Het therapeutisch effect van nitriet bij ischemie
advertisement
FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar 2013 - 2014 Het therapeutisch effect van nitriet bij ischemie-reperfusie letsels Stijn Vanneste Promotor: Prof. Dr. Romain Lefebvre Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE 1 2 INHOUDSOPGAVE INLEIDING ............................................................................................................................................... 7 MATERIALEN EN METHODEN ............................................................................................................. 12 RESULTATEN ......................................................................................................................................... 13 Hoofdstuk 1. De bronnen van nitriet .................................................................................................... 13 1.1 De endogene bron van nitriet: oxidatie van NO ......................................................................... 13 1.2 De exogene bronnen van nitriet.................................................................................................. 15 1.3 Nitrietconcentraties in het lichaam ............................................................................................. 17 Hoofdstuk 2. De bioactivatie van nitriet naar NO ................................................................................. 18 2.1 De non-enzymatische reductie van nitriet .................................................................................. 19 2.2 Reductie van nitriet door heem-bevattende globinen................................................................ 20 2.2.1 Reductie door hemoglobine ................................................................................................. 21 2.2.2 Reductie door myoglobine ................................................................................................... 23 2.2.3 Reductie door neuroglobine................................................................................................. 23 2.3 Reductie van nitriet door molybdeen-bevattende enzymes ...................................................... 24 2.4 Reductie van nitriet door eiwitten uit de mitochondriale transportketen ................................. 25 2.5 Andere nitrietreductasen ............................................................................................................ 25 Hoofdstuk 3. Mechanismen van de cytoprotectieve effecten van nitriet tijdens I/R ........................... 26 3.1 Nitriet-gemedieerde cytoprotectie is NO-afhankelijk en NOS-onafhankelijk ............................. 26 3.2 Enkele pathofysiologische kenmerken van I/R letsels ................................................................ 27 3.2.1 Generatie van ROS................................................................................................................ 28 3.2.2 Opening van de mitochondrial permeability transition pore (mPTP) .................................. 30 3.3 Mechanismen van nitriet-gebaseerde cytoprotectie .................................................................. 31 3.3.1 Reversibele S-nitrosilatie van complex I............................................................................... 32 3.3.2 Reversibele nitrosilatie van complex IV ............................................................................... 33 3.3.3 De mechanismen van nitriet bootsen ischemische preconditionering (IPC) na .................. 34 3.3.4 De opening van ATP-dependente kaliumkanalen door nitriet ............................................. 36 3.3.5 Inhibitie van mitochondriale fissie door fosforylatie van Drp1 ............................................ 37 Hoofdstuk 4: Nitriet als potentieel therapeuticum bij I/R letsels ......................................................... 39 4.1 Dierstudies betreffende nitriettoediening bij I/R ........................................................................ 39 4.2 Veiligheid van nitriettherapie bij I/R ........................................................................................... 43 4.3 Nitriettherapie bij acuut myocardinfarct (AMI) .......................................................................... 44 4.4 Nitriettherapie bij beroerte ......................................................................................................... 45 3 DISCUSSIE ............................................................................................................................................. 47 REFERENTIELIJST .................................................................................................................................. 49 Afkortingen: 5-HD 5-hydroxydecanoaat AMI Acuut myocard-infarct AMPK AMP-kinase ATP Adenosinetrifosfaat cGMP Cyclisch guanosinemonofosfaat CVA Cerebrovasculair accident CVA Cardiovasculair accident DLT Dose limiting toxicity Drp1 Dynamin-related protein-1 eNOS Endotheliaal NOS GC Guanylaatcyclase H202 Waterstofperoxide Hb Hemoglobine HNO3 Salpeterzuur HO-° Hydroxyl radicaal I/R Ischemie-reperfusie iNOS Induceerbaar NOS IPC Ischemische preconditionering K + ATP kanalen ATP-gevoelig kaliumkanaal Mb Myoglobine metHB Methemoglobine Mo-co Molybdeen-cofactor MnSOD Mangaan superoxide dismutase mPTP Mitochondrial permeability transition pore MTD Maximal tolerated dose Ngb Neuroglobine nNOS Neuronaal NOS NO Stikstofmonoxide NO2- Nitriet NO3- Nitraat NOS NO synthase 4 O2-° Superoxide anion - ONOO Peroxynitriet PCI Percutane coronaire interventie PKA Proteïne kinase A PKG Proteïne kinase G R-ONO2 Organische nitraten ROS Reactive oxygen species SAH Subarachnoïdale hemorragie STEMI ST-elevated acute myocard infarct XDH Xanthine-dehydrogenase XO Xanthine-oxidase XOR Xanthine oxireductase 5 SAMENVATTING Achtergrond: Nitriet werd jarenlang beschouwd als een inert eindproduct van het metabolisme van stikstofmonoxide (NO). Recent onderzoek heeft echter aangetoond dat nitriet in weefsels een belangrijk reservoir is van NO. Tijdens ischemie of hypoxie kan nitriet terug worden omgezet tot NO. Omstandigheden van slechte weefselperfusie worden gekenmerkt door een verlaagde beschikbaarheid aan NO. De ontdekking van de nitraat-nitriet-NO pathway verklaart de cytoprotectieve effecten van nitriet in hypoxische omstandigheden. Dit heeft geleid tot een herevaluatie van de rol die nitriet speelt in verschillende ziektetoestanden. De mogelijkheid om nitriet aan te wenden in de therapie van ischemie/reperfusie (I/R) letsels is hier één van. Doelstelling: In deze literatuurstudie geven we een overzicht van de bronnen van nitriet. De mechanismen van de omzetting van nitriet naar NO en de mechanismen van nitrietgemedieerde cytoprotectie worden eveneens besproken. Daarnaast gaan we na hoe ver men staat in het onderzoek naar nitriet als mogelijk therapeuticum bij I/R letsels. Hierbij bespreken we de reeds uitgevoerde dierstudies, de veiligheid van nitriettoediening en de vertaling naar de kliniek voor acuut myocardinfarct (AMI) en cerebrovasculair accident. Resultaten: Toediening van nitriet werd bestudeerd in talrijke diermodellen en heeft zich bewezen als een effectief middel om I/R schade te verminderen in het hart, de hersenen, de lever en de longen. Het cytoprotectief effect van nitriet tijdens I/R gebeurt via NO als intermediair. Er zijn reeds verschillende eiwitten geïdentificeerd die verantwoordelijk zijn voor de reductie van nitriet naar NO in het bloed en in de weefsels, de belangrijkste zijn deoxyhemoglobine, deoxymyoglobine en xanthine-oxidase. De mitochondriën zijn de centrale plaats waar de mechanismen van cytoprotectie zich afspelen. Klinische studies hebben aangetoond dat nitriettoediening in therapeutische dosissen veilig is bij gezonde mensen. De resultaten van een eerste klinische studie konden, in vergelijking met de controlegroep, geen reductie van de infarctzone aantonen bij AMI. In de hersenen werd het eerste klinisch onderzoek naar nitriettoediening uitgevoerd bij patiënten met subarachnoïdale hemorragie (SAH). Er werd aangetoond dat potentieel therapeutische dosissen nitriet veilig zijn bij patiënten met SAH, dit zet de deur open voor het ontwikkelen van andere klinische studies die de neuroprotectieve effecten van nitriet evalueren. 6 INLEIDING In deze masterscriptie bespreken we het gebruik van nitriet bij ischemie-reperfusie letsels. Deze materie is complex en dient in de juiste context geplaatst te worden. Omdat nitriet een eindproduct is van stikstofmonoxide (NO) maar via NO zijn werkingsmechanisme uitoefent, vertrekken we vanaf deze molecule om uiteindelijk tot nitriet en de aanwending ervan bij ischemie-reperfusie letsels te komen. NO is een intra- en intercellulaire signaalmolecule die een belangrijke rol speelt in vele fysiologische en pathofysiologische processen zoals vasodilatatie, neurotransmissie, immunomodulatie, cardiale contractie, inhibitie van plaatjesaggregatie, inhibitie van de mitochondriale respiratie (cytoprotectie), stamceldifferentiatie en proliferatie.(1) NO wordt in het lichaam geproduceerd door de inbouw van zuurstof (oxidatie) in het aminozuur L-arginine, een reactie die wordt gekatalyseerd door NO synthasen (NOS); zie figuur 1.(2) Deze familie van enzymen bestaat uit 3 isovormen genoemd naar de plaats waar ze initieel werden ontdekt: endotheliaal NOS (eNOS), induceerbaar NOS (iNOS) en neuronaal NOS (nNOS). Het best gekend is NO gevormd door endotheelcellen (eNOS) dat een belangrijke rol speelt als vaatdilatator. In 1980 ontdekten Robert F.Furchgott, Louis J.Ignarro en Ferrid Murad het belang van NO als endotheel-afhankelijke relaxatiefactor (endothelial derived relaxationfactor, EDRF).(3) In 1998 kregen ze hiervoor de Nobelprijs voor fysiologie en geneeskunde. In het cardiovasculaire systeem wordt NO afgegeven door gezond vaatendotheel, o.a. als reactie op weefselhypoxie. NO diffundeert naar de vasculaire gladde spiercellen waar het zorgt voor de activatie van guanylaatcyclase (GC), waardoor de concentratie cGMP stijgt en vaatverwijding optreedt. (1) Deze inzichten in het NO-systeem hebben geleid tot farmacologische strategieën die direct gebruik maken van de vaatverwijdende capaciteit van NO. Bij pulmonale hypertensie bijvoorbeeld wordt beademing met NO toegepast bij pasgeborenen met persisterende pulmonaire hypertensie om vaatverwijding in het longvaatbed te verkrijgen.(4) Welbekend zijn de organische nitraten (R-ONO2, vaak aangeduid als ‘nitraten’), zoals nitroglycerine, die sinds de vroege jaren 1800 gebruikt worden in de behandeling van angina pectoris.(5) Sinds de ontdekking van NO als vasodilatator heeft men gevonden dat de werking van dergelijke 7 medicijnen in feite steunt op de vrijzetting van NO uit deze nitraten binnen de gladde spiercellen van de vaatwand. Figuur 1: Vereenvoudigde biochemie van stikstofmonoxide in het cardiovasculaire systeem. Behalve een vaatverwijdend effect heeft NO ook een remmende werking op plaatjesadhesie en –aggregatie en speelt het een rol in de endotheelfunctie en contractiliteit van het myocard. (bron: http://www.nhlbi.nih.gov/funding/training/redbook/K23Blood.htm) NO kent een korte werkingsduur, wordt snel geoxideerd tot nitriet (NO2-) en vervolgens tot nitraat (NO3-). Figuur 1 illustreert nitraat en nitriet nog als stabiele eindproducten van het katabolisme van NO. Recent is in dit concept echter verandering gekomen. Onderzoek dat gedurende de laatste twintig jaar werd uitgevoerd, heeft aangetoond dat nitraat en nitriet in bloed en weefsels terug kunnen worden gerecycleerd tot NO en dit vooral tijdens hypoxie.(6)(7)(8)(9) In omstandigheden van lage zuurstofspanning en pH kan nitriet worden gereduceerd tot biologisch beschikbare NO. Op die manier worden verschillende antwoorden op zuurstoftekort geboden, zoals hypoxische vasodilatatie. Nitriet zou dus dienst doen als een NO ‘pro-drug’ die selectief kan worden gereduceerd. De ontdekking van deze wederkerige relatie tussen nitriet en NO heeft bij wetenschappers gezorgd voor een vernieuwde interesse in de biologische rol van nitriet. Een verlaagde beschikbaarheid van NO draagt namelijk bij tot talrijke ziektes en dit zou het therapeutisch aanwenden van nitriet als een endogeen reservoir voor NO bijzonder interessant maken. De waarschijnlijk meest gedocumenteerde relatie tussen NO en ziekte is deze in het 8 cardiovasculaire systeem. Verlaagde concentraties van NO worden geassocieerd met dysfunctie van het endotheel, vorming van atherosclerotische plaques, arteriële restenose, perifeer vaatlijden, en ischemie-reperfusie letsels.(1) Vele andere pathologische condities zoals chronische inflamatie, neurologische dysfunctie en kanker worden ook gekenmerkt door verstoorde beschikbaarheid van NO. Figuur 2 geeft een overzicht van dergelijke ziektes en illustreert de verscheidenheid aan therapeutische mogelijkheden voor nitriet. Figuur 2: Effecten van op nitriet gebaseerde therapie. Overzicht van de belangrijkste mogelijke effecten van nitriet als potentieel therapeuticum bij verschillende pathologische condities.(10) In deze scriptie zal de nadruk worden gelegd op ischemie-reperfusie (I/R) letsels. I/R is een complex pathofysiologisch proces verantwoordelijk voor orgaanschade in omstandigheden waarbij de bloedtoevoer gecompromitteerd wordt (vb. acuut myocardinfarct (AMI), cardiovasculair accident (CVA) en orgaantransplantaties). I/R letsels dragen in grote mate bij tot de morbiditeit en mortaliteit van vele ziektes in de westerse wereld. Ondanks jaren onderzoek bestaan slechts weinig specifieke farmacologische behandelingen om I/R letsels te bestrijden. Zoals vermeld neemt men in de pathogenese van I/R letsels een gedaalde beschikbaarheid van NO waar. De gedaalde concentratie van NO wordt onder andere 9 verklaard doordat tijdens ischemie minder NO kan worden gevormd door NOS, daar deze enzymen zuurstof nodig hebben om L-arginine te oxideren. Tevens werd aangetoond dat toevoeging van een NOS-inhibitor gedurende I/R letsels de schade aan weefsels nog vergroot.(11) De reductie van nitriet wordt in deze situaties als een belangrijke bron van NO gezien.(3) De laatste jaren werd aangetoond dat NO, naast een vaatverwijderend effect, ook een cytoprotectief effect heeft bij I/R letsels. Bij proefdieren behandeld met NO werd, na inductie van een I/R letsel, een verkleining van de infarctzone gezien in het hart, de lever, de longen en de nieren.(1) Verschillende therapeutische strategieën worden nu onderzocht om de beschikbaarheid van NO te verhogen bij I/R letsels. Dit is onder andere mogelijk via inhalatie van NO, inname van medicijnen die fungeren als NO-donor of NO-substraat (vb. L-arginine) en toediening van de anionen nitriet en nitraat.(1) In 2005 was er de eerste studie die bij in vivo muismodellen het cytoprotectief van een lage dosis nitriet kon aantonen na I/R van het hart en de lever.(12) Bij het myocardiaal I/R letsel zorgde nitriet voor een vermindering van de infarctzone van 67 procent. In deze masterscriptie zal worden ingegaan op de toediening van nitriet bij I/R letsels en het cytoprotectief effect daarvan. In de eerste drie hoofdstukken van de resultaatsectie in deze scriptie worden achtereenvolgens besproken 1) de bronnen van nitriet, 2) hoe de omzetting van nitriet naar NO (dit wordt de ‘bioactivatie’ van nitriet naar NO genoemd) precies gebeurt en 3) wat de mechanismen zijn achter de cytoprotectieve effecten van nitriet. 1) Naast NO als endogene bron kan nitriet ook via de voeding worden opgenomen als nitraat. Voor deze omzetting spelen commensale bacteriën in het digestief stelsel een belangrijke rol. 2) Hoe de bioactivatie van nitriet naar NO gebeurt, is nog niet volledig opgehelderd. Naast de non-enzymatische vorming kan nitriet door diverse eiwitten tot NO worden gerecycleerd. Dit noemt men de enzymatische vorming van nitriet. Dergelijke eiwitten beschikken over de capaciteit om nitriet tot NO te reduceren en werden gevonden in het bloed en in de weefsels. Opvallend is dat de functie van deze eiwitten sterk afhankelijk is van zuurstof en dat ze pas tot NO producerende ‘enzymen’ worden omgevormd in omstandigheden van hypoxie. Zo is deoxyhemoglobine geïdentificeerd als het reductase van nitriet in het bloed. Waarschijnlijk zijn er afhankelijk van het weefsel specifieke reductasen. In het hart bijvoorbeeld wordt deoxymyoglobine gezien als het belangrijkste nitriet-reductase tijdens ischemie. Mitochondriën spelen bij nitrietreductie, net zoals bij cytoprotectie, ook een belangrijke rol. 10 Zo kunnen tijdens hypoxie verschillende eiwitten uit de electronentransportketen nitriet reduceren. Over de regulatorische pathways van hoe ischemische omstandigheden de activiteit van de nitrietreductasen verhogen is nog niet veel geweten. Naast een overzicht van de belangrijkste nitrietreductasen, duiden we enkele van deze hypoxie- en redox-regulerende mechanismen die hun activiteit controleren. 3) Nitriet kan de uitgebreidheid van I/R letsels beperken door het vasodilaterend en antiaggregerend effect ervan op de bloedvaten, maar ook door een protectief effect op de cellen van het letsel zelf. De mechanismen achter deze nitriet-gemedieerde cytoprotectie zijn complex en worden nog niet volledig begrepen. Nitriet zou enkel zijn effect kunnen uitoefenen via NO als intermediair. Vast staat dat de mitochondriën de centrale plaats zijn waar de mechanismen van cytoprotectie zich afspelen. Bij I/R letsels ziet men namelijk dat de schade geïnitieerd wordt ter hoogte van deze organellen: er worden reactive oxygen species (ROS) - dit zijn zuurstofradicalen en ionen - geproduceerd die lipiden, proteïnen en DNA beschadigen en zo de normale celfunctie aantasten wat uiteindelijk leidt tot apoptose of necrose van de cel. Nitriet is tijdens ischemie in staat de mitochondriale respiratie te moduleren wat leidt tot daling in de generatie van ROS en minder oxidatieve schade aan mitochondriale eiwitten wat uiteindelijk zorgt voor een verkleining van de infarctzone. Gezien de aanzienlijke resultaten in preklinische studies met betrekking tot het cytoprotectief effect van nitriet, lijkt de klinische vertaling naar op nitriet gebaseerde therapieën bij I/R letsels logisch. In het vierde hoofdstuk van de resultaatsectie in deze scriptie zal een overzicht worden gegeven van de studies die reeds zijn uitgevoerd bij dier en mens. Tevens worden de uitdagingen in de potentiële nitrietbehandeling bij acuut myocardinfarct en beroerte (stroke) besproken, omdat dit de I/R letsels zijn waar meest onderzoek wordt naar verricht. 11 MATERIALEN EN METHODEN De informatie voor deze literatuurstudie werd uit relevante artikels gehaald die gezocht werden via de database ‘Pubmed’ en in mindere mate via ‘ISI Web of Knowledge’. Om een globaal beeld te bekomen over nitriet als potentiële therapie bij I/R letsels, de reductiemechanismen en de cytoprotectieve effecten van nitriet werden eerst enkele systematische reviews doorgenomen. Op basis hiervan konden we een grove structuur maken van de verschillende te bespreken onderdelen. Uiteindelijk kwamen we tot een reeks zoekopdrachten via combinaties van de volgende trefwoorden: nitrite, ischemia, ischemia reperfusion, mitochondria, reduction, reactive hemoglobin, oxygen myoglobin, species, neuroglobin, cytoprotection, xanthineoxireductase, ischemic preconditioning, preconditioning, therapy, sodium nitrite, myocard, kidney, liver, brain, stroke. De restrictiecriteria waren: artikels gepubliceerd in de laatste 10 jaar en opgesteld in het Engels. De resultaten van de zoekopdracht werden geselecteerd op basis van de titel en daarna werd het abstract gelezen. Tenslotte gingen we de impactfactor na van het tijdschrift waarin het geselecteerde artikel werd gepubliceerd, om zo het belang van de gevonden literatuur in reliëf te kunnen plaatsen. Artikels uit een tijdschrift met een impactfactor lager dan 1 werden niet behouden. We vonden ook bruikbare artikels via de functie ‘related articles’ in Pubmed. De geselecteerde artikels werden gelezen en daarnaast kon nog bruikbare literatuur gevonden worden via de referenties uit de discussiesecties van de geanalyseerde artikels. Om de artikels te classificeren werd gebruik gemaakt van het programma ‘Mendeley Desktop’. Hierbij werden de artikels geordend volgens de indeling die overeenkwam met de inhoudsopgave van de literatuurstudie. Mendeley werd ook gebruikt tijdens het schrijven van de masterscriptie, om referenties in te voeren. Om up-to-date te blijven met de literatuur gebruikten we op aanraden van professor R. Lefebvre het programma ‘Pubcrawler’. Dit is een programma dat via Pubmed de laatste treffers opzoekt voor de ingegeven zoektermen en deze per mail doorstuurt met een regelmaat die men zelf kan bepalen. 12 RESULTATEN Hoofdstuk 1. De bronnen van nitriet De hoeveelheid nitriet in het lichaam wordt gevormd door drie bronnen van nitriet. Een eerste bron is de endogene vorming van nitriet via de oxidatie van NO in het bloed. De tweede en derde bron van nitriet zijn exogene bronnen en worden hoofdzakelijk via het dieet ingenomen. Dit gebeurt ofwel via de inname van nitraat dat gereduceerd wordt tot nitriet, ofwel via de inname van nitriet. 1.1 De endogene bron van nitriet: oxidatie van NO De endogene bron van nitriet bestaat uit de oxidatie van NO (zie figuur 3). NO wordt onder andere in endotheelcellen gevormd door eNOS uit L-arginine (de klassieke L-arginine-NOSNO pathway) en is welgekend als signaalstof in de regeling van de bloedstroom en de hartfunctie. De molecule NO komt voor als een gasvormig vrij radicaal dat in fysiologische omstandigheden snel oxideert tot nitriet (NO2-) en daarna tot nitraat (NO3-).(13) Deze oxidatie gebeurt traag in vitro maar wordt versneld door de zuurstofrijke omgeving in het plasma en door de aanwezigheid van ceruloplasmine, een transporteiwit voor koper dat dienst doet als oxidase.(14) Naast de snelle oxidatie van NO reageert het grootste gedeelte van NO snel met oxyhemoglobine en vormt methemoglobine en nitraat.(13) 13 Figuur 3: NO geproduceerd door eNOS diffundeert ofwel in de onderliggende gladde spiercel, of wordt vrijgesteld in het lumen van het bloedvat. In het lumen wordt het grootste gedeelte van NO opgenomen door de rode bloedcel en reageert met oxyhaemoglobine tot methaemoglobine en nitraat. Een minderheid ontsnapt aan de scavengerfunctie van haemoglobine en reageert met plasmabestanddelen tot nitriet en andere ‘nitrosilated species’(13) Nitriet is veel stabieler dan NO en heeft door zijn unieke redoxpositie tussen NO en nitraat een relatief lange halfwaardetijd in het bloed en de weefsels (na diffusie vanuit het bloed).(13) Zoals we hebben vermeld kan nitriet in situaties van hypoxie en metabole stress, wanneer het zuurstofafhankelijke NOS tekortschiet, terug worden gereduceerd tot NO (zie hoofdstuk 3). Deze omvorming maakt deel uit van de nitraat-nitriet-NO pathway. Nitriet, eerst een afbraakproduct van het endogeen NO-metabolisme, fungeert dus in pathofysiologische omstandigheden als een endogene bron van NO. Dit komt het ischemische weefsel ten goede door de vaatverwijdende en cytoprotectieve effecten die NO bewerkstelligt. Sinds de ontdekking van de nitraat-nitriet-NO pathway is de cirkel tussen de omzetting van NO, nitriet en nitraat rond en kan men nitriet bij zoogdieren schematisch voorstellen in een ‘stikstofcyclus’. (zie figuur 4) 14 = nitraat = nitriet Figuur 4: De plaats van nitriet in ‘een stikstofcyclus’(15) 1.2 De exogene bronnen van nitriet Een kleine fractie van de nitrietspiegel in het bloed is afkomstig van nitriet in het dieet. Nitrieten worden toegevoegd aan vleeswaren om hun kleur te bewaren of om de groei van bacteriën te remmen. De grootste fractie van de dieetcomponent wordt echter opgenomen als nitraat, dat kan worden omgevormd tot nitriet. Voedsel rijk aan nitraten zijn rode bieten, selder en groene bladgroenten zoals spinazie en sla. In de mondholte kunnen commensale bacteriën aanwezig in de posterieure crypten van de tong, nitraat reduceren tot nitriet. Bacteriën spelen in de ‘stikstofcyclus’ bij zoogdieren een essentiële rol in de stap van nitraatomzetting naar nitriet, daar ze over enzymatische machinerie beschikken om nitraat op een veel efficiëntere manier te reduceren in vergelijking met de eukaryote cel.(16) Als we het spijsverteringsstelsel verder doorlopen (zie figuur 5) zien we vervolgens dat door de zuurtegraad in de maag een deel van het nitriet wordt geprotoneerd tot salpeterzuur (HNO3) en dan verder reageert tot NO en andere stikstofoxides. Het grootste gedeelte van het ingeslikte nitriet ontsnapt echter aan het zure milieu van de maag, wordt opgenomen door de dunne darm en komt terecht in de systemische circulatie. Slechts een heel klein gedeelte van het ingenomen nitraat wordt onmiddellijk door bacteriën in de mondholte gereduceerd tot nitriet. Nadat nitraat wordt ingeslikt, wordt het geabsorbeerd 15 door het bovenste gedeelte van de dunne darm. Zo komt nitraat in het bloed terecht en mengt zich vervolgens met het endogene nitraat. 75 procent van het plasmanitraat wordt via de nieren in de urine afgescheiden. Terwijl de overige 25 procent actief wordt opgenomen door de speekselklieren en zo gesecreteerd in de mondholte.(16) 20 procent van het nitraat in het speeksel wordt door de commensale bacteriën in de mondholte omgezet tot nitriet.(16) Uiteindelijk wordt dus 5 à 8 procent van het nitraat ingenomen via de voeding omgezet naar nitriet in het speeksel. De weg van nitraatinname tot opname in de speekselklier noemt men de enterosalivaire-cyclus van nitraat. Deze cyclus zorgt ervoor dat verhoogde hoeveelheden nitraat beschikbaar worden gesteld voor commensale bacteriën. Figuur 5: De enterosalivaire-cyclus van nitraat(17) 16 Het belang van de enterosalivaire-cyclus en de commensale nitraat-nitriet pathway werd aangetoond in studies waaruit bleek dat de plasmaconcentratie van nitriet daalde als de proefpersonen hun speeksel niet doorslikten of bij muizen waar men antiseptische mondspoeling gebruikte, ter eradicatie van de nitraat-reducerende bacteriën in de mondholte.(16)(18) Zonder bacteriën zouden zoogdieren wellicht geen nitraat kunnen metaboliseren. Omgekeerd gebruiken bacteriën nitraat als een terminale electronenacceptor om tijdens de respiratie ATP te produceren, wat een symbiotische relatie suggereert. Sinds in 2004 door Lundberg et al. werd ontdekt dat de inname van nitraat de plasmaconcentratie van nitriet en de NO-spiegels in het bloed doet stijgen is er de laatste jaren veel onderzoek verricht naar de cardiovasculaire effecten van nitraat.(16) Bij gezonde individuen heeft nitraat via zijn omzetting naar NO een bloeddrukverlagend effect. De diastolische bloeddruk werd met 4 mm Hg verminderd na inname van een natrium-nitraat oplossing in vergelijking met een placebogroep.(19) Gezien nitraat zo alomtegenwoordig is in ons dagelijks dieet is er een stijgende interesse om nitraatrijk voedsel te implementeren in het cardiovasculair risicomanagement. Een recente studie toonde reeds aan dat nitraat een bloeddrukverlagend effect heeft bij patiënten met hypertensie.(20) Ook in de sportfysiologie is nitraat veelbelovend. Inname van het sap van rode bieten en van natrium-nitraat toonde een gedaalde zuurstofkost tijdens submaximale inspanning.(21) 1.3 Nitrietconcentraties in het lichaam De drie bronnen (endogeen NO, exogeen nitriet en exogeen nitraat) dragen bij tot de hoeveelheid nitriet in de circulatie. De plasmaconcentratie aan nitriet is variabel en bedraagt bij gezonde individuen in nuchtere toestand tussen de 0,1 en 0,5 µM.(22) Nitrietconcentraties verschillen per weefsel en in de rode bloedcel is de concentratie hoger dan in het plasma.(13) Factoren zoals fysieke activiteit, gezondheid en levensstijl beïnvloeden de nitrietspiegels in het plasma. Zo zijn lagere nitrietconcentraties beschreven bij patiënten met myocardinfarct en endotheliale dysfunctie.(23) Fysische activiteit verhoogt bij gezonde individuen de plasmaconcentratie aan nitriet, maar niet bij patiënten met cardiovasculaire ziektes.(22) 17 Hoofdstuk 2. De bioactivatie van nitriet naar NO Eens gevormd, kan nitriet in het bloed en in de weefsels worden gereduceerd tot bioactief NO. Dit kan door een non-enzymatische reductie en een enzymatische reductie. De non-enzymatische reductie van nitriet gebeurt via een protonatiereactie en werd al eerder aangehaald in hoofdstuk 1 (bronnen van nitriet). Een tweede reactie is de enzymatische reductie van nitriet. Verschillende eiwitten met een dergelijke reductasecapaciteit zijn vooropgesteld. De belangrijkste zijn de heem-bevattende globines, molybdeen-bevattende enzymen en eiwitten uit de mitochondriale elektronentransportketen (zie figuur 6). Terwijl de reactiemechanismen achter deze verschillende reductiesystemen elk in verschillende mate zijn opgehelderd, is het duidelijk dat de reductie van nitriet door alle ontdekte reductasen wordt geoptimaliseerd in omstandigheden van hypoxie en acidose. Welke reductase aangesproken wordt voor de omzetting van nitriet naar NO zou afhangen van het type weefsel, van de mate van acidose en van de mate van hypoxie en oxidatieve stress. Figuur 6: Overzicht van de belangrijkste groepen van nitrietreductasen bij zoogdieren en hun regulatiemechanismen (24) 18 2.1 De non-enzymatische reductie van nitriet Dat NO, onafhankelijk van het eNOS, in het lichaam kan worden gevormd (de nitriet-NO pathway) werd in 1994 voor het eerst ontdekt onder niet-ischemische omstandigheden. Twee onderzoeksgroepen stelden vast dat een deel van het speeksel-nitriet, afkomstig uit de enterosalivaire circulatie van dieet-nitraat, wordt omgezet tot NO-gas in de maag (zie figuur 5).(6)(7) Het zure milieu van de maag bewerkstelligt een protonatiereactie waardoor nitriet tot HNO2 wordt gereduceerd, en dan verder een decompositie ondergaat tot NO (zie tabel 1: Eq.(1), (2), (3)). De productie van NO door de maag, is sterk afhankelijk van de pH en kan na inname van protonpompinhibitoren nagenoeg volledig worden geremd.(7) Vermoedelijk heeft de lokaal sterk verhoogde concentratie van NO een bacteriedodende functie tegen ingeslikte enteropathogenen. We merken op dat in aanwezigheid van polyfenolen (aanwezig in groeten en fruit) en ascorbaat (vitamine C), de reductie van nitriet in de maag wordt versterkt (zie tabel 1: Eq.(4), Eq.(5) en figuur 4).(25) In 1995 vonden Zweier et al. dat de omzetting van nitriet ook gebeurde onder ischemische omstandigheden, in het myocard van de rat.(8) Dit zorgde voor een shift in de zienswijzen van de nitriet-fysiologie. In plaats van een afbraakproduct zou nitriet nu dienst kunnen doen als een reservoir voor NO, dat tijdens periodes van slechte weefselperfusie zou kunnen worden aangewend. Later werden de eerste eiwitten (her)ontdekt die tijdens ischemie als nitrietreductasen fungeren. Tabel 1: Reductiereacties van nitriet naar NO bij zoogdieren (Fe2+ = actieve vorm van heemijzer dat reversibel O2 kan binden, Fe3+ = met-heem, de niet actieve vorm van heemijzer)(26) 19 2.2 Reductie van nitriet door heem-bevattende globinen De meest bestudeerde groep van nitrietreductasen is deze uit de familie van de globinen. Dit zijn kleine globulaire metalloproteïnen met een karakteristieke structuur. Globinen beschikken over een heemgroep. Heem bestaat uit een porfyrine-ring met centraal een ijzeratoom dat de heempocket wordt genoemd. Deze heempocket kan op een reversibele manier binden met gassen zoals O2, CO en NO. Globinen zijn het best gekend om hun functie als zuurstoftransporter die de mitochondriën in de cel van brandstof voorzien . Ze bestaan uit hemoglobine (Hb) in de rode bloedcellen en myoglobine (Mb) in hart- en skeletspierweefsel.(27) Recent werd ook neuroglobine (Ngb) ontdekt in de hersenen en de retina.(28) De heemgroep van de globinen is echter ook in staat om nitriet te reduceren tot NO. Dit werd reeds in 1937 voor het eerst ontdekt bij Hb.(29) Hoewel bij alle heemglobinen de snelheid van reductie verschillend is, gebeurt de reductie van nitriet volgens eenzelfde reactie (zie tabel 1, Eq.(6)). Via welke intermediairen deze reductie door heem-bevattende globinen gebeurt, is nog niet duidelijk. We merken op dat deoxy-heem (= heem dat niet gebonden is aan O2) nodig is als reactant voor de reductiereactie van de heem-globinen. Nitrietreductie vereist namelijk een deoxygenatie van de heemgroep, want dan is het heemijzer vrij van zuurstof en zijn er meer bindingsplaatsen voor nitriet. Zoals in hoofdstuk 1 vermeld, reageert het oxyhemoglobine in normoxische omstandigheden snel met NO tot methemoglobine en nitraat. Hetzelfde wordt gezien bij oxyMb en oxyNgb.(30)(31) Tijdens hypoxie verandert de rol van de heem-bevattende globinen dus van een NO-scavenger naar een producent van NO. Zo werd bij alle heemglobinen vastgesteld dat de reductiesnelheid van nitriet naar NO maximaal is bij een pO2 waarbij het heem-globine voor de helft gesatureerd is met O2 (deze pO2 waarde duidt men aan met p50).(32) Dit maakt dat de reductie van nitriet door Mb (p50= 2,2 mm Hg) en Ngb (p50= 2,4 mm Hg) pas optreedt bij een veel lagere zuurstofspanning dan de reductie van nitriet door hemoglobine (p50= 26 mm Hg).(32)(33)(34) Er is ook H+ nodig om de reductie van nitriet door heem-bevattende globinen te voltrekken. Een verlaging van pH zorgt voor een toename in reactiesnelheid. Dit alles suggereert dat nitrietreductasen uit de familie van de heem-globines de loslating van NO via hypoxie- en/of pH-sensing moduleren. Dit leidt dan tot de inductie van een breed spectrum aan NO-gemedieerde responsen in gebieden onderhevig aan ischemische stress. 20 2.2.1 Reductie door hemoglobine In het bloed gebeurt de vorming van NO via de reductaseactiviteit van Hb in de rode bloedcellen. De snelheid van bovenvernoemde nitriet-reductasereactie wordt in het geval van hemoglobine geregeld door veranderingen in de quaternaire structuur van het eiwit Men spreekt van een ‘allosterisch’ geregelde nitrietreductie (zie figuur 6). De allosterische eigenschappen van de binding tussen zuurstof en Hb zijn al meer dan 100 jaar gekend. Huang et al. ontdekten in 2005 dat de binding tussen nitriet en Hb ook een allosterisch karakter vertoont. (32) Deze allosterisch geregelde vorming van NO wordt beïnvloed door de zuurstofspanning en gebeurt als volgt. Afhankelijk van de zuurstofspanning onderscheiden we een R-conformatie en een T-conformatie van Hb1. Huang et al. ontdekten dat de R-conformatie van Hb, door zijn welbepaalde tertiaire vorm, een meer negatieve redox potentiaal heeft dan de T-conformatie en nitriet dus efficiënter kan reduceren tot NO.(32) Het reactant voor nitrietreductie is echter deoxyhemoglobine en in deze omstandigheden van lage pO2 wordt Hb net gekarakteriseerd door een gedaalde R-status. Wanneer de O2-saturatie van Hb stijgt, komt Hb meer voor als Rtetrameer en stijgt dus enerzijds de snelheid van nitrietreductie. Anderzijds zorgt de gestegen O2-saturatie van Hb ervoor dat de concentratie aan deoxyHb daalt, en er dus minder bindingsplaatsen zijn voor nitriet, waardoor de snelheid in nitrietreductie terug daalt. Tussen deze twee tegengestelde processen wordt nu een evenwicht gezocht (zie figuur 7). 1 Een eigenschap van Hb is dat de bindingsaffiniteit voor zuurstof wordt vergroot bij een verhoging van de O2-saturatie en wordt verlaagd bij een daling van de O2-saturatie. Dit gebeurt via sterische veranderingen in het Hb. Binding van een eerste molecule O2 zorgt namelijk voor een vormverandering in de tetramere structuur van het Hb, waardoor de affiniteit voor een tweede zuurstofbinding wordt vergroot. Zo komt bij hoge pO2, Hb voor als een molecule met hoge zuurstofaffiniteit, in een vorm die de R(relaxed)-conformatie wordt genoemd. Omgekeerd komt bij een lage pO2, Hb voornamelijk voor in een T(tense)-conformatie met een lage zuurstofaffiniteit.(27) 21 Figuur 7: Schematische voorstelling van de nitrietreductase-activiteit van hemoglobine(35) Dit geeft een verklaring voor het feit dat de maximale reductiecapaciteit van Hb precies wordt bereikt op het punt wanneer Hb voor de helft verzadigd is met O2 (p50) en zich dus in een toestand bevindt tussen de R en de T-conformatie. Deze allosterisch gecontroleerde bioactivatie van nitriet zou belangrijk zijn in het mechanisme van hypoxische vasodilatatie.(9) De rode bloedcel fungeert als een soort zuurstofsensor, die via de productie van NO, vasodilatatie in slecht doorstroomde gebieden mogelijk maakt. Eén van de uitdagingen in het onderzoek naar de reductie van nitriet in het bloed is het vraagstuk hoe NO, gevormd door Hb, zijn werking kan uitoefenen. Het is namelijk zo dat NO grotendeels word gecapteerd en inactief wordt gemaakt alvorens het de rode bloedcel kan verlaten. Dit gebeurt via de onderstaande reactie. Deoxyhemoglobine(Fe2+ ) + NO → ijzer−nitrosyl−hemoglobine(Fe2+−NO ) NO raakt gevangen tussen de heemgroepen van het deoxyhemoglobine (dat niet reageerde met nitriet) en vormt zich om tot het stabiele ijzer-nitrosyl-hemoglobine. Er zijn verschillende theoriën aangebracht over hoe NO de rode bloedcel kan verlaten. Deze mechanismen vallen buiten de focus van deze thesis. Het is een onderwerp dat fel besproken en slecht begrepen wordt.(36) 22 2.2.2 Reductie door myoglobine Nitriet kan ook in de weefsels worden gereduceerd. In hart- en skeletspierweefsel gebeurt dit door Mb. Alhoewel de structuur van Mb homoloog is aan die van Hb, zijn er geen allosterische wijzigingen mogelijk zoals die worden gezien bij Hb. De Mb structuur is ‘locked’ in een Rstand.(37) De heemgroep van myoglobine heeft hierdoor een zeer lage redox potentiaal. Dit zorgt ervoor dat, wanneer Mb gedeoxygeneerd is, nitriet zeer snel kan reduceren tot NO. Men heeft gemeten dat deoxyMb, nitriet 30 maal sneller reduceert dan deoxyHb.(32)(33) De Mb-afhankelijke reductie van NO2- is niet alleen betrokken bij hypoxische vasodilatatie.(38) Maar NO gevormd door de reductiecapaciteit van Mb speelt ook een rol bij cytoprotectie na I/R.(33) Het bewijs en het werkingsmechanisme hiervan zullen we zien in het volgende hoofdstuk. Mb zou het dominante nitrietreductase zijn in het hart. Nitriet heeft ook een cytoprotectief effect op de lever en de hersenen. Welke nitrietreductasen in deze weefsels de belangrijkste rol spelen in cytoprotectie zijn minder gekend. Neuroglobine bijvoorbeeld is exclusief aanwezig in de hersenen en is in staat de reductie van nitriet te katalyseren. Het is echter ook mogelijk dat er in de hersenen en in de lever geen dominante nitrietreductasen zijn en deze rol vervuld wordt door een combinatie van verschillende reductasen. 2.2.3 Reductie door neuroglobine Neuroglobine werd voor het eerst beschreven in 2000, toen het geïdentificeerd werd in de hersenen van muizen.(28) Alhoewel Ngb een zuurstof-bindend globine is, wordt zijn functie als zuurstofleverancier aan neuronen in twijfel getrokken. In tegenstelling tot Hb en Mb heeft Ngb namelijk een lage affiniteit voor zuurstof. Bovendien maakt de lage concentratie aan Ngb gevonden in de hersenen, Ngb minder geschikt voor deze functie. Hoewel de fysiologische rol van Ngb nog grotendeels onbekend is, heeft men gevonden dat tijdens hypoxie de expressie van Ngb opgeregeld wordt. Tevens hebben in vitro en in vivo studies aangetoond dat Ngb een beschermend effect heeft op neuronen tijdens I/R.(39)(40). Petersen et al. vonden dat tijdens hypoxie Ngb in staat is nitriet te reduceren tot NO, wat kan zorgen voor cytoprotectie.(41) De snelheid van deze nitrietreductie zou redox-afhankelijk zijn. Tiso et al. toonden aan dat oxidatieve stress in staat is de structuur van de Ngb-molecule te veranderen waardoor Ngb een betere NO-producent wordt.(42) Omdat Ngb (net zoals 23 cytochroom c, zie 2.4) over een bijzondere structuur beschikt, wordt veel onderzoek verricht naar welke de post-translationele modificaties van dit eiwit zijn. Het mechanisme van redoxafhankelijke modificatie van Ngb is hier één van, en suggereert een soort van redox-sensor voor de modulatie van de nitrietreductie. Hieronder leggen we dit mechanisme uit. Ngb vertegenwoordigt de typische monomere structuur van het Mb-type. Het Ngb verschilt structureel van Mb en Hb door het zogenaamde bis-histidine hexa-coordinated bindingschema van het heemijzer. Bij Hb en Mb is het heemijzer penta-coordinated.2 Het bishistidine hexa-coordinated bindingsschema houdt in dat in afwezigheid van een extern ligand (zoals O2 , CO, of nitriet) het distale histidine rechtstreeks gebonden is aan het heemijzer. Zo vereist de binding van nitriet met het heemijzer een dissociatie van de distale histidinebinding. De transitie van een hexa-coordinated naar een penta-coordinated heem bij Ngb (zie figuur 6) kan nitriet vele malen sneller reduceren dan Mb en Hb. Tiso et al. ontdekten dat oxidatie van twee cysteïneresiduen aan de oppervlakte van de Ngb-molecule zorgde voor de transitie naar het penta-coordinated heem. De heempocket wordt dus als het ware opengezet voor nitrietreductie wanneer neuronen worden blootgesteld aan oxidatieve stress. 2.3 Reductie van nitriet door molybdeen-bevattende enzymes Van de molybdeen-bevattende enzymen is xanthine oxireductase (XOR) het best gekend. XOR is een belangrijk enzyme in het nucleotidenmetabolisme. Het katalyseert de laatste twee reacties in de degradatie van de purinebasen: de oxidatie van hypoxanthine naar xanthine en van xanthine naar urinezuur. XOR komt onder twee vormen voor: het xanthinedehydrogenase (XDH) en het xanthine-oxidase (XO). Onder pathologische omstandigheden, zoals bij I/R, wordt XDH omgezet tot XO en kan het bijdragen tot celschade via de productie van ROS (zie hoofdstuk 3, generatie van ROS).(43) Wanneer XOR echter met nitriet wordt gecombineerd kwam men tot de vaststelling dat dit enzyme, tijdens hypoxie, protectieve effecten kan uitoefenen via de reductie van nitriet naar NO.(44)(45) Het exacte reactiemechanisme achter deze XOR-gemedieerde nitrietreductie is niet gekend. Wel is 2 Het heemijzer heeft bij Hb en Mb, wanneer het niet gebonden is aan O 2, vijf bindingen. Vier bindingen met de vier stikstofatomen uit de porfyrinering van de heemgroep. En een 5de binding met een histidine-aminozuur (HisF8, het proximale histidine) uit het globine. We spreken van een pentacoordinated heem. Bij oxygenatie van Mb of Hb wordt O2 enerzijds aan het Fe van de heemgroep gebonden (een 6e binding aan Fe) en anderzijds aan een histidine (HisE7, het distale histidine) uit het globine. 24 geweten dat deze reactie zich voordoet op de molybdeen–cofactor (Mo-co) van XOR (zie tabel 1, Eq.(7)). Hoe XOR in hypoxische omstandigheden switcht van een oxidant-producent naar een NO-producent moet nog verder worden onderzocht. Ondertussen suggereert men dat XOR betrokken is in de mechanismen van cytoprotectie na I/R.(45)(46)(47) Overigens werden andere molybdeen-bevattende enzymen, zoals aldehydeoxidase en sulfietoxidase (zie figuur 6) geïdentificeerd met een nitrietreductasecapaciteit.(48) 2.4 Reductie van nitriet door eiwitten uit de mitochondriale transportketen Mitochondriën hebben naast hun functie als energieproducerende organellen ook een belangrijke taak als initiator van celschade bij I/R. Ze spelen eveneens een rol in de beschermende anti-apoptotische signaalwegen die geactiveerd worden na ischemie (zie hoofdstuk 3). Voor de eiwitten uit de mitochondriën werd een nieuwe rol voorgesteld als potentiële nitrietreductasen. Nohl et al. onderzochten of cytochromen in de elektronentransportketen van de mitochondriën in aanmerking komen voor de reductie van nitriet naar NO. Cytochromen zijn heembevattende eiwitten, maar behoren niet tot de familie van de heem-bevattende globinen. Men vond dat mitochondriën uit de lever van de rat in staat waren nitriet tot NO te reduceren tijdens anoxie en acidose. Men identificeerde het cytochroom bc1 complex (complex III) uit de elektronentransportketen, als de plaats waar de reductie optrad.(49) Een latere studie door Castello et al. toonde aan dat ook het cytochroom c oxidase (complex IV) uit de elektronentransportketen, en de mitochondriale elektrondrager cytochroom c over een reductasecapaciteit voor nitriet beschikken.(50) De rol van cytochroom c als nitrietreductase werd verder onderzocht. Net zoals bij Ngb, is nitrietreductie pas mogelijk nadat het hexacoordinated heem van cytochroom c geconverteerd wordt naar zijn penta-coordinated vorm (zie figuur 7).(51) Bovendien werd aangetoond dat NO, gevormd door cytochroom c tijdens ischemie, in staat is de mitochondriale respiratie te inhiberen.(51) Zoals we in het volgende hoofdstuk zullen zien kan dit zorgen voor cytoprotectie tijdens I/R. 2.5 Andere nitrietreductasen Naast de hierboven besproken mechanismen van nitrietreductie werden talrijke andere nitrietreductasen geïdentificeerd, waaronder het enzym carboanhydrase en zelfs eNOS.(52)(53) Vanin et al. toonden aan dat in omstandigheden van anoxie, wanneer eNOS geen L-arginine kan oxideren tot NO, eNOS i.p.v. L-arginine nitriet kan gebruiken om NO te 25 vormen. eNOS zou dus zowel in hypoxie als in normoxie een bron zijn van NO. Door de veelheid aan nitrietreductie-mechanismen is het evenwel moeilijk om de bijdrage van eNOS aan de totale productie van NO tijdens hypoxie te bepalen. Hoofdstuk 3. Mechanismen van de cytoprotectieve effecten van nitriet tijdens I/R Cytoprotectie is het proces waarbij chemische verbindingen bescherming bieden aan cellen tegen schadelijke effecten. Hoe nitriet en NO deze rol vervullen in de adaptatie bij ischemische stress blijft onduidelijk. Men hoopt I/R letsels te beperken door een beter begrip van deze processen. 3.1 Nitriet-gemedieerde cytoprotectie is NO-afhankelijk en NOS- onafhankelijk Uit in vitro modellen met geïsoleerde mitochondriën werd aangetoond dat de mitochondriën de belangrijkste organellen zijn waar de mechanismen van cytoprotectie door nitriet zich afspelen. De omzetting naar NO blijkt hierbij essentieel te zijn. Dat nitriet zijn effect uitoefent via NO werd bewezen in dierstudies. Dieren vertoonden bij inname van nitriet en na het induceren van een I/R letsel, allen een verlies aan cytoprotectie door nitriet wanneer ze met de NO-scavenger carboxy-PTIO behandeld werden.(12)(45) Er werd ook vastgesteld dat NOS knockout muizen en muizen behandeld met een inhibitor van eNOS de cytoprotectieve effecten van nitriet niet konden inhiberen.(12)(45) Dit bewijst dat het effect van nitriet onafhankelijk is van eNOS. Evenzeer klopt dit met het feit dat de vorming van NO door eNOS zuurstofafhankelijk is en dat de activiteit van deze enzymen verzwakt tijdens ischemie. Toevoeging van nitriet zorgt dus voor cytoprotectie door NO maar zonder tussenkomst van NOS. Welke de pathways zijn die NO vormen in hypoxemische situaties is grotendeels onbekend. In het vorige hoofdstuk gaven we een overzicht van de belangrijkste reductoren van nitriet. Met betrekking tot het cytoprotectief effect werd aangetoond dat myoglobine in het hart noodzakelijk is om nitriet-gemedieerde cytoprotectie mogelijk te maken.(33)(54) De waargenomen vermindering van de infarctzone werd namelijk volledig teniet gedaan in myoglobine knockout (-/-) muizen: de in vivo toediening van nitriet verkleinde de myocardinfarctzone met 61% in myoglobine(+/+) muizen, terwijl nitriet geen protectief effect had in myoglobine(-/-) muizen.(54) Hetzelfde werd vastgesteld voor Ngb in 26 de hersenen. Knock-down van Ngb-genen verslechterde de uitkomst van hersenschade tijdens I/R.(40) Ook het nitrietreductase XOR zou een belangrijke rol spelen in nitriet-gemedieerde cytoprotectie. In diermodellen verminderde de toediening van de XOR-remmer allopurinol de protectieve effecten van nitrietbehandeling na geïnduceerde I/R letsels in de lever en het hart. (45)(46) Het is weinig waarschijnlijk dat de reductasecapaciteit van hemoglobine een rol speelt in nitriet-gemedieerde cytoprotectie van het hart. Dit werd vastgesteld uit het feit dat nitriet zijn protectief effect blijft uitoefenen in studies waarin het Langendorff hartmodel wordt gebruikt.(45)(47) Dit is een vaak gebruikte in vitro techniek waarbij een geïsoleerd proefdierhart doorstroomd wordt met een voedende oplossing in plaats van bloed. Om de cytoprotectieve mechanismen van nitriet beter te begrijpen lichten we eerst kort een aantal belangrijke kenmerken van de pathofysiologie van I/R letsels toe. We zullen zien dat mitochondriale dysfunctie een belangrijk initiator is van schade bij I/R letsels. Het voorgestelde werkingsmechanisme van protectie door nitriet (en NO) bestaat dan ook vaak uit de modulering van specifieke eiwitten in de mitochondriën. 3.2 Enkele pathofysiologische kenmerken van I/R letsels Het hart, de nieren en de hersenen zijn de organen die het snelst schade ondervinden bij ischemie. Insufficiënte bloedaanvoer naar het hart kan leiden tot een myocardinfarct. Tijdig herstel (reperfusie) van het bloeddebiet naar het acute ischemische myocard is essentieel om de mortaliteit en morbiditeit van deze patiënten te beperken. Toch kan het proces van reperfusie na een ischemische periode paradoxaal genoeg ook leiden tot een vorm van schade, vandaar de term reperfusie-letsel. Dit werd voor het eerst beschreven door Hearse et al. in 1973. De reoxygenatie bij reperfusie na myocardischemie genereert reactive oxygen species (ROS) welke celschade triggeren.(55) Het wordt nu erkend dat de gestegen productie van ROS door mitochondriën tijdens reperfusie een van de majeure mechanismen is onderliggend aan I/R letsels. ROS werden reeds binnen de 10 seconden na reperfusie gedetecteerd.(56) De mitochondriën zijn een belangrijke aandrijver van post-ischemische celdood. En dit niet alleen door een toegenomen ROS-productie, maar ook door de opening van de mitochondriale permeability transition pore (mPTP) gevolgd door de vrijstelling van pro-apoptotische proteïnen zoals cytochroom c. 27 3.2.1 Generatie van ROS ROS zijn een groep van oxidanten waarin we twee soorten moleculen onderscheiden: de vrije radicalen en de niet-radicalen. Vrije radicalen hebben een ongepaard elektron op hun buitenste schil en zijn daarom zeer reactief. Voorbeelden zijn het superoxide anion (O2-°) en het hydroxyl radicaal (HO-°). De niet-radicalen zijn reactieve componenten zonder ongepaard elektron op hun buitenste schil zoals bijvoorbeeld: waterstofperoxide (H2O2) en peroxynitiriet (ONOO-). ROS kunnen door middel van oxidatie schade aan celstructuren aanrichten, zowel binnen als buiten de mitochondria. Onder normoxische omstandigheden worden kleine hoeveelheden ROS geproduceerd door de mitochondriën, meer bepaald in de elektronentransportketen (respiratory chain); zie figuur 8. In de elektronentransportketen worden energierijke elektrondonoren (vb. NADH) gebruikt om uiteindelijk ATP te produceren. Dit is de belangrijkste energiebron bij zoogdieren. Elektrondonoren komen de elektronentransportketen binnen in complex I of II en worden getransfereerd naar complex III en IV. Complex IV (cytochroom c oxidase) is de terminale elektronacceptor in de keten en gebruikt de elektronen voor de reductie van zuurstof tot water. De transfer van elektronen van complex I tot IV zorgt voor energie die nodig is om protonen van de mitochondriale matrix naar de intermembranale ruimte te pompen. Dit protongradiënt wordt door complex V, het ATP synthase, gebruikt om ATP te vormen. Een kleine gedeelte van de elektronen die de elektronentransportketen doorlopen raken niet tot complex IV en ontsnappen de keten ter hoogte van complex I en III waar ze zorgen voor de generatie van superoxide. Er wordt geschat dat onder fysiologische omstandigheden 1 à 2 procent van de elektronen uit de elektrontransportketen verantwoordelijk zijn voor de vorming van superoxide.(57) Deze kleine hoeveelheden ROS kunnen efficiënt worden geneutraliseerd door antioxidanten zoals mangaan superoxide dismutase (MnSOD). 28 Figuur 8: De mitochondriale elektronentransportketen; reductie van zuurstof naar water en vorming van superoxide tijdens normoxie (bron: http://www.vmi.pitt.edu/index.html) De situatie tijdens I/R letsels is anders. Na de ischemische fase leidt reperfusie tot een buitengewone productie van ROS. Deze oxidatieve uitbarsting zorgt voor een depletie van de pool aan beschikbare antioxidanten en leidt tot weefselschade. De verhoogde mitochondriale ROS productie tijdens reperfusie wordt veroorzaakt door de opeenstapeling van elektronen in de elektronentransportketen. Deze accumulatie van elektronen ontstaat tijdens ischemie, door een verlaagd O2 aanbod aan de elektronentransportketen, en zorgt voor een verhoogd reductiepotentiaal van de mitochondriale complexen. Wanneer de concentratie van O2 tijdens reperfusie terug stijgt, zorgt dit in combinatie met het overaanbod aan elektronen voor een incomplete reductie van O2 waardoor ROS gevormd worden. De belangrijkste plaatsen van ROS-productie tijdens dit proces zijn de mitochondriale complexen I en III van de elektronentransportketen.(58) Er worden tijdens reperfusie na myocardischemie concentraties aan superoxide anion, H2O2 en hydroxyl radicaal gemeten die het dubbel bedragen van de concentratie in een niet-ischemische achtergrond.(59) De dysfunctie van de elektronentransportketen-complexen staat centraal in de progressie van I/R-letsels: de geproduceerde radicalen zullen de complexen beschadigen, wat leidt tot nog meer productie van ROS tijdens reperfusie en verdere beschadiging. We merken op dat naast de mitochondriën ook verscheidene enzymen verantwoordelijk zijn voor de productie van ROS na I/R. XO is hier een voorbeeld van. Tijdens ischemie wordt 29 ATP voornamelijk gemetaboliseerd tot hypoxanthine die door het XO verder wordt geoxideerd tot urinezuur. XO gebruikt bij deze reactie O2 als elektronenacceptor, dat wordt omgezet tot O2-°. Op die manier zorgt het enzyme XO dus voor de vorming van ROS tijdens reperfusie.(43) 3.2.2 Opening van de mitochondrial permeability transition pore (mPTP) De mitochondrial permeability transition pore (mPTP) is een kanaal van het binnenste mitochondriale membraan, dat geopend wordt in pathologische omstandigheden en dat bijdraagt tot de opeenvolging van veranderingen die uiteindelijk leiden tot I/R geïnduceerde celdood door activatie van de mitochondriale apoptotische pathway.(60) Een beperking van de bloedstroom tijdens ischemie zal het niveau van O2 snel doen dalen. Dit zorgt ervoor dat mitochondriën, die zuurstof (aeroob metabolisme ) nodig hebben voor hun ATP-productie, overschakelen naar een anaeroob metabolisme. Deze anaerobe energieproductie geeft slechts 2 molecules ATP in plaats van 38 molecules ATP. Na verloop van tijd zullen de energiedependente mechanismen in de cel lijden onder dit tekort aan ATP. De ATP-afhankelijke Na+/K+ pomp zal geïnhibeerd worden waardoor de cel zal depolariseren en een influx van Ca2+ de mitochondriën zal binnendringen. De influx van Ca2+ triggert de opening van de mPTP. De opening van dit kanaal zal via loslating van cytochroom c een reactie (zie figuur 9) in gang zetten waardoor de cel in apoptose of necrose gaat. De mPTP is bovendien zeer gevoelig aan oxidatieve stress. In een ratmodel, waarbij hersenen werden blootgesteld aan ischemie en reperfusie zorgde de productie van ROS tijdens reperfusie voor triggering van de mPTP, wat leidde tot mitochondriale zwelling, ruptuur en vrijstelling van cytochroom c en uiteindelijk tot apoptotische celdood.(61) 30 Figuur 9: Apoptotische pathway in de mitochondriën na I/R en de centrale rol van de mPTP (62) 3.3 Mechanismen van nitriet-gebaseerde cytoprotectie We nemen het hart als model om uit te leggen wat geweten is over de mechanismen achter de nitriet-gemedieerde cytoprotectie na een I/R letsel. Er zijn reeds veel mechanismen ontdekt van NO-gemedieerde cytoprotectie in de mitochondriën zoals de inductie van anti-apoptose pathways en pathways die de mitochondriale respiratie vertragen. Hoewel het cytoprotectief effect van nitriet werkt via NO als intermediair (nitrite-derived NO mediated cytoprotection), zijn de veelheid aan targets zoals gezien wordt bij studies waar toediening van NO het uitgangspunt is, (nog) niet allemaal aangetoond in studies waar nitriettoevoeging het vertrekpunt is. Een overzicht geven van deze NO-gemedieerde mechanismen van cytoprotectie valt buiten de focus van deze thesis. We bespreken enkel die mechanismen van NO-gemedieerde cytoprotectie die ook geobserveerd werden in studies waarbij nitriet werd toegediend. 31 3.3.1 Reversibele S-nitrosilatie van complex I Nitriet oefent op de mitochondriën zijn cytoprotectief effect uit, onder andere via modulatie van complexen in de elektronentransportketen. Shiva et al. toonden aan dat nitriet tijdens I/R zorgt voor reversibele inhibitie van complex I.(60) Dit mechanisme van nitriet-gemedieerde cytoprotectie werd reeds in verschillende diermodellen van I/R gedemonstreerd.(63)(64) Inhibitie van complex I zorgt voor verminderde productie van ROS tijdens reperfusie en dus voor een beperking van oxidatieve schade. Zo vond men dat nitriet een verlaagde productie van H2O2 teweegbracht en dat de activiteit van aconitase, een mitochondriaal enzyme dat zeer gevoelig is aan oxidatieve schade, werd bewaard. Complex I voorkomt indirect, via de gedaalde generatie van ROS, opening van de mPTP en hierdoor het vrijkomen van cytochroom c en pro-apotatische signalisatie (zie figuur 10).(60) De inhibitie van complex I gebeurt via een post-translationele modificatie van het eiwit, namelijk via S-nitrosilatie. Hierbij wordt NO gebonden aan de thiol groep (-SH) van het aminozuur cysteïne in complex I wat leidt tot de vorming van een S-nitrosothiol groep (SNO). Het chemisch mechanisme waardoor nitriet kan zorgen voor S-nitrosylatie is niet helemaal duidelijk. Men denkt dat tijdens I/R S-nitrosylatie mogelijk wordt gemaakt door een reactie die zorgt voor de conversie van nitriet naar N2O3.(60) De reactieproducten tijdens de klassieke reductiereactie, wanneer nitriet wordt omgezet tot NO door heemmoleculen (in I/R omstandigheden), reageren verder tot N2O3. Het voorgestelde reactiemechanisme voor de Snitrosilatie van complex I is als volgt. Na de reductiereactie van nitriet door deoxyHb, waarbij nitriet wordt omgezet naar NO en metHb, reageert een andere molecule nitriet met metHb. Het gevormde ‘nitriet-metHb’-intermediair ziet er dan als volgt uit: Fe2+ – NO2° . Hierna reageert NO2° met NO tot N2O3. N2O3 is reactiever dan NO door zijn hogere oxidatiestatus en zorgt zo voor S-nitrosylatie. 32 Figuur 10: Nitriet-gemedieerde cytoprotectie; nitriet bewerkstelligt reversibele inhibitie van complex I en IV en zorgt zo voor cytoprotectie (bron: http://www.vmi.pitt.edu/index.html) Het feit dat de remming van complex I transiënt gebeurt is belangrijk. Het onomkeerbaar remmen van de mitochondriale respiratie zou de productie van ATP drastisch verminderen, waardoor cellulaire herstelmechanismen die voor hun functie afhankelijk zijn van ATP, zouden worden tegengewerkt.(60) 3.3.2 Reversibele nitrosilatie van complex IV De inhibitie van cytochroom c oxidase (=complex IV) is betrokken in nitriet-gemedieerde protectie na I/R.(54) Cytochroom c oxidase is het terminale complex van de elektronentransportketen, O2 bindt hierop en wordt gereduceerd tot water. Voor NO is complex IV het primair doelwit in de mitochondriën. NO bindt op Complex IV, gaat in competitie met O2 en kan zo de mitochondriale respiratie inhiberen. Deze NO-dependente inhibitie gebeurt volledig reversibel. Studies waarin bewezen werd dat nitriet-gemedieerde protectie in het hart afhankelijk is van de reductaseactiviteit van deoxymyoglobine toonden aan dat dit cytoprotectief effect te wijten is aan de binding van NO aan complex IV.(1)(33) Inhibitie van complex IV zorgt niet rechtstreeks voor een daling in de productie van ROS, zoals gezien wordt bij inhibitie van complex I. Het zijn voornamelijk complex I en III die verantwoordelijk zijn voor de productie van schadelijke ROS tijdens reperfusie. Het is zelfs 33 zo dat inhibitie van complex IV kan zorgen voor een verhoogde productie van ROS door vertraging van de elektronenstroom en de hiermee gepaarde accumulatie van elektronen in complex I en III.(65) Deze kleine stijging van ROS speelt echter geen grote rol in de progressie van het letsel tijdens I/R en zet zelfs beschermende reacties in gang (zie 3.3.3). De vertraging van het tempo van de mitochondriale ademhaling tijdens ischemie en reperfusie door inhibitie van complex IV door NO, gebeurt zo dat de zuurstofconsumptie daalt terwijl de generatie van ATP behouden blijft.(66) Hierin zit het cytoprotectief effect vervat. Dit mechanisme zou ten grondslag liggen aan het fenomeen van "myocardial hibernation". Bij dit fenomeen wordt in de setting van chronische ischemie de metabole activiteit van het hart tijdelijk stilgelegd om zo de energiereserves niet uit te putten en het weefsel te sparen van oxidatieve schade. Eens reperfusie optreedt wordt deze inhibitie opgeheven en keert de normale metabole functie terug.(54) 3.3.3 De mechanismen van nitriet bootsen ischemische preconditionering (IPC) na Nitriet- en NO-gemedieerde cytoprotectie zijn niet de enige cytoprotectieve middelen waarbij modulatie van de mitochondriale functie belangrijk is. De meest succesvolle cytoprotectieve strategie tot dusver is ischemische preconditionering (IPC). IPC is een experimenteel procedé waarbij door korte periodes van ischemie gevolgd door reperfusie, het weefsel kan worden beschermd tegen navolgende periodes van aanhoudende ischemie en zo de infarctzone kan reduceren. Dit fenomeen werd door Murry et al. voor het eerst beschreven bij honden en werd ondertussen bij verschillende diersoorten geobserveerd, alsook bij mensen. We vermelden IPC omdat er opmerkelijk veel parallellen zijn met de mechanismen achter nitriet-gemedieerde cytoprotectie. De idee achter IPC is dat de korte intervallen van ischemie gevolgd door reperfusie, protectieve pathways activeren (die o.a. geïnduceerd worden door ROS), welke de infarctzone significant kunnen reduceren. Het spreekt voor zich dat de klinische bruikbaarheid van IPC enkel beperkt is tot geplande I/R letsels, zoals bij een harttransplantatie, een coronaire bypassoperatie en bij percutane coronaire interventies. De laatste 20 jaar is sinds de ontdekking van IPC-gemedieerde protectie veel onderzoek verricht naar de mechanismen achter IPC met als doel medicijnen te ontwikkelen die de protectieve effecten van IPC mimeren. 34 De exacte signalisatiewegen van dit fenomeen zijn nog grotendeels onbekend en vallen buiten de focus van deze masterscriptie. Ondertussen is wel gebleken dat onder andere ROS en NO belangrijke mediatoren zijn.(67)(68) Zoals vermeld leidt de uitbarsting van grote hoeveelheden ROS tijdens reperfusie tot cellulaire schade, necrose en apoptose. Generatie van ROS door de mitochondriën blijkt echter essentieel te zijn in de signalisatiewegen bij IPC-gemedieerde cytoprotectie.(67) Lage concentraties ROS induceren beschermende pathways waaronder de activering van AMPKinase (AMPK).(69) AMPK functioneert als een metabole sensor en speelt in het hart een belangrijke rol als signaalstof in de cellulaire respons op ischemische stress die verder antiapoptose pathways kan activeren. Hoewel NO betrokken is bij de protectieve mechanismen van ischemische preconditionering, werd aangetoond dat blokkade van NOS niet zorgde voor inhibitie van IPC-gemedieerde cytoprotectie. Dit zorgde voor de hypothese dat nitriet als NOS-onafhankelijke bron van NO, van groot belang zou zijn bij cytoprotectie door IPC.(60) Meer studies zijn nodig om deze hypothese te testen, want in tegenstelling tot ROS en NO is de betrokkenheid van nitriet in de signaalweg bij IPC-gemedieerde cytoprotectie niet aangetoond. Het is wel zo dat de tot nu toe bekende mechanismen van protectie door nitriet deze van IPC bijna lijken te mimeren. Onderstaande parallellen tussen IPC- en nitrietgemedieerde cytoprotectie suggereren een potentiële rol voor nitriet als een mediator van IPC. Net zoals bij toediening van nitriet moduleert IPC de mitochondriale uitbarsting van ROS en dit leidt tot een onderdrukking van oxidatieve schade in het weefsel. Burwell et al. toonden door het gebruik van een hartmodel aan dat cytoprotectie door IPC geassocieerd is met de vorming van S-nitrosothiolen in het hartspierweefsel en met inhibitie van de activiteit van complex I.(58) Het is welbekend dat het effect van IPC zich voordoet in twee tijdsvensters. Meteen na de toepassing van IPC is er een acuut of klassiek tijdsvenster van protectie dat zich gedurende minuten of uren voordoet. Dit wordt gevolgd door een tweede tijdsvenster 24 tot 72 uur na IPC, de zogenaamde vertraagde cytoprotectie.(68) In de studie van Shiva et al. suggereert men dat nitriet ook werkt via twee vensters van protectie. Men stelde vast dat nitriet niet alleen toegediend tijdens ischemie (net voor reperfusie), maar ook toegediend 24h vóór de inductie van een I/R letsel zorgde voor cytoprotectie. In beide gevallen zag men bij muizen een even grote vermindering van het mycardinfarct of de leverischemie. Verder onderzoek naar hoe nitriet kan zorgen voor vertraagde cytoprotectie leverde volgende vaststellingen op.(60) 35 Men kon niet aantonen dat de nitrietbehandeling een invloed had op de expressie van mRNA van de belangrijkste genen betrokken bij mitochondriale biogenese, antioxidatieve defensie en bio-energetica. Maar via de detectie van S-nitrosothiolen vond men dat bij deze late vorm van cytoprotectie hetzelfde mechanisme van mitochondriale S-nitrosilatie actief was en dit terwijl de halfwaardetijd van nitriet in het bloed ongeveer 15 minuten bedraagt. Dit suggereert dat Snitrosilatie van de mitochondriale complexen zich snel voltrekt en tenminste 24 uur stabiel blijft. Verrassend hierbij was dat er ondanks de vorming van S-nitrosothiolen 24 uur voor ischemie geen verandering in mitochondriale respiratie of gedaalde productie van ATP te detecteren was tot na inductie van het IR-letsel. Complex I wordt dus pas geïnhibeerd in omstandigheden van ischemie. De mechanismen achter deze I/R-afhankelijke modulatie van het ge-S-nitrosyleerde complex zijn niet duidelijk. 3.3.4 De opening van ATP-dependente kaliumkanalen door nitriet Baker et al. evalueerden de betrokkenheid van mitochondriale ATP-gevoelige kalium (K+ATP) kanalen (gelegen op de binnenste mitochondriale membraan) in nitriet-geïnduceerde cardioprotectie.(47) De opening van de K+ATP kanalen is een belangrijk protectief mechanisme bij NO- en IPC-gemedieerde cytoprotectie. De opening van K+ATP kanalen lijkt te lijden tot depolarisatie van de mitochondriale membraan en een kleine stijging van ROS. Er werd aangetoond dat dit leidt tot de activering van anti-apoptose pathways.(70) Zo werd de opening van K+ATP kanalen geassocieerd met verminderde calciumaccumulatie in de mitochondriën en preventie van opening van de mPTP. In geïsoleerde mitochondria toonde men aan dat inactivatie van mitochondriale K+ATP kanalen ook zorgt voor preventie van de loslating van cytochroom c.(70) Cytoprotectie door de opening van K+ATP kanalen bij toediening van exogeen NO tijdens I/R gebeurt, net zoals bij NO-gemedieerde vasodilatatie, door activatie van het oplosbaar guanylaatcyclase (sGC). De gestegen concentratie van cGMP leidt tot activatie van proteïne kinase G (PKG) en beschermt de cel tegen I/R letsels door opening van mitochondriale K+ATP kanalen.(70) Om de rol van K+ATP kanalen als mediator van nitriet-gemedieerde cytoprotectie te onderzoeken werd aan ratten, die voor inductie van I/R in het myocard al dan niet behandeld werden met nitriet, 5-hydroxydecanoaat (5-HD) en HMR 1098 toegediend. 5-HD en HMR 1098 blokkeren de K+ATP kanalen. De toediening ervan bij nitriet behandelde ratten zorgde ervoor dat de vermindering van de infarctzone werd teniet gedaan. Bij ratten die niet waren 36 behandeld met nitriet, had zowel 5-HD als HMR 1098 geen effect op de infarctzone na inductie van een I/R letsel.(47) Hieruit werd besloten dat activatie van het K+ATP kanaal deel uitmaakt van nitriet-gemedieerde protectie. Shiva et al. suggereerden dat K+ATP kanalen geen target zijn van nitriet-gemedieerde cytoprotectie.(60) Ze gebruikten hiervoor een K+ATP kanaal blokker (diazoxide) en een K+ATP kanaalopener (glibenclamide) en vonden geen significant verschil in cytoprotectie na I/R bij toediening van nitriet samen met diazoxide versus toediening van enkel nitriet. Hetzelfde werd gezien bij de combinatie glibenclamide en nitriet. En dit terwijl beide farmaceutica, elk toegediend zonder nitriet, wel cytoprotectie beïnvloedden na I/R. Hieruit blijkt dat ondanks het sterke protectieve effect dat de activatie van de K+ATP kanalen teweegbrengt, de betrokkenheid ervan in het beschermend effect van nitriet controversieel is. 3.3.5 Inhibitie van mitochondriale fissie door fosforylatie van Drp1 In tegenstelling tot wat vaak wordt gedacht, is de mitochondriale populatie van een cel erg fluctuerend. De processen die leiden tot veranderingen in hoeveelheid, vorm en distributie van mitochondriën - kortweg de mitochondriale dynamiek - zijn fissie (splitsen) en fusie (samensmelten). Enkele eiwitten die betrokken zijn bij mitochondriale fissie zijn geïdentificeerd en sommige van hen zijn geassocieerd met mitochondriale ziekten. De betrokkenheid van veranderde mitochondriale dynamiek in de pathogenese van I/R werd onderzocht en recent werd gevonden dat inhibitie van mitochondriale fissie het hart beschermt tegen I/R letsels. Zo zorgde de farmacologische inhibitie van het eiwit dat mitochondriale fissie regelt, dynamin-related protein-1 (Drp1), voor een verkleining van de myocardiale infarctzone in knaagdiermodellen.(71) Recent toonden Kamga Pride et al. aan dat ook nitriet de mitochondriale dynamiek kan moduleren.(72) In een I/R model bij in cultuur gebrachte H9c2 rat-cardiomyocyten werd de volgende signalisatiecascade waargenomen (zie figuur 11). 37 Figuur 11: Nitriet-afhankelijke activatie van de PKA-Drp1-AMPK pathway (er werd aangetoond dat deze pathway ook actief is tijdens normoxie) (72) Nitriet is in staat proteïne kinase A (PKA) te activeren. Dit eiwit fosforyleert en inhibeert Drp1. Inhibitie van Drp1 zorgt structureel voor een stijging van de mitochondriale fusie. Functioneel zorgt dit voor een verhoging van de membraanpotentiaal over de mitochondriën en een toename van de mitochondriale productie van ROS. Deze productie van ROS leidt tot oxidatie en activatie van de AMPK-pathway, een essentiële stap in cytoprotectie die ook belangrijk is in IPC-gemedieerde cytoprotectie. Dat mitochondriale productie van ROS hierin essentieel is werd aangetoond door het gebruik van een ROS scavenger. Dit inhibeerde de activatie van AMPK waardoor de cytoprotectie, waargenomen na toediening van nitriet, werd verhinderd.(72) In de studie van Kamga Pride et al. wordt nitriettherapie toegediend tijdens normoxie, 1 uur voor inductie van het I/R letsel. Dit zorgt voor een significante vertraging van celdood in de cardiomyocyten. De vaststelling door verschillende andere studies, dat nitriet toegevoegd vóór I/R een (vertraagd) cytoprotectief heeft, doet vermoeden dat nitriet in niet-ischemische omstandigheden een signaalstof is.(73)(60) Tot voor kort was er geen enkele studie die deze hypothese hard kon maken. Inhibitie van complex I bijvoorbeeld, een belangrijk mechanisme van met nitriet bekomen cytoprotectie zoals hierboven uitgelegd, werd enkel waargenomen in omstandigheden van ischemie/reperfusie. Ook in de studie van Kamga Pride et al. kon na nitriettoediening en voor inductie van het I/R letsel in de cardiomyocyten, geen inhibitie van complex I worden geobserveerd. 38 Tijdens normoxie werd echter wel een verhoogde PKA activiteit door nitriet waargenomen. Voor het eerst werd een nitriet-signaalweg blootgelegd die leidt tot cytoprotectie in omstandigheden van normoxie. Een toestand waarin het onwaarschijnlijk is dat nitriet naar NO wordt omgezet gezien deze reductie voornamelijk gebeurt in omstandigheden van hypoxie en lage pH. Hoe of via welk intermediair nitriet kan zorgen voor activatie van PKA tijdens normoxie is onduidelijk. Hoofdstuk 4: Nitriet als potentieel therapeuticum bij I/R letsels De resultaten uit talrijke dierstudies met nitriettoediening bij I/R letsels van zowel het hart, de hersenen, de lever en de nieren zijn veelbelovend te noemen. De inzichten die deze studies ons hebben bijgebracht op het gebied van mechanismen van cytoprotectie en identificatie van nitrietreductasen werden reeds besproken in de vorige hoofdstukken. In dit hoofdstuk bespreken we de resultaten van deze studies in functie van de toepasbaarheid naar de kliniek. Tevens bespreken we de veiligheid van nitriettherapie. Daarna gaan we na hoe ver men staat in het onderzoek naar nitriet als mogelijk therapeuticum bij AMI en stroke. 4.1 Dierstudies betreffende nitriettoediening bij I/R Sinds ontdekt werd dat nitriet in ischemische omstandigheden een alternatieve bron is van NO, zijn veel studies verricht naar de effecten van nitriettoediening bij diermodellen in ischemische condities. Het eerste effect van de omzetting van nitriet naar NO dat men vond, was vasodilatatie.(9)(74) Kort daarop volgden een hele reeks studies die in diermodellen demonstreerden dat exogeen toegediend nitriet de uitgebreidheid van geïnduceerde I/R letsels kon beperken. In tabel 2 vinden we een overzicht van dierstudies gepubliceerd tussen 2004 en 2009 waarin de toediening van nitriet zorgde voor een reductie van I/R letsels. Als we nitriet therapeutisch benaderen is het nuttig om na te gaan in welke grootteorde van concentraties en via welke toedieningswegen nitriet werkzaam is in ischemische modellen. Bovendien is het belangrijk om te weten wat de invloed is van de timing en duur van nitriettoediening op het cytoprotectief effect. 39 40 Tabel 2: Overzicht van dierstudies waar nitriettoediening een gunstig effect had op het I/R letsel (met bijgevoegde referenties) (78) (77) (76) (60) (46) (12) (75) (45) (47) (47) (60) (12) (73) Dosis De eerste studie in deze reeks werd uitgevoerd door Webb et al. in 2004. Webb et al. demonstreerden dat in een Langendorff hartmodel van de rat, infusie van (lage) concentraties natrium-nitraat (van 10 tot 100 µM), voor en tijdens een ischemisch insult, zorgde voor de productie van NO.(45) Er werd hierbij een behoud van de functie van het linker ventrikel vastgesteld en een kleinere infarctzone in vergelijking met ratten die een zoutoplossing kregen toegediend. Hoewel men vaststelde dat de concentratie van NO steeg naarmate men de dosis nitriet opdreef (van 10 tot 100 µM), merkte men hierbij geen verschil in de mate van protectie van het myocardweefsel. Kort daarna rapporteerden Duranski et al. dat nitriet protectief was in in vivo muismodellen van myocard- en leverischemie.(12) In deze studies werden oplossingen van natrium-nitriet (dosis van 2,4 tot 960 nmol) toegediend tijdens myocard- en leverischemie. Voorts vertoonde het efficiëntieprofiel van de nitriettherapie een U-vormige curve. Dit betekent dat zowel zeer lage als zeer hoge dossisen van nitriet niet leiden tot protectie van het weefsel. We merken hierbij op dat supra-fysiologische concentraties (van hoog µM tot laag mM) zelfs cellulaire apoptose en necrose promoten (zie 4.2).(79) Er werd in de studie van Duranski et al. een maximale protectie van de lever en het hart bereikt bij een bijna-fysiologische (48nmol) dosis van nitriet. Het feit dat het cytoprotectief effect reeds in lage, bijna-fysiologische dosissen optreedt, is een pluspunt voor potentieel therapeutisch gebruik (Vb. minder kans op bijwerkingen, zie 4.2). Tevens suggereert dit dat nitriet pathofysiologische responsen op ischemische stress moduleert. Toedieningsweg In de meerderheid van de dierstudies werd nitriet systemisch (intraveneus of intraperitoneaal) toegediend. Bij myocardiale I/R letsels echter, zorgden verschillende toedieningswegen niet voor een significant verschil in het protectieve resultaat van de nitriettherapie. Zo was oraal toegediend nitriet evenzeer in staat het I/R letsel te beperken als intraveneus toegediend nitriet. Muizen die een standaarddieet kregen en waarbij gedurende 7 dagen nitriet in hun drinkwater werd toegevoegd, vertoonden bij inductie van een myocardiaal I/R letsel een reductie van de infarctzone van 48 procent.(73) Bij studies met I/R van de nieren zouden discrepanties in werkzaamheid van nitriettherapie te wijten kunnen zijn aan een verschil in de toedieningsweg van nitriet. Basireddy et al. observeerden dat systemische toediening (intraveneus of intraperitoneaal) geen bescherming 41 bood bij inductie van een I/R letsel in de nieren van ratten.(80) Tripatara et al. bevestigden deze resultaten in een gelijkaardig model, maar konden bij toediening van dezelfde hoeveelheden nitriet wel een protectief effect aantonen wanneer nitriet topisch werd toegediend.(76) Nitriet heeft, naast een beschermend effect op I/R wanneer het systemisch of oraal wordt toegediend, ook protectieve eigenschappen via een endocrinologische manier. Dit werd geïllustreerd in een dierstudie met transgene muizen waarbij humaan eNOS, specifiek voor cardiomyocten, tot overexpressie werd gebracht. NO wordt afgebroken tot nitriet, waarvan men verhoogde spiegels detecteerde in het bloed. Wanneer bij deze dieren een I/R letsel in de lever werd geïnduceerd, werd een significante reductie van het I/R letsel waargenomen in vergelijking met wildtype muizen.(81) Nitriet afkomstig van het hart zorgt dus via transport door het bloed, voor protectie in verder gelegen organen. In de klinische praktijk van de behandeling van I/R letsels zou de intraveneuze toedieningsmogelijkheid van nitriet het interessantst zijn. We merken op dat, gezien de verscheidenheid aan effecten van nitriet (zie figuur 1 in de inleiding), de veelheid aan effectieve toedieningswijzen een voordeel zou zijn voor een aangepaste behandeling per conditie (bvb orale inname van nitriet bij chronische ischemie zoals perifeer arterieel lijden). Timing Gonzalez et al. toonden aan dat nitriet, toegediend gedurende 5 minuten net voor het begin van de reperfusie-fase, ook zorgde voor myocardiale cytoprotectie.(75) Dit werd aangetoond in een model bij de hond waarbij de periode van coronaire occlusie 2 uur bedroeg. Intraveneuze toediening van natrium-nitriet gedurende de laatste 5 minuten van deze ischemische periode zorgde voor een vermindering van de myocardiale infarctzone van 70 procent (= de infarctzone van de controlegroep die een zoutoplossing kreeg toegediend) naar 36 procent. In vergelijking met een groep dieren die reeds natrium-nitriet kregen toegediend gedurende 60 minuten voor reperfusie, en waarvan de infarctzone 23 procent bedroeg, is dit verschil niet zo groot. Uit de zeer gunstige protectieve effecten van nitriettoediening vlak voor reperfusie besloten Gonzalez et al. dat nitriet een aanzienlijk potentieel zou kunnen hebben als aanvullende therapie bij AMI. In deze setting zou nitriet kunnen worden toegediend net voor PCI of trombolyse. Zoals vermeld in het vorige hoofdstuk bleek toediening van nitriet, 24 uur voor inductie van ischemie, ook bescherming te bieden (de zogenaamde vertraagde cytoprotectie). Deze eigenschap van nitriet, waarbij weefsels als het ware ‘gepre-conditioneerd’ worden aan een 42 ischemische periode, zou nuttig kunnen zijn bij transplantaties. Zowel het donororgaan als de recipiërende patiënt zouden 24 uur voor de transplantatie kunnen behandeld worden met nitriet. Zo zou een omgeving worden gecreëerd waarin de schade van I/R tijdens en na de transplantatie wordt beperkt. 4.2 Veiligheid van nitriettherapie bij I/R Ondanks het enthousiasme voor nitriettherapie is het van belang om behoedzaam te blijven. Als we het gebruik van nitriet als mogelijk therapeuticum bij de mens nagaan is het belangrijk de potentiële gevaren in acht te nemen. Er zou na nitriettoediening hypotensie kunnen optreden door de verhoogde beschikbaarheid van NO en de daarmee gepaard gaande vasodilatatie. Dit zou de omvang van het I/R letsel, een situatie waar reeds hypoperfusie van het orgaan aanwezig is, negatief kunnen beïnvloeden. Een te sterke stijging van de beschikbaarheid van NO kan cytotoxische effecten hebben. Men is het erover eens dat zeer hoge concentraties NO weefselschade kunnen promoten.(79) Dit is te wijten aan de vorming van peroxynitriet, een zeer potent ROS dat ontstaat door de snelle reactie van NO met een ander zuurstofradicaal, namelijk het superoxide-anion (zie figuur 1).(77) De bezorgdheid voor bovenstaande speelt ook mee in het onderzoek van toediening van NO (Vb. via inhalatie van NO-gas of intra-veneuze toediening van NO-donoren) als potentiële therapie bij I/R-letsels. En is een reden waarom na succesvolle dierstudies slechts weinig klinische studies werden uitgevoerd.(82) Een voordeel echter van nitriet boven therapie met NO of NO-donoren, ligt in de stabiliteit van de molecule nitriet. Zoals eerder vermeld kan nitriet na transport door het bloed, worden opgeslagen in de weefsels. Bovendien gebeurt de reductie van nitriet naar NO preferentieel in weefsels onderhevig aan ischemie. Nitriet-afhankelijke vrijstelling van NO zorgt op die manier voor een gerichte bescherming, en vermindert hierbij het risico op systemische bijwerkingen van NO. Een ander gevaar van nitriet is methemoglobinemie. Net zoals NO (zie figuur 3) kan nitriet namelijk reageren met oxyhemoglobine. Door oxydatie van het heemijzer (van Fe3+ naar Fe2+) ontstaat methemoglobine (metHb). MetHb kan geen zuurstof binden en bij te hoge plasmaconcentraties kan dit interfereren met de capaciteit van de rode bloedcellen om zuurstof te transporteren. Dit gebeurt wanneer de plasmaconcentratie van metHb 20 tot 30 procent van de totale concentratie van Hb bedraagt.(83) 43 De veiligheid van de toediening van nitriet bij mensen werd in 2011 bestudeerd in een klinische studie (fase1).(83) Bij gezonde individuen werd in een stijgende dosis natriumnitriet systemisch toegediend, en dit gedurende 48 uur. Men bepaalde de hoogste dosis die geen bijwerkingen veroorzaakte (maximal tolerated dose (MTD)) en de dosis waarbij bijwerkingen optraden (dose limiting toxicity (DLT)). Deze bedroegen respectievelijk 267 en 446 mg/kg/u. De toxische effecten van nitriet waren: een asymptomatische verhoging van de bloeddruk die transiënt was, en een zeer lichte stijging van de plasmaconcentratie van metHb. Gezien de therapeutische dosissen van nitriet, afgeleid uit preklinische studies, onder de MTD en DLT vallen, besloot men dat intraveneuze toediening van nitriet veilig is. Voorts besloot men dat deze studie zeer waardevol is om de stap te maken naar klinische trials die nitriettherapie onderzoeken bij specifieke condities zoals I/R van het hart, de lever, de nieren en de hersenen. We merken op dat nog niet geweten is of nitrietbehandeling zou kunnen leiden tot pathologische accumulatie van NO (door de vorming van peroxynitriet) in het ischemische weefsel. 4.3 Nitriettherapie bij acuut myocardinfarct (AMI) Vandaag is de behandeling van I/R letsels gebaseerd op het tijdig herstellen van de orgaanperfusie. Bij een acuut myocardinfarct (AMI) bijvoorbeeld, bestaat de therapie uit het opheffen van de arteriële occlusie door percutane coronaire interventie (PCI; dit is het plaatsen van een stent die de vernauwde coronair openzet) of door intraveneuze toediening van trombolytica. Voor het aandeel van de weefselschade die, zoals eerder vermeld, ontstaat tijdens reperfusie, bestaat echter geen effectieve therapie. Het cytoprotectief effect van nitriet, dat voornamelijk optreedt tijdens reperfusie, zou één van de mogelijkheden kunnen zijn om aan het gebrek aan ‘reperfusie-therapie’ tegemoet te komen. Uit de reeds aangehaalde dierstudies (zie tabel 2) is duidelijk dat nitriet bij I/R een cardioprotectief effect heeft, en dit zowel toegediend vóór ischemie, als net vóór reperfusie. Onlangs werden de resultaten gepubliceerd van een gerandomiseerde klinische studie bij patiënten met een eerste acuut STEMI (ST-elevated acute myocard infarct) die nitriet intraveneus kregen toegediend, net voor reperfusie d.m.v. PCI.(84) Dit is de eerste klinische studie waarbij het therapeutisch effect van nitriettherapie werd getest bij patiënten die een spontaan I/R letsel doormaken. De resultaten van deze studie waren echter negatief. Men repliceerde hetzelfde protocol (timing, duur, en dosis van nitriettoediening) als gebruikt werd 44 door Gonzalez et al. in het model bij de hond (zie 4.1). In tegenstelling tot de veelbelovende resultaten in deze dierstudie, kon bij mensen geen reductie van de infarctzone worden aangetoond. Het is niet duidelijk waarom de gunstige resultaten uit dierstudies niet konden worden bevestigd in deze klinische studie. Een mogelijke verklaring voor deze verschillen, die wordt aangehaald in het artikel, is het feit dat bijna alle patiënten voor reperfusie, als standaardtherapie, organische nitraten kregen toegediend. Het zou kunnen dat deze NOdonoren reeds een bepaalde graad van cardioprotectie geïnduceerd hadden, en hierdoor het potentieel voor een bijkomstig cardioprotectief effect door nitriet inperken. Of erger nog, zouden de organische nitraten, in combinatie met nitriet, kunnen zorgen voor een hoge concentratie aan NO in het hartspierweefsel, dat schadelijk zou zijn. 4.4 Nitriettherapie bij beroerte Beroerte (stroke) of een cerebrovasculair accident (CVA) is een I/R letsel van de hersenen en kunnen we afhankelijk van het ontstaansmechanisme opdelen in twee types, ischemische CVA en hemorragische CVA. 80 procent van alle CVA’s zijn ischemisch en ontstaan wanneer de bloedtoevoer onderbroken wordt door een bloedklonter. Een hemorragische CVA ontstaat, zoals het woord het zegt, door een bloeding, meestal na het barsten van een aneurisma. Tot op vandaag bestaat de enige behandeling van ischemische CVA uit het intraveneus toedienen van een trombolyticum. Een beperking van deze therapie is het risico op bloedingen, daarom mag trombolyse slechts worden uitgevoerd tot 3 uur na het begin van het infarct. Aangezien, in tegenstelling tot AMI, het gevoel van urgentie bij ischemische CVA veel lager ligt, krijgen een meerderheid van de patiënten mensen geen tijdige behandeling met trombolyse. Voor hemorragische CVA bestaat tot op heden geen farmacologische therapie. Jung et al. hebben veel onderzoek verricht naar het gebruik van nitriet bij ischemische CVA. In 2006 werd in een dierstudie met ratten aangetoond dat nitriet intraveneus (in nanomolaire dosissen) toegediend op het tijdstip van reperfusie, na occlusie van de arteria cerebri media, leidde tot een significante vermindering van de infarctzone en een verbetering van functioneel herstel.(77) Wanneer men in een volgende studie de timing van nitriettoediening wijzigde, ontdekte men dat nitriet ook neuroprotectief was, wanneer toegediend 3 uur na cerebrale I/R.(85) Dit zou het gebruik in acute setting bijzonder nuttig maken. 45 Een andere studie door Jung et al. onderzocht het effect van chronische nitriettherapie 24 uur voor het I/R letsel. Er werd aangetoond dat continue toediening van nitriet, gedurende 7 dagen, zorgde voor neuronale en vasculaire regeneratie, en beter functioneel herstel van de hersenen.(86) Terwijl de dosis aan nitriet nodig voor neuroprotectie in acute cerebrale ischemie bijzonder laag was, waren in deze studie dosissen van 100 µg/kg nodig om protectie te bieden. Het mechanisme achter deze discrepantie is niet duidelijk. Voor (intracraniële) hemorragische CVA werden ook positieve resultaten geboekt met nitriettherapie.(87) Bij subarachnoïdale hemorragie (SAH), een ander subtype van hemorragische CVA, treedt de bloeding op in de met liquor gevulde ruimte tussen de hersenen en de arachnoïdale hersenvliezen. Een verwikkeling geassocieerd met SAH zijn cerebrale vasospasmen. Fathi et al. toonden aan dat infusie met nitriet in een model van vasospasme bij apen, zorgde voor een omkering van vasospasmen geïnduceerd door SAH.(88) Er wordt namelijk gedacht dat dysfunctioneel eNOS verantwoordelijk is voor de vasospastische respons na SAH. In 2013 werd een klinische studie gepubliceerd die de veiligheid van nitriettherapie bij patiënten met SAH testte. Gedurende 2 weken kregen patiënten met SAH nitriet toegediend, en dit in gelijkaardige dosissen die in preklinische studies voor een therapeutisch effect zorgden. Er werd geen toxiciteit (de concentraties aan metHb gingen niet hoger dan 3,3 procent van de totale concentratie aan Hb) of hypotensie waargenomen.(89) Deze gunstige resultaten tonen aan dat potentieel therapeutische dosissen voor de mens, veilig zijn bij patiënten met SAH, en zet de deur open voor het ontwikkelen van andere klinische studies die de neuroprotectieve effecten van nitriet evalueren. 46 DISCUSSIE Onderzoek dat gedurende de laatste 20 jaar gevoerd werd, heeft de manier waarop we over nitriet en nitraat denken drastisch veranderd. De ontdekking van de nitraat-nitriet-NO pathway toonde aan dat deze anionen veel meer zijn dan de voedingsadditieven waarmee men ze in het verleden hoofdzakelijk associeerde. Er is in het onderzoek rond nitriet als het ware een shift gebeurd van nitriet als mogelijk toxische stof, naar nitriet als een biologisch relevante molecule. Het is nu duidelijk dat nitriet een belangrijke rol speelt in de homeostase van NO en zo verscheidene ziektetoestanden, waaronder I/R, gunstig zou kunnen beïnvloeden. In het eerste deel van de masterscriptie zijn we dieper ingegaan op wat reeds gekend is over de bronnen, de bioactivatie en de werkingsmechanismen van nitriet tijdens I/R. We hebben gezien dat bij zoogdieren verschillende eiwitten in het bloed en de weefsels kunnen dienen als reductasen voor de omzetting van nitriet naar NO. Er zijn nog veel onduidelijkheden en wellicht zullen in de toekomst de reactiemechanismen en de zuurstof- en redoxafhankelijke regulatiemechanismen achter de besproken reductiesystemen verder worden opgehelderd. Bovendien vermelden vele auteurs dat, hoewel in de literatuur de meeste aandacht gaat naar deoxyHb, deoxyMb en XO, het mogelijk is dat in de nabije toekomst nog meer nitrietreductasen zullen worden geïdentificeerd. De overvloed aan kandidaat ‘enzymes’ voor nitrietreductie zou een overblijfsel zijn van ons preaeroob verleden als bacteriën, waarbij stikstofoxiden zoals nitriet werden gebruikt als terminale elektronenacceptor in de energieproductie. Ook over de cytoprotectieve effecten van nitriet die in deze masterscriptie werden besproken, bestaan nog veel onbeantwoorde vragen. Zo is het chemisch mechanisme achter nitrietgemedieerde S-nitrosylatie van het mitochondriale complex I niet helemaal duidelijk. De mechanismen achter de I/R-afhankelijke inhibitie van het ge-S-nitrosyleerde complex (bij vertraagde cytoprotectie door nitriet) zijn eveneens onduidelijk. In de studie van Kamga Pride et al. (72), waarin als cytoprotectief effect de inhibitie van de mitochondriale fissie werd vooropgesteld, is niet geweten hoe nitriet (tijdens normoxie en waarschijnlijk onafhankelijk van de reductie van nitriet naar NO) kan zorgen voor de activatie van PKA. Tevens is de betrokkenheid van nitriet in IPC-gemedieerde cytoprotectie nog niet aangetoond. Ook over de K+ATP kanalen als target van nitriet-gemedieerde cytoprotectie bestaat controverse. We 47 kunnen besluiten dat verder onderzoek nodig is naar de cytoprotectieve mechanismen van nitriet tijdens I/R. Een beter begrip van deze nitriet-gemedieerde beschermingsmechanismen zou ons verder kunnen brengen in klinische studies rond het therapeutisch aanwenden van nitriet. Bovendien zou de verdere ontrafeling van cytoprotectieve signaalwegen van nitriet, targets kunnen blootleggen waarop farmacotherapeutisch kan worden ingewerkt. In het tweede deel van de masterscriptie gingen we de mogelijkheid na van nitriet-gebaseerde therapie bij I/R, waarbij we de uitdagingen voor nitriet in de behandeling van twee specifieke ziektebeelden (AMI en CVA) bespraken. Het onderzoek naar nitriet als mogelijk therapeuticum bij I/R heeft een kritisch punt bereikt tussen pre-klinische studies en klinische studies. Bij AMI is men reeds het verst gevorderd. Hier zagen we echter dat, ondanks de gunstige resultaten in dierproeven, de eerste klinische studie dit echter niet kon bevestigen. Als we in het onderzoeksveld van cardioprotectie de resultaten van andere ‘reperfusietherapiëen’ nagaan, valt het op dat er reeds een groot aantal mislukte pogingen geweest zijn om veelbelovende strategieën in dierproeven te vertalen naar de klinische setting. Volgens D Hausenloy et al. is deze discrepantie o.a. te wijten aan het feit dat vele experimentele modellen voor AMI te veel verschillen van de klinische setting van AMI in termen van comorbiditeit (leeftijd, diabetes, dylipidemie en hypertensie) en concomitante medicatie.(90) Als we deze afweging toepassen op de literatuur rond het onderzoek van nitriet als mogelijk therapeuticum bij I/R letsels is het inderdaad zo dat er weinig bekend is over interacties met andere medicatie. Dit aspect zal verder onderzoek vereisen om (mogelijke schadelijke) interacties te evalueren. Klinische studies betreffende de veiligheid van nitriettoediening rapporteerden dat intraveneuze toediening van nitriet veilig is bij gezonde vrijwilligers en ook reeds bij patiënten met SAH. Bovendien is toediening van nitriet zoals eerder vermeld uniek ten opzichte van andere farmacologische behandelingen bij I/R letsels, daar het een stabiele molecule is, die fungeert als een endocrien reservoir van NO en pas wordt ‘geactiveerd’ in weefels in zuurstofnood. Het is duidelijk dat nitriet-gebaseerde therapie bij I/R een zeker potentieel heeft, de resultaten van klinische studies zullen uitwijzen welke richting het zal uitgaan. 48 REFERENTIELIJST 1. Lei J, Vodovotz Y, Tzeng E, Billiar TR. Nitric oxide, a protective molecule in the cardiovascular system. Nitric Oxide [Internet]. Elsevier Inc.; 2013 Nov 30 [cited 2014 Jan 23];35:175–85. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24095696 2. S. Moncada, A. Higgs. The L-arginine-nitric oxide pathway. N Engl J Med. 1993;329:2002–12. 3. Bian K, Doursout M-F, Murad F. Vascular System: Role of Nitric Oxide in Cardiovascular Diseases. J Clin Hypertens [Internet]. 2008 Apr [cited 2014 Mar 14];10(4):304–10. Available from: http://doi.wiley.com/10.1111/j.1751-7176.2008.06632.x 4. Roberts JD Jr, et al. Inhaled nitric oxide and persistent pulmonary hypertension of the newborn. The Inhaled Nitric Oxide Study Group. N Engl J Med. 1997;336:605–10. 5. Butler AR, Feelisch M. Therapeutic uses of inorganic nitrite and nitrate: from the past to the future. Circulation [Internet]. 2008 Apr 22 [cited 2014 Mar 10];117(16):2151–9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18427145 6. Benjamin N, O’Driscoll F, Dougall H, Duncan C, Smith L, Golden M, et al. Stomach NO synthesis. Nature [Internet]. 1994 Apr 7 [cited 2014 Mar 14];368(6471):502. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/368502a0 7. Lundberg J, Weitzberg E, Lundberg J, Alving K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut [Internet]. 1994 [cited 2014 Mar 14];0:1543–6. Available from: http://gut.bmj.com/content/35/11/1543.abstract 8. Zweier JL, Wang P, Samouilov A, Kuppusamy P. Enzyme-independent formation of nitric oxide in biological tissues. Nat Med. 1995;1:804–9. 9. Cosby K, Partovi KS, Crawford JH, Patel RP, Reiter CD, Martyr S, et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nat Med [Internet]. 2003 Dec [cited 2014 Feb 19];9(12):1498–505. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14595407 10. Kevil CG, Kolluru GK, Pattillo CB, Giordano T. Inorganic nitrite therapy: historical perspective and future directions. Free Radic Biol Med [Internet]. Elsevier Inc.; 2011 Aug 1 [cited 2013 Jun 18];51(3):576–93. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21619929 11. Hoshida S, Yamashita N, Igarashi J, Nishida M, Hori M, Kamada T, et al. Nitric oxide synthase protects the heart against ischemia-reperfusion injury in rabbits. J Pharmacol Exp Ther [Internet]. 1995 Jul 1 [cited 2014 Mar 15];274(1):413–8. Available from: http://jpet.aspetjournals.org/content/274/1/413.short 12. Duranski MR, Greer JJM, Dejam A, Jaganmohan S, Hogg N, Langston W, et al. Cytoprotective effects of nitrite during in vivo ischemia-reperfusion of the heart and liver. J Clin Invest [Internet]. 2005 May;115(5):1232–40. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1077170&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 13. Dejam A, Hunter CJ, Pelletier MM, Hsu LL, Machado RF, Shiva S, et al. Erythrocytes are the major intravascular storage sites of nitrite in human blood. Blood [Internet]. 2005 Jul 15 [cited 2014 Mar 24];106(2):734–9. Available from: 49 http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1895176&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 14. Shiva S, Wang X, Ringwood LA, Xu X, Yuditskaya S, Annavajjhala V, et al. Ceruloplasmin is a NO oxidase and nitrite synthase that determines endocrine NO homeostasis. Nat Chem Biol [Internet]. Nature Publishing Group; 2006 Sep [cited 2014 Mar 23];2(9):486–93. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nchembio813 15. Lundberg JO, Gladwin MT, Ahluwalia A, Benjamin N, Bryan NS, Butler A, et al. Nitrate and nitrite in biology, nutrition and therapeutics. Nat Chem Biol [Internet]. Nature Publishing Group; 2009 Dec [cited 2014 Mar 24];5(12):865–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nchembio.260 16. Lundberg JO, Govoni M. Inorganic nitrate is a possible source for systemic generation of nitric oxide. Free Radic Biol Med [Internet]. 2004 Aug 1 [cited 2014 Mar 23];37(3):395–400. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15223073 17. Lundberg JO, Weitzberg E, Gladwin MT. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov [Internet]. 2008 Feb [cited 2014 Jan 21];7(2):156–67. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18167491 18. Hendgen-Cotta UB, Luedike P, Totzeck M, Kropp M, Schicho A, Stock P, et al. Dietary nitrate supplementation improves revascularization in chronic ischemia. Circulation [Internet]. 2012 Oct 16 [cited 2014 Mar 24];126(16):1983–92. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22992322 19. Larsen FJ, Ekblom B, Sahlin K, Lundberg JO, Weitzberg E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. N Engl J Med [Internet]. 2006 Dec 28 [cited 2014 Mar 24];355(26):2792–3. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17192551 20. Ghosh SM, Kapil V, Fuentes-Calvo I, Bubb KJ, Pearl V, Milsom AB, et al. Enhanced vasodilator activity of nitrite in hypertension: critical role for erythrocytic xanthine oxidoreductase and translational potential. Hypertension [Internet]. 2013 May 15 [cited 2014 Mar 24];61(5):1091–102. Available from: http://hyper.ahajournals.org/content/early/2013/04/15/HYPERTENSIONAHA.111.00933. 21. Larsen FJ, Weitzberg E, Lundberg JO, Ekblom B. Effects of dietary nitrate on oxygen cost during exercise. Acta Physiol (Oxf) [Internet]. 2007 Sep [cited 2014 Mar 1];191(1):59–66. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17635415 22. Rassaf T, Heiss C, Mangold S, Leyendecker T, Kehmeier ES, Kelm M, et al. Vascular formation of nitrite after exercise is abolished in patients with cardiovascular risk factors and coronary artery disease. J Am Coll Cardiol [Internet]. Journal of the American College of Cardiology; 2010 Apr 6 [cited 2014 Mar 24];55(14):1502–3. Available from: http://content.onlinejacc.org/article.aspx?articleid=1142692 23. Kehmeier ES, Kropp M, Kleinbongard P, Lauer T, Balzer J, Merx MW, et al. Serial measurements of whole blood nitrite in an intensive care setting. Free Radic Biol Med [Internet]. 2008 Jun 1 [cited 2014 Mar 24];44(11):1945–50. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18374662 24. Shiva S. Nitrite: A Physiological Store of Nitric Oxide and Modulator of Mitochondrial Function. Redox Biol [Internet]. 2013 Jan [cited 2014 Jan 24];1(1):40–4. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3661298&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 25. Rocha BS, Gago B, Barbosa RM, Laranjinha J. Dietary polyphenols generate nitric oxide from nitrite in the stomach and induce smooth muscle relaxation. Toxicology [Internet]. 2009 Nov 9 [cited 2014 Apr 9];265(1-2):41–8. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0300483X09004818 50 26. Bueno M, Wang J, Mora AL, Gladwin MT. Nitrite signaling in pulmonary hypertension: mechanisms of bioactivation, signaling, and therapeutics. Antioxid Redox Signal [Internet]. 2013 May 10 [cited 2013 Jun 21];18(14):1797–809. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22871207 27. Voet, D. (2008) Fundamentals of Biochemistry, 3rd. ed., Fig. 07_06, John Wiley & Sons [Internet]. [cited 2014 Apr 1]. Available from: http://eu.wiley.com/WileyCDA/WileyTitle/productCd0470228423.html?filter=TEXTBOOK 28. Burmester T, Weich B, Reinhardt S, Hankeln T. A vertebrate globin expressed in the brain. Nature [Internet]. 2000 Sep 28 [cited 2014 Apr 3];407(6803):520–3. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11029004 29. Brooks J. The Action of Nitrite on Haemoglobin in the Absence of Oxygen. Proc R Soc B Biol Sci [Internet]. 1937 Aug 3 [cited 2014 Apr 14];123(832):368–82. Available from: http://rspb.royalsocietypublishing.org/cgi/doi/10.1098/rspb.1937.0057 30. Gödecke A, Molojavyi A, Heger J, Flögel U, Ding Z, Jacoby C, et al. Myoglobin protects the heart from inducible nitric-oxide synthase (iNOS)-mediated nitrosative stress. J Biol Chem [Internet]. 2003 Jun 13 [cited 2014 Apr 3];278(24):21761–6. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12665503 31. Van Doorslaer S, Dewilde S, Kiger L, Nistor S V., Goovaerts E, Marden MC, et al. Nitric Oxide Binding Properties of Neuroglobin: A CHARACTERIZATION BY EPR AND FLASH PHOTOLYSIS. J Biol Chem [Internet]. 2003 Feb 14 [cited 2014 Apr 3];278(7):4919–25. Available from: http://www.jbc.org/content/278/7/4919.short 32. Huang Z, Shiva S, Kim-Shapiro DB, Patel RP, Ringwood LA, Irby CE, et al. Enzymatic function of hemoglobin as a nitrite reductase that produces NO under allosteric control. J Clin Invest [Internet]. 2005 Aug [cited 2014 Mar 30];115(8):2099–107. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1177999&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 33. Shiva S, Huang Z, Grubina R, Sun J, Ringwood LA, MacArthur PH, et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circ Res [Internet]. 2007 Mar 16 [cited 2014 Mar 3];100(5):654–61. Available from: http://circres.ahajournals.org/content/100/5/654.long 34. Giuffrè A, Moschetti T, Vallone B, Brunori M. Neuroglobin: enzymatic reduction and oxygen affinity. Biochem Biophys Res Commun [Internet]. 2008 Mar 21 [cited 2014 Apr 14];367(4):893–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18198128 35. Castiglione N, Rinaldo S, Giardina G, Stelitano V, Cutruzzolà F. Nitrite and nitrite reductases: from molecular mechanisms to significance in human health and disease. Antioxid Redox Signal [Internet]. 2012 Aug 15 [cited 2013 Jun 20];17(4):684–716. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22304560 36. Patel RP, Hogg N, Kim-Shapiro DB. The potential role of the red blood cell in nitrite-dependent regulation of blood flow. Cardiovasc Res [Internet]. 2011 Feb 15 [cited 2014 Apr 14];89(3):507–15. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3028972&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 37. Huang KT, Keszler A, Patel N, Patel RP, Gladwin MT, Kim-Shapiro DB, et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. J Biol Chem [Internet]. 2005 Sep 2 [cited 2014 Apr 1];280(35):31126–31. Available from: http://www.jbc.org/content/280/35/31126.long 38. Totzeck M, Hendgen-Cotta UB, Luedike P, Berenbrink M, Klare JP, Steinhoff H-J, et al. Nitrite regulates hypoxic vasodilation via myoglobin-dependent nitric oxide generation. Circulation [Internet]. 51 2012 Jul 17 [cited 2014 Mar 20];126(3):325–34. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3410747&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 39. Liu J, Yu Z, Guo S, Lee S-R, Xing C, Zhang C, et al. Effects of neuroglobin overexpression on mitochondrial function and oxidative stress following hypoxia/reoxygenation in cultured neurons. J Neurosci Res [Internet]. 2009 Jan [cited 2014 Apr 5];87(1):164–70. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2631383&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 40. Sun Y, Jin K, Peel A, Mao XO, Xie L, Greenberg D a. Neuroglobin protects the brain from experimental stroke in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 2003 Mar 18;100(6):3497–500. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21441145 41. Petersen MG, Dewilde S, Fago A. Reactions of ferrous neuroglobin and cytoglobin with nitrite under anaerobic conditions. J Inorg Biochem [Internet]. 2008 Sep [cited 2014 Apr 2];102(9):1777–82. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18599123 42. Tiso M, Tejero J, Basu S, Azarov I, Wang X, Simplaceanu V, et al. Human neuroglobin functions as a redox-regulated nitrite reductase. J Biol Chem [Internet]. 2011 May 20 [cited 2014 Apr 2];286(20):18277–89. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3093900&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 43. Thompson-Gorman SL, Zweier JL. Evaluation of the role of xanthine oxidase in myocardial reperfusion injury. J Biol Chem [Internet]. 1990 Apr 25 [cited 2014 Apr 7];265(12):6656–63. Available from: http://www.jbc.org/content/265/12/6656.abstract?ijkey=2a6fea9cce020333bce617f4e099c3b5f553fc42& keytype2=tf_ipsecsha 44. Millar TM, Stevens CR, Benjamin N, Eisenthal R, Harrison R, Blake DR. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Lett [Internet]. 1998 May [cited 2014 Apr 7];427(2):225–8. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001457939800430X 45. Webb A, Bond R, McLean P, Uppal R, Benjamin N, Ahluwalia A. Reduction of nitrite to nitric oxide during ischemia protects against myocardial ischemia-reperfusion damage. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 2004 Sep 14 [cited 2014 Mar 21];101(37):13683–8. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=518813&tool=pmcentrez&rendertype=abstra ct 46. Lu P, Liu F, Yao Z, Wang C-Y, Chen D-D, Tian Y, et al. Nitrite-derived nitric oxide by xanthine oxidoreductase protects the liver against ischemia-reperfusion injury. Hepatobiliary Pancreat Dis Int [Internet]. 2005 Aug [cited 2014 Apr 3];4(3):350–5. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16109514 47. Baker JE, Su J, Fu X, Hsu A, Gross GJ, Tweddell JS, et al. Nitrite confers protection against myocardial infarction: role of xanthine oxidoreductase, NADPH oxidase and K(ATP) channels. J Mol Cell Cardiol [Internet]. 2007 Oct [cited 2014 Mar 20];43(4):437–44. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2735077&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 48. Li H, Kundu TK, Zweier JL. Characterization of the magnitude and mechanism of aldehyde oxidasemediated nitric oxide production from nitrite. J Biol Chem [Internet]. 2009 Dec 4 [cited 2014 Apr 7];284(49):33850–8. Available from: http://www.jbc.org/content/284/49/33850.long 49. Nohl H, Staniek K, Sobhian B, Bahrami S, Redl H, Kozlov A V. Mitochondria recycle nitrite back to the bioregulator nitric monoxide. Acta Biochim Pol [Internet]. 2000 Jan [cited 2014 Apr 8];47(4):913–21. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11996114 52 50. Castello PR, David PS, McClure T, Crook Z, Poyton RO. Mitochondrial cytochrome oxidase produces nitric oxide under hypoxic conditions: implications for oxygen sensing and hypoxic signaling in eukaryotes. Cell Metab [Internet]. Elsevier; 2006 Apr 4 [cited 2014 Mar 19];3(4):277–87. Available from: http://www.cell.com/article/S1550413106000714/fulltext 51. Basu S, Azarova NA, Font MD, King SB, Hogg N, Gladwin MT, et al. Nitrite reductase activity of cytochrome c. J Biol Chem [Internet]. 2008 Nov 21 [cited 2014 Apr 2];283(47):32590–7. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2583304&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 52. Aamand R, Dalsgaard T, Jensen FB, Simonsen U, Roepstorff A, Fago A. Generation of nitric oxide from nitrite by carbonic anhydrase: a possible link between metabolic activity and vasodilation. Am J Physiol Heart Circ Physiol [Internet]. 2009 Dec [cited 2014 Apr 14];297(6):H2068–74. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19820197 53. Vanin AF, Bevers LM, Slama-Schwok A, van Faassen EE. Nitric oxide synthase reduces nitrite to NO under anoxia. Cell Mol Life Sci [Internet]. 2007 Jan [cited 2014 Apr 14];64(1):96–103. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17160351 54. Hendgen-Cotta UB, Merx MW, Shiva S, Schmitz J, Becher S, Klare JP, et al. Nitrite reductase activity of myoglobin regulates respiration and cellular viability in myocardial ischemia-reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 2008 Jul 22 [cited 2014 Mar 9];105(29):10256–61. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2481313&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 55. Hearse DJ, Humphrey SM, Chain EB. Abrupt reoxygenation of the anoxic potassium-arrested perfused rat heart: a study of myocardial enzyme release. J Mol Cell Cardiol [Internet]. 1973 Aug [cited 2014 Mar 18];5(4):395–407. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4355339 56. Ambrosio G, Zweier JL, Duilio C, Kuppusamy P, Santoro G, Elia PP, et al. Evidence that mitochondrial respiration is a source of potentially toxic oxygen free radicals in intact rabbit hearts subjected to ischemia and reflow. J Biol Chem [Internet]. 1993 Sep 5 [cited 2014 Mar 18];268(25):18532–41. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8395507 57. E G, A K. Mitochondrial respiration at low levels of oxygen and cytochrome c. Portland Press Ltd.; 2001 Apr 1 [cited 2014 Mar 18]; Available from: http://www.biochemsoctrans.org/bst/030/0252/bst0300252.htm 58. Burwell LS, Nadtochiy SM, Tompkins AJ, Young S, Brookes PS. Direct evidence for S-nitrosation of mitochondrial complex I. Biochem J [Internet]. 2006 Mar 15 [cited 2014 Feb 18];394(Pt 3):627–34. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1383712&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 59. Zweier J, Kuppusamy P, Williams R, Rayburn B, Smith D, Weisfeldt M, et al. Measurement and characterization of postischemic free radical generation in the isolated perfused heart. J Biol Chem [Internet]. 1989 Nov 15 [cited 2014 Mar 18];264(32):18890–5. Available from: http://www.jbc.org/content/264/32/18890.abstract?ijkey=0d1663d41788474cc6c9486284eea96ac45cbbd 0&keytype2=tf_ipsecsha 60. Shiva S, Sack MN, Greer JJ, Duranski M, Ringwood L a, Burwell L, et al. Nitrite augments tolerance to ischemia/reperfusion injury via the modulation of mitochondrial electron transfer. J Exp Med [Internet]. 2007 Sep 3 [cited 2014 Mar 3];204(9):2089–102. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2118713&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 53 61. Ohsawa I, Ishikawa M, Takahashi K, Watanabe M, Nishimaki K, Yamagata K, et al. Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals. Nat Med [Internet]. 2007 Jun [cited 2014 Jan 24];13(6):688–94. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17486089 62. Halestrap AP. A pore way to die: the role of mitochondria in reperfusion injury and cardioprotection. Biochem Soc Trans [Internet]. 2010 Aug [cited 2014 Mar 23];38(4):841–60. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20658967 63. Dezfulian C, Shiva S, Alekseyenko A, Pendyal A, Beiser DG, Munasinghe JP, et al. Nitrite therapy after cardiac arrest reduces reactive oxygen species generation, improves cardiac and neurological function, and enhances survival via reversible inhibition of mitochondrial complex I. Circulation [Internet]. 2009 Sep 8 [cited 2014 Mar 18];120(10):897–905. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2755623&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 64. Raat NJH, Noguchi AC, Liu VB, Raghavachari N, Liu D, Xu X, et al. Dietary nitrate and nitrite modulate blood and organ nitrite and the cellular ischemic stress response. Free Radic Biol Med [Internet]. 2009 Sep 1 [cited 2014 Mar 18];47(5):510–7. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0891584909002950 65. Poderoso J. Nitric Oxide Inhibits Electron Transfer and Increases Superoxide Radical Production in Rat Heart Mitochondria and Submitochondrial Particles. Arch Biochem Biophys [Internet]. 1996 Apr 1 [cited 2014 Mar 18];328(1):85–92. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003986196901460 66. Clerc P, Rigoulet M, Leverve X, Fontaine E. Nitric oxide increases oxidative phosphorylation efficiency. J Bioenerg Biomembr [Internet]. 2007 Apr [cited 2014 Feb 11];39(2):158–66. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17447126 67. Vanden Hoek TL. Reactive Oxygen Species Released from Mitochondria during Brief Hypoxia Induce Preconditioning in Cardiomyocytes. J Biol Chem [Internet]. AMER SOC BIOCHEMISTRY MOLECULAR BIOLOGY INC, 9650 ROCKVILLE PIKE, BETHESDA, MD 20814 USA; 1998 Jul 17 [cited 2014 Mar 2];273(29):18092–8. Available from: http://apps.webofknowledge.com/full_record.do?product=UA&search_mode=GeneralSearch&qid=5&SI D=T1Fok1GCC23dhjWLucW&page=1&doc=2 68. Bolli R, Dawn B, Tang XL, Qiu Y, Ping P, Xuan YT, et al. The nitric oxide hypothesis of late preconditioning. Basic Res Cardiol [Internet]. 1998 Oct [cited 2014 Mar 22];93(5):325–38. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3701309&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 69. Zmijewski JW, Banerjee S, Bae H, Friggeri A, Lazarowski ER, Abraham E. Exposure to hydrogen peroxide induces oxidation and activation of AMP-activated protein kinase. J Biol Chem [Internet]. 2010 Oct 22 [cited 2014 Mar 19];285(43):33154–64. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2963401&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 70. Xu Z, Ji X, Boysen PG. Exogenous nitric oxide generates ROS and induces cardioprotection: involvement of PKG, mitochondrial KATP channels, and ERK. Am J Physiol Heart Circ Physiol [Internet]. 2004 Apr 1 [cited 2014 Mar 22];286(4):H1433–40. Available from: http://ajpheart.physiology.org/content/286/4/H1433 71. Ong S-B, Subrayan S, Lim SY, Yellon DM, Davidson SM, Hausenloy DJ. Inhibiting mitochondrial fission protects the heart against ischemia/reperfusion injury. Circulation [Internet]. 2010 May 11 [cited 2014 Mar 19];121(18):2012–22. Available from: http://circ.ahajournals.org/content/121/18/2012.long 54 72. Kamga Pride C, Mo L, Quesnelle K, Dagda RK, Murillo D, Geary L, et al. Nitrite activates protein kinase A in normoxia to mediate mitochondrial fusion and tolerance to ischaemia/reperfusion. Cardiovasc Res [Internet]. 2014 Jan 1 [cited 2014 Mar 5];101(1):57–68. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24081164 73. Bryan NS, Calvert JW, Elrod JW, Gundewar S, Ji SY, Lefer DJ. Dietary nitrite supplementation protects against myocardial ischemia-reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 2007 Nov 27 [cited 2014 Mar 19];104(48):19144–9. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2141922&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 74. Modin A, Björne H, Herulf M, Alving K, Weitzberg E, Lundberg JO. Nitrite-derived nitric oxide: a possible mediator of “acidic-metabolic” vasodilation. Acta Physiol Scand [Internet]. 2001 Jan [cited 2014 Apr 9];171(1):9–16. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11350258 75. Gonzalez FM, Shiva S, Vincent PS, Ringwood LA, Hsu L-Y, Hon YY, et al. Nitrite anion provides potent cytoprotective and antiapoptotic effects as adjunctive therapy to reperfusion for acute myocardial infarction. Circulation [Internet]. 2008 Jun 10 [cited 2014 Mar 24];117(23):2986–94. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2587279&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 76. Tripatara P, Patel NSA, Webb A, Rathod K, Lecomte FMJ, Mazzon E, et al. Nitrite-derived nitric oxide protects the rat kidney against ischemia/reperfusion injury in vivo: role for xanthine oxidoreductase. J Am Soc Nephrol [Internet]. 2007 Feb 1 [cited 2014 Apr 12];18(2):570–80. Available from: http://jasn.asnjournals.org/content/18/2/570.long 77. Jung K-H, Chu K, Ko S-Y, Lee S-T, Sinn D-I, Park D-K, et al. Early intravenous infusion of sodium nitrite protects brain against in vivo ischemia-reperfusion injury. Stroke [Internet]. 2006 Nov [cited 2014 Apr 14];37(11):2744–50. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17008610 78. Raat NJH, Shiva S, Gladwin MT. Effects of nitrite on modulating ROS generation following ischemia and reperfusion. Adv Drug Deliv Rev [Internet]. Elsevier B.V.; 2009 Apr [cited 2014 Feb 11];61(4):339–50. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0169409X09000283 79. Yasmin W. Generation of peroxynitrite contributes to ischemia-reperfusion injury in isolated rat hearts. Cardiovasc Res [Internet]. 1997 Feb 1 [cited 2014 Apr 13];33(2):422–32. Available from: http://cardiovascres.oxfordjournals.org/content/33/2/422.long 80. Basireddy M, Isbell TS, Teng X, Patel RP, Agarwal A. Effects of sodium nitrite on ischemia-reperfusion injury in the rat kidney. Am J Physiol Renal Physiol [Internet]. 2006 Apr [cited 2014 Apr 12];290(4):F779–86. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16278276 81. Elrod JW, Calvert JW, Gundewar S, Bryan NS, Lefer DJ. Nitric oxide promotes distant organ protection: evidence for an endocrine role of nitric oxide. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 2008 Aug 12 [cited 2014 Apr 13];105(32):11430–5. Available from: http://www.pnas.org/content/105/32/11430.full 82. Roberts BW, Mitchell J, Kilgannon JH, Chansky ME, Trzeciak S. Nitric oxide donor agents for the treatment of ischemia/reperfusion injury in human subjects: a systematic review. Shock [Internet]. 2013 Mar [cited 2014 Feb 5];39(3):229–39. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23358103 83. Pluta RM, Oldfield EH, Bakhtian KD, Fathi AR, Smith RK, Devroom HL, et al. Safety and feasibility of long-term intravenous sodium nitrite infusion in healthy volunteers. PLoS One [Internet]. 2011 Jan [cited 2014 Apr 8];6(1):e14504. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3018414&tool=pmcentrez&rendertype=abstr act 84. Siddiqi N, Neil C, Bruce M, Maclennan G, Cotton S, Papadopoulou S, et al. Intravenous sodium nitrite in acute ST-elevation myocardial infarction: a randomized controlled trial (NIAMI). Eur Heart J 55 [Internet]. 2014 Mar 17 [cited 2014 Mar 23]; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24639423 85. Jung K-H, Chu K, Lee S-T, Park H-K, Kim J-H, Kang K-M, et al. Augmentation of nitrite therapy in cerebral ischemia by NMDA receptor inhibition. Biochem Biophys Res Commun [Internet]. 2009 Jan 16 [cited 2014 Apr 14];378(3):507–12. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08022705 86. Jung K-H, Chu K, Lee S-T, Sunwoo J-S, Park D-K, Kim J-H, et al. Effects of long term nitrite therapy on functional recovery in experimental ischemia model. Biochem Biophys Res Commun [Internet]. Elsevier Inc.; 2010 Dec 3 [cited 2014 Apr 14];403(1):66–72. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21040706 87. Jung K-H, Chu K, Lee S-T, Kim J-M, Park D-K, Kim M, et al. Tolerated nitrite therapy in experimental intracerebral hemorrhage: Rationale of nitrite therapy in a broad range of hyperacute strokes. Neurochem Int [Internet]. Elsevier B.V.; 2011 Aug [cited 2014 Apr 14];59(1):5–9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21672590 88. Fathi AR, Pluta RM, Bakhtian KD, Qi M, Lonser RR. Reversal of cerebral vasospasm via intravenous sodium nitrite after subarachnoid hemorrhage in primates. J Neurosurg [Internet]. American Association of Neurological Surgeons; 2011 Dec 1 [cited 2014 Apr 15];115(6):1213–20. Available from: http://thejns.org/doi/abs/10.3171/2011.7.JNS11390?url_ver=Z39.882003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub=pubmed 89. Oldfield EH, Loomba JJ, Monteith SJ, Crowley RW, Medel R, Gress DR, et al. Safety and pharmacokinetics of sodium nitrite in patients with subarachnoid hemorrhage: a phase IIa study. J Neurosurg [Internet]. American Association of Neurological Surgeons; 2013 Sep 30 [cited 2014 Apr 15];119(3):634–41. Available from: http://thejns.org/doi/abs/10.3171/2013.3.JNS13266?url_ver=Z39.882003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub=pubmed& 90. Hausenloy DJ, Yellon DM. Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target. J Clin Invest [Internet]. American Society for Clinical Investigation; 2013 Jan 2 [cited 2014 Mar 19];123(1):92–100. Available from: http://www.jci.org/articles/view/62874 56
