Bekijk online

UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN
Vakgroep Farmaceutische Analyse
Laboratorium voor Radiofarmacie
Academiejaar 2014-2015
PRODUCTIE EN EVALUATIE VAN EEN ANTI-N-CADHERINE
ANTILICHAAM
Dorien VAN DIEST
Eerste master Farmaceutische Zorg
Promotor
Prof. Dr. Apr. Filip De Vos
Commissarissen
Dr. Apr. Caroline Dumolyn
Prof. Dr. Apr. Olivier De Wever
AUTEURSRECHT
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de
beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk
de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.”
2 juni 2015
SAMENVATTING
Prostaatkanker is de meest voorkomende kanker bij mannen en het aantal sterftegevallen
staat op de tweede plaats bij de kankergerelateerde doodsoorzaken [1, 2]. Gemetastaseerd en
castratieresistente prostaatkanker zijn de meest dodelijke vormen van kanker. Daarom is er nood
aan een methode om deze agressieve vormen van de kanker op te sporen [3]. Bij castratieresistente
prostaatkanker en metastasering van prostaatkanker treedt er switch van E-cadherine naar
N-cadherine op [3, 4]. De stijging in N-cadherine expressie kan gebruikt worden voor de specifieke
targetting van N-cadherine met monoclonale antilichamen. De antilichamen kunnen gelabeld
worden met een radio-isotoop en gebruikt worden bij diagnose en behandeling van vergevorderde
prostaatkanker [5].
In voorgaand onderzoek werd er een hybridomacellijn aangemaakt die anti-N-cadherine
antilichamen produceert. Het antilichaam wordt opgekweekt met behulp van een CELLine CL 350
bioreactor. De aanwezigheid van het antilichaam in het supernatans van de hybridomacellen en de
binding van het geproduceerde antilichaam aan recombinant N-cadherine en de peptidesequentie
waaraan het antilichaam bindt, worden bevestigd met behulp van Western blotting.
Het IgM antilichaam dat wordt geproduceerd door de TE5-BE2 hybridomacellen, wordt
opgezuiverd uit het supernatans. De opzuivering gebeurt op twee manieren, namelijk met behulp
van een HiTrap kolom en met een ammoniumsulfaatprecipatie; deze laatste wordt gecombineerd
met een PD-10 ontzoutingskolom. Na opzuivering wordt bepaald in welke fractie het antilichaam zich
bevindt met coomassie blauwkleuring en Western blotting. De concentratie van het antilichaam in de
opgezuiverde fractie wordt bepaald met behulp van een Micro BCATM Protein Assay Kit.
Tenslotte wordt de binding van het IgM antilichaam aan recombinant N-cadherine,
recombinant E-cadherine, de peptidesequentie en Bovine Serum Albumine (BSA- nagegaan met
behulp van een Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Elisa). Daarnaast wordt de binding van het
antilichaam op cellen getest door gebruikt te maken van een cellijn die N-cadherine tot expressie
brengt (A549) en een cellijn die geen N-cadherine tot expressie brengt (SKBR3). Daarnaast wordt de
binding van het IgM antilichaam aan recombinant N-cadherine, recombinant E-cadherine en A549 en
SKBR3 cellysaten getest met behulp van Western-Blotting en wordt de binding van het anti-murien
IgM antilichaam aan verschillende concentraties van het IgM antilichaam getest.
DANKWOORD
Graag wil mijn promotor, Prof. F. De Vos bedanken om mij de mogelijkheid te geven dit
onderzoek uit te voeren.
Mijn begeleidster, Dr. C. Dumolyn wil ik bedanken voor haar dagelijkse begeleiding bij de
experimenten en goede raad voor het schrijven van mijn thesis.
Ik wil ook alle medewerkers van het labo en mijn medestudenten bedanken voor de goede
sfeer in het labo.
Tenslotte wil ik ook mijn ouders, mijn vrienden en mijn vriend Tim bedanken voor hun steun
op de momenten dat ik het nodig had.
INHOUDSOPGAVE
1.
INLEIDING ............................................................................................................................ 1
1.1.
DE PROSTAAT ............................................................................................................................ 1
1.2.
PROSTAATKANKER .................................................................................................................... 2
1.3.
DIAGNOSE VAN PROSTAATKANKER .......................................................................................... 3
1.3.1.
Screening naar prostaatkanker .............................................................................. 3
1.3.1.1. Digital Rectal Examination ..............................................................................................4
1.3.1.2. Prostaat Specifiek Antigen ..............................................................................................4
1.3.2.
Beeldvormingstechnieken ..................................................................................... 5
1.3.2.1. Transrectale ultrasonografie ..........................................................................................5
1.3.2.2. Comuterized tomografie.................................................................................................6
1.3.2.3. Magnetic resonance imaging ..........................................................................................6
1.3.2.4. Radionuclide bone scintigrafie .......................................................................................7
1.3.2.5. Single-photon emmision computerized tomografie ......................................................7
1.3.2.6. Positron emission tomografie.........................................................................................8
1.4.
THERAPIE VAN PROSTAATKANKER.......................................................................................... 10
1.4.1.
Radioimmunotherapie......................................................................................... 10
1.4.1.1. Antilichamen ................................................................................................................ 10
1.4.1.2. IgM antilichamen ......................................................................................................... 11
1.4.1.3. Gebruik van monoklonale antilichamen bij kanker ..................................................... 11
1.4.1.4. Gebruik van Fab en F(ab)2 fragmenten van monoklonale antilichamen bij kanker .... 12
1.4.1.5. Radioimmunotherapie ................................................................................................. 13
1.5.
EPITHELIALE-MESENCHYMALE TRANSITIE .............................................................................. 14
1.6.
CADHERINES ............................................................................................................................ 15
2.
OBJECTIEVEN...................................................................................................................... 17
3.
MATERIALEN EN METHODEN .............................................................................................. 19
3.1.
DE CELLEN ............................................................................................................................... 19
3.2.
SPLITSEN VAN CELLEN ............................................................................................................. 19
3.2.1.
Splitsen van adherente cellen .............................................................................. 19
3.2.2.
Splitsen van niet-adherente cellen ....................................................................... 19
3.3.
TELLEN VAN CELLEN ................................................................................................................ 20
3.4.
OPKWEKEN VAN HET ANTILICHAAM ...................................................................................... 20
3.5.
SDS-PAGE ................................................................................................................................ 20
3.5.1.
Gieten van de gel ................................................................................................ 21
3.5.2.
Laden van de gel ................................................................................................. 21
3.5.2.1. Trichloorazijnzuurprecipitatie...................................................................................... 22
3.6.
WESTERN BLOTTING ............................................................................................................... 22
3.7.
COOMASSIE KLEURING............................................................................................................ 23
3.8.
OPZUIVERING VAN HET ANTILICHAAM ................................................................................... 23
3.8.1.
HiTrap kolom ...................................................................................................... 23
3.8.2.
Ammoniumsulfaat precipitatie ............................................................................ 24
3.8.3.
Ontzouting .......................................................................................................... 24
3.9.
CONCENTRATIEBEPALING ....................................................................................................... 25
3.10. ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY ........................................................................... 25
3.10.1.
4.
Cellulaire Elisa ..................................................................................................... 26
RESULTATEN ...................................................................................................................... 27
4.1.
PRODUCTIE VAN EEN ANTI-N-CADHERINE ANTILICHAAM...................................................... 27
4.3.
OPZUIVERING VAN HET ANTILICHAAM MET AMMONIUMSULFAATPRECIPITATIE ................ 31
4.4.
ONTZOUTING MET BEHULP VAN EEN PD-10 KOLOM ............................................................. 32
4.5.
CONCENTRATIEBEPALING VAN HET ANTI-N-CADHERINE IGM ANTILICHAAM ....................... 34
4.6.
BINDING VAN HET ANTILICHAAM NAGAAN AAN DE HAND VAN ELISA .................................. 35
4.7.
BINDING VAN HET ANTILICHAAM NAGAAN AAN DE HAND VAN WESTERN BLOTTING ......... 37
5.
DISCUSSIE EN CONCLUSIE ................................................................................................... 39
6.
LITERATUURLIJST ................................................................................................................ 43
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
ADEPT
Antibody Directed Enzym Prodrug Therapie
APS
Ammonium Persulfaat
BCIP
5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfaat
BPH
Beningne Prostaat Hypertrofie
BSA
Bovine Serum Albumine
CT
Computerized Tomografie
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DRE
Digital Rectal Examination
EDTA
Ethyleendiaminetetra-azijnzuur
Elisa
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
EMT
Epitheliale Mesenchymale Transitie
HDP
Hydroxymethyldiphosphonaat
IG
Immunoglobuline
MDP
Methyldiphosphonate
MRI
Magnetic Resonance Imaging
NBT
Nitro Blauw Tetrazolium chloride
PBS
Phosphate Buffered Saline
PET
Positron emission tomografie
PPA
Palpatio Per Anum
PSA
Prostaat-specifiek antigen
PSMA
Prostaat-specifiek membraan antigen
SDS
Natriumdodecylsulfaat
SDS-PAGE
Natriumdodecylsulfaat Polyacrylamide Gel-elektroforese
SPECT
Single-photon emission computerized tomografie
TEMED
Tetramethyleendiamine
TRUS
Transrectale ultrasonografie
WR
Working Reagent
1. INLEIDING
1.1. DE PROSTAAT
De prostaat is een mannelijke geslachtsklier die net onder de blaas voorkomt rond de
urethra (Fig. 1.1A). Hij is verantwoordelijk voor de productie van prostaatvocht dat ongeveer 15%
van het totale ejaculatie volume uitmaakt. Het prostaatvocht dient als voeding voor de zaadcellen en
maakt de zaadcellen beweeglijker [6] (www.kuleuven.be, www.prostaat.be).
Men kan de stoornissen aan de prostaat indelen in drie groepen. Een eerste groep omvat
de goedaardige aandoeningen van de prostaat, ook wel Benigne Prostaat Hypertrofie (BPH) of
prostatisme genoemd. Een tweede groep zijn de maligne prostaataandoeningen. Adenocarcinomen
maken het grootste deel van de maligne prostaataandoening uit. De laatste groep omvat de
infectieuze en inflammatoire ziekten van de prostaat, deze worden ook wel prostatitis genoemd. Eén
derde van alle mannen maakt prostatitis door gedurende zijn leven [6].
De prostaat is opgebouwd uit drie zones (Fig. 1.1B), die elke een verschillende oorsprong
hebben en aanleiding geven tot verschillende pathologieën. De centrale zone bestaat uit 25% van het
prostaatweefsel; toch ontstaan slechts 5% van de prostaatkankers in deze zone. De transitiezone
omvat slechts 5 tot 10% van het prostaatweefsel. In deze zone vindt BPH zijn oorsprong alsook 25%
van de prostaatkankers. Zeventig percent van de prostaatkankers ontstaan in de perifere zone van de
prostaat [6-8].
Figuur 1.1: A: Ligging van de prostaat (www.urologiekortrijk.be), B: Zones van de prostaat: perifere
zone, centrale zone en transitiezone [9]
1
1.2. PROSTAATKANKER
Een tumor is een aandoening waarbij cellen in een weefsel ongecontroleerd beginnen te
delen. Tumorcellen kunnen ontstaan wanneer er mutaties gebeuren in het genetisch materiaal van
de cel. Deze mutaties kunnen enkel ontstaan bij falen van de DNA herstelmechanismen die normaal
de schade aan DNA herstellen. De mutaties kunnen toevallig gebeuren, veroorzaakt worden door
carcinogenen zoals tabaksrook, chemicaliën, bestraling en infectieuze agentia of kunnen erfelijk zijn.
Een kwaadaardige tumor kan invasie in de omliggende weefsels vertonen waarbij het aanliggend
weefsel wordt vernietigd. Soms kan de tumor metastaseren door zich te verspreiden naar andere
plaatsen in het lichaam via het bloed of de lymfe [10].
Prostaatkanker is met een geschatte incidentie van 233 000 nieuwe gevallen in de
Verenigde Staten in 2014 de meest voorkomende kanker bij mannen. Het aantal sterftegevallen in
2014 wordt in de Verenigde Staten op 29 480 geschat, waarmee het bij de man op de tweede plaats
van de kankergerelateerde doodsoorzaken staat (Fig. 1.2) [1, 2].
Figuur 1.2: Geschatte incidentie van de meest voorkomende kankers en sterfgevallen van deze
kankers in 2014 in de Verenigde Staten [2]
2
Het risico op prostaatkanker neemt toe met de leeftijd. Zeventig procent van de
prostaatkankerpatiënten is ouder dan 65 jaar en prostaatkanker komt zelden voor bij mannen onder
de 45 jaar. Het risico op prostaatkanker is ook afhankelijk van de etnische groep; zo hebben mannen
met een zwarte huidskleur een groter risico op prostaatkanker dan blanke mannen. Het risico op
prostaatkanker is ook afhankelijk van de familiale voorgeschiedenis van prostaatkanker en het dieet,
waarbij verzadigd vet het risico op prostaatkanker doet stijgen [6, 7, 11].
Prostaatkankers die lokaal blijven zijn goed behandelbaar, maar de kans op genezing
verkleint wanneer de tumorcellen metastaseren buiten de grenzen van de prostaat [12].
Gemetastaseerde en castratieresistente prostaatkanker zijn de meest dodelijke vormen van kanker,
daarom is er nood aan een methode om deze agressieve vormen van kanker te kunnen opsporen [3].
1.3. DIAGNOSE VAN PROSTAATKANKER
1.3.1. Screening naar prostaatkanker
In het beginstadium vertoont prostaatkanker weinig symptomen. De aanwezigheid van
symptomen wijst meestal eerder op BPH, maar kan ook een teken zijn van vergevorderde
prostaatkanker [6].
Symptomen van prostaatkanker kunnen zijn het moeilijk beginnen of stoppen van de
urineflow, zwakke of onderbroken urineflow, verhoogde frequentie van urineren (voornamelijk
’s nachts), pijn of een branderig gevoel tijdens urineren, hematurie, onvermogen om te urineren en
pijn aan de rug, het bekken of de dij. Deze symptomen kunnen echter ook voorkomen bij
goedaardige prostaataandoeningen [7].
Men start met screenen naar prostaatkanker vanaf een leeftijd van 50 jaar. Bij mannen met
een verhoogd risico op prostaatkanker, zoals mannen met zwarte huidskleur en patiënten met een
familielid in eerste lijn met prostaatkanker, start men de screening al vanaf 45 jaar. Door de massale
screening naar prostaatkanker worden de meeste prostaatkankers reeds in een vroeg stadium
gediagnosticeerd. Als de diagnose wordt gesteld wanneer de tumor nog lokaal is, is de 5-jaar
overleving 100%. De 5-jaar overleving daalt naar 34% wanneer er reeds metastasen aanwezig zijn. De
algemene 5-jaar overleving is 99% [6, 7, 11].
Screening naar prostaatkanker gebeurt met Digital Rectal Examination (DRE) en door
bepaling van het Prostaat Specifiek Antigen (PSA) in het bloed [6, 11].
3
1.3.1.1.
Digital Rectal Examination
Digital Rectal Examination (DRE), ook wel Palpatio Per Anum (PPA) of rectaal toucher
genoemd, is een onderzoek dat door de arts wordt uitgevoerd. Hierbij wordt de prostaat via de anus
beoordeeld wat betreft de grootte en vorm van de prostaat en aanwezigheid van verhardingen
(www.prostaatkanker.org, www.deprostaatkliniek.nl, www.gezondheid.be). Het nadeel is dat de
tumor niet wordt opgemerkt wanneer deze zich centraal in de prostaat of aan de andere kant van de
prostaat bevindt. Slechts 30% van de tumoren kan via deze methode worden opgemerkt (www.
Deprostaatkliniek.nl).
1.3.1.2.
Prostaat Specifiek Antigen
Het prostaatvocht bevat verschillende proteïnen waaronder het Prostaat Specifiek Antigen
(PSA) [6]. Dit wordt grotendeels uitgescheiden bij de ejaculatie, maar een kleine hoeveelheid komt in
het bloed terecht [13]. Een PSA-waarde van 4,0 ng/mL bloed of minder wordt als normaal
beschouwd. Bij mannen jonger dan 60 jaar stelt men de grens op 2,5 ng/mL. De absolute PSA-waarde
is echter minder belangrijk dan de snelheid waarmee de waarde stijgt. Er is een significant riscio op
prostaatkanker wanneer de PSA-waarde 0,75 ng/mL per jaar stijgt [6].
PSA is de meest gebruikte tumormerker [13]. De massale screening naar prostaatkanker
met behulp van PSA-bepaling heeft er voor gezorgd dat de incidentie van prostaatkanker is gestegen
omdat meer mannen met prostaatkanker werden gediagnosticeerd. Het blijft echter controversieel
of de PSA-screening impact heeft op de overleving [6]. De PSA-waarde is een sensitieve
tumormerker, maar de specificiteit ervan is beperkt aangezien er een groot aantal vals positieve
waarden zijn. De PSA-waarde is verhoogd bij mannen met prostaatkanker, maar ook bij andere
prostaataandoeningen zoals prostatitis en BPH en ook bij ejaculatie, trauma en urineretentie stijgt de
PSA waarde. Twee derde van alle verhoogde waarden bij mannen ouder dan 50 zijn te wijten aan
BPH [6, 11, 13].
De meest effectieve manier van prostaatkankerscreening is met behulp van PSA en DRE
samen [6].
4
1.3.2. Beeldvormingstechnieken
Beeldvormingtechnieken kunnen helpen bij het stellen van de diagnose van prostaatkanker
en bij het bepalen van het stadium waarin de kanker zich bevindt. Dit is belangrijk om te beslissen
welke therapie moet worden opgestart bij de patiënt. Men kan ook de respons van de tumor op een
bepaalde therapie opvolgen door middel van beeldvorming [7].
1.3.2.1.
Transrectale ultrasonografie
Patiënten die abnormale DRE bevindingen of verhoogde PSA-waarden hebben, worden
verder geëvalueerd met behulp van transrectale ultrasonografie (TRUS) en door een biopsie van de
prostaat te nemen [11].
Transrectale ultrasonografie is een beeldvormingtechniek waarbij men in het rectum een
echoprobe
inbrengt die hoogfrequente (5 tot 7,5 MHz)
geluidsgolven uitzendt
[11]
(www.gezondheid.be, www.allesoverkanker.be). In figuur 1.3 wordt getoond hoe men met de TRUS
probe de prostaat kan bereiken.
Figuur 1.3: Transrectale ultrasonografie (wwww.gezondheid.be)
De techniek kan worden gebruikt voor detectie van prostaatkanker en het bepalen van het
stadium waarin de tumor zich bevindt. De weerkaatsing van de hoogfrequente geluidsgolven wordt
opgevangen door een echotransducer, waardoor de plaats en grootte van de tumor kunnen worden
bepaald. Hoe steviger een weefsel, hoe sneller de uitgezonden geluidsgolven door het weefsel gaan.
Een gezonde prostaat zal overal dezelfde dichtheid hebben zodat op de monitor een egaal grijs
scherm wordt gezien. Een prostaattumor wordt meestal gezien als een hypo-echogene zone. Veertig
percent van de prostaatkankers zijn echter iso-echogeen, wat de detectie van prostaatkanker
bemoeilijkt. Bovendien is de aanwezigheid van een hypo-echogene zone niet specifiek voor
prostaatkanker, het kan ook wijzen op goedaardige aandoeningen van de prostaat [7, 11].
5
TRUS kan ook gebruikt worden om het volume van de tumor, de eventuele doorbraak door
het prostaatkapsel en de aantasting van de omliggende weefsels te bepalen. Daarom kan men van
TRUS gebruik maken voor het bepalen van het stadium waarin de tumor zich bevindt
(www.prostaatkanker.org). Tenslotte kan TRUS ook worden gebruikt om het nemen van een biopt
van de prostaat gericht te laten verlopen [7, 11]. Biopsie is na DRE, bepalen van de PSA-waarde en
TRUS noodzakelijk om te bepalen of er een maligne tumor van de prostaat aanwezig is. Bij een
positieve test kan men ook de gradering van de tumor bepalen aan de hand van het biopt. Het biopt
geeft echter in beperkt mate informatie over de eventuele metastasering van de tumor, daarom is
verder onderzoek noodzakelijk [7, 11] (www.prostaatkanker.org).
1.3.2.2.
Comuterized tomografie
Computerized tomografie (CT) is van beperkt belang bij de detectie van prostaatkanker
omdat het een beperkte resolutie heeft in zachte weefsels. Het kan wel worden gebruikt bij evaluatie
van patiënten met vergevorderde ziekten voor de opsporing van metastasen in de omliggende
lymfeklieren, de longen of de lever. CT maakt gebruik van een röntgenbron die rond het lichaam van
de patiënt draait. De mate waarin X-stralen door het lichaam van de patiënt geabsorbeerd worden is
afhankelijk van de dichtheid van de weefsels waar ze worden doorgestuurd. Aan de andere zijde van
het apparaat bevindt zich een röntgendetector die de niet geabsorbeerde straling opvangt. De
sterkte van de straling die wordt opgevangen door de detector kan worden omgezet in een
afbeelding. Dichtere weefsels absorberen meer energie dan minder dichte weefsels en zullen op de
afbeelding donkerder grijs kleuren [7, 11] (www.urologiekortrijk.be) (www.natuurkunde.nl).
1.3.2.3.
Magnetic resonance imaging
Een Magnetic resonance imaging (MRI) scanner bevat een gelijkspanningsspoel die zorgt
voor de aanleg van een magnetisch veld [11]. De waterstofatomen die in grote hoeveelheden in het
lichaam aanwezig zijn, hebben allemaal een willekeurige spin, maar bij aanleggen van een
magneetveld gaan ze zich richten volgens dit magneetveld. Daarnaast heeft een MRI-scanner ook
een spoel die radiogolven uitzendt. De elektromagnetische straling verandert de richting van de spin
van de waterstofatomen. De energie die hiervoor nodig is, komt overeen met een bepaalde
frequentie, de resonantiefrequentie. Wanneer het uitzenden van de elektromagnetische straling
stopt, zullen de atomen na een bepaalde tijd terugvallen naar hun grondtoestand. Hierbij wordt
straling vrijgesteld die door de detector wordt opgevangen en door een computer wordt omgezet in
een beeld. De hoeveelheid energie die vrijkomt, is afhankelijk van de hoeveelheid waterstofatomen
6
die in het weefsel aanwezig zijn, en is dus verschillend voor elk weefsel. Om een beter beeld te
krijgen kan men gebruik maken van contrastvloeistoffen. Deze veranderen lokaal het magnetisch
veld, waardoor verschillende soorten weefsels een ander signaal geven (www.natuurkunde.nl,
www.uzleuven.be).
Aangezien MRI een goede resolutie heeft in zachte weefsels laat het toe de grootte en
locatie van de lokale tumor in de prostaat en eventuele uitzaaiingen te beoordelen [11].
1.3.2.4.
Radionuclide bone scintigrafie
Radionuclide bone scintigrafie wordt gebruikt voor het opsporen van botmetastasen bij
patiënten met prostaatkanker [11]. Na de lymfeknopen zijn de botten de tweede meest
voorkomende plaats van metastasen. Aanwezigheid van botmetastasen is gerelateerd aan een
slechte prognose en is een belangrijke doodsoorzaak [14].
Radionuclide bone scintigrafie wordt toegepast bij patiënten met een PSA-waarde groter
dan 15 tot 20 ng/mL, patiënten met skeletale symptomen en patiënten met vergevorderde
prostaatkanker [11].
De detectie van botmetastasen kan gebeuren met
99m
Tc-hydroxymethyldiphosphonaat
(HDP). De botmetastasen worden gezien door een verhoogde opname van radioactief gemerkte
bifosfonaten in zones met verhoogde osteoblastische activiteit als respons op de verhoogde
osteolyse door de tumor. twee tot zes uur na injectie bevindt ongeveer 50% van de geïnjecteerde
dosis zich in het skelet. De vertraging tussen injectie en beeldvorming maakt klaring van de
radioactief gemerkte bifosfonaten uit de zachte weefsels mogelijk zodat een grotere target-totachtergrond verhouding wordt bekomen met verbeterde visualisatie van het bot tot gevolg [15-17].
De techniek heeft een hoge gevoeligheid maar een lage specificiteit. Vals positieven zijn
voornamelijk te wijten aan accumulatie van de tracer in het bot bij goedaardige botziekten [16, 17].
1.3.2.5.
Single-photon emmision computerized tomografie
Een andere beeldvormingtechniek die gebruikt kan worden bij het opsporen van
prostaatkanker is Single-photon emission computerized tomografie (SPECT) [9]. Bij SPECT injecteert
men radioactief gelabelde stoffen die specifiek binden op het weefsel dat men in beeld wenst te
brengen. Bij verval van de radioactieve isotopen wordt er gammastraling uitgezonden die wordt
7
opgevangen door een fotondetector. Dit signaal kan worden omgezet in een beeld [18]
(www.mayfieldclinic.com).
De meest gebruikte isotoop voor SPECT is 99mTc. Daarnaast kan men ook gebruik maken van
111
In, 201Tl, 123I, 125I, 131I, 67Ga, 133Xe, 177Lu en 67Cu. Deze isotopen hebben een halfwaardetijd van enkele
uren tot dagen [19].
111
In-capromab pendetide (ProstaScint®) is een radioactief gelabeld monoklonaal
antilichaam dat specifiek gericht is tegen het prostaat specifiek membraan antigen (PSMA). Dit is een
transmembranair proteïne dat op het merendeel van de prostaatkankers tot expressie komt en
waarvan de expressie toeneemt bij uitgezaaide en castratieresitente tumoren. ProstaScint® kan
gebruikt worden voor de detectie van lymfeknoopmetastasen, lokalisatie van de plaats van herval bij
patiënten met een detecteerbare PSA na prostatectomie en opsporen van metastasen [11, 17, 20,
21].
1.3.2.6.
Positron emission tomografie
Naast SPECT kan ook Positron emission tomografie (PET) worden gebruikt voor het
specifiek opsporen van eventuele uitzaaiingen naar de lymfeknopen, voor het bepalen van de
grootte en locatie van de tumor en voor detectie van herval na behandeling [22]. Het is de
belangrijkste methode voor het opsporen van vroegtijdige metastasering bij agressieve tumoren en
voor het opvolgen van de reactie van patiënten op de therapie [23, 24].
Zo kunnen bijvoorbeeld veranderingen in de metabole activiteit die optreden in
tumorweefsel worden gedetecteerd. De gebruikte tracers zijn dan substanties die door de tumoren
in grote hoeveelheden worden verbruikt. Wanneer er verhoogde consumptie van de tracer wordt
waargenomen in een weefsel door een verhoogde metabole activiteit ervan, wijst dit op de
aanwezigheid van een tumor [22, 23].
Voor het in beeld brengen van prostaatkanker met PET kan men gebruik maken van
18
F-fluorodeoxyglucose, 11C-choline, 18F-choline, 11C-acetaat, 18F-acetaat, 11C-metionine, 18F-fluoride,
18
F-fluorodihydrotestosteron en antilichamen gemerkt met radionucliden [23, 24].
11
C-choline en
18
F-choline kunnen ook worden gebruikt voor de detectie van
prostaatkanker. Choline komt voor in de celmembraan en aangezien tumorcellen sneller delen dan
8
normale cellen, is er verhoogde opname van choline in tumorcellen. Bij schade aan de prostaat
accumuleert de substantie op de aangetaste plaatsen. Choline laat een betere differentiatie tussen
goedaardige en kwaadaardige aandoeningen van de prostaat toe in vergelijking met
18
F-fluorodeoxyglucose.
18
F heeft als voordeel dat het een langer halfleven heeft dan
11
C,
respectievelijk 120 en 20min, zodat 18F-choline langer op voorhand kan worden gesynthetiseerd. Een
nadeel van
18
F-choline is dat het meer renaal wordt geklaard dan
11
C-choline. Accumulatie van
18
F-choline in de urinewegen kan de beeldvorming van de prostaat verstoren [22, 24-26].
Verder kan men gebruik maken van 11C-acetaat. Acetaat is een essentiële precursor in het
vetzuurmetabolisme. De vetzuren worden geïncorporeerd in de celmembraan. Bij prostaatkanker is
er een verhoogde vetzuursynthese omwille van de snelle proliferatie van de cellen en dus een
verhoogde opname van acetaat. Acetaat wordt slechts in beperkte hoeveelheden uitgescheiden in
de urine en wordt snel uit de andere weefsels geklaard als gevolg van het optreden van oxidatie naar
11
C-CO2 [24, 26].
Bij prostaatkanker is er een verhoogde eiwitsynthese. De opname van aminozuren,
waaronder methionine, is verhoogd. 11C –methionine is een andere tracer die wordt gebruikt bij het
opsporen van prostaatkanker. 11C-metionine wordt niet in de urine uitgescheiden en snel geklaard uit
het bloed [24, 26].
De
androgeenreceptor speelt
Anti-androgenen
Dihydrotestosteron
kunnen
is
worden
de
een
rol
gebruikt
belangrijkste
bij
voor
ligand
de
van
de
progressie
van
prostaatkanker.
behandeling
van
prostaatkanker.
de
androgeenreceptor
zodat
18F-
Fluorodihydrotestosteron kan worden gebruikt om te bepalen of de tumor androgeengevoelig is en
om anti-androgene therapie op te volgen [24, 26].
Door toediening van
18
F-fluoride kan men botmetastasen detecteren. De opname van
18
F-fluoride in het bot gebeurt op een manier die vergelijkbaar is met de opname van
99m
Tc-methyldiphosphonate (MDP).
18
F-fluoride wordt in het bot voornamelijk opgenomen op
plaatsen met verhoogde botturnover zoals ter hoogte van de botmetastasen. De plasmaklaring van
18
F-fluoride is sneller dan bij
99m
Tc-MDP waardoor er een beter target-tot-achtergrond verhouding
wordt bekomen [24, 26].
Tenslotte kan men ook gebruik maken van radioactief gelabelde monoklonale antilichamen
als tracers bij PET. Een voorbeeld hiervan is een 68Ga-gelabeld antilichaam dat specifiek bindt aan het
9
prostaat-specifiek membraan antigen (68Ga-PSMA-HBED-CC). Een ander voorbeeld is een antilichaam
gemerkt met een radionuclide dat specifiek bindt aan HER2. HER2 komt tot overexpressie bij
sommige vergevorderde prostaatkankers [24, 26-30].
1.4. THERAPIE VAN PROSTAATKANKER
Veel gebruikte therapieën bij prostaatkanker zijn chirurgie, radiotherapie, chemotherapie,
hormonale therapie, cryochirugie en radioimmunotherapie. Het gebruik van antilichamen bij
radioimmunotherapie wordt verder besproken.
1.4.1. Radioimmunotherapie
1.4.1.1.
Antilichamen
Antilichamen zijn glycoproteïnen, die aangemaakt worden in de B-cellen van het
immuunsysteem. Ze beschermen het lichaam tegen lichaamsvreemde elementen zoals bacteriën,
virussen en tumorcellen. Ze zijn opgebouwd uit twee lichte en twee zware ketens, elk opgebouwd uit
een constant domein en een variabel domein. Het Fc-domein is verantwoordelijk voor de
effectorfuncties:
opsonisatie,
complementactivatie
en
antibody
dependent
cell-mediated
cytotoxicity. Het Fab-domein is het antigenbindend gedeelte van het antilichaam (Fig. 1.4). Er
bestaan vijf verschillende klassen antilichamen: Immunoglobuline (Ig) G, IgM, IgE, IgA en IgD
antilichamen [31, 32].
Figuur 1.4: Structuur van een antilichaam [33]
10
1.4.1.2.
IgM antilichamen
IgM antilichamen zijn de antilichamen die worden aangemaakt bij het eerste contact met
een antigen, daarna treedt klasseswitch naar een IgG antilichaam op (www.merckmanual.nl). De
pentamere structuur van IgM antilichamen wordt afgebeeld in figuur 1.5.
Figuur 1.5: Structuur van een IgM antilichaam [34]
1.4.1.3.
Gebruik van monoklonale antilichamen bij kanker
Antilichamen tegen tumorspecifieke antigenen kunnen gebruikt worden voor de diagnose
en/of behandeling van tumoren. Het voordeel aan het gebruik van antilichamen tegen
tumorspecifieke antigenen is dat de therapie enkel de tumorcellen beïnvloedt en niet de gezonde
cellen met minder bijwerkingen tot gevolg. Een voorwaarde hiervoor is dat het antigen waartegen
het antilichaam wordt ontwikkeld niet of weinig tot expressie komt op gezonde cellen en veel tot
expressie komt op de tumorcellen. Een nadeel is echter dat een immuunreactie kan worden
geïnitieerd tegen de toegediende antilichamen [26, 35, 36].
De antilichamen die men gebruikt bij radioimmunotherapie zijn meestal IgG antilichamen
die worden aangemaakt in muriene hybridomacellen. Hybridomacellen zijn B-cellen die gefusioneerd
zijn met myelomacellen. De hybridomacellen kunnen één specifiek antilichaam in grote
hoeveelheden aanmaken. Doordat de muriene antilichamen lichaamsvreemd zijn voor de patiënt,
kan er een immuunreactie worden geïnitieerd. Er kunnen humane antimuriene antilichamen worden
aangemaakt die de muriene antilichamen neutraliseren. De oplossing hiervoor bestaat erin om de
structuur van de antilichamen meer te doen lijken op die van humane antilichamen. Er kan gebruik
gemaakt worden van chimere antilichamen die bestaan uit een murien variabel gedeelte en een
humaan constant gedeelte. Het antilichaam is dan voor 70% humaan zodat het minder immunogeen
is. Bovendien kan het door de aanwezigheid van het humaan Fc-domein humane effectorcellen en de
complementcascade activeren. Men kan ook gebruik maken van gehumaniseerde antilichamen
11
waarbij enkel de hypervariabele loops murien zijn. Het antilichaam is dan voor 85 tot 90% humaan
waardoor het nog minder immunogeen is [26, 37].
Men kan gebruik maken van ongeconjugeerde of bispecifieke antilichamen die aanleiding
geven tot een immuunrespons tegen de tumorcel. Soms kan binding van het antilichaam aan een
tumorspecifiek eiwit ook direct aanleiding geven tot groeistop of apoptose van de tumorcel [5, 35,
38, 39].
Daarnaast kan men geconjugeerde antilichamen gebruiken waarbij men toxines,
radionucliden of enzymen linkt aan een antilichaam dat specifiek bindt op een tumorspecifiek
antigen. Antilichamen geconjugeerd met toxines worden, na binding aan het tumorspecifiek antigen,
geïnternaliseerd zodat het toxine of chemotherapeuticum wordt vrijgesteld in de tumorcel en deze
afdoodt [5]. Antilichamen gelinkt aan een radionuclide kunnen worden gebruikt voor visualisatie of
afdoding van de tumor. In tegenstelling tot bij antilichamen gelinkt aan toxines en
chemotherapeutica is opname van het radionuclide in de cel niet noodzakelijk voor afdoding van de
cel [5, 40]. Bij Antibody directed enzym prodrug therapie (ADEPT) wordt een enzym gekoppeld aan
het antilichaam. Na binding van het antilichaam ter hoogte van de tumor, wordt een prodrug
toegediend die door het enzym, gebonden ter hoogte van de tumorsite, wordt omgezet tot een
cytotoxische stof. Een voordeel hiervan is dat de toxische stof kleiner is dan het antilichaam en
daardoor beter doorheen het tumorweefsel kan diffunderen [41].
1.4.1.4.
Gebruik van Fab en F(ab)2 fragmenten van monoklonale antilichamen bij
kanker
Antilichamen zijn grote eiwitten met een molecuul gewicht van 150 kDa. Het nadeel
hiervan is dat ze slechts in beperkte mate in het tumorweefsel doordringen en een trage
plasmaklaring hebben. Antilichamen hebben een halfleven van 2 dagen tot 3 weken afhankelijk van
de klasse waartoe ze behoren. Doordat antilichamen grote eiwitten zijn hebben ze een groot risico
op het uitlokken van een immuunreactie. Dit kan een voordeel zijn wanneer men een immuunreactie
wenst uit te lokken, maar het kan ook een nadeel zijn wanneer men geen immuunreactie wenst [3638].
Met behulp van enzymen kunnen de antilichamen in fragmenten worden geknipt. Met
papaïne kan het antilichaam worden geknipt in een Fc-fragment en 2 Fab-fragmenten. Met pepsine
kan het antilichaam gesplitst worden in een Fc-fragment en een F(ab)2-fragment (Fig. 1.6). De Fab en
12
F(ab)2 fragmenten (respectievelijk 50 kDa en 110 kDa) zijn kleiner en vertonen daardoor betere
weefselpenetratie dan de volledige antilichamen. De fragmenten worden sneller uit het lichaam
geklaard (Fab-fragmenten: T1/2 = 7,2 - 19,2 uren en F(ab’)2-fragmenten: T1/2 = 2,1 – 5,9 dagen).
Hierdoor kan de beeldvorming sneller na de inspuiting volgen en kan er een grotere signaal-tot-ruis
verhouding worden bekomen. Een nadeel aan de kleine fragmenten is dat door het korte halfleven
de opname in de tumorcellen lager is. Daarnaast kunnen ze geen effectorfuncties uitoefenen doordat
ze geen Fc-domein hebben [36-38, 40, 42, 43].
Figuur 1.6: Knippen van monoklonale antilichamen in fragmenten met behulp van pepsine en
papaïne [38]
1.4.1.5.
Radioimmunotherapie
Radioimmunotherapie maakt gebruik van monoklonale antilichamen gelabeld met een
radionuclide om tumorcellen op een selectieve manier af te doden [44, 45]. De straling die wordt
uitgezonden door verval van de radioisotopen, doodt de tumorcellen voornamelijk door schade aan
te brengen aan het DNA van de cellen [35].
De meest gebruikt radionucliden voor radioimmunotherapie zijn de β-stralers
jodium-131 (131I), yttrium-90 (90Y) en lutetium-177 (177Lu).
131
I en
177
Lu hebben een langer halfleven
(respectievelijk 8 dagen en 6,7 dagen) dan 90Y (2,7 dagen). Dit heeft als gevolg dat de energie van de
β-deeltjes groter is voor 90Y dan voor 131I en
177
Lu. Β-stralers met lagere energie zijn meer effectief
13
voor de behandeling van micrometastase, terwijl β-stralers met hogere energie meer effect hebben
bij grote tumoren [21, 26, 46].
Het antigen waartegen het radioactief monoklonaal antilichaam is gericht is een
oppervlakte-antigen dat zo weinig mogelijk wordt gesecreteerd. Daarnaast komt het in grote
hoeveelheden tot expressie op de tumorcellen en komt het zo weinig mogelijk tot expressie in
normale weefsels [46].
De meest gebruikte tracer bij de behandeling van gemetastaseerde prostaatkanker is een
anti-PSMA monoklonaal antilichaam [27, 47, 48].
1.5. EPITHELIALE-MESENCHYMALE TRANSITIE
Epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) is een proces dat plaatsvindt tijdens de
embryonale ontwikkeling. Hierbij verliezen sommige cellen van een epitheelweefsel hun binding met
naburige cellen en kunnen ze zich individueel verplaatsen zodat er uit de eerst gevormde epitheliale
weefsels ook niet epitheliale weefsels kunnen worden gevormd (Fig. 1.7) [12, 32, 49].
Figuur 1.7: Epitheliale mesenchymale transitie [50]
EMT is echter ook betrokken bij de tumorprogressie. Door de EMT krijgen de tumorcellen
meer bewegingsvrijheid en invasieve eigenschappen zodat ze de primaire tumor kunnen verlaten en
op andere plaatsen in het lichaam metastasen vormen [49].
Tijdens de EMT verandert de expressie van bepaalde eiwitten op het membraanoppervlak
van de cel, zoals de expressie van cadherines. Er treedt switch van E-cadherine naar N-cadherine op.
De adhesie tussen N-cadherines is minder stabiel en meer dynamisch dan die tussen E-cadherines
met verhoogde beweeglijkheid van de tumorcellen, invasieve eigenschappen en metastase tot
gevolg [49].
14
1.6. CADHERINES
Cadherines zijn een familie van calciumafhankelijke transmembranaire adhesieglycoproteïnen. In aanwezigheid van Ca2+ zorgen ze voor de adhesie tussen cellen zodat de cellen in
een weefsel samenblijven [51, 52]. Cadherines spelen een rol in de intercellulaire communicatie.
Voor het vormen van metastasen is een adhesieve interactie tussen de tumorcellen en de
cellen van het targetorgaan noodzakelijk. Aangezien cadherines betrokken zijn in de adhesie tussen
cellen, zullen ze ook een rol spelen in het vormen van metastasen [53, 54].
Tijdens de tumorprogressie treedt er progressief verlies van E-cadherine en toename van
N-cadherine op. Deze verandering in cadherine-subtype stelt de tumorcellen in staat om te
interageren met ander cellen die N-cadherine tot expressie brengen zoals fibroblasten en vasculaire
endotheliale cellen. Op deze manier zorgen ze er voor dat invasie en metastase naar de bloedbaan
mogelijk worden [53, 54].
Men heeft switch van E-cadherine naar N-cadherine vastgesteld in preklinische in vivo
studies bij metastasering van prostaatcarcinoma, borstcarcinoma en blaascarcinoma en bij multiple
myeloma. De switch is in vitro vastgesteld bij metastasering van maagcarcinoma, pancreascarcinoma,
oesofaguscarcinoma, ovariacarcinoma, tyroïdcarcinoma, colorectale carcinoma en niet-kleincellige
longcarcinoma [54-57].
Via een immunohistochemisch detectiesysteem heeft men ontdekt dat N-cadherine ook
voorkomt in de gezonde epitheelcellen van de thymus, de hypofyse, de pancreas, de lever, de bijnier,
het endometrium van de uterus, de ovaria, de maag en ook in neuronale weefsels [4, 58].
Het opsporen van de EMT door specifieke targetting van N-cadherine met monoklonale
antilichamen kan worden gebruikt voor het stellen van de diagnose en het bepalen van de prognose
en therapie bij kankers waarbij switch van E- naar N-cadherine optreedt [5].
N-cadherine komt niet voor in normaal prostaatweefsel maar wel bij prostaattumoren. De
expressie neemt toe bij metastasering van prostaatkanker en prostaatkanker die resistent is voor
hormoontherapie of castratieresistente prostaatkanker [3, 4]. Up-regulatie van N-cadherine en
down-regulatie van E-cadherine wijst dus op een agressieve tumor met slechte prognose [12, 49].
15
De sterfte aan prostaatkanker is niet te wijten aan de primaire tumor maar aan de
uitzaaiing van de tumor naar andere weefsels en organen. Daarom heeft men vooral nood aan een
methode waarmee men de agressieve vormen van prostaatkanker, waarbij metastasering optreedt,
kan opsporen [53, 54]. In het artikel van Tanaka, H. et al. toonde men aan dat antilichamen tegen
N-cadherine de groei, de lokale invasie, de metastasering van de tumor en de evolutie naar
castratieresistente prostaatkanker van vergevorderde prostaatkanker kunnen afremmen [3]. Het
monoklonaal antilichaam kan ook gelabeld worden met een radio-isotoop en gebruikt worden bij
diagnose en behandeling van vergevorderde prostaatkanker [5].
16
2. OBJECTIEVEN
Prostaatkanker is met een geschatte incidentie van 233 000 nieuwe gevallen in de
Verenigde Staten in 2014 de meest voorkomende kanker bij mannen. Het aantal sterftegevallen in
2014 wordt op 29 480 per jaar geschat in de Verenigde Staten, hiermee staat prostaatkanker bij de
man op de tweede plaats bij de kankergerelateerde doodsoorzaken [1, 2].
Prostaatkankers die lokaal blijven zijn goed behandelbaar, maar de kans op genezing
verkleint wanneer de tumorcellen metastaseren buiten de grenzen van de prostaat [12].
Gemetastaseerde en castratieresistente prostaatkanker zijn de meest dodelijke vormen van kanker.
Daarom is er nood aan een methode om deze agressieve vorm van de kanker op te kunnen sporen
[3]. Bij prostaatkanker worden de metastasen voornamelijk teruggevonden in de lymfeklieren en het
beenmerg, beide plaatsen worden goed doorbloed en zijn dus toegankelijk voor circulerende
antilichamen.
Bovendien
zijn
prostaatkankercellen
gevoelig
aan
radioactieve
straling.
Radioimmunodiagnose en radioimmunotherapie zijn bijgevolg ideaal voor de diagnose en
behandeling van prostaatkanker. Het antigen waartegen het radioactief monoklonaal antilichaam is
gericht, is een oppervlakte-antigen dat zo weinig mogelijk wordt gesecreteerd. Daarnaast komt het in
grote hoeveelheden tot expressie op de tumorcellen en komt het zo min mogelijk tot expressie in
normale weefsels [46].
Bij overgang van androgeen afhankelijke naar castratieresitente prostaatkanker treedt
epitheliale mesenchymale transitie (EMT) op. Tijdens de EMT treedt er switch van E-cadherine naar
N-cadherine op. De adhesie tussen N-cadherines is minder stabiel en meer dynamisch dan die tussen
E-cadherines met verhoogde beweeglijkheid van de tumorcellen, invasieve eigenschappen en
metastase tot gevolg [49]. N-cadherine komt dus niet voor in normaal prostaatweefsel maar wel bij
prostaattumoren. De expressie neemt toe bij metastasering van prostaatkanker en prostaatkanker
die resistent is aan hormoontherapie of castratieresistente prostaatkanker [3, 4]. Up-regulatie van
N-cadherine en down-regulatie van E-cadherine wijst dus op een agressieve tumor met slechte
prognose [12, 49]. Het opsporen van de EMT door specifieke targetting van N-cadherine met
monoklonale antilichamen kan worden gebruikt voor het stellen van de diagnose en het bepalen van
de prognose en therapie bij kankers waarbij switch van E- naar N-cadherine optreedt [5].
Antilichamen tegen N-cadherine kunnen de groei, de lokale invasie, de metastasering van de tumor
en de evolutie naar castratieresistente prostaatkanker van vergevorderde prostaatkanker afremmen
17
[3]. Het monoklonaal antilichaam kan ook gelabeld worden met een radio-isotoop en gebruikt
worden bij diagnose en behandeling van vergevorderde prostaatkanker [5].
Het doel van deze thesis is de productie van een anti-N-cadherine antilichaam en evaluatie
van de specifieke binding van het antilichaam aan N-cadherine.
Voor de productie van een anti-N-cadherine antilichaam wordt gebruik gemaakt van
TE5-BE2 hybridomacellen. De hybridomacellen produceren een IgM antilichaam, dit wordt
opgekweekt met behulp van een CELLine CL 350 bioreactor. De aanwezigheid van het antilichaam in
het supernatans van de hybridomacellen en de binding van het geproduceerde antilichaam aan
recombinant N-cadherine en de peptidesequentie waaraan het antilichaam bindt, worden nagegaan
met behulp van Western blotting.
Het IgM antilichaam dat wordt geproduceerd door de TE5-BE2 hybridomacellen, wordt
opgezuiverd uit het supernatans. De opzuivering gebeurt op twee manieren, namelijk met behulp
van een HiTrap kolom en met een ammoniumsulfaatprecipatie; deze laatste wordt gecombineerd
met ontzouting met behulp van een PD-10 kolom. Na opzuivering wordt bepaald in welke fractie het
antilichaam zich bevindt met coomassie blauwkleuring en Western blotting. De concentratie van het
antilichaam in de opgezuiverde fractie wordt bepaald met behulp van een Micro BCATM Protein Assay
Kit. Daarna kan overgegaan worden naar in vitro experimenten om de affiniteit ten opzichte van het
antigen te testen.
Tenslotte wordt de binding van het IgM antilichaam aan recombinant N-cadherine,
recombinant E-cadherine, de peptidesequentie en BSA nagegaan met behulp van Elisa. Daarnaast
wordt de binding van het antilichaam op cellen nagegaan door gebruikt te maken van een cellijn die
N-cadherine tot expressie brengt (A549) en een cellijn die N-cadherine niet tot expressie brengt
(SKBR3). Ook wordt de binding van het IgM antilichaam aan recombinant N-cadherine, recombinant
E-cadherine en A549 en SKBR3 cellysaten getest met behulp van Western-Blotting en wordt de
binding van het anti-murien IgM antilichaam aan verschillende concentraties van het IgM antilichaam
getest.
18
3. MATERIALEN EN METHODEN
3.1. DE CELLEN
Er wordt gebruik gemaakt van een A549 cellijn van niet-kleincelllige longcarcinomacellen
(Dienst Radiotherapie, UZ Gent, België) en een SKBR3 cellijn van borstcarcinomacellen (Dienst
Radiotherapie, UZ Gent, België). Als basismedium wordt Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM,
Lonza,
Verviers,
België)
gebruikt,
waaraan
L-glutamine
(Lonza,
Verviers,
België),
penicilline/streptomycine (Lonza, Verviers, België) en 10% foetaal kalfsserum (FBS) (Lonza, Verviers,
België) toegevoegd wordt.
De gebruikte hybridomacellen zijn van de TE5-BE2 cellijn (Dienst Radiotherapie, UZ Gent,
België). Als groeimedium wordt het protein-free hybridoma medium gebruikt (Life Technologies,
Grand Island, USA). Hieraan worden L-glutamine, penicilline/streptomycine en foetaal kalfsserum
toegevoegd.
3.2. SPLITSEN VAN CELLEN
3.2.1. Splitsen van adherente cellen
Zodra de cellen in de cultuurfles (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) voldoende zijn
gegroeid, worden ze gesplitst zodat ze voldoende groeiruimte hebben. Eerst wordt het oude medium
verwijderd en de cellen gewassen met Phosphate Buffered Saline (PBS) (Lonza, Verviers, België).
Vervolgens worden de cellen losgemaakt van de bodem van de cultuurfles met behulp van een
mengsel van trypsine en ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (Lonza, Verviers, België). Wanneer
de cellen voldoende zijn losgekomen, wordt de werking van het trypsine/EDTA geneutraliseerd met
een zelfde hoeveelheid medium. De cellen worden samen met het medium overgebracht in een
centrifugeerbuisje dat gedurende 3 minuten wordt gecentrifugeerd bij 1100 rpm. Het supernatans
wordt verwijderd en de cellen worden geresuspendeerd in nieuw medium. Een deel van de bekomen
suspensie met cellen wordt in een nieuwe cultuurfles met medium gepipetteerd om de gewenste
verdunning te bekomen. Tenslotte worden deze cultuurflessen in de incubator geplaatst bij 37°C en
5% CO2 zodat de cellen opnieuw kunnen groeien.
3.2.2. Splitsen van niet-adherente cellen
Wanneer de cellen in de cultuurfles voldoende zijn gegroeid wordt een deel van het
medium, waarin de cellen gesuspendeerd zitten, uit de cultuurfles genomen en overgebracht in een
andere cultuurfles. Daarna wordt de cultuurfles aangelengd met vers medium tot het gewenste
volume.
19
3.3. TELLEN VAN CELLEN
Aan een kleine hoeveelheid van de cellen gesuspendeerd in het celmedium wordt trypaan
blauw (Lonza, walkersville, USA) toegevoegd. Van dit mengsel wordt 10 µL tussen de telkamer van
Bürker (Marienfeld, Lauda-Königshofen, Duitsland ) en een dekglaasje(Menzel-Gläser, Braunschweig,
Duitsland) gebracht. Met behulp van een microscoop wordt het aantal cellen geteld dat zich bevindt
in de hokjes van de telkamer. Het totaal aantal cellen kan worden berekend met volgende formule:
totaal aantal cellen (cellen/mL) = geteld aantal cellen (in 25 hokjes) x verdunningsfactor x 104.
3.4. OPKWEKEN VAN HET ANTILICHAAM
De hybridomacellen worden opgekweekt in een CELLine CL 350 bioreactor (Sigma-Aldrich,
Steinheim, Duitsland) De bioreactor bestaat uit twee compartimenten gescheiden door een
semipermeabele membraan, een mediumcompartiment met een groene dop en een
celcompartiment met een witte dop. Bij het openen van het celcompartiment moet de groene dop
steeds los staan of eraf worden genomen. Wanneer de CELLine CL 350 bioreactor voor het eerst
wordt gebruikt, wordt eerst 10 mL van het medium toegevoegd aan het mediumcompartiment van
de bioreactor gedurende minstens 5 minuten, om de semipermeabele membraan te equilibreren.
Vervolgens worden 8 x106 levende cellen gesuspendeerd in 5 mL medium. De groene dop van het
mediumcompartiment wordt geopend terwijl de 5 mL celsuspensie wordt toegevoegd aan het
celcompartiment hierbij moet steeds opgelet worden dat er geen luchtbellen in het celcompartiment
worden gebracht. Daarna wordt 340 mL medium toegevoegd aan het mediumcompartiment.
Tenslotte wordt de bioreactor in de incubator geplaatst bij 37°C en 5% CO2. Splitsen van de cellen
gebeurt om de 5 tot 7 dagen. Hierbij wordt eerst het medium verwijderd uit het
mediumcompartiment en daarna wordt de celsuspensie verwijderd uit het celcompartiment met
behulp van een steriele pipet (LP italiana spa, Milaan, Italië). De vloeistof wordt hiervoor
verschillende malen op en neer gepipetteerd.
Door de aanwezigheid van de semipermeabele membraan kunnen de antilichamen, die
worden geproduceerd door de hybridomacellen, niet migreren naar het mediumcompartiment zodat
ze in meer geconcentreerde vorm voorkomen in het celcompartiment.
3.5. SDS-PAGE
Natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel-elektroforese (SDS-PAGE) is een techniek die in
combinatie met Western blotting gebruikt kan worden om het moleculair gewicht van een eiwit te
bepalen of om de zuiverheid van een proteïnemengsel te onderzoeken.
20
3.5.1. Gieten van de gel
Een lang en een kort glazen plaatje (Bio-Rad, Hercules, Verenigde Staten) worden in een
plaatjeshouder geplaatst, waarna deze in een klemsysteem wordt geplaatst. Eerst wordt de resolving
gel gegoten tussen de twee glazen plaatjes tot ongeveer 2 centimeter van de bovenkant. Vervolgens
wordt de gel bedekt met isopropanol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) zodat alle luchtbellen
verdwenen zijn. Na polymerisatie van de gel wordt het isopropanol verwijderd en wordt de stacking
gel tussen de plaatjes gegoten tot aan de bovenkant van de plaatjes. In de nog vloeibare stacking gel
wordt een kammetje geplaatst om de kanteeltjes te maken. Na polymerisatie van de stacking gel is
de gel klaar voor gebruik.
De resolving gel van 10% bestaat uit 14,85 mL basisoplossing, 10 μL tetramethyleendiamine
(TEMED, Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) en 150 μL 10% ammonium persulfaat (APS,
Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) voor twee gels. De basisoplossing van 10% bevat 25 mL
acrylamide (Bio-Rad, Hercules, Verenigde Staten), 25 mL 1,5 M TRIS met pH 8,8 (Sigma-Aldrich,
Steinheim, Duitsland), 1 mL 10% natrium dodecyl sulfaat (SDS, Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland)
en 48,5 mL gedemineraliseerd water.
De stacking gel van 4% bestaat uit 6,6 mL basisoplossing, 6,6 μL TEMED en 60 μL 10% APS
voor twee gels. De basisoplossing van 4% bevat 2,5 mL acrylamide, 6,3 mL 0,5 M TRIS met pH 6,8
(Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland), 250 μL 10% SDS en 15,9 mL gedemineraliseerd water.
3.5.2. Laden van de gel
Aan het eiwit, dat op gel wordt gebracht, wordt een mengsel van laemmli buffer (Bio-Rad,
Hercules, Verenigde Staten) en eventueel β-mercapto-ethanol (Bio-Rad, Hercules, Verenigde Staten),
dat de zwavelbindingen van het proteïne reduceert, toegevoegd. Vervolgens wordt de oplossing van
het eiwit in de ladingsbuffer 10 minuten opgewarmd bij 95°C om het eiwit te denatureren (Grant
Instruments, Cambridge, Engeland), zodat het zijn secundaire en tertiaire structuur verliest. De gels
worden in een bakje geplaatst en de kanteeltjes van de gel worden geladen met het eiwit en een
referentieladder (Bio-Rad, Hercules, Verenigde Staten). De kamers van het bakje worden gevuld met
running buffer (Tris/Glycine/SDS buffer, Bio-Rad Laboratories, München, Duitsland). Het bakje wordt
op een elektroforesetoestel (Bio-Rad, Hercules, Verenigde Staten) aangesloten en wordt ingesteld op
170 V. De laemmli buffer bevat SDS, een anionisch detergent dat bindt aan de polypeptideketen. De
hoeveelheid gebonden SDS is rechtevenredig met het moleculair gewicht van het proteïne, zodat de
ladingsdichtheid per lengte-eenheid gelijk blijft. Door binding van SDS krijgen de proteïnen een
21
negatieve lading en worden ze aangetrokken naar de positieve pool van het elektrisch veld dat
opgewekt wordt door het elektroforesetoestel. De gel bestaat uit een stacking gel en een resolving
gel. De stacking gel heeft een lagere concentratie aan acrylamide dan de resolving gel, waardoor de
poriën van de stacking gel groter zijn. Bij de pH van de running buffer zal het glycine, dat er in
aanwezig is, negatief geladen zijn. Wanneer het glycine in de stacking gel, met een pH van 6,6,
terechtkomt, gaat glycine over naar het neutraal geladen zwitterion, zodat het zeer traag doorheen
het elektrisch veld migreert. Het chlorideion, dat het tegenion van Tris is, beweegt daarentegen snel
doorheen de stacking gel. Alle proteïnen hebben een mobiliteit die tussen deze van de chlorideionen
en deze van glycine ligt, waardoor de proteïnen in een smalle zone tussen de chlorideionen en
glycine komen te liggen. Wanneer de proteïnen in de running gel, met een pH van 8,8, terechtkomen,
zal glycine opnieuw een negatieve lading krijgen. Glycine sneller migreren dan de proteïnen, zodat
deze vrijkomen in de gel. Doordat de poriën van de resolving gel kleiner zijn dan deze van de stacking
gel, zullen de proteïnen gescheiden worden op basis van hun grootte [59-61].
3.5.2.1.
Trichloorazijnzuurprecipitatie
Om het antilichaam aan te concentreren voor het op gel te laden, wordt gebruik gemaakt
van de trichloorazijnzuurprecipitatie. Het staal wordt gevortext en 1 uur bij -20 °C bewaard. Na
ontdooien van het staal wordt het gedurende 20 minuten gecentrifugeerd aan 14 000 tpm. Het
supernatans wordt verwijderd en de pellet wordt gewassen met 1 mL 100% aceton. Daarna wordt
het staal kort gevortext en gecentrifugeerd gedurende 15 minuten om vervolgens opnieuw het
supernatans te verwijderen en de pellet te wassen met 1 mL 70% ethanol. Het staal wordt opnieuw
gevortext en 15 minuten gecentrifugeerd. Na het supernatans er afgehaald te hebben wordt het
staal gedroogd. Tenslotte wordt de pellet opgelost in ultrapuur water.
3.6. WESTERN BLOTTING
De proteïnen op de gel moeten overgebracht worden op een nitrocellulosemembraan
(Amersham Biosciences, Piscataway, Verenigde Staten) om ze daarna te kunnen detecteren met
antilichamen. Alvorens de nitrocellulosemembraan op de gel wordt geplaatst, wordt ze bevochtigd
met transferbuffer die bestaat uit 100 mL 10X transfer buffer (25mM TRIS (Sigma-Aldrich, Steinheim,
Duitsland), 192 mM glycine (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland), pH 8,3), 200 mL methanol
(Chem-Lab, Zedelgem, België) en 700 mL gedestilleerd water. Luchtbellen tussen de gel en de
nitrocellulosemembraan worden verwijderd met behulp van een roller. Op de nitrocellulosemebraan
en aan de andere kant van de gel worden twee vochtige Whatman filterpapiertjes (Amersham
Pharmacia Biotech, Uppsala, Zweden) geplaatst, die ook bevochtigd worden met de transferbuffer.
22
Luchtbellen worden opnieuw verwijderd met de roller. Vervolgens wordt de gel met de
nitrocellulosemembraan in een houder in het elektroforesetoestel geplaatst, samen met een ijsblok.
Deze ijsblok zorgt dat de transferbuffer niet opwarmt omdat methanol, dat aanwezig is in de
transferbuffer, ontvlambaar is. Het toestel wordt gevuld met transferbuffer en wordt ingesteld op
100 V gedurende 1 uur. Nadat de proteïnen van de gel zijn overgegaan op de
nitrocellulosemembraan wordt deze in een blocking buffer gelegd. Deze blocking buffer bestaat uit
5% Nonfat Dry Milk (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) in 1x Tris buffered saline (TBS, Bio-Rad,
München, Duitsland). De blocking buffer dient om de niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren,
zodat het antilichaam enkel aan zijn specifieke bindingsplaatsen kan binden.
Het primair antilichaam, (GC4, Sigma-Aldrich, Steimheim, Duitsland) dat bindt aan het eiwit
waarvan detectie gewenst is, wordt opgelost in blocking buffer en toegevoegd aan het blotje. Dit
mengsel wordt gedurende 1 uur geschud (Heidolph promax 2020, Heidolph Instruments, Schwabach,
Duitsland), vervolgens wordt de vloeistof verwijderd en er wordt vier keer 5 minuten gewassen met
1xTBS 0,05 % Tween20. Voor visualisatie van het primair antilichaam wordt een secundair
antilichaam (AntiMouse IgG Alkaline Phosphatase Produced in goat (Sigma-Aldrich, Steinheim,
Duitsland) of Antimouse IgM (µ-chain specific)-Alkaline Phosphatase antibody Produced in goat
(Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland)) toegevoegd. Het blotje wordt opnieuw gedurende 1 uur
geschud. Nadat het blotje is gewassen, wordt het detectiesubstraat bestaande uit 5-bromo-4-chloro3-indolyl fosfaat (BCIP) en nitro blauw tetrazolium chloride (NBT) (Invitrogen, Camarillo, Verenigde
Staten) toegevoegd. BCIP wordt gedefosforyleerd door het alkalisch fosfatase dat aan het secundair
antilichaam gebonden zit. Het gedefosforyleerde BCIP reduceert NBT waardoor een paars-blauw
substraat wordt gevormd. Het blotje worden opnieuw geschud tot paars-blauwe bandjes zichtbaar
worden en wordt tenslotte opnieuw gewassen. De aanwezigheid van een paars-blauw bandje wijst
op de aanwezigheid van het eiwit waaraan het primair antilichaam bindt op het blotje.
3.7. COOMASSIE KLEURING
Coomassie Blauw (expedeon, Cambridgeshire, UK) is een kleurstof die bindt aan eiwitten.
Door de gel te laten incuberen in de kleurstof worden de eiwitten op de gel zichtbaar [62].
3.8. OPZUIVERING VAN HET ANTILICHAAM
3.8.1. HiTrap kolom
De opzuivering van het antilichaam gebeurt met behulp van een HiTrap kolom (GE
Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Zweden). Eerst wordt aan het supernatans van de
23
hybridomacellen geleidelijk (NH4)2SO4 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) toegevoegd onder
continu roeren tot een eindconcentratie van 0,8 M wordt bekomen. Vervolgens wordt het
supernatans gefiltreerd over een membraanfilter van 0,45 µm (Sartorius Stedim, Goettingen,
Duitsland). De pomp wordt ingesteld op een flow van 1mL/min en de kolom wordt er aan gekoppeld.
Bij eerste gebruik wordt de kolom achtereenvolgens gewassen met 5 mL binding buffer (20mM
natriumfosfaat (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) , 0,8M ammoniumsulfaat , pH 7,5), 5mL elution
buffer (20mM natriumfosfaat) en 5 mL regeneration buffer (20mM natriumfosfaat + 0,0174 mM
isopropanol) De kolom wordt geëquilibreerd met 5 mL binding buffer en vervolgens wordt het
supernatans op de kolom gebracht. Daarna wordt de kolom gewassen met 15 mL binding buffer en
vervolgens wordt geëlueerd met 12 mL elution buffer. Tenslotte wordt 7 mL regeneration buffer
toegevoegd.
3.8.2. Ammoniumsulfaat precipitatie
Precipitatietechnieken kunnen verschillende fracties van elkaar scheiden op basis van een
verschil in oplosbaarheid. Voor de opzuivering van IgM antilichamen kan gebruik gemaakt worden
van een precipitatietechniek. Proteïnen verschillen onderling in hun hydrofobiciteit. Door de
zoutconcentratie te verhogen ontstaan extra hydrofobe interacties tussen de proteïnen zodat ze
preciperen. Verschillende proteïnen slaan neer bij een verschillende zoutconcentratie. IgM
antilichamen slaan neer bij een specifieke concentratie ammoniumsulfaat [63].
Om IgM antilichamen te preciperen wordt het supernatans eerst gefiltreerd over een
membraanfilter van 0,45 µm en wordt één deel 1 M Tris-HCl pH 8 toegevoegd aan 10 delen staal om
de pH te behouden. Vervolgens wordt ammoniumsulfaatoplossing toegevoegd tot er een 50%
verzadigde oplossing ontstaat. Na 1 uur roeren wordt de oplossing 20 minuten gecentrifugeerd bij
10 000 g. Nadien wordt het supernatans verwijderd en de pellet wordt twee keer gewassen met een
gelijk volume van een 50% verzadigde ammoniumsulfaatoplossing gevolgd door opnieuw 20 minuten
centrifugatie. Tenslotte wordt de pellet opgelost in een klein volume PBS om te gebruiken in de
volgende stap.
3.8.3. Ontzouting
Voor het bepalen van de concentratie van het IgM antilichaam wordt gebruik gemaakt van
een Micro BCATM Protein Assay Kit (Thermo scientific, Rockford, USA). De kit is echter niet compatibel
met de hoge zoutconcentraties die aanwezig zijn in het staal na precipitatie met ammoniumsulfaat.
24
Daarom wordt het ammoniumsulfaat eerst verwijderen met behulp van een PD-10
ontzoutingskolom.
De PD-10 ontzoutingkolom (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Zweden) bevat een
Sephadex G-25 medium dat snelle scheiding van substanties met een hoog moleculair gewicht van
substanties met een laag moleculair gewicht toelaat. Voor het scheiden van de kleine
ammoniumsulfaatmoleculen van de IgM antilichamen met hoog moleculair gewicht wordt gebruik
gemaakt van een kolom met een cut-off waarde van 5 000. Moleculen die groter zijn dan de grootste
poriën van de Sephadex matrix worden eerst geëlueerd, moleculen die kleiner zijn dan de grootste
poriën penetreren in de poriën van de Sephadex matrix en elueren daarom later van de kolom.
Na het verwijderen van het topje van de kolom wordt de kolombewaringsoplossing
weggegoten. Voor gebruik word de PD-10 kolom geëquilibreerd met 4 x 2,5 mL equillibratiebuffer
(PBS). Vervolgens wordt maximaal 2,5 mL staal toegevoegd aan de kolom en onder aan de kolom
weer opgevangen. Daarna wordt verschillende malen geëlueerd met 1 mL PBS en wordt het eluaat
opgevangen tot de IgM antilichamen van de kolom zijn gekomen.
3.9. CONCENTRATIEBEPALING
Voor het bepalen van de concentratie van het IgM antilichaam in het supernatans van de
TE5-BE2 hybridomacellen wordt gebruik gemaakt van een Micro BCATM Protein Assay Kit. Eerst
worden er een verdunningsreeks BSA standaarden gemaakt (0-200 µg/mL) in een 96-well plaat
(Becton Dickinson, Meylan, Frankrijk). Vervolgens wordt een verdunningsreeks gemaakt van de eiwitstalen. Daarna wordt het Micro BCA working reagent (WR), dat bestaat uit 25 delen Micro BCA
Reagent MA, 24 delen Reagent MB en 1 deel Reagent MC, toegevoegd. De totale hoeveelheid WR die
nodig is, wordt bepaald volgens volgende formule: (aantal standaarden + aantal onbekenden) x
(aantal herhalingen) x (volume WR per staal). Het WR wordt toegevoegd aan elke well van de 96-well
plaat. De plaat wordt geschud gedurende 30 seconden en gedurende 2 uur in de incubator gezet bij
37°C. Na afkoeling wordt met behulp van een spectrofotometer (MDS Analytical Technologies,
Berkshire, UK) de absorbantie bepaald bij 562 nm.
3.10. ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY
Een Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Elisa) wordt gebruikt om de binding van een
antilichaam op een eiwit na te gaan. Een 96-well plaat wordt gecoat met het eiwit waarvan de
binding met het antilichaam wordt nagegaan. Hiervoor wordt het eiwit opgelost in coating buffer die
bestaat uit (0,3688g NaHCO3 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland), 0,0646g Na2CO3 (Sigma-Aldrich,
25
Steinheim, Duitsland) en 1 mM CaCl2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) in 100 mL gedemineraliseerd
water, pH 9,4). Daarnaast worden de platen voor het maken van de antilichaamverdunningen
geblokkeerd met 200 µL melkoplossing (2g melkpoeder in 100 mL PBS 0,9 M CaCl 2 en 0,5 M MgCl2
(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)). De plaat wordt gedurende één nacht bewaard bij 4°C. De volgende
dag worden de platen drie maal gewassen met 200 µL wasbuffer (PBS + 0,9 M CaCl2 en 0,5 M MgCl2
en 0,05% Tween 20). Vervolgens wordt 200 µL melkoplossing toegevoegd aan elke well en wordt de
plaat 1 uur bij 37°C geplaatst. Er wordt een verdunningsreeks van het te testen antilichaam gemaakt
in de geblokkeerde plaat. Deze verdunningsreeks wordt nadien overgebracht naar de gecoate plaat.
De plaat wordt gedurende anderhalf uur bij 37°C geplaatst. Na 3 maal wassen met 200 µL wasbuffer
wordt 50 µL een 1 op 1000 verdunning van het secundair antilichaam in melkoplossing toegevoegd
aan elke well en wordt de plaat 1 uur bij 37°C bewaard. Vervolgens wordt de plaat 3 maal gewassen
met 200 µL wasbuffer en 1 maal met 100µL substraatbuffer (50 mM TRIS pH 9,5 en 1 mM MgCl 2) en
wordt 50 µL detectiesubstraat (1 tabletje para-nitrofenylfosfaat (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland)
per 5 mL detectiesubstraat) toegevoegd aan elke well. De absorbantie bij 405 nm wordt om het half
uur bepaald gedurende 2 uur.
3.10.1. Cellulaire Elisa
Een cellulaire Elisa gebeurt op een manier vergelijkbaar met de gewone Elisa. De plaat
wordt echter niet met eiwitten maar met cellen gecoat. Hiervoor worden de cellen die
gesuspendeerd zijn in medium gepipetteerd in de 96-well plaat en worden de platen gedurende één
nacht bewaard bij 37°C en 5% CO2. De volgende dag worden de cellen 1 maal gewassen door
voorzichtig 200 µL wasbuffer toe te voegen. Nadien worden de cellen gefixeerd met 100 µL aceton
(Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland)-PBS in een 30/20 verhouding. Na 10 minuten wordt 1 maal
gewassen met wasbuffer alvorens 200 µL melkoplossing wordt toegevoegd en wordt de plaat 1 uur
bij 37°C geplaatst. De overige stappen zijn identiek aan deze bij de gewone Elisa.
26
4. RESULTATEN
4.1. PRODUCTIE VAN EEN ANTI-N-CADHERINE ANTILICHAAM
Er wordt gebruik gemaakt van TE5-BE2 hybridomacellen voor de productie van een
anti-N-cadherine antilichaam. Het antilichaam wordt opgekweekt in een bioreactor. De aanwezigheid
van het anti-N-cadherine antilichaam in het supernatans van de hybridomacellen wordt nagegaan
door het gereduceerde supernatans op gel te brengen en te transfereren naar een
nitrocellulosemembraan. Vervolgens wordt het antilichaam op het blotje gedetecteerd door middel
van een anti-murien IgG Alkaline Phosphatase antilichaam. In figuur 4.1A is in laan 2 een bandje te
zien bij 25 kDa of minder en een licht bandje bij meer dan 250 kDa; dit wijst op aanwezigheid van het
antilichaam in het supernatans van de hybridomacellen. Daarnaast wordt gekeken of het antilichaam
geproduceerd door de TE5-BE2 hybridomacellen bindt aan N-cadherine. Hiervoor wordt een gel
geladen met gereduceerd recombinant N-cadherine en de peptidensequentie waarop het
antilichaam bindt en wordt het supernatans van de hybridomacellen toegevoegd aan het blotje als
primair antilichaam. Tenslotte gebeurt de visualisatie met een anti-murien IgG Alkaline Phosphatase
secundair antilichaam.
Figuur 4.1: Western blotting van een gel geladen met merker (laan 1 en 3), gereduceerd
supernatans van de TE5-BE2 hybridomacellen (laan 2), gereduceerd recombinant N-cadherine (laan
4) en de peptidensequentie waaraan het antilichaam bindt (laan 5). A: anti-murien IgG Alkaline
Phosphatase secundair antilichaam, B: supernatans van de TE-BE2 hybridomacellen als primair
antilichaam, anti-murien IgG Alkaline Phosphatase als secundair antilichaam
In figuur 4.1B is een bandje te zien ter hoogte van 100 à 150 kDa in laan 4 en één ter hoogte
van 25 kDa in laan 4 en 5. Het antilichaam bindt dus zowel aan recombinant humaan N-cadherine als
aan de peptidensequentie.
27
Tot hiertoe werd het IgM antilichaam steeds gedetecteerd met een anti-murien IgG
Alkaline Phosphatase secundair antilichaam. Dit is mogelijk omdat het IgM antilichaam gedeeltelijk
overeenkomt in structuur met een IgG antilichaam en het secundair antilichaam bijgevolg ook kan
binden met IgM antilichamen. Vanaf dit punt wordt het antilichaam specifiek gedetecteerd met een
anti-murien IgM Alkaline Phosphatase secundair antilichaam.
De specifieke detectie van het anti-N-cadherine IgM antilichaam met een anti-murien IgM
Alkaline Phosphatase secundair antilichaam wordt nagegaan door middel van Western blotting.
Hiervoor worden gereduceerd recombinant N-cadherine en de peptidensequentie waarop het
antilichaam bindt, op gel gebracht en getransfereerd op een nitrocellulose membraan.
Figuur 4.2: Western blotting van een gel geladen met merker (laan 3, 6, 9 en 12), gereduceerd
recombinant N-cadherine (laan 2, 5, 8 en 11)) en de peptidensequentie waaraan het antilichaam
bindt (laan 1, 4, 7 en 10). B + C: GC4 als primair antilichaam en A + D supernatans als primair
antilichaam. A + B anti-murien IgM Alkaline Phosphatase als secundair antilichaam en C + D: antimurien IgG Alkaline Phosphatase als secundair antilichaam.
In figuur 4.2A, C en D is een bandje aanwezig ter hoogte van 100 à 150 kDa (laan 2, 8 en
11). Hieruit volgt dat het antilichaam aanwezig in het supernatans van de TE5-BE2 hybridomacllen
bindt aan N-cadherine en gedetecteerd kan worden met een anti-murien IgM Alkaline Phosphatase
secundair antilichaam (Fig. 4.2A) en met een anti-murien IgG Alkaline Phosphatase secundair
antilichaam (Fig. 4.2D). Daarnaast blijkt ook dat het GC4 antilichaam bindt aan N-cadherine en
28
gedetecteerd kan worden met een anti-murien IgG Alkaline Phosphatase secundair antilichaam
(Fig. 4.2C). In figuur 4.2B zijn geen bandjes te zien en, aangezien er wel binding van het GC4
antilichaam aan N-cadherine is (Fig. 4.2C), wijst dit erop dat het GC4 antilichaam niet gedetecteerd
kan worden door middel van het murien IgM Alkaline Phosphatase secundair antilichaam.
4.2. OPZUIVERING VAN HET ANTILICHAAM MET BEHULP VAN EEN HITRAPTM KOLOM
Het geproduceerde TE5-BE2 IgM antilichaam wordt opgezuiverd met behulp van een
HiTrapTM kolom. Er worden stalen genomen van de verschillende stappen van de opzuivering. Er
wordt een staal genomen van het supernatans voor opzuivering, één van de doorloop nadat het
supernatans op de kolom is gebracht, één van de wasstap die daarop volgt, vijf stalen bij elutie van
de kolom en één bij regeneratie van de kolom. Deze stalen worden op gel geladen om te bepalen in
welke fractie het antilichaam aanwezig is. De eiwitten worden gevisualiseerd met coomassie
bauwkleuring (Fig. 4.3).
Figuur 4.3 Coomassie kleuring van een gel geladen met merker (laan 1), supernatans voor
opzuivering (laan 2), doorloop (laan 3), na wassen (laan 4), elutiefractie 1, 2, 3, 4 en 5 (laan 5, 6, 7,
8, en 9), gereduceerde elutiefractie 2, 3, 4 en 5 (laan 11, 12, 13 en 14), regeneratie (laan 10) en
gereduceerde regeneratie (laan 15).
29
In figuur 4.3 zijn verschillende bandjes te zien in laan 2, 3, 4, 7 en 11. Dit wijst op de
aanwezigheid van eiwitten in de stalen met supernatans voor opzuivering, in de doorloop, na
wassen, in elutiefractie 3 en gereduceerde elutiefractie 2.
Daarnaast werden de eiwitten van de gel getransfereerd op een nitrocellulosemembraan
en het antilichaam gedetecteerd met anti-murien IgM Alkaline Phosphatase secundair antilichaam
(Fig. 4.4).
Figuur 4.4 Western blotting van een gel geladen met merker (laan 1), supernatans voor opzuivering
(laan 2), doorloop (laan 3), na wassen (laan 4), elutiefractie 1, 2, 3, 4 en 5 (laan 5, 6, 7, 8, en 9),
gereduceerde elutiefractie 2, 3, 4 en 5 (laan 11, 12, 13 en 14), regeneratie (laan 10) en
gereduceerde regeneratie (laan 15). Als Secundair antilichaam wordt gebruik gemaakt van een
anti-murien IgM Alkaline Phosphatase antilichaam.
In Figuur 4.4 zijn in laan 2, 3 en 4 verschillende bandjes te zien ter hoogte van 100 tot 250
kDa. Dit zijn afbraakbandjes van het IgM antilichaam. De bandjes wijzen op de aanwezigheid van het
antilichaam in het staal met supernatans voor opzuivering, in de doorloop, en in de wasstap. Het
volledige antilichaam bevindt zich bovenaan aan het blotje. Het antilichaam is overgelopen naar de
baantjes ernaast doordat te veel antilichaam geladen werd. In laan 7 is een bandje te zien bij 37 à 50
kDa en in laan 11 en ook in mindere maten in laan 12, 13, 14 en 15 zijn bandjes te zien bij 100 à 150
kDa. Dit is waarschijnlijk een fragment van het antilichaam dat bestaat uit een zware en een lichte
keten verbonden met een disulfidebrug. De aanwezigheid van dit bandje wijst op de aanwezigheid
30
van antilichamen in de stalen met gereduceerde elutiefractie 2 en in mindere mate in gereduceerde
elutiefractie 3, 4 en 5 en in de gereduceerde regeneratie.
4.3. OPZUIVERING VAN HET ANTILICHAAM MET AMMONIUMSULFAATPRECIPITATIE
Het geproduceerde TE5-BE2 IgM antilichaam wordt opgezuiverd met behulp van een
ammoniumsulfaatprecipitatie. Door het toevoegen van ammoniumsulfaat aan het supernatans van
de TE5-BE2 hybridomacellen daalt de oplosbaarheid van het IgM antilichaam en slaat het neer. Er
worden stalen genomen van de verschillende stappen van de opzuivering. Er wordt een staal
genomen van het supernatans voor opzuivering, één na elke wasstap met de 50% verzadigde
ammoniumsulfaatoplossing en één van de uiteindelijk bekomen oplossing in PBS. Deze stalen
worden op gel geladen om te bepalen in welke fractie het antilichaam aanwezig is. De eiwitten
worden gevisualiseerd met coomassie bauwkleuring (Fig. 4.5).
Figuur 4.5: Coomassie kleuring van een gel geladen met merker (laan 5), supernatans voor
opzuivering (laan 4), na wasstap 1 (laan 3), na wasstap 2 (laan 2) en de PBS-oplossing (laan 1).
In Figuur 4.5 zijn verschillende bandjes te zien in laan 1 en 4. Dit wijst op de aanwezigheid
van eiwitten in het staal voor opzuivering en in de uiteindelijk bekomen PBS-oplossing.
Daarnaast werden de eiwitten van de gel getransfereerd op een nitrocellulosemembraan
en het antilichaam gedetecteerd met anti-murien IgM Alkaline Phosphatase secundair antilichaam
(Fig. 4.6).
31
Figuur 4.6: Western blotting van een gel geladen met merker (laan 1), gereduceerd supernatans
voor opzuivering (laan 2), gereduceerde wasstap 1 (laan 3), gereduceerde wasstap 2 (laan 4) en
gereduceerde PBS-oplossing (laan 5). Als Secundair antilichaam wordt gebruik gemaakt van een
anti-murien IgM Alkaline Phosphatase antilichaam.
In figuur 4.6 zijn bandjes te zien ter hoogte van 50 en 75 kDa in laan 2, 3 en 5, dit wijst op
aanwezigheid van het antilichaam in de stalen met supernatans voor opzuivering, in de eerste
wasstap en in de uiteidelijk bekomen PBS-oplossing. Het bandje bij 50 kDa is waarschijnlijk
veroorzaakt door het Fab-fragment van het antilichaam en het bandje bij 75 kDa door de zware
keten van het antilichaam.
4.4. ONTZOUTING MET BEHULP VAN EEN PD-10 KOLOM
Na opzuivering van het antilichaam met behulp van ammoniumsulfaatprecipitatie wordt de
bekomen PBS-oplossing ontzout met een PD-10 kolom. Er wordt een staal genomen van de
verschillende opgevangen fracties, namelijk één van de PBS-oplossing voor opzuivering, één van het
staal na het doorlopen van de kolom en drie fracties na elutie met PBS. Deze stalen worden op gel
geladen om te bepalen in welke fractie het antilichaam aanwezig is. De eiwitten worden
gevisualiseerd met coomassie bauwkleuring (Fig. 4.7)
32
Figuur 4.7: Coomassie kleuring van een gel geladen met merker (laan 6), PBS-oplossing
voor ontzouting (laan 5), doorloop (laan 4), elutiefractie 1, 2 en 3 (laan 3, 2 en 1).
In figuur 4.7 zijn verschillende bandjes te zien in laan 1 en 5; dit wijst op de aanwezigheid
van het anti-N-cadherine-antilichaam in de oplossing voor ontzouting en in elutiefractie 3.
Daarnaast werden de eiwitten van de gel getransfereerd op een nitrocellulosemembraan
en het antilichaam gedetecteerd met anti-murien IgM Alkaline Phosphatase secundair antilichaam
(Fig. 4.8).
Figuur 4.8: Western blotting van een gel geladen met merker (laan 1), PBS-oplossing voor
ontzouting (laan 2), doorloop (laan 3), elutiefractie 1, 2 en 3 (laan 4, 5 en 6). Als secundair
antilichaam wordt gebruik gemaakt van een anti-murien IgM Alkaline Phosphatase antilichaam.
33
In Figuur 4.8 zijn in laan 2, 5 en 6 bandjes te zien ter hoogte van 50 en 75 kDa; dit wijst op
aanwezigheid van het antilichaam in de stalen met PBS-oplossing voor de ontzouting en in
elutiefractie 2 en 3.
4.5. CONCENTRATIEBEPALING VAN HET ANTI-N-CADHERINE IGM ANTILICHAAM
Na ontzouting kan de concentratie van het TE5-BE2 IgM antilichaam worden bepaald met
een Micro BCATM Protein Assay Kit. Rekening houdend met de verdunningsfactor van de stalen,
wordt de concentratie van de stalen berekend aan de hand van de gemeten absorbantiewaarden
met behulp van de ijklijn (Fig. 4.9).
optische densiteit (562 nm)
0,8
y = 0,0151x + 0,141
R² = 0,9961
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
10
20
30
40
50
concentratie in µg/mL
Figuur 4.9: Ijklijn opgesteld door het uitzetten van de gemeten absorbantie in functie van de
concentratie van de standaarden.
Het antilichaam bevindt zich in fractie 4 van de opzuivering van het antilichaam (laan 6 in
Fig. 4.8). Met behulp van de vergelijking van de ijklijn kan aan de hand van de gemeten absorbantie
van de onbekende, de concentratie van de onbekende worden berekend:
y = 0,0112x + 0,1763
x = (y – 0,1763)/0,0112
De concentratie van het antilichaam in fractie 4 bedraagt 5,168 mg/mL.
De concentratie van het antilichaam werd gemeten in een ander staal. De ijklijn opgesteld
aan de hand van de gemeten absorbantie van de standaarden, is te zien in figuur 4.10.
34
0,9
y = 0,0156x + 0,1466
R² = 0,9972
optische densiteit
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
10
20
30
40
50
concentratie in µg/mL
Figuur 4.10: Ijklijn opgesteld door het uitzetten van de gemeten absorbantie in functie
van de concentratie van de standaarden.
Het antilichaam bevindt zich in fractie 4 en 5 van de opzuivering van het antilichaam. Met
behulp van de vergelijking van de ijklijn kan aan de hand van de gemeten absorbantie van de
onbekende, de concentratie van de onbekende worden berekend:
y = 0,0115x + 0,2087
x = (y - 0,2087)/0,0115
De concentratie van het antilichaam bedraagt 2,871 mg/mL in fractie 5 en 1,050 mg/mL in
fractie 4.
4.6. BINDING VAN HET ANTILICHAAM NAGAAN AAN DE HAND VAN ELISA
Om een eerste indicatie van de binding van het TE5-BE2 IgM antilichaam aan N-cadherine
te bekomen, wordt een vereenvoudigde Elisa uitgevoerd. De affiniteit van het antilichaam ten
opzichte van N-cadherine-expresserende A549 cellen en recombinant N-cadherine wordt nagegaan
(figuur 4.11A en B respectievelijk). De visualisatie gebeurt met behulp van een anti-murien IgM
Alkaline Phosphatase secundair antilichaam.
35
Figuur 4.11: vereenvoudigde Elisa: A: Binding van het IgM antilichaam aan A549 cellen. B: Binding
van het IgM antilichaam aan recombinant N-cadherine.
Uit figuur 4.11 blijkt dat er zowel binding is van het TE5-BE2 IgM antilichaam aan de A549
cellen als aan N-cadherine.
Daarna wordt een uitgebreide Elisa uitgevoerd. Naast evaluatie van de binding van IgM ten
opzichte van A549 cellen en recombinant N-cadherine, wordt ook de binding ten opzichte van de
N-cadherine negatieve SKBR3 cellijn, recombinant E-cadherine en BSA nagegaan. Tevens wordt de
binding van het commercieel beschikbaar anti-N-caderine GC4 antilichaam ten opzichte van de
verschillende cellijnen en eiwitten nagegaan. Om aspecifieke binding van de gebruikte secundaire
antilichamen na te gaan, worden een aantal wellen met cellen en eiwitten zonder primair
antilichaam geïncubeerd (Fig. 4.12).
Er is binding van het IgM antilichaam aan recombinant N-cadherine, recombinant
E-cadherine, het peptide en BSA (Fig. 4.12A). In Figuur 4.12 C is te zien dat er binding van het IgM
antilichaam aan de A549 en de SKBR3 cellen is. Figuur 4.12 D toont dat er binding van het GC4
antilichaam is aan SKBR3 cellen en niet aan A549 cellen. De binding is in al deze gevallen aan de lage
kant in vergelijking met de vereenvoudigde Elisa. De binding van het GC4 antilichaam aan
recombinant N-cadherine, recombinant E-cadherine, het peptide en BSA is verwaarloosbaar (Fig.
4.12B). Aangezien er geen specifieke binding van het positieve controle antilichaam (GC4) aan
N-cadherine werd waargenomen, moet deze test nog herhaald worden.
36
Figuur 4.12: A: Binding van het IgM antilichaam aan recombinant N-cadherine, recombinant Ecadherine, BSA en de peptidensequentie. B: Binding van het GC4 antilichaam aan recombinant Ncadherine, recombinant E-cadherine, BSA en de peptidensequentie. C: Binding van het IgM
antilichaam aan A549 en SKBR3 cellen. D: Binding van het GC4 antilichaam aan A549 en SKBR3
cellen.
4.7. BINDING VAN HET ANTILICHAAM NAGAAN AAN DE HAND VAN WESTERN BLOTTING
Na de opzuivering van het anti-N-cadherine antilichaam wordt een gel gelopen met A549
en SKBR3 cellysaten, met recombinant N-cadherine, recombinant E-cadherine en verschillende
hoeveelheden van het opgezuiverde antilichaam (Fig. 4.13).
37
Figuur 4.13: Western blotting van een gel geladen met merker (laan 1, 4 en 9),
gereduceerde cellysaten van A549 cellen (laan 2 en 5) en SKBR3 cellen (laan 3 en 6), gereduceerd
recombinant N-cadherine (laan 7), gereduceerd recombinant E-cadherine (laan 8), gereduceerde
opgezuiverd antilichaam (laan 10, 11 en 12) respectievelijk 0,5 µg, 1 µg en 2 µg. Als primair
antilichaam wordt gebruik gemaakt van GC4 antilichamen voor laan 2 en 3 en van IgM
antilichamen voor laan 5, 6, 7 en 8. Als secundair antilichaam wordt gebruik gemaakt van antimurien IgG Alkaline Phosphatase antilichamen (laan 2 en 3) en van anti-murien IgM Alkaline
Phosphatase antilichamen (overige lanen).
In figuur 4.13 is een bandje te zien in laan 7 ter hoogte van 100 à 150 kDa, wat wijst op
binding van het IgM antilichaam aan N-cadherine. In laan 8 is echter geen bandje te zien, wat
aantoont dat er geen binding aan E-cadherine is. Daarnaast is ook een bandje te zien in laan 12 ter
hoogte van 75 kDa en in minder mate in laan 10 en 11; dit wijst op de aanwezigheid van het IgM
antilichaam. Er is geen bandje te zien bij de cellysaten, noch bij toevoeging van het GC4 antilichaam
(laan 2 en 3), noch bij toevoeging van het IgM antilichaam (laan 5 en 6). Mogelijks is dit een gevolg
van een probleem met de cellen of de cellysaten.
38
5. DISCUSSIE EN CONCLUSIE
Prostaatkanker is de meest voorkomende kanker bij mannen en het aantal sterftegevallen
staat op de tweede plaats bij de kankergerelateerde doodsoorzaken bij mannen [1, 2].
Gemetastaseerd en castratieresistente prostaatkanker zijn de meest dodelijke vormen van kanker.
Daarom is er nood aan een methode om deze agressieve vorm van de kanker op te sporen [3].
Bij overgang van androgeen afhankelijke naar castratieresitente prostaatkanker treedt
epitheliale mesenchymale transitie (EMT) op. Tijdens de EMT treedt er switch van E-cadherine naar
N-cadherine op. N-cadherine komt dus niet voor in normaal prostaatweefsel, maar wel bij
metastasering van prostaatkanker en castratieresistente prostaatkanker [3, 4]. In het artikel van
Tanaka, H. et al. werd reeds aangetoond dat antilichamen tegen N-cadherine de groei, de lokale
invasie, de metastasering van de tumor en de evolutie naar castratieresistente prostaatkanker van
vergevorderde prostaatkanker kunnen afremmen [3].
In deze thesis wordt op zoek gegaan naar een antilichaam dat specifiek bindt aan
N-cadherine. Dit antilichaam kan gelabeld worden met een radioisotoop en gebruikt worden voor de
diagnose of behandeling van gevorderde prostaatkanker [5].
In voorgaand onderzoek werd aangetoond dat het anti-N-cadherine GC4-antilichaam in
vitro specifiek op recombinant N-cadherine bindt en niet op recombinant E-cadherine, maar in vivo
werden geen goede resultaten bekomen [64]. Daarom werd besloten een nieuw anti-N-cadherine
antilichaam aan te maken. Hiervoor werd een peptidensequentie van N-cadherine gekozen. Het
peptide werd aangemaakt en geïnjecteerd bij muizen. De aanwezigheid van een anti-N-cadherine
antilichaam in het bloed van de muizen werd getest. De lymphoïede cellen van de milt van de muizen
die een anti-N-cadherine antilichaam aanmaakten, werden gefusioneerd met myelomacellen. De
binding van het supernatans van de bekomen hybridomacellen op recombinant N-cadherine,
recombinant E-cadherine en BSA werd nagegaan. Het supernatans van de TE5 BE2 hybridomacellen
toonden de beste binding op recombinant N-cadherine, met een beperkte binding op recombinant
E-cadherine en BSA, daarom werden de TE5-BE2 hybridomacellen geselecteerd voor verder
onderzoek [65].
De aanwezigheid van het antilichaam in het supernatans van de TE5-BE2 hybridomacellen
en de binding van dit antilichaam aan recombinant N-cadherine en de peptidensequentie werden
getest met behulp van Western blotting. Hieruit bleek dat een antilichaam aanwezig is in het
39
supernatans van de hybridomacellen en dat dit zowel bindt aan recombinant N-cadherine als aan de
peptidensequentie.
Het anti-N-cadherine antilichaam moet worden opgezuiverd om gebruikt te worden voor
diagnose of behandeling van prostaatkanker. De opzuivering gebeurde met behulp van een HiTrap
kolom. Dit gaf echter geen goede resultaten, zodat overgegaan werd tot de opzuivering met
ammoniumsulfaatprecipatie gecombineerd met ontzouting met behulp van een PD-10 kolom.
Binding van het opgezuiverde IgM antilichaam aan het recombinant N-cadherine alsook aan
E-cadherine en het negatieve controle eiwit BSA werd nagegaan via Elisa en Western blotting. Het
recombinant N-cadherine op Western blotting werd specifiek gedetecteerd door middel van het IgM
antilichaam. Uit zowel de cellulaire Elisa (met N-cadherine positieve A549 en N-cadherine negatieve
SKBR3 cellen) als de Elisa met gecoat N-cadherine, E-cadherine, peptide en BSA konden geen
sluitende connclusies gevormd worden. Bovendien werd er geen specifieke binding van het positieve
controle antilichaam, GC4, aan N-cadherine waargenomen. Deze test moet dus herhaald worden.
Uit de Elisa testen kan de affiniteit van het antilichaam voor het antigen worden berekend
via de dissociatieconstante Kd. Hierbij is Kd gelijk aan de concentratie van N-cadherine
vermenigvuldigd met de concentratie van het anti-N-cadherine antilichaam gedeeld door de
concentratie van het antigen-antilichaam complex.
Tenslotte werd de binding van het IgM antilichaam aan recombinant N-cadherine,
recombinant E-cadherine en A549 en SKBR3 cellysaten getest met behulp van Western-Blotting en
werd de binding van het anti-murien IgM antilichaam aan verschillende concentraties van het IgM
antilichaam getest.
Het monoklonaal antilichaam dat aangemaakt wordt door de TE5-BE2 hybridomacellen is
mogelijk geschikt als monoklonaal antilichaam voor de diagnose en behandeling van prostaatkanker.
Om hieromtrent een besluit te vormen, zijn verdere in vitro en in vivo experimenten om de
specifieke binding van het antilichaam aan N-cadherine na te gaan noodzakelijk. Mogelijke
vervolgexperimenten zijn immunocytochemische, immunohistochemische en in vivo experimenten.
In de toekomst kan een sandwich Elisa ontwikkeld worden voor de detectie van
N-cadherine in niet opgezuiverde biologische stalen. Voor sandwich Elisa zijn twee antilichamen
nodig die binden aan een verschillend epitoop van het antigen. Eerst wordt een 96-well plaat gecoat
40
met een gekende hoeveelheid van één van beide primaire antilichamen. Daarna worden de nietspecifieke plaatsen op het oppervlak geblokkeerd en wordt het antigenbevattende staal aan de plaat
toegevoegd. Na wassen wordt het tweede primair antilichaam en een secundair antilichaam
toegevoegd gevolgd door de detectie. Sandwich Elisa is gevoeliger dan gewone Elisa. De antilichamen
die gebruikt kunnen worden voor een sandwich Elisa voor de detectie van N-cadherine zijn het GC4
antilichaam en het TE5-BE2 antilichaam [66, 67].
Na het herhalen van de Elisa’s moeten er nog een aantal testen worden gedaan om de
binding van het antilichaam in vitro en in vivo verder te onderzoeken. Zo moeten er nog
immunohistochemische
testen
worden
uitgevoerd
op
prostaatkankerweefsel.
Het
prostaatkankerweefsel kan afkomstig zijn van mannen bij wie radicale prostatectomie is uitgevoerd
en zachte weefsel- en beendermetastasen kunnen verkregen worden bij mannen die gestorven zijn
aan prostaatkanker, zodat de verdeling van het antigen in het weefsel kan worden bestudeerd. De
intensiteit van de kleur is evenredig met het expressieniveau van het antigen [3, 68].
Daarnaast moet de binding van het antilichaam in vivo worden nagegaan. Hiervoor kan
men gebruik maken van xenograften van humane prostaattumoren weefsels bij severe combined
immunodeficient (SCID) muizen. Deze xenograften hebben de eigenschappen van de originele
tumoren zodat ze kunnen worden gebruikt als model voor humane prostaattumoren [69].
Bij de diagnose en behandeling van verschillende andere kankers zou gebruik gemaakt
kunnen worden van radioactief gelabelde monoklonale IgM antilichamen. Een voorbeeld hiervan is
een
188
Re gelabeld monoklonaal IgM antilichaam gericht tegen melanine, dat in fase I klinische
studies reeds aangetoond heeft dat het kan gebruikt worden bij de behandeling van metatatische
melanoma [70, 71]. Een ander voorbeeld is een 90Y gelabeld monoklonaal antilichaam dat kan dienen
ter behandeling van ovariumkanker. Dit werd in vivo aangetoond bij SCID-muismodellen van deze
ziekte [72].
Voor de diagnose en behandeling van prostaatkanker moet het anti-N-cadherine
radioactief gelabeld worden. Voor de diagnose van prostaatkanker kan het anti-N-cadherine IgM
antilichaam gelabeld worden met 131I.
Antilichamen zijn met een molecuul gewicht van 150 kDa grote eiwitten. Als gevolg hiervan
kunnen ze slechts in beperkte mate in het tumorweefsel doordringen en hebben ze een trage
plasmaklaring [36-38]. Met behulp van enzymen kunnen de antilichamen in fragmenten worden
41
geknipt die kleiner zijn en dus een betere weefselpenetratie en een snellere klaring uit het lichaam
vertonen dan de volledige antilichamen. Met papaïne kan het antilichaam worden geknipt in een
Fc-fragment en 2 Fab-fragmenten. Met pepsine kan het antilichaam gesplitst worden in een
Fc-fragment en een F(ab)2-fragment [36-38, 40, 42, 43]. Het anti-N-cadherine IgM antilichaam kan
met behulp van papaïne of pepsine in fragmenten worden geknipt. De binding van deze fragmenten
aan N-cadherine moet nagegaan worden met behulp van Elisa en Western Blotting alvorens
overgegaan kan worden op verdere in vitro experimenten op weefselcoupes en in vivo
experimenten.
42
6. LITERATUURLIJST
1.
Schrecengost R, Knudsen KE. Molecular pathogenesis and progression of prostate cancer.
Seminars in oncology. 2013;40(3):244-58.
2.
Siegel R, Ma J, Zou Z, Jemal A. Cancer statistics, 2014. CA: a cancer journal for clinicians.
2014;64(1):9-29.
3.
Tanaka H, Kono E, Tran CP, Miyazaki H, Yamashiro J, Shimomura T, et al. Monoclonal
antibody targeting of N-cadherin inhibits prostate cancer growth, metastasis and castration
resistance. Nature medicine. 2010;16(12):1414-20.
4.
Tomita K, van Bokhoven A, van Leenders GJ, Ruijter ET, Jansen CF, Bussemakers MJ, et al.
Cadherin switching in human prostate cancer progression. Cancer research.
2000;60(13):3650-4.
5.
Sharkey RM, Goldenberg DM. Cancer radioimmunotherapy. Immunotherapy. 2011;3(3):34970.
6.
Kutikov A, Guzzo TJ, Malkowicz SB. Clinical approach to the prostate: an update. Radiologic
clinics of North America. 2006;44(5):649-63, vii.
7.
Kundra V. Prostate cancer imaging. Seminars in roentgenology. 2006;41(2):139-49.
8.
Raja J, Ramachandran N, Munneke G, Patel U. Current status of transrectal ultrasoundguided prostate biopsy in the diagnosis of prostate cancer. Clinical radiology. 2006;61(2):14253.
9.
Jung AJ, Westphalen AC. Imaging prostate cancer. Radiologic clinics of North America.
2012;50(6):1043-59.
10.
Bertram JS. The molecular biology of cancer. Molecular aspects of medicine. 2000;21(6):167223.
11.
Akin O, Hricak H. Imaging of prostate cancer. Radiologic clinics of North America.
2007;45(1):207-22.
12.
Tran NL, Nagle RB, Cress AE, Heimark RL. N-Cadherin expression in human prostate
carcinoma cell lines. An epithelial-mesenchymal transformation mediating adhesion
withStromal cells. The American journal of pathology. 1999;155(3):787-98.
13.
Stenman UH, Leinonen J, Zhang WM, Finne P. Prostate-specific antigen. Seminars in cancer
biology. 1999;9(2):83-93.
14.
Beheshti M, Langsteger W, Fogelman I. Prostate cancer: role of SPECT and PET in imaging
bone metastases. Seminars in nuclear medicine. 2009;39(6):396-407.
15.
Love C, Din AS, Tomas MB, Kalapparambath TP, Palestro CJ. Radionuclide bone imaging: an
illustrative review. Radiographics : a review publication of the Radiological Society of North
America, Inc. 2003;23(2):341-58.
43
16.
Langsteger W, Haim S, Knauer M, Waldenberger P, Emmanuel K, Loidl W, et al. Imaging of
bone metastases in prostate cancer: an update. The quarterly journal of nuclear medicine
and molecular imaging : official publication of the Italian Association of Nuclear Medicine
(AIMN) [and] the International Association of Radiopharmacology (IAR), [and] Section of the
So. 2012;56(5):447-58.
17.
Beer AJ, Eiber M, Souvatzoglou M, Schwaiger M, Krause BJ. Radionuclide and hybrid imaging
of recurrent prostate cancer. The Lancet Oncology. 2011;12(2):181-91.
18.
Gullberg GT, Reutter BW, Sitek A, Maltz JS, Budinger TF. Dynamic single photon emission
computed tomography—basic principles and cardiac applications. Physics in Medicine and
Biology. 2010;55(20):R111-91.
19.
Cai J, Li F. Single-photon emission computed tomography tracers for predicting and
monitoring cancer therapy. Current pharmaceutical biotechnology. 2013;14(7):693-707.
20.
Mari Aparici C, Seo Y. Functional imaging for prostate cancer: therapeutic implications.
Seminars in nuclear medicine. 2012;42(5):328-42.
21.
Mease RC. Radionuclide based imaging of prostate cancer. Current topics in medicinal
chemistry. 2010;10(16):1600-16.
22.
Sanz G, Rioja J, Zudaire JJ, Berian JM, Richter JA. PET and prostate cancer. World journal of
urology. 2004;22(5):351-2.
23.
Schoder H, Larson SM. Positron emission tomography for prostate, bladder, and renal cancer.
Seminars in nuclear medicine. 2004;34(4):274-92.
24.
Jadvar H. Molecular imaging of prostate cancer with PET. Journal of nuclear medicine :
official publication, Society of Nuclear Medicine. 2013;54(10):1685-8.
25.
Takahashi N, Inoue T, Lee J, Yamaguchi T, Shizukuishi K. The roles of PET and PET/CT in the
diagnosis and management of prostate cancer. Oncology. 2007;72(3-4):226-33.
26.
Bouchelouche K, Tagawa ST, Goldsmith SJ, Turkbey B, Capala J, Choyke P. PET/CT Imaging
and Radioimmunotherapy of Prostate Cancer. Seminars in nuclear medicine. 2011;41(1):2944.
27.
Kahn D, Austin JC, Maguire RT, Miller SJ, Gerstbrein J, Williams RD. A phase II study of [90Y]
yttrium-capromab pendetide in the treatment of men with prostate cancer recurrence
following radical prostatectomy. Cancer biotherapy & radiopharmaceuticals. 1999;14(2):99111.
28.
Bouchelouche K, Choyke PL, Capala J. Prostate specific membrane antigen- a target for
imaging and therapy with radionuclides. Discovery medicine. 2010;9(44):55-61.
29.
Afshar-Oromieh A, Avtzi E, Giesel FL, Holland-Letz T, Linhart HG, Eder M, et al. The diagnostic
value of PET/CT imaging with the (68)Ga-labelled PSMA ligand HBED-CC in the diagnosis of
recurrent prostate cancer. European journal of nuclear medicine and molecular imaging.
2015;42(2):197-209.
44
30.
Eder M, Neels O, Muller M, Bauder-Wust U, Remde Y, Schafer M, et al. Novel Preclinical and
Radiopharmaceutical Aspects of [68Ga]Ga-PSMA-HBED-CC: A New PET Tracer for Imaging of
Prostate Cancer. Pharmaceuticals (Basel, Switzerland). 2014;7(7):779-96.
31.
Breedveld FC. Therapeutic monoclonal antibodies. Lancet. 2000;355(9205):735-40.
32.
Maeda M, Johnson KR, Wheelock MJ. Cadherin switching: essential for behavioral but not
morphological changes during an epithelium-to-mesenchyme transition. Journal of cell
science. 2005;118(Pt 5):873-87.
33.
Johnston SL. Biologic therapies: what and when? Journal of Clinical Pathology. 2007;60(1):817.
34.
Maizels N. Secret sharers in the immune system: a novel RNA editing activity links switch
recombination and somatic hypermutation. Genome Biology. 2000;1(4):reviews1025.1-3.
35.
Song H, Sgouros G. Radioimmunotherapy of solid tumors: searching for the right target.
Current drug delivery. 2011;8(1):26-44.
36.
Haylock AK, Spiegelberg D, Nilvebrant J, Sandström K, Nestor M. In vivo characterization of
the novel CD44v6-targeting Fab fragment AbD15179 for molecular imaging of squamous cell
carcinoma: a dual-isotope study. EJNMMI Research. 2014;4:11.
37.
Chames P, Van Regenmortel M, Weiss E, Baty D. Therapeutic antibodies: successes,
limitations and hopes for the future. British journal of pharmacology. 2009;157(2):220-33.
38.
Wa C, Mallik R, Hage DS. Development of immunoaffinity restricted access media for rapid
extractions of low-mass analytes. Analytical chemistry. 2008;80(22):8751-62.
39.
Buhler P, Wolf P, Gierschner D, Schaber I, Katzenwadel A, Schultze-Seemann W, et al. A
bispecific diabody directed against prostate-specific membrane antigen and CD3 induces Tcell mediated lysis of prostate cancer cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII.
2008;57(1):43-52.
40.
Li GN, Wang SP, Xue X, Qu XJ, Liu HP. Monoclonal antibody-related drugs for cancer therapy.
Drug discoveries & therapeutics. 2013;7(5):178-84.
41.
Tietze LF, Krewer B. Antibody-directed enzyme prodrug therapy: a promising approach for a
selective treatment of cancer based on prodrugs and monoclonal antibodies. Chemical
biology & drug design. 2009;74(3):205-11.
42.
Kawashima H. Radioimmunotherapy: a specific treatment protocol for cancer by cytotoxic
radioisotopes conjugated to antibodies. TheScientificWorldJournal. 2014;2014:492061.
43.
Nielsen JT, Poulsen J, Flo C, Marqversen J, Rehling M. Pharmacokinetics and dosimetry of
[111In] F(ab')2 fragments against prostatic acid phosphatase after intraprostatic injection for
immunoscintigraphy in prostate cancer. Clinical physiology (Oxford, England).
1995;15(5):467-81.
45
44.
Vacchelli E, Vitale I, Tartour E, Eggermont A, Sautes-Fridman C, Galon J, et al. Trial Watch:
Anticancer radioimmunotherapy. Oncoimmunology. 2013;2(9):e25595.
45.
Jhanwar YS, Divgi C. Current status of therapy of solid tumors. Journal of nuclear medicine :
official publication, Society of Nuclear Medicine. 2005;46 Suppl 1:141s-50s.
46.
Khan A, Shergill I, Arya M, Barua JM, Kaisary AV. Radiommunotherapy and prostate cancer: a
promising new therapy in the management of metastatic disease. BJU international.
2006;98(1):8-9.
47.
Simone CB, 2nd, Hahn SM. What's in a Label? Radioimmunotherapy for metastatic prostate
cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer
Research. 2013;19(18):4908-10.
48.
David KA, Milowsky MI, Kostakoglu L, Vallabhajosula S, Goldsmith SJ, Nanus DM, et al. Clinical
utility of radiolabeled monoclonal antibodies in prostate cancer. Clinical genitourinary
cancer. 2006;4(4):249-56.
49.
Gravdal K, Halvorsen OJ, Haukaas SA, Akslen LA. A switch from E-cadherin to N-cadherin
expression indicates epithelial to mesenchymal transition and is of strong and independent
importance for the progress of prostate cancer. Clinical cancer research : an official journal of
the American Association for Cancer Research. 2007;13(23):7003-11.
50.
Duband JL. Diversity in the molecular and cellular strategies of epithelium-to-mesenchyme
transitions: Insights from the neural crest. Cell adhesion & migration. 2010;4(3):458-82.
51.
Drivalos A, Papatsoris AG, Chrisofos M, Efstathiou E, Dimopoulos MA. The role of the cell
adhesion molecules (integrins/cadherins) in prostate cancer. International braz j urol : official
journal of the Brazilian Society of Urology. 2011;37(3):302-6.
52.
Jaggi M, Nazemi T, Abrahams NA, Baker JJ, Galich A, Smith LM, et al. N-cadherin switching
occurs in high Gleason grade prostate cancer. The Prostate. 2006;66(2):193-9.
53.
Voura EB, Sandig M, Siu CH. Cell-cell interactions during transendothelial migration of tumor
cells. Microscopy research and technique. 1998;43(3):265-75.
54.
Li G, Satyamoorthy K, Herlyn M. N-cadherin-mediated intercellular interactions promote
survival and migration of melanoma cells. Cancer research. 2001;61(9):3819-25.
55.
Vandyke K, Chow AW, Williams SA, To LB, Zannettino AC. Circulating N-cadherin levels are a
negative prognostic indicator in patients with multiple myeloma. British journal of
haematology. 2013;161(4):499-507.
56.
De Wever O, Pauwels P, De Craene B, Sabbah M, Emami S, Redeuilh G, et al. Molecular and
pathological signatures of epithelial-mesenchymal transitions at the cancer invasion front.
Histochemistry and cell biology. 2008;130(3):481-94.
57.
Islam SS, Mokhtari RB, Noman AS, Uddin M, Rahman MZ, Azadi MA, et al. Sonic hedgehog
(Shh) signaling promotes tumorigenicity and stemness via activation of epithelial-tomesenchymal transition (EMT) in bladder cancer. Molecular carcinogenesis. 2015.
46
58.
Tsuchiya B, Sato Y, Kameya T, Okayasu I, Mukai K. Differential expression of N-cadherin and
E-cadherin in normal human tissues. Archives of histology and cytology. 2006;69(2):135-45.
59.
Smith BJ. SDS polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods in molecular biology
(Clifton, NJ). 1994;32:23-34.
60.
Wu X, Koiwa H. One-step casting of Laemmli discontinued sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis gel. Analytical biochemistry. 2012;421(1):347-9.
61.
Tastet C, Lescuyer P, Diemer H, Luche S, van Dorsselaer A, Rabilloud T. A versatile
electrophoresis system for the analysis of high- and low-molecular-weight proteins.
Electrophoresis. 2003;24(11):1787-94.
62.
Georgiou CD, Grintzalis K, Zervoudakis G, Papapostolou I. Mechanism of Coomassie brilliant
blue G-250 binding to proteins: a hydrophobic assay for nanogram quantities of proteins.
Analytical and bioanalytical chemistry. 2008;391(1):391-403.
63.
GE healtcare. Recombinant Protein Purification Handbook. 2e uitgave. 2006.
64.
Verstraete S. In vitro en in vivo evaluatie van 123I-anti-N-cadherine GC4 antilichaam en
F(AB')2-fragment in prostaatkanker: Universiteit Gent; 2013.
65.
Verniers A. selectie van een geschikt monoklonaal antilichaam tegen rN-cadherine bij
prostaatkanker: Universiteit Gent; 2014.
66.
Liu LN, Jing FJ, Cui J, Fu GY, Wang ZQ. Detection of circulating antigen in serum of mice
infected with Trichinella spiralis by an IgY-IgM mAb sandwich ELISA. Experimental
parasitology. 2013;133(2):150-5.
67.
Abebe M, Kumar V, Rajan S, Thaker A, Sevinc S, Vijay HM. Detection of recombinant Alt a1 in
a two-site, IgM based, sandwich ELISA opens up possibilities of developing alternative assays
for the allergen. Journal of immunological methods. 2006;312(1-2):111-7.
68.
Matos LL, Trufelli DC, de Matos MG, da Silva Pinhal MA. Immunohistochemistry as an
important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 2010;5:9-20.
69.
Lin D, Xue H, Wang Y, Wu R, Watahiki A, Dong X, et al. Next generation patient-derived
prostate cancer xenograft models. Asian journal of andrology. 2014;16(3):407-12.
70.
Schweitzer AD, Rakesh V, Revskaya E, Datta A, Casadevall A, Dadachova E. Computational
model predicts effective delivery of 188-Re-labeled melanin-binding antibody to metastatic
melanoma tumors with wide range of melanin concentrations. Melanoma research.
2007;17(5):291-303.
71.
Jandl T, Revskaya E, Jiang Z, Harris M, Dorokhova O, Tsukrov D, et al. Melanoma stem cells in
experimental melanoma are killed by radioimmunotherapy. Nuclear medicine and biology.
2013;40(2):177-81.
47
72.
Borchardt PE, Quadri SM, Freedman RS, Vriesendorp HM. Intraperitoneal
radioimmunotherapy with human monoclonal IGM in nude mice with peritoneal
carcinomatosis. Cancer biotherapy & radiopharmaceuticals. 2000;15(1):53-64.
64.
Verstraete S. In vitro en in vivo evaluatie van 123I-anti-N-cadherine GC4 antilichaam en
F(AB')2-fragment in prostaatkanker: Universiteit Gent; 2013.
65.
Verniers A.
selectie van een geschikt monoklonaal antilichaam tegen rN-cadherine bij
prostaatkanker: Universiteit Gent; 2014.
66.
Matos LL, Trufelli DC, de Matos MG, da Silva Pinhal MA. Immunohistochemistry as an
important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker insights. 2010;5:9-20.
67.
Lin D, Xue H, Wang Y, Wu R, Watahiki A, Dong X, et al. Next generation patient-derived
prostate cancer xenograft models. Asian journal of andrology. 2014;16(3):407-12.
68.
Liu LN, Jing FJ, Cui J, Fu GY, Wang ZQ. Detection of circulating antigen in serum of mice
infected with Trichinella spiralis by an IgY-IgM mAb sandwich ELISA. Experimental
parasitology. 2013;133(2):150-5.
69.
Abebe M, Kumar V, Rajan S, Thaker A, Sevinc S, Vijay HM. Detection of recombinant Alt a1 in
a two-site, IgM based, sandwich ELISA opens up possibilities of developing alternative assays
for the allergen. Journal of immunological methods. 2006;312(1-2):111-7.
WEBPAGINA’S

http://www.allesoverkanker.be/prostaatkanker (geraadpleegd op 24/02/2015)

http://bitesizebio.com/580/how-sds-page-works/ (28/05/2015)

http://www.deprostaatkliniek.nl/onderzoeken-prostaat/onderzoekenprostaatvergroting/inwendige-echografie/ (geraadpleegd op 22/02/2015)

http://www.gezondheid.be/index.cfm?fuseaction=art&art_id=430 (geraadpleegd op
13/02/2015)

http://www.kuleuven.be/lucas/prostaatkanker/prostKBeh/pkbeh3.php (geraadpleegd op
18/02/2015)

http://www.kuleuven.be/onderzoek/onderzoeksdatabank/project/3M10/3M100589.htm
(geraadpleegd op 13/02/2015)

http://www.mayfieldclinic.com/PE-SPECT.htm (geraadpleegd op 28/02/2015)

http://merckmanual.nl/mmhenl/sec16/ch183/ch183c.html?qt=IgM&alt=sh (geraadpleegd op
13/02/2015)
48

http://www.natuurkunde.nl/artikelen/view.do?supportId=145582 (geraadpleegd op
28/02/2015)

http://www.natuurkunde.nl/artikelen/view.do?supportId=764277 (geraadpleegd op
09/03/2015)

http://www.natuurkunde.nl/artikelen/758/de-ct-scan (geraadpleegd op 09/03/2015)

http://www.prostaat.be/prostaat/functie/ (geraadpleegd op 19/02/2015)

http://www.prostaatkanker.org/2008/leeszaal/termen1.html (geraadpleegd op 20/02/2015)

http://www.tijdschriftkarakter.be/de-moleculaire-basis-van-kankeruitzaaiing/ (geraadpleegd
op 13/02/2015)

http://www.urologiekortrijk.be/patieninformatie/ziektebeelden/prostaat (geraadpleegd op
19/02/2015)

http://www.urologiekortrijk.be/patieninformatie/onderzoeken-en-technieken/ctmri-scan
(geraadpleegd op 25/02/2015)

http://www.uzleuven.be/video/MRI (geraadpleegd op 28/02/2015)
49
BIJLAGE: EVENING LECTURES @ FFW
Lezing Dr. Inge Huybrechts: Research on the causes of human cancer and scientific strategies for
cancer prevention and control
Kanker is wereldwijd de meest voorkomende doodsoorzaak. De incidentie van kanker is de
laatste tijd enorm gestegen en men verwacht dat deze nog verder zal stijgen de komende decennia.
De meest voorkomende kankers zijn longkanker, prostaatkanker en colorectale kanker bij mannen en
borstkanker, colorectale kanker en baarmoederhalskanker bij vrouwen. Het voorkomen van kanker,
de meest voorkomende kankers en de kankermortaliteit verschillen van land tot land. Hieruit volgt
dat de ontwikkeling van kanker zowel te wijten is aan genetische voorbeschikbaarheid als aan
omgevingsinvloeden. De belangrijkste risicofactoren voor de ontwikkeling van kanker zijn tabak
gebruik, infectie met Helicobacter pylori, alcohol gebruik, hepatitis B en C, weinig groenten en fruit
inname, infectie met het humane papillomavirus, fysieke inactiviteit, overgewicht en obesitas. Ook
socio-economisch factoren beïnvloeden het voorkomen van kanker en kankermortaliteit. The
International Agency for Resesarch on Cancer (IARC) classificeert omgevingsfactoren waaraan
mensen kunnen worden blootgesteld in vijf groepen op basis van de sterkte van de evidentie dat een
blootstelling een mogelijk risico vormt op de latere ontwikkeling van kanker. De classificatie wordt
gemaakt op basis van de IARC Monographs die bestaan uit een reeks wetenschappelijke reviews
waarin omgevingsfactoren, die het risico op kankerontwikkeling bij mensen vergroten, worden
beschreven.
Lezing Prof. Raymond Schiffelers: Therapy with RNA: excitement and challenges
Aangezien het tot overexpressie komen van een specifiek proteïne kan leiden tot de
ontwikkeling van een ziekte, is er nood aan een methode om de aanmaak van deze eiwitten te
inhiberen. De transfer van informatie van DNA via RNA naar proteïnen biedt een aantrekkelijk
aangrijpingspunt voor therapeutische interventies. Het design van antisense RNA is een methode om
de aanmaak van proteïnen te inhiberen. Antisense RNA is enkelstrengig RNA dat complementair is
aan messenger RNA (mRNA). Door baseparing van de oligonucleotideketen met mRNA wordt de
translatiemachinerie geremd en de translatie van mRNA in proteïnen geïnhibeerd. Een meer potente
methode om de aanmaak van proteïnen te inhiberen is de toediening van dubbelstrenging RNA. Dit
dubbelstrengig RNA wordt in stukken geknipt met behulp van het DICER enzym met vorming van
dubbelstrengig small interferring RNA (siRNA). Dit dubbelstrengig RNA wordt afgewonden waardoor
enkelstrengig RNA ontstaat, dat bindt met het complementaire mRNA met behulp van RISC,
waardoor het mRNA wordt ontbonden. Een soortgelijk mechanisme doet zich voor bij microRNA
(miRNA), dat aanwezig is in het lichaam en de genexpressie helpt reguleren. In tegenstelling tot bij
siRNA is de oligonucleotidesequentie van het miRNA niet volledig complementair met deze van het
mRNA. De binding van het miRNA met mRNA zal niet voor klieving van het mRNA zorgen, maar voor
het uiteenvallen van de translatiemachinerie. Het grote voordeel van RNA therapie is dat het design
van de geneesmiddelen gemakkelijk is, aangezien de sequentie van alle mRNA’s in het lichaam
gekend zijn. Een nadeel is dat RNA moleculen grote, geladen moleculen zijn, waardoor ze moeilijk in
de cel kunnen doordringen. Een ander probleem is de snelle klaring van RNA uit het lichaam.
Daarnaast is ook de overdracht van informatie van DNA naar proteïnen complexer dan oorspronkelijk
gedacht, er bestaan veel verschillende RNA soorten waarvan voor sommige de functie niet gekend is.
Lezing Prof. John LiPuma: The evolution of Microbiology in cystic Fibrosis
Cystische fibrose (CF) is de meest voorkomende dodelijke genetische aandoening bij
blanken. De ziekte wordt veroorzaakt door mutaties in genen die coderen voor de cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator (CFTR), een ionenkanaal dat chloride- en thiocyanaationen
transporteert door de celmembraan van epitheelcellen. De meest ernstige symptomen doen zich
voor ter hoogte van de luchtwegen. Door het defect aan CFTR is de hoeveelheid vloeistof ter hoogte
van het luchtwegoppervlak gedaald, met verminderde mucocilliaire klaring tot gevolg. Hierdoor
ontstaat obstructie van de longen, gevolgd door infectie met inflammatie en opnieuw obstructie tot
gevolg. Deze neerwaartse spiraal heeft uiteindelijk respiratoir falen tot gevolg. Cystische fibrose (CF)
werd voor het eerst beschreven in de jaren 30 van de vorige eeuw. Enkele jaren later werd het
belang van infectie bij de ontwikkeling van de ziekte ontdekt. De eerste behandelingen met
verschillende antibiotica deden de overleving spectaculair stijgen. Later werd, door de toenemende
vrees voor resistentie, het gebruik van antibiotica beperkt tot deze van wie de werking was bewezen
met behulp van susceptibiliteitstesten. Door de behandeling van CF is de ziekte geëvolueerd van een
kinderziekte naar een ziekte die ook voorkomt bij adolescenten. Pseudomonas verving
Staphylococcus als het pathogeen dat de voornaamste rol speelt bij de ziekte. In de periode die
daarop volgde ontdekte men dat de eigenschappen van Pseudomonas wijzigen als reactie op
stressvolle situaties. De Pseudomonas bacterie past zich aan om de longen van de gastheer te
kunnen koloniseren. Ondertussen bleek ook dat de overeenkomt tussen de werking van antibiotica in
vivo niet overeenkomt met deze in susceptibiliteitstesten. Hierdoor werd terug overgeschakeld op
een intensieve controle van de infecties met antibiotica. Later bleek CF een polymicrobiële infectie is.
De interactie met andere bacteriën wijzigt de eigenschappen van pseudomonas. Door het ontstaan
van niet-cultuur-afhankelijke methoden voor karakterisatie van bacteriën bleek dat er verschillende
Pseudomonas bacteriën bestaan die genotypisch en/of fenotypisch van elkaar verschillen. De
populatie van bacteriën blijft niet constant gedurende de tijd. Men hoopt in de toekomst een
verband te kunnen leggen tussen de bacteriepopulatie, die bepaald wordt door DNA-sequenering en
het optreden van symptomen, zodat de therapie hieraan kan aangepast worden.