zijn gemiddeld
2.0 cm groter dan de homozygoot wild types. De ANOVA p-waarde is significant en bedraagt
0.0089.
Tabel 8b. Invloed rs11206244 op lichaamssamenstelling
rs11206244
C/C
C/T
T/T
p-waarde
Gewicht
80.7 ± 12.2
81.7 ± 11.2
82.0 ± 12.4
0.81
Lengte
174.2 ± 6.1
179.9 ± 6.5
180.2 ± 6.8
0.0089
BMI
25.4 ± 3.6
25.3 ± 3.4
25.3 ± 3.8
0.54
Totale lean mass
64.6 ± 7.2
65.3 ± 6.45
65.3 ± 7.4
0.70
Totale fat mass
16.4 ± 6.7
16.4 ± 6.2
16.8 ± 6.5
0.81
BMC
- Heup
48.5 ± 8.0
49.2 ± 8.2
49.0 ± 7.4
0.89
- Wervelzuil
76.0 ± 13.2
76.2 ± 12.1
75.3 ± 12.0
0.81
- Whole body
2879 ± 382
2869 ± 369
2888 ± 378
0.77
1.09 ± 0.14
1.07 ± 0.13
1.08 ± 0.13
0.17
- Wervelzuil
1.06 ± 0.13
1.06 ± 0.12
1.05 ± 0.12
0.26
- Whole body
1.22 ± 0.10
1.21 ± 0.10
1.22 ± 0.10
0.18
BMD
- Heup
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
c. rs2235544
De lengte is eveneens significant beïnvloed door SNP rs223554. Heterozygote dragers van de
SNP zijn gemiddeld 0.4 cm kleiner (p = 0.0471) en homozygote dragers zijn gemiddeld 1.9
cm kleiner (p= 0.0050) dan de wild types. De ANOVA p-waarde (p= 0.0160) is eveneens
significant.
Tabel 8c. Invloed rs2235544 op lichaamssamenstelling
rs2235544
A/A
A/C
C/C
p-waarde
Gewicht
81.4 ± 12.2
81.8 ± 12.2
79.9 ± 10.3
0.43
Lengte
179.8 ± 6.3
179.4 ± 6.6
178.0 ± 6.0
0.016
BMI
25.2 ± 3.9
25.4 ± 3.4
25.2 ± 3.1
0.63
Totale lean mass
62.2 ± 6.6
62.3 ± 6.8
61.3 ± 6.1
0.36
Totale fat mass
16.4 ± 7.0
16.6 ± 6.3
16.0 ± 5.9
0.61
BMC
- Heup
49.4 ± 8.3
48.8 ± 8.2
48.5 ± 7.3
0.37
- Wervelzuil
77.1 ± 13.1
75.7 ± 11.9
75.2 ± 13.2
0.18
- Whole body
2887 ± 378
2879 ± 376
2854 ± 367
0.55
1.08 ± 0.14
1.08 ± 0.14
1.09 ± 0.14
0.87
- Wervelzuil
1.07 ± 0.13
1.06 ± 0.12
1.05 ± 0.12
0.30
- Whole body
1.22 ± 0.10
1.22 ± 0.10
1.22 ± 0.10
0.99
BMD
- Heup
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
d. rs225014
De invloed van rs225014 op de lichaamssamenstelling blijft enkel beperkt tot de BMD van de
wervelzuil en dit voor homozygoot mutanten ten opzichte van wild type. Dit wordt verder
besproken.
3.3.4 Relatie met andere parameters uit literatuur
In voorgaande literatuur werd reeds beschreven dat de SNP rs225014 in verband staat
hypertensie, obesitas, insulineresistensie (HOMAIR) en diabetes mellitus type 2. Dit werd
echter niet bevestigd in het eigen onderzoek. Hetzelfde geldt tevens voor de relatie van SNP
rs11206244 met IGF1 (hogere spierkracht, meer spierkracht en spiermassa). Het verband
tussen SNP rs11206244 en rT3/TT4 is dan weer wel bevestigd in onze studie. Er is een
significant verschil over de verschillende categorieën (ANOVA p= 0.0390) en verder ook een
significant verschil tussen de homozygoten (p= 0.0111).
3.3.5 Invloed van SNP‟s in het deïodinase 1-gen op de verschillende lengteparameters
a. rs11204244
Aangezien er bij de beide SNP‟s in het DiO1-gen een associatie werd gezien met de
lichaamslengte (zie figuur 13 en 14), werden ook andere lengteparameters bepaald. Hieruit
bleek dat SNP2 (rs11206244) ook positief geassocieerd was met de calf height, sitting height,
sternum height en armenspan (ANOVA p-waarde is respectievelijk 0.040, 0.014, 0.011 en
0.023, zie tabel 9a).
Figuur 13. Het effect van de SNP rs11206244
op de lengte
Figuur 14. Het effect van de SNP2235544
op de lengte
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
Tabel 9a. Invloed rs11206224 op verschillende lengteparameters
rs11206244
C/C
C/T
T/T
p-waarde
Lengte
174.2 ± 6.1
179.9 ± 6.5
180.2 ± 6.8
0.0089
Calf height
48.4 ± 2.4
48.9 ± 2.5
49.2 ± 2.4
0.040
Sitting height
93.9 ± 3.3
94.7 ± 3.2
94.6 ± 3.3
0.014
Sternum height
61.1 ± 2.8
61.7 ± 2.6
61.9 ± 2.7
0.011
Armenspan
181.4 ± 6.8
183.5 ± 7.5
183.8 ± 7.2
0.023
b. rs2235544
Voor SNP3 (rs2235544) kon de associatie met de totale lichaamslengte niet worden
doorgetrokken naar de andere lengteparameters voor heterozygote dragers. Voor homozygote
dragers werd wel een significante associatie gezien met calf height, sitting height en
armenspan maar niet met sternum height. De ANOVA P-waarde was enkel significant voor
armenspan. Zie tabel 9b.
Tabel 9b. Invloed rs2235544 op verschillende lengteparameters
rs2235544
A/A
A/C
C/C
p-waarde
Lengte
179.9 ± 6.3
179.4 ± 6.6
178.0 ± 6.0
0.016
Calf height
48.9 ± 2.4
48.8 ± 2.5
48.2 ± 2.5
0.065
Sitting height
94.5 ± 3.2
94.4 ± 3.3
93.9 ± 3.3
0.075
Sternum height
61.7 ± 2.7
61.5 ± 2.7
61.2 ± 2.6
0.19
Armenspan
183.3 ± 7.0
183.0 ± 7.7
180.8 ± 6.3
0.0093
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
4. Bespreking
4.1. TRHR
4.1.1. rs7832552
a. Eigen bevindingen
In de oorspronkelijke studiepopulatie (n=675) werd geen associatie gezien tussen de SNP en
de schildklierhormoonparameters of de parameters van de lichaamssamenstelling. In de
volledige studiepopulatie (n=999) werden de schildklierparameters nog niet bepaald, dus kon
het eventuele effect van de SNP op de schildklierhormoonparameters nog niet geanalyseerd
worden. Wel werd reeds een databank opgesteld met een beperkt aantal gegevens over de
lichaamssamenstelling.
Er werd gezien dat de SNP positief geassocieerd is met de lengte. Het significante verschil
was enkel te zien tussen homozygoot dragers van de SNP (T/T) en homozygoot wild type
(WT) (C/C), waarbij de dragers gemiddeld 1.5 cm groter waren (p= 0.02). Voor heterozygoot
dragers (C/T) ten opzichte van homozygoot WT (C/C) verviel het verband (p= 0.32).
Wanneer we het globale effect bekeken, verviel dit eveneens (ANOVA p= 0.062).
Verder was de SNP in onze populatie ook borderline-significant verschillend voor de
spiermassa of lean body mass (LBM) en dit opnieuw voor homozygote dragers (T/T) ten
opzichte van homozygoot WT (C/C) (p= 0.05). De spiermassa bij de dragers lag gemiddeld
860 gram hoger. Het verschil tussen heterozygote dragers (C/T) en homozygoot WT (C/C)
was niet significant (p= 0.41). Het verband verviel eveneens wanneer we de categorieën
onderling vergeleken (ANOVA p= 0.14).
Er werd geen associatie gevonden tussen de SNP en de andere parameters voor
lichaamssamenstelling, zijnde gewicht, BMI, totale vetmassa en vetpercentage, in de beperkte
database die voor handen was.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
b. Mogelijke verklaringen
Deze SNP is gelegen in het enige intron van het TRHR-gen. De binding van TRH aan TRHR
is nodig om de secretie van TSH te stimuleren, wat leidt tot de vrijlating van T4. We zagen dat
homozygoot dragers (T/T) gemiddeld 1.5 cm groter waren dan WT (C/C). We vermoeden dat
dit te wijten is aan een interactie met de groeihormoon-as. Deze hypothese kan echter niet
bevestigd worden aangezien de concentratie GH niet bepaald is.
T4 is belangrijk in de ontwikkeling van skeletspieren. Mutaties in het TRHR-gen kunnen de
affiniteit voor TRH veranderen, waardoor centrale hypo- of hyperthyreose ontstaat. Dit heeft
vermoedelijk een effect op de expressie van zware keten myosine-isovormen in de spieren.
Verder is T4 ook nodig voor de anabole werking van groeihormoon IGF1, dat een belangrijke
rol speelt in de balans van spiereiwitten. (26)
Het feit dat de homozygoot WT (C/C) 860 gram minder LBM hebben dan homozygote
dragers van de SNP (T/T), zou kunnen wijzen op verminderde spieropbouw.
c. Vergelijking met bestaande literatuur
De gevonden associatie tussen de SNP en de lengte is een nieuw gegeven en werd dus nog
niet eerder besproken in de literatuur.
In de voorgaande genome-wide association studie (GWAS) (26) werd reeds een associatie
gevonden tussen deze SNP (rs7832552) en de spiermassa of LBM. De homozygote dragers
van de SNP hadden gemiddeld een 2.55 kg hogere LBM ten opzichte van de heterozygote
dragers en de niet-dragers (p= 7.58x10-8). Leeftijd, geslacht en vetmassa (fat body mass of
FBM) werden gezien als significante beïnvloedende factoren van LBM (p < 0.05). Daarom
werden de ruwe data voor LBM in de GWAS hiervoor aangepast.
In het huidige onderzoek zagen we een veel minder uitgesproken effect op de LBM. Dit kan
te maken hebben met het feit dat onze gegevens niet werden gecorrigeerd voor leeftijd,
geslacht en FBM. Er werd eveneens een verschil in LBM waargenomen tussen het T/T
genotype en het C/C genotype, maar dit verschil bedraagt slechts 860 gram (p= 0.05). Verder
werd ook bevestigd dat heterozygote dragers (C/T) niet significant verschillend waren van
homozygoot WT (C/C) (p= 0.40). Het effect valt dan ook weg in de ANOVA-vergelijking
waaruit we algemeen kunnen afleiden dat dragers van de SNP niet significant verschillend
waren van niet-dragers (p= 0.14).
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
4.2
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Deiodinase 1
Deïodinase 1 speelt een belangrijke rol bij de omzetting van T4 naar T3 en dus in de activatie
van de schildklierhormonen. Daarnaast speelt het ook een rol bij de afbraak, meer bepaald in
de omzetting van rT3 naar T2.
De twee SNP‟s in de DIO1 genen (rs11206244 (SNP2) en rs2235544 (SNP3)) zouden dus
theoretisch een effect moeten hebben op de concentraties FT3, rT3 en FT4. Peeters et al. (27)
rapporteerden significante associaties van SNP2 met toegenomen FT 4, rT3 en rT3/FT4 en
afgenomen TT3/rT3 en FT3/FT4. Panicker et al. rapporteerden significante associaties van
SNP3 met toegenomen FT3, afgenomen FT4 en rT3 en dus ook een toegenomen FT3/FT4, wat
allemaal wijst op een toegenomen enzymactiviteit. Volgens Panicker et al. zijn beide SNP‟s
in linkage disequilibrium (r2= 0.41), waarbij rs2235544 de drijvende kracht is van de
associatie (gezien de kleinere P-waarde). (12)
4.2.1 rs11206244
a. Eigen bevindingen
De resultaten van rs11206244 staan samengevat in tabel 7a. We zagen een significant stijging
in de concentratie rT3 bij dragers van de SNP ten opzichte van de WT. Bij heterozygote
dragers was de concentratie 0.018 ng/ml hoger (p= 0.01) en bij homozygote dragers van de
SNP was deze 0.037 ng/ml hoger (p< 0.0001). De ANOVA p-waarde bedroeg 0.0001 wat
betekent dat de verschillen tussen de categorieën als significant kunnen beschouwd worden.
De concentratie FT4 was bij homozygote dragers significant hoger dan bij homozygote nietdragers (p= 0.017). Het verschil bedroeg 0.05 ng/dl. De ANOVA p-waarde was eveneens
significant en bedroeg 0.03.
Voor de verhoudingen van verschillende parameters, werd een significant resultaat gevonden
voor FT3/FT4 en TT3/rT3 en dit voor de homozygote dragers ten opzichte van WT
(respectievelijk p= 0.003 en p= 0.0009). De ANOVA p-waarden waren hierbij eveneens
significant (p= 0.008 en p= 0.004). Beide waarden voor de verhoudingen daalden bij dragers
van de SNP. Het verschil voor de ratio FT3/FT4 bedroeg 0.16 en voor de ratio TT3/rT3 was
dit 1.13 lager bij dragers van de SNP ten opzichte van niet-dragers.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Wat lichaamssamenstelling (zie tabel 8b) betreft, werd een significante invloed gezien op de
lengte en dit voor zowel hetero- als homozygote dragers van de SNP (respectievelijk p= 0.005
en p= 0.03). De heterozygote dragers waren gemiddeld 1.7 cm groter en de homozygoot
mutanten waren gemiddeld 2.0 cm groter dan de homozygoot WT. Ook de ANOVA pwaarde was significant en bedroeg 0.009.
Verder was er enkel nog een borderline significant resultaat gevonden voor de BMD van de
heup en dit voor heterozygote dragers ten opzichte van WT (p= 0.06). Dit leidde tot een BMD
die 0.016 g/cm2 lager was bij de heterozygote dragers.
b. Mogelijke verklaringen
De SNP zorgt een verlaagde activiteit van D1 waardoor er verschillende effecten op de
schildklierhormoonparameters te zien zijn. D1 is vooral belangrijk in de productie van T3 en
klaring van rT3 in het serum. We verwachten dus dat er bij verlaagde activiteit van D1 minder
T3 en meer rT3 aanwezig zal zijn in het serum. Voor rT3 wordt dit bevestigd in ons onderzoek,
maar wat betreft T3 bekwamen we geen significante resultaten. Dit kan te wijten zijn aan het
feit dat T3 ook nog gevormd wordt via alternatieve pathways. Verder werd ook een
significante stijging gezien in FT4 bij homozygoot mutanten en dit omdat minder FT 4 wordt
omgezet naar FT3 door de gedaalde activiteit van D1. Het logische gevolg van de stijging in
rT3 is een daling in de ratio TT3/rT3. Verder zien we ook een daling van de ratio rT3/FT4 en dit
omdat het effect op rT3 veel groter is dan het effect op FT4 (p= 0.0001 tov p= 0.03).
Het effect op de lengte is mogelijk te wijten aan het later sluiten van de groeischijven door
verlaagde activiteit van D1 en dus door een verminderde beschikbaarheid van T3 en
toegenomen beschikbaarheid van T4. T3 is namelijk verantwoordelijk voor het sluiten van de
groeischijven. Wanneer er dus minder T3 aanwezig is, is het mogelijk dat de groeischrijven
iets later sluiten waardoor men iets langer groeit. T 3 stimuleert de osteoblasten die zorgen
voor botvorming en dus voor verbening van de kraakbenige groeischijven. (28) Daarnaast
werd een mogelijk link met de GH-as mogelijk geacht.
Voor de daling in de BMD van de heup (C/T tov C/C) hebben we geen duidelijke verklaring.
Er zijn tevens geen gelijkaardige associaties gevonden in de literatuur. Gezien de significante
verschillen enkel opgaan voor heterozygoot dragers ten opzichte van WT, doet dit vermoeden
dat deze bevindingen enkel op toeval berusten.
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
c. Vergelijking met bestaande literatuur
Door Peeters et al. (27) werd het verband tussen twee SNP‟s onderzocht, namelijk
rs11206224 (C/T) en rs12095080 (A/G), waarbij blijkt dat slechts drie haplotypes voorkomen
in een cohorte van gezonde bloeddonoren. Voor deze drie haplotypes werd de invloed op
schildklierhormoonparameters nagegaan. Haplotype 1 (C-A) is het homozygoot wild type
voor beide SNP‟s en heeft geen correlatie met de schildklierhormoonparameters. Haplotype 2
(T-A) kent een significant positieve correlatie met rT3 en rT3/FT4 en een significante
negatieve correlatie met TT3/rT3. Voor haplotype 3 (C-G) geldt het omgekeerde -weliswaar
niet significante- verband. Algemeen kan dus gesteld worden dat SNP2 een negatief effect
heeft op de activiteit van deïodinase 1. In een recenter onderzoek van van der Deure et al.
(15), uitgevoerd op een grotere populatie, werd het effect van de SNP rs12095080 niet
bevestigd, waardoor we hebben besloten deze SNP niet te onderzoeken.
Beide onderzoeken tonen aan dat dragers van de SNP rs11206244 gekenmerkt worden door
een stijging in rT3 en FT4, een daling in TT3/rT3 en een stijging in rT3/FT4 door de
verminderde
activiteit
van
D1.
Het
geobserveerde
effecten
op
de
schildklierhormoonparameters uit voorgaande studies werden in onze studie bevestigd.
Wanneer we het effect op de verschillende parameters van lichaamssamenstelling
onderzochten, werd enkel een significant effect gevonden op de lengte. Dragers van het Tallel zijn groter dan niet dragers. Bij heterozygote dragers zien we een gemiddelde stijging in
de lengte van 1.7 cm, bij homozygoten is dit 2.0 cm. Deze bevinding werd nog niet eerder
beschreven in de literatuur.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
4.2.2 rs2235544
a. Eigen bevindingen
In onze studie bestond er een uitgesproken significant verschil tussen dragers van de SNP en
WT-dragers wat betreft rT3 met een ANOVA p-waarde van 0.0001. Bij de heterozygote
dragers lag de concentratie rT3 0.22 ng/ml lager dan bij homozygoot WT (p= 0.0001). Bij
homozygote dragers was de concentratie 0.029 ng/ml lager (p= 0.0002).
Ook de concentratie FT3 was significant verschillend maar dit enkel voor heterozygote dragers
ten opzichte van WT (p= 0.014). Het verschil bedroeg 0.090 ng/dl met een ANOVA p-waarde
van 0.05 (borderline significant). Verder werd ook nog een borderline significant resultaat
gezien bij heterozygoot mutanten wat betreft FT4 (p= 0.05), waarbij bij de mutanten de
concentratie FT4 1.78 ng/dl lager lag. De ANOVA p-waarde was hierbij niet significant en
bedroeg 0.14.
Voor de verhouding FT3/FT4 lag de waarde bij heterozygote (p= 0.0002) en homozygote (p=
0.04) dragers respectievelijk 0.11 en 0.10 hoger dan bij het WT. De ANOVA p-waarde
bedroeg 0.0011. Gezien het significante verschil in rT 3 was het ook logisch dat er een
significant verschil gezien werd in de verhouding TT3/rT3. De waarden bij heterozygote en
homozygote dragers van de SNP lagen respectievelijk 0.89 en 0.74 hoger dan bij het WT (pwaarde was respectievelijk <0.0001 en 0.007). De ANOVA p-waarde was eveneens
significant en bedroeg 0.0001. Tot slot werd ook een significant verschil gezien bij TT3/TT4
(ANOVA p-waarde was 0.011), waarbij de heterozygoten een concentratie hadden die
gemiddeld 0.001 hoger ligt dan bij WT (p= 0.007). Het verschil is echter niet significant
tussen de homozygoot WT en homozygote dragers van de SNP.
In het eigen onderzoek werd ook nog gekeken naar de effecten op verschillende parameters
van de lichaamssamenstelling. Er werd enkel een associatie gevonden met de lengte. Dragers
van het C-allel zijn kleiner dan niet-dragers. Bij de vergelijking van heterozygoten met
homozygoot WT bedroeg het verschil 0.4 cm (p= 0.047). Het verschil werd groter bij
homozygote dragers van de SNP ten opzichte van homozygoot WT en bedroeg dan gemiddeld
1.9cm (p= 0.0050). Ook wanneer we de categorieën onderling vergeleken, bleef het resultaat
significant (ANOVA p= 0.016).
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
b. Mogelijke verklaringen
De SNP zorgt een verhoogde activiteit van D1. Hierdoor zijn er verschillende effecten te zien
op de schildklierhormoonparameters. Zoals reeds vermeld, is D1 vooral belangrijk in de
productie van serum T3 en klaring van serum rT3. We verwachtten dus dat er bij verhoogde
activiteit van D1 meer T3 en minder rT3 worden gevonden in het serum. We zagen inderdaad
een significante daling in rT3 bij dragers van de SNP, omdat deze sneller werd omgezet naar
T2. We zagen verder een stijging in FT3, maar deze was slechts borderline-significant en ging
enkel op, wanneer gekeken naar de categorieën onderling, voor heterozygoot mutanten ten
opzichte van WT. Mogelijke verklaring is dat de T 3 ook reeds deels wordt omgezet tot T 2 en
dit eveneens onder invloed van D1. De borderline-significant lagere concentratie in FT 4 bij de
heterozygoten kan verklaard worden doordat door de verhoogde activiteit van D1 meer FT 4
wordt omgezet naar FT3. Het feit dat er enkel borderline-significante resultaten worden
bekomen en dit enkel voor de heterozygoot mutanten, doet vermoeden dat hier sprake is van
toeval. De toename van FT3/FT4 is te wijten aan de toename in FT3 en eventueel ook de
daling in FT4. De stijging van TT3/rT3 is te wijten aan de afname in rT3.
Het geobserveerde effect op de lengte is mogelijks te wijten aan de verhoogde T 3concentratie, wat een snellere sluiting van de groeischijven en dus een vroegere groeistop tot
gevolg kan hebben. Dit is een mogelijke reden waarom mutanten kleiner zijn dan niet
mutanten. (28)
c. Vergelijking met bestaande literatuur
Een veel voorkomende variant in intron 3 van het DIO1 gen (rs2235544) is een duidelijke
genetische merker geassocieerd met veranderingen in de omzetting van FT4 naar FT3. De SNP
is geassocieerd met de concentratie van FT3, rT3 en FT4 en de verhouding FT3/FT4. Elke kopij
van het C-allel is geassocieerd met een toename van FT 3/FT4 van ±2 SD. Het C-allel is
geassocieerd met een hogere deïodinase 1 enzymactiviteit (stijging FT3/FT4 en FT3, daling
FT4 en rT3). De SNP rs2235544 is verantwoordelijk voor ±2% van de genetische variatie in
FT4 en 1,5% in FT3. Ondanks het effect op FT3/FT4 is er geen associatie tussen rs2235544 en
de circulerende concentratie TSH. Hierdoor kan rs2235544 gebruikt worden als een
hulpmiddel om de effecten van de veranderingen in het evenwicht tussen circulerend T3 en T4
na te gaan op verschillende weefsels, in afwezigheid van een toename in algemene TH
productie. (12)
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
De in de literatuur reeds besproken relatie van de SNP met FT 3/FT4 en rT3 werd in dit
onderzoek bevestigd. Dit was eveneens het geval voor de afwezigheid van de invloed op TSH
(A/C tov C/C p= 0.998, A/A tov C/C p= 0.11 en ANOVA p= 0.18). De relatie met FT3 werd
echter enkel bevestigd voor het heterozygote genotype (p= 0.001, verschil= 0.071nmol/l) en
niet voor de homozygote dragers (p= 0.21). Bij vergelijking tussen de categorieën werd een
borderline-significant resultaat gezien (ANOVA p= 0.05). De relatie met FT4 werd in dit
onderzoek niet bevestigd (A/C tov C/C p= 0.05, A/A tov C/C p= 0.22 en ANOVA p= 0.14),
enkel bij het heterozygote genotype zien we een borderline significant verschil met
homozygoot WT. De meest uitgesproken significante invloed werd gevonden op rT3
(ANOVA p= 0.0001). Bij de heterozygote dragers lag de concentratie rT3 0.22 nmol/l lager
dan bij homozygoot WT (p= 0.0001). Bij homozygote dragers was de concentratie 0.029
nmol/l lager (p= 0.0002). Ondanks het feit dat FT3 en FT4 over het algemeen bekeken niet
significant verschillend zijn, is er toch een significant verschil gezien in de verhouding van
beiden FT3/FT4 (p= 0.0011) waarbij zowel het hetero- als homozygote genotype zorgen voor
een waarde die 0.10 hoger ligt dan bij het WT (respectievelijk p= 0.0002 en p= 0.04).
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
4.3
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Deiodinase 2
D2 speelt een rol in thermogenese, wat minder van belang is bij volwassenen. D2 mRNA is
wel aanwezig in het volwassen menselijk hart en in de skeletspieren en speelt dus mogelijks
een rol in de thyroïdstatus en de metabole activiteit van de skeletspieren. De activatie van T4
naar T3 door D2 zorgt voor verandering in intracellulair schildklierstatus op een
weefselspecifieke manier, onafhankelijk van serum T3. (17)
4.3.1 rs225014
a. Eigen bevindingen
In het huidige onderzoek werd bij de door ons onderzochte parameters van
lichaamssamenstelling en schildklierconcentraties enkel een significant resultaat gevonden
voor de BMD van de wervelzuil en TT4.
Bij het eerste zien we een significant verschil tussen homozygoot mutanten en homozygoot
WT (p= 0.04), wat wijst op een verschil in BMD ter hoogte van de wervelzuil van 0.032
g/cm2 (mutant lager dan WT). Er is geen significant verschil tussen de 3 genotypes (ANOVA
p= 0.12).
Wat betreft TT4 is eveneens enkel een significant verband te zien voor C/C ten opzichte van
T/T (p= 0.048) met een 9.44 nmol/l lagere concentratie tot gevolg. Ook hier vervalt het
verband wanneer gekeken wordt naar de verschillende categorieën (ANOVA p= 0.14).
b. Mogelijke verklaringen
Deze SNP heeft een toegenomen werking van D2 tot gevolg waardoor een toegenomen botturnover en dus een gedaalde botmassa mogelijk is en dit onder andere ter hoogte van de
wervelzuil zoals geobserveerd in ons onderzoek. Verder kan de toegenomen activiteit van D2
ook de daling in T4 verklaren, aangezien er een verhoogde omzetting verwacht wordt van T 4
naar T3.
Uit eerdere studies bleek echter dat D2 vooral lokaal werkt. In onze studie hebben we geen
gegevens verzameld over de invloed op weefselniveau, maar er wordt wel een lokale daling in
T4 verwacht.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
c. Vergelijking met bestaande literatuur
Volgens de Jong et al. (29) heeft het D2-Thr92Ala polymorfisme geen effect op serum THlevels. De mogelijkheid bestaat wel dat de SNP een effect heeft op de locale TH-activiteit,
omdat D2 vooral betrokken is in de conversie van T 4 naar T3 op weefselniveau. Er wordt
gesuggereerd dat de potentiële effecten van het D2-polymorfisme teniet gedaan worden door
gestegen D3-activiteit. Klinische observaties suggereren een duidelijke betrokkenheid van TH
in botmetabolisme, maar de moleculaire mechanismen waardoor TH inwerkt op bot zijn nog
deels onbekend. Bij de mens is er een significante associatie tussen bot-mineraaldensiteit
(BMD) en serum-TH-concentraties te zien. T3 promoot osteoblastische proliferatie,
differentiatie, apoptose en ook osteoclastvorming en -activatie, waardoor het leidt tot
bothermodellering.
De relatie tussen de drie D2 Thr92Ala genotypes, BMD en biochemische parameters van
skeletmetabolisme werd bestudeerd via stapsgewijze regressie. Na correctie voor
verschillende parameters werd een significante onafhankelijke relatie gevonden tussen de
verschillende genotypes en de BMD van de femurhals (6% lager in homozygoten tov WT
patiënten). Hetzelfde gold ook voor de totale BMD van de heup en er werden eveneens
relaties met biochemische parameters van skeletmetabolisme gezien. Uit de studie werd
geconcludeerd dat de daling in locale beschikbaarheid van T 3 ten gevolge van de SNP in D2
mogelijk kan resulteren in een toegenomen botturnover en gedaalde botmassa van de
femurhals. (17)
In de huidige studie werd dus een invloed gezien op de BMD van de wervelzuil, in
tegenstelling tot een vorig onderzoek waar een verband gezien werd tussen de SNP en de
BMD van de femurhals en de heup. Dit doet vermoeden dat de SNP een invloed heeft op de
BMD in het algemeen. Verder is de geobserveerde invloed op T4 een nieuw aspect dat nog
niet eerder werd besproken.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
4.4
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Invloed van SNP2 en 3 op de verschillende lengteparameters
Aangezien er bij de beide SNP‟s in DiO1 een associatie werd gezien met de lichaamslengte,
werd ook het effect op de andere lengteparameters bepaald. Hieruit bleek dat SNP2
(rs11206244) ook positief geassocieerd was met de calf height, sitting height, sternum height
en armenspan. Alle ANOVA p-waarden waren hierbij significant.
Voor SNP3 (rs2235544) kon de associatie met de totale lichaamslengte niet worden
doorgetrokken naar de andere lengteparameters voor heterozygoten. Voor homozygote
dragers van de SNP werd wel een significante associatie gezien met calf height, sitting height
en armenspan maar niet met sternum height. De ANOVA p-waarde was enkel significant voor
armenspan (p= 0.009).
De verwachte tegengestelde associaties tussen SNP2 en SNP3 wat betreft verschillende
lengteparameters werden in onze studie dus enkel bevestigd voor homozygote dragers.
5. Algemeen besluit
Algemeen kunnen we besluiten dat de genetische varianten in de HPTA een invloed hebben
op de schildklierhormoonparameters die in lijn zijn met de gewijzigde activiteit in D1 en D2.
Verder hebben de genetische varianten ook een invloed op de verschillende parameters van
lichaamssamenstelling. Zo hebben SNP1, 2 en 3 een invloed op de lengte. Verder heeft SNP1
ook een invloed op de LBM en heeft SNP4 een invloed op de botmassa of BMD.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
6. Referentielijst
1.
Handboek Anatomie : Human anatomy. Marieb, Mallatt and Wilhelm. 4th edition, 2005 p.719.
2.
http://img.webmd.com/dtmcms/live/webmd/consumer_assets/site_images/articles/image_article_collections/
anatomy_pages/THYROID_72.jpg
3.
Handboek Endocrinology: An integrated approach. Nussey SS and Whitehead SA. London: Taylor &
Francis (2001) hoofdstuk 3 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=endocrin&part=A235)
4.
Thyroid function testing. GA Brent. Springer 2010. Hoofdstuk 1 : thyroid hormone metabolism p.3, fig 1.2
5.
Chiamolera MI and Wondisford FE. Minireview: thyrotropin-releasing hormone and the thyroid hormone
feedback mechanism. Endocrinology 2009; vol. 150 : p.1091-1096
6.
Basset JHD and Williams GR. Critical role of hypothalamic-pituitary-thyroid axis in bone. Bone 2008; vol.
43 : p.418-426
7.
Van der Deure WM, Peeters RP and Visser TJ. Genetic variation in thyroid hormone transporters. Best
Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism 2007; vol. 21 (2) : p.339-350.
8.
Sinclair D. Analytical aspects of thyroid antibodies estimation. Autoimmunity 2008; vol.41 (1) : p.46-54
9.
Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods (21st ed.). McPherson RA and Pincus
MR. Saunders, 21st edition, august 2006
(http://www.amazon.com/Clinical-Diagnosis-Management-Laboratory-Methods/dp/1416002871)
10. Heuer H and Visser TJ. Minireview: Pathophysiological importance of thyroid hormone transporters.
Endocrinology 2007; 150 (3) : p.1078-1083
11. Thyroid function testing. GA Brent. Springer 2010. Hoofdstuk 1 : thyroid hormone metabolism p.7, fig 1.4
12. Panicker V, Cluett C, Shields B, Murray A, Parnell KS, Weedon MN, Singleton A, Hernandez D, Evans J,
Durant C, Ferrucci L, Melzer D, Saravanan P, Visser TJ, Ceresini G, Hattersley AT, Vaidya B, Dayan CM
and Frayling TM. A common variation in deiodinase 1 gene DIO1 is associated with the relative levels of
free thyroxine and triiodothyronine. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2008; vol. 93 (8) :
p.3075-3081
13. Jones DD, May KE and Geraci SA. Subclinical thyroid disease. The American Journal of Medicine 2010;
vol. 123 (6) : p. 502-504
14. De Lloyd A, Bursell J, Gregory JW, Rees DA and Ludgate M. TSH receptor activation and body
composition. Journal of Endocrinology 2010; vol. 204 : p. 13-20
15. Van der Deure WM, Hansen PS, Peeters RP, Uiterlinden AG, Fenger M, Kyvik KO, Hegedüs L and Visser
TJ. The effect of genetic variation in the type 1 deiodinase gene on the interindividual variation in serum
thyroid hormone levels: an investigation in healthy Danish twins. Clinical endocrinology 2009; vol. 70 : p.
954-960
16. Canani LH, Capp C, Dora JM, Souza Meyer EL, Wagner MS, Harney JW, Larsen PR, Gross JL, Bianco AC
and Maia AL. The type 2 Deiodinase A/G polymorphism is associated with decreased enzyme velocity and
increased insuline resistance in patients with type 2 Diabetes Mellitus. Journal of Clinical Endocrinology
and Metabolism 2005; vol. 90 (6) : p. 3472-3478
17. Heemstra K, Hoftijzer H, Van der Deure WM, Peeters RP, Hamdy NA, Pereira A, Corssmit EP, Romijn JA,
Visser TJ and Smit JW. The type 2 dieodinase Thr92Ala polymorphism is associated with increased bone
turn-over and decreased femoral neck bone mineral density. Journal of Bone and Mineral Research 2010;
vol.25 (6) : p. 1385-1391
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
18. Kim J, Wang Z, Heymsfield SB, Baumgartner RM and Gallagher D. Total body skeletal muscle mass:
estimation by a new dual-energy X-ray absorptiometry method. American Journal of Clinical Nutrition
2002; vol. 76 : p. 378-383.
19. Van Langendonk L, Claessens AL, Lefevre J, Thomis M, Phillippaerts R, Delvau K, Lysens R, Vanden
Eynde B and Beunen G. Association between bone mineral density (DXA), body structure and body
composition in middle-aged men. American Journal of Human Biology 2002; vol. 14 : p. 735-742
20. http://www.mannen-gezondheid.com/vetverbranding.html
21. Ashe MC, Khan KM, Kontulainen SA, Guy P, Liu D, Beck TJ and McKay HA. Accuracy of pQCT for
evaluating the aged human radius: an ashing, histomorphometry and failure load investigation. Osteoporosis
international 2006; vol. 17 : p. 1241-1251
22. Drouin JL, Valovic-McLeod TC, Schultz SJ, Gansneder BM and Perrin DH. Reliability and validity of the
Biodex system 3 isokinetic dynamometer velocity, torque and position measurements. European Journal of
Applied Physiology 2004; vol. 91 : p. 22-29.
23. Hamilton GF, McDonald C and Chenier TC. Measurement of grip strength: Validity and reliability of the
Sphygmomanometer and Jamar grip dynamometer. JOSPT 1992; vol.16 (5): p. 215-219
24. Taqman drug metabolism genotyping assays; Reference guide. Part1.Background information, Chapter
1.Introduction, Overview of Taqman probe-based chemistry. Figuur 1-2, p.1-8
25. Baecke JA, van Staveren WA and Burema J. Food consumption, habitual physical activity, and body fatness
in Young Dutch adults. American Journal of Clinical Nutrition 1983; vol. 37 (2): p.278-286
26. XG Liu, LJ Tan, SF Lei, YJ Shen, L Wang, H Yan, YF Guo, DH Xiong, XD Chen, F Pan, TL Yang, YP
Zhang, Y Guo, NL Tang,XZ Zhu, HY Deng, S Levy, RR Recker, CJ Papasian and HW Deng. Genome-wide
association and replication studies identified TRHR as an important gene for lean body mass. The American
Journal of Human Genetics 2009; vol. 84: p.418-423
27. Peeters RP, van den Beld AW, van Toor H, Uitterlinden AG, Janssen JAM, Lamberts SWJ and Visser TJ.
A polymorphism in type I deiodinase is associated with circulating free insulin-like growth factor I levels
and body composition in humans. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2005; vol.90 (1) :
p. 256–263
28. Basset JHD and Williams GR. The molecular actions of thyroid hormone in bone. Trends in endocrinology
and metabolism 2003; vol.14 (8): p. 356-364
29. De Jong FJ, Peeters RP, den Heijer T, van der Deure WM, Hofman A, Uitterlinden AG, Visser TJ and
Breteler MMB. The association of polymorphisms in the type 1 and 2 deiodinase genes with circulating
thyroid hormone parameters and atrophy of the medial tamporal lobe. The Journal of Clinical Enocrinology
& Metabolism 2007; vol.92 (2) : p. 636-640
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Bijlagen
1. Protocols RIA
T3
X. PROCEDURE
A. Handling notes
Do not use the kit or components beyond expiry date.
Do not mix materials from different kit lots.
Bring all the reagents to room temperature prior to use.
Thoroughly mix all reagents and samples by gentle agitation or swirling.
Use a clean disposable pipette tip for addition of each different reagent and
sample in order to avoid cross-contamination.
High precision pipettes or
automated pipetting equipment will improve the precision.
Respect the incubation times.
Prepare a calibration curve for each run, do not use data from previous runs.
B. Procedure
1. Label coated tubes in duplicate for each calibrator, control and sample. For the
determination of total counts, label 2 normal tubes
2. Briefly vortex calibrators, controls and samples and dispense 50μl of each into the
respective tubes.
3. Dispense 200 µl of 125 Iodine labelled T3 into each tube, including the uncoated tubes for
total counts.
4. Dispense 100 µl of anti-T3 into each tube, except tubes for total counts.
5. Shake the tube rack gently by hand to liberate any trapped air bubbles.
6. Incubate for 1 hour at room temperature with continuous shaking.
7. Aspirate (or decant) the content of each tube (except total counts). Be sure that the plastic
tip of the aspirator reaches the bottom of the coated tube in order to remove all the liquid.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
8. Wash tubes with 2 ml Working Wash solution (except total counts) and aspirate (or
decant). Avoid foaming during the addition of the Working Wash solution.
9. Let the tubes stand upright for two minutes and aspirate the remaining drop of liquid.
10. Count tubes in a gamma counter for 60 seconds.
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
XI. CALCULATION OF RESULTS
1. Calculate the mean of duplicate determinations.
2. Calculate the bound radioactivity as a percentage of the binding determined at the zero
calibrator point (0) according to the following formula :
B/B0 (%) = (Counts (calibrator or sample)/Counts (zero calibration)) x 100
3. Using a 3 cycle semi-logarithmic or logit-log graph paper, plot the (B/B0(%)) values for
each calibrator point as a function of the T3 concentration of each calibrator point. Reject
obvious outliers.
4. Computer assisted methods can also be used to construct the calibration curve. If automatic
result processing is used, a 4-parameter logistic function curve fitting is recommended.
5. By interpolation of the sample (B/B0 (%)) values, determine the T3 concentrations of the
samples from the calibration curve.
6. For each assay, the percentage of total tracer bound in the absence of unlabelled T3 (B0/T)
must be checked.
T4
X. PROCEDURE
A. Handling notes
Do not use the kit or components beyond expiry date.
Do not mix materials from different kit lots.
Bring all the reagents to room temperature prior to use.
Thoroughly mix all reagents and samples by gentle agitation or swirling.
Use a clean disposable pipette tip for addition of each different reagent and
sample in order to avoid cross-contamination.
High precision pipettes or
automated pipetting equipment will improve the precision.
Respect the incubation times.
Prepare a calibration curve for each run, do not use data from previous runs.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
B. Procedure
1. Label coated tubes in duplicate for each calibrator, control and sample. For the
determination of total counts, label 2 normal tubes
2. Briefly vortex calibrators, controls and samples and dispense 20μl of each into the
respective tubes.
3. Dispense 200 µl of 125Iodine labelled T4 into each tube, including the uncoated tubes for
total counts.
4. Dispense 100 µl of anti-T4 into each tube, except tubes for total counts.
5. Shake the tube rack gently by hand to liberate any trapped air bubbles.
6. Incubate for 1 hour at room temperature with continous shaking.
7. Aspirate (or decant) the content of each tube (except total counts). Be sure that the plastic
tip of the aspirator reaches the bottom of the coated tube in order to remove all the liquid.
8. Wash tubes with 2 ml Working Wash solution (except total counts) and
aspirate (or decant). Avoid foaming during the addition of the Working Wash solution.
9. Let the tubes stand upright for two minutes and aspirate the remaining drop of liquid.
10. Count tubes in a gamma counter for 60 seconds.
XI. CALCULATION OF RESULTS
1. Calculate the mean of duplicate determinations.
2. Calculate the bound radioactivity as a percentage of the binding determined at the zero
calibrator point (0) according to the following formula :
B/B0 (%) = (Counts (calibrator or sample)/Counts (zero calibration)) x 100
3. Using a 3 cycle semi-logarithmic or logit-log graph paper, plot the (B/B0(%)) values for
each calibrator point as a function of the T4 concentration of each calibrator point. Reject
obvious outliers.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
4. Computer assisted methods can also be used to construct the calibration curve. If automatic
result processing is used, a 4-parameter logistic function curve fitting is recommended.
5. By interpolation of the sample (B/B0 (%)) values, determine the T4 concentrations of the
samples from the calibration curve.
6. For each assay, the percentage of total tracer bound in the absence of unlabelled T4 (B0/T)
must be checked.
rT3
6. Methodology
6.1. Collection and handling of serum samples
- Serum: the blood samples must be collected into dry tubes. The serum must beseparated by
centrifigutation.
- Plasma: add an anticoagulant, centrifuge for 10 minutes and collect the plasma.
- Storage: the serum may be assayed within 24 hours if stored at 2-8°C, or afterperiods if
stored at -20°C. Repeating freezing and thawing must be a voided.
- Dilutions: the samples have to be assayed undiluted. Eventual dilutions must be
performed using “0” Calibrator supplied with the kit.
6.2. Assay procedure
Do not mix reagents of different lots.
Bring the different components of the kit to room temperature prior to use.
Perform the assay in duplicates.
Calibrators, control and samples must be assayed at the same time and in duplicate.
Follow strictly the different steps of the procedure and use interchangeable tips.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Label the tubes in duplicate for T ("Total count"), NSB, calibrators, control serum and
samples.
1. NSB : pipette 200 μl of calibrator 0 into the corresponding tubes.
2. CAL 0-7 : pipette 100 μl of each calibrator into the corresponding tubes.
3. Control serum and samples : pipette 100 μl of each control serum or samples into the
corresponding tubes.
4. Add 100 μl of 125I-rT3 tracer to each tube. Prepare also2 tubes containing only 100 μl of
tracer for the determination of the total activity (T tubes).
The "Total count" tubes do not participate in the following steps.
5. Add 100 μl of anti-rT3 antiserum (Ab rT3) to each tube, except NSB and total radioactivity
tubes. Mix all tubes with a vortex mixer.
6. Incubate for 3 hours at room temperature (18-25°C).
7. Add 1 ml of SOLN PEG to each tube, except T tubes (total radioactivity).
8. Mix all tubes with a vortex mixer set at high speed until complete mixing of the PEG and
the incubation medium. To not comply with that step could yield serious analytical biases.
9. Centrifuge all tubes except T tubes (total radioactivity), ie
• 20 minutes at 2000 x g;
• 20 minutes at 2500 x g;
• 15 minutes at 3500 x g;
10. Eliminate carefully the supernatant by decantation or aspiration
11. Count radioactivity in each tube in Gamma-Counter for 1 minute.
6.3. Data processing
NSB mean counts may be subtracted from all mean counts except from total radioactivity.
B0 mean counts are used to calculate the % binding in absence of cold antigen (maximum
binding).
B0 mean counts
--------------------------------------------- x 100 = % binding
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Total radioactivity mean counts
% relative binding of standard and samples is calculated with the following formula:
Mean counts (standard, sample or control)
----------------------------------------------------------- x 100 = % relative binding
B0 mean counts
Draw the dose-response curve by plotting the % relative binding of each standard (y
axis) against the relative concentration (x axis) using semilogaritmic paper.
By interpolating on the standard curve the % relative binding of each sample, one obtains the
sample antigen concentration in ng/ml.
The user can choose, according to assay characteristic, the calculation method and the graphic
expression which allows the best data treatment.
TBG
Test procedure
1. Preparations
- Allow all kit components and patient samples to warm up to room temperature.
- Agitate all liquid reagents –including patient sera- gently before use (avoid foam
formation).
- Numer the coated tubes (preferentially using a, b for duplicates). Non-coated
tubes (Ta,b) serve for the measurement of total radioactivity.
- Prepare washing solution: dilute 11ml concentrate with distilled water to yield
550ml. We strongly recommend to contact the manufacturer or distributor before
using other washing solutions.
2. Into the tubes 1a, b,…, 5a, b pipette 20µl of TBG standards with increasing
concentrations, and into tubes 6a, b etc. pipette 20ùl of control serum, resp. of each
sample.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
3. Into each tube –including Ta, b- pipette 100µl of tracer. The tubes Ta, b are now kept
separately until the radioactivity is measured (cf. point 9).
4. Pipette 200µl antibody solution into each tube –except Ta, b.
5. Cover the tubes with adhesive foil and incubate fot 2 hours at room temperature (1727°C) on an orbital shaker (170-250rpm).
6. Aspirate the liquid completely or decant and turn the tubes upside down for a moment
on blotting paper.
7. Thereafter was the tubes –not Ta,b- with 2ml washing solution.
8. Aspirate the liquid completely or decant and turn the tubes upside down for 5-10
minutes on blotting paper.
9. Measure the radioactivity of each tube, including Ta, b. Recommend counting time:
1minute.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
2. Protocol DNA-extractie
Cellyse
-
Voeg 3ml EDTA-bloed toe aan een 15ml tube die 9ml RBC-lyse bevat
Mengen en 10 minuten laten incuberen op een rotor kamertemperatuur (KT)
10 minuten centrifugeren aan 3000-3500 rpm
Verwijder supernatans (witte pellet over in ongeveer 100-200µl)
Vortex tube om cellen opnieuw op te lossen
Voeg 3ml cellyse-oplossing toe en resuspendeer cellen door te mengen (niet vortexen)
Eiwitprecipitatie
-
Voeg 1 ml eiwitprecipitatie-oplossing toe aan het cellysaat
Vortex aan hoge snelheid gedurende 20 seconder om alles te mengen (bruine vlokken
ontstaan)
10 minuten centrifugeren aan 3000-3500 rpm
5minuten incuberen op ijs
Oplossing terug op KT brngen
10 minuten centrifugeren aan 3000-3500 rpm
DNA-precipitatie
-
Breng supernatans (met DNA!) over in andere 15ml tube die 3 ml 100% isopropanol
bevat
Men staal 10 minuten op rotor op KT
5 minuten centrifugeren aan 3000-3500 rpm (DNA = kleine witte pellet)
Giet supernatans af op en laat tube omgekeerd uitdrogen op stukje papier
Voeg 3 ml 70% ethanol toe en meng de oplossing met het DNA (DNA wassen)
5 minuten centrifugeren aan 3000-3500 rpm
Giet voorzichtig supernatans af en laat tube omgekeerd uitdrogen op stukje papier
gedurende 15 minuten
DNA-hydratatie
-
Voeg 200µl DNA-hydratatie-oplossing toe
Laat overnacht op KT rehydrateren
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
3. Protocol PCR : bepaling positieve controles
Stap 1: PCR-mix
-
Maak de PCR mix aan volgens volgende verhoudingen. Vermenigvuldig de volumes (µl)
telkens met het aantal stalen dat je wil amplificeren en maak een overmaat van ongeveer
10%.
o Master mix:
12.5
o Primer 1 = FP:
0.2
o Primer 2 = RP:
0.2
o Aqua:
11.1
o
PCR sample:
1
-
Vortex de mix en breng 24 µl van de mix in elk welletje van de plaat of strip.
-
Voeg nu 1 µl van elk staal toe aan de PCR-mix. Zorg er ook voor dat je steeds 2 of 3
positieve controles meeneemt en een negatieve controle (blanco).
-
Dek de plaat of de strip af met een doorzichtige thermoseal / caps.
-
Vortex de plaat of de strip en draai die daarna kort af met een centrifuge op 1000 RPM.
Stap 2: PCR
-
Plaats de plaat in het PCR toestel en kies het juiste programma (onder Run)
Stap 3: Testen PCR reactie
-
Maak een 2% agarosegel:
o 2.8 g agarosepoeder + 140ml 1mM TBE buffer in geval van 15x20 cm tray
o 3.5 g agarosepoeder + 175 ml 1mM TBE buffer in geval van 15x25 cm tray
o Warm dit mengsel op in de microgolf tot het begint te koken en roer om.
o Daarna 3 tot 4 keer laten opkoken tot dat de oplossing niet meer visceus is.
o Laten afkoelen tot +/- 60°C in een oventje of op de bench en in geltray gieten.
o Laat gel stollen.
-
Breng 2.5 µl orange loading dye in een strip en voeg 2.5 µl staal toe.
-
Laad 5 µl staal + loading dye in de laantjes van de gel (meest linkse laantje 2 µl ladder)
-
30 min op 200 V laten lopen (running buffer = 0.5mM TBE)
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
-
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Laat de gel 15 minuten kleuren in ethidium bromide oplossing in het ethidium bromide
lokaal.
-
DNA visualiseren met behulp van een UV lamp en foto nemen.
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
4. Protocol agarosegelelektroforese
Stap 1: Restrictie enzyme mix
-
Maak de restrictie mix aan volgens volgende verhoudingen (beschreven door producent
restrictie-enzymes). Vermenigvuldig de volumes telkens met het aantal stalen dat je wil
verknippen en maak een overmaat van ongeveer 10%.
o Restrictie buffer Tango:
2
o Restrictie enzyme MspI:
1
o Aqua:
18
o PCR sample:
10
-
Breng 21 µl van de mix in elk welletje van de plaat of strip of in een ebje.
-
Voeg nu 10 µl van elk staal toe.
-
Dek de plaat of de strip af met een doorzichtige thermoseal / caps en plaats de strip
gedurende de gewenste tijd bij de gepaste temperatuur.
Stap 2: Analyse fragmenten dmv gel elektroforese
-
Maak een 2% agarosegel:
o 2.8 g agarosepoeder + 140ml 1mM TBE buffer in geval van 15x20 cm tray
o 3.5 g agarosepoeder + 175 ml 1mM TBE buffer in geval van 15x25 cm tray
o Warm dit mengsel op in de microgolf tot het begint te koken.
o Haal uit de microgolf en roer om.
o Daarna 3 tot 4 keer laten opkoken tot dat de oplossing niet meer visceus is.
o Laten afkoelen tot +/- 60°C in een oventje of op de bench en in geltray gieten.
-
Breng 5 µl orange loading dye in een strip
-
Voeg 10 µl van elk staal toe.
-
Laad 15 µl staal+loading dye in de laantjes van de gel; meest linkse laantje 2 µl ladder
laden (blauw).
-
45 min op 200 V laten lopen (running buffer = 0.5mM TBE)
-
Laat de gel 15 minuten kleuren in ethidium bromide oplossing in het ethidium bromide
lokaal.
Bandjes visualiseren met behulp van een UV lamp en foto nemen.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
5. Protocol Taqman PCR : genotypering stalen
Opm: Werken op ijs is noodzakelijk
Bereken hoeveel van elk product je nodig hebt en hou rekening met overmaat van ongeveer 2
stalen. Voor 1 staal heb je nodig:
a. 5 μL Taqman gtXPRESS (2x)
b. 0.5 μL SNP genotyping assay (20x)
c. 3.5 μL H2O
Maak oplossing in 1,5 mL epje, vortex zeer goed en verdeel deze oplossing aan 9 μL in 48well plaat met behulp van handystep (Brand tip van 500 μL)
Opm. Tijdens werken met 48-well plaat, probeer zoveel mogelijk de plaat te hanteren aan de
zijschortjes. Op die manier heb je minder kans dat er een substantie op de plaat terecht komt
dat het licht zal „scatteren‟ (in StepOne tijdens uitlezen plaat)
Breng 1 μL DNA (9 ng/μL is max concentratie!!!) naar oplossing (zie plate design om te
weten welk staal op welke plaats hoort)
Neem 1 negatieve en 3 positieve controles mee
Breng Clear adhesive folie op plaat. Neem hierbij alleen de zijkanten van de folie vast! (folie
aandrukken door zachtjes met plastic tool over folie te wrijven, niet met doekje want dit laat
stof achter. Het is niet nodig om de folie stevig aan te drukken want tijdens opwarmen in
Stepone doet de kleefstof wel zijn werk.
Verwijder de plastic randjes van de folie want de kleefstof op de randjes kan mss de StepOne
beschadigen. Als je de grijze plastic tool van applied biosystems gebruikt om de folie tegen te
houden, voorkom je voming van kreuken.
Vortex plaat (niet te zacht) en draai af (centrifuge in telkamer tot 1000 laten komen en
stoppen)
Importeer de gegevens van de plaat in StepOne.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
6. Foto’s gels positieve controles
rs7832552
Na PCR hadden alle aanwezige amplicons een lengte van ongeveer 200bp zoals kon worden
afgelezen van de gel. Dit komt overeen met de verwachte lengte van 205bp.
rs11206244
Na PCR hadden alle aanwezige amplicons een lengte tussen de 100 en 200bp zoals kon
worden afgelezen van de gel. Dit komt overeen met de verwachte lengte van 124bp.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
rs2235544
Na PCR hadden alle aanwezige amplicons een lengte van iets meer dan 100bp zoals kon
worden afgelezen van de gel. Dit komt overeen met de verwachte lengte van 113bp.
rs225014
Na PCR hadden alle aanwezige amplicons een lengte iets meer dan 100bp zoals kon worden
afgelezen van de gel. Dit komt overeen met de verwachte lengte van 114bp.
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
7. Online Hardy-Weinberg calculators
Michael H. Court, 2005-2008,
http://www.tufts.edu/~mcourt01/Documents/Court%20lab%20-%20HW%20calculator.xls
Hardy-Weinberg equilibrium calculator
rs7832552 (1e groep)
Genotypes
Observed #
Genfrequentie (%)
Homozygote reference C/C
346
51.6
Heterozygote C/T
273
40.7
Homozygote variant T/T
51
7.6
Var allele freq
0.28
χ2 =
0.079625405
2
χ test P value =
0.777806
(with 1 degree of freedom)
Hardy-Weinberg equilibrium calculator
rs7832552 (1e en 2e groep)
Genotypes
Observed #
Genfrequentie (%)
Homozygote reference C/C
488
49.5
Heterozygote C/T
424
43.0
Homozygote variant T/T
73
7.4
Var allele freq
0.29
χ2 =
2.149721773
2
χ test P value =
0.142596
(with 1 degree of freedom)
Hardy-Weinberg equilibrium calculator
rs11206244
Genotypes
Observed #
Genfrequentie (%)
Homozygote reference
290
43.0
Heterozygote
310
46.0
Homozygote variant
75
11.0
Var allele freq
0.34
2
χ =
0.333496193
2
χ test P value =
0.563608
(with 1 degree of freedom)
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
Hardy-Weinberg equilibrium
rs2235544
Genotypes
Observed #
Homozygote reference:
214
Heterozygote:
321
Homozygote variant:
133
Var allele freq:
0.44
2
χ =
0.403596069
2
χ test P value =
0.525238
Genfrequentie (%)
32.0
48.1
19.9
(with 1 degree of freedom)
Hardy-Weinberg equilibrium
rs225014
Genotypes
Observed #
Homozygote reference:
288
Heterozygote:
310
Homozygote variant:
77
Var allele freq:
0.34
2
χ =
0.218471189
2
χ test P value =
0.640207
(with 1 degree of freedom)
Genfrequentie (%)
42.7
46.0
11.4
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
8. Afkortingenlijst (alfabetisch)
ATG = anti-TG
ATPO = anti-TPO
BMC = bone mineral content
BMD = bone mineral density
BMI = body mass index
D1 = deïodinase 1
D2 = deïodinase 2
D3 = deïodinase 3
DiO1-gen = deïodinase 1 gen
DiO2-gen = deïodinase 2 gen
DiO3-gen = deïodinase 3 gen
DIT = di-iodotyrosine
DNA = desoxyribonucleïnezuur (of acid)
DXA = dual energy X-ray absorptiometry
ECLIA = elektro-chemoluminiscentie immuno-assay
EDTA = ethylene-diamine tetra-azijnzuur
FT3 = free of vrij T3
FT4 = free of vrij T4
GWAS = genome wide association study
HPTA = hypothalomo-pituitary-thyroid axis
IRD = inner ring deiodination
IVA = instant vertebral assessment
MCT = monocarboxylaat transporter
MIT = monoiodotyrosine
Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen
2e jaar Master in de Biomedische Wetenschappen
NIS = natrium(Na)/jodium(I) symporter
OATP = organic anion transporting peptides
ORD = outer ring deiodination
PCR = polymerase chain reaction
pQCT = peripheral quantative computed tomography
RIA = radio-imunno-assay
rT3 = reverse T3 of 3,3‟,5‟-tri-iodothyronine
SNP = single nucleotide polymorphism
T2 = 3,3‟-di-iodothyronine
T3 = 3,3‟,5-tri-iodothyronine
T4 = thyroxine
TBE-buffer = Tris/Boraat/EDTA-buffer
TBG = thyroid-bindend globuline
TG = thyroglobuline
TH = thyroid hormoon (of schildklierhormoon)
TPO = thyroid peroxidase
TRH = thyroid releasing hormone
TRHR = thyroid releasing hormone receptor
TSH = thyroid stimulating hormone
TSHR = thyroid stimulating hormone receptor
TT3 = totaal T3
TT4 = totaal T4