Ontwikkelingen DNA diagnostiek binnen de Pathologie

Moleculaire Diagnostiek
binnen de Pathologie
in Nederland
Moleculaire Pathologie in Nederland
1)
welke bepalingen komen in aanmerking voor
moleculaire diagnostiek binnen de Pathologie ?
2)
welke technieken zijn daarvoor nodig ?
3)
wat zijn de randvoorwaarden voor een hoog
kwalitatieve moleculaire diagnostiek ?
Ed Schuuring
Moleculair bioloog
Hoofd moleculair diagnostisch lab van Pathologie UMCG
Voorzitter van de landelijke werkgroep Moleculaire Diagnostiek in de Pathologie
Moleculaire diagnostiek:
* Het gebruik van moleculair-biologische technieken om
wat bedoelen we eigenlijk met moleculaire diagnostiek ?
genetische veranderingen (op RNA/DNA niveau) te detecteren
* Deze veranderingen te gebruiken als aanvullende informatie in
de differentiaal diagnostiek
Moleculaire Pathologie in Nederland
1)
welke bepalingen komen in aanmerking voor
moleculaire diagnostiek binnen de Pathologie ?
2)
welke technieken zijn daarvoor nodig ?
3)
wat zijn de randvoorwaarden voor een hoog
kwalitatieve moleculaire diagnostiek ?
Welke genetische veranderingen ?
Chromosomale deleties
DNA amplificaties
Puntmutaties
Chromosomale translocaties
Numerieke chromosoom afwijkingen
Expressie-verschillen
Polymorfismen
Exogene agentia (bv virussen)
1
Moleculaire diagnostiek in Nederland
Waar gebeurt moleculaire diagnostiek ?
pathologie
hematologie
(klinische) genetica
klinische chemie
transplantatie geneeskunde/immunologie
medische microbiologie/virologie
Centraal laboratorium (alleen uitvoering)
Pathologie
HPV, EBV, B/T-cel clonaliteits, p53, t(11;22)
Belangrijkste verschillen zijn:
Hematologie
BCR/ABL, MLL/AF4, inv(16), trisomy(12), B/T-cel clonaliteits, EBV
• Aanbod van materiaal (serum, urine, weefsel, blood)
(Klinische) genetica
BRCA1-mutations, del(22q11), +21, p53, t(11;22)
• Indicatie (klinische vraagstelling)
Klinische chemie
Factor V Leiden, APOE, HFE, TPMT, KIT
Transplantatie geneeskunde/immunologie
HLA-typering, EBV, CMV, chimerisme
Medische microbiologie/virologie
EBV, CMV, HPV, TBC
Aanbevelingen van de taakgroep Moleculair
Diagnostische Pathologie aan de NVvP
(1998/2001)
Taakgroep opgericht (1996)
Moleculaire Diagnostische Pathologie
Aanbevelingen van de NVvP-taakgroep
Moleculair Diagnostische Pathologie (1998)
Indicaties:
1) welke indicaties voor Pathologie ?
2) wat hebben we nodig ?
3) hoe toetsen we onze kwaliteit ?
1)
lijst met indicaties voor Pathologie
2)
voorstel voor de inrichting laboratoria
en handelwijze
3)
kwaliteitsborging en toetsing
maligne lymfomen
soliede tumoren
hereditaire problematiek
micro-organismen
anders
In opdracht van de Ned Ver v Pathologie
www.moleculaire-pathologie.nl
2
Aanbevelingen van de NVvP-taakgroep Moleculair
Diagnostische Pathologie (1998)
Indicaties voor maligne lymfomen
target
Folliculair lymfoom vs folliculaire hyperplasie
B-NHL NOS vs B-cel hyperplasie
T-NHL vs T-cel hyperplasie
Mantelcellymfoom vs B-NHL
Burkitt vs grootcellig B-NHL
ALCL vs HD
Posttransplantatie LPD vs mononucleosis
B-cel clonale verwantschap
T-cel clonale verwantschap
Minimal Residual Disease (MRD)
t(14;18), Ig
Ig
TCR
t(11;14)
t(8;14) en varianten
t(2;5), EBV
EBV, Ig
Ig
TCR
Ig, t(14;18)
Nieuwe indicaties in de Moleculaire Pathologie
API-MALT in t(11;18) in MALT
Translocatie BCL6, BCL2 en MYC voor classificatie DLCBL
Expressie-microarray in borstkanker
FUS/CHOP in t(12:16) in myxoid liposarcoom
HHV8 in Kaposi sarcoom
Del(1p) en del(19q) in dd oligodendroglioom
DNA promoter methylering in prostaat carcinoom
Numerieke chromosomale afwijkingen in urine blaascarcinoom
BRAF-mutatie analyse in melanoom (e.a.)
Hoog-risico HPV-detectie tbv vroeg-detectie cervixcarcinoom
Nieuwe indicaties in de Moleculaire Pathologie
Moleculaire markers mbt gen-specifieke targeted therapie:
HER2 amplificatie in borstkanker (Herceptin)
MGMT-methylering glioblastoom (temozolomide)
KIT-mutatie analyse in GIST (Glivec)
HER2 amplificatie in maagcarcinoom (Herceptin)
BRAF-mutatie analyse in melanoom (PLX4032)
Laag-risico-HPV in larynxpapillomen (Cidofovir)
EGFR/KRAS-mutatie analyse in longkanker (Erlotinib)
KRAS-mutatie analyse in colonkanker (cetuximab)
www.moleculaire-pathologie.nl
EGFR-activatie voor selectie patienten EGFR-targeted therapie
Nieuwe indicaties in de Moleculaire Pathologie
* Vervanging door immunohistochemie (ALK, cycline D1 en HHV8)
EGFR-activatie voor selectie patienten EGFR-targeted therapie
Diagnostiek nu:
Diagnostiek nu:
EGFR-mutaties
EGFR-amplificatie
EGFR-expressie
KRAS-mutatie
EGFR-mutaties
EGFR-amplificatie
EGFR-expressie
KRAS-mutatie
Effect andere componenten:
BRAF-mutatie
PTEN-deletie
PI3K-mutatie
EGFRviii-expressie
ErbB2/3/4 co-expressie
cMET-expressie
pAKT-expressie
* Multifactor analyse:
- Specifieke profielen op basis van expressie array (borstkanker)
- Genomische profielen op basis van array-CGH
- EGFR-activatie pathway analyse (longkanker)
Niet alleen veel EGFR-eiwit maar vele verschillende
componenten kunnen leiden tot de zelfde EGFR-activatie
Niet alleen veel EGFR-eiwit maar vele verschillende
componenten kunnen leiden tot de zelfde EGFR-activatie
En daarmee de respons op therapie kunnen beïnvloeden
3
Samenspel tussen histopathologie en
moleculaire pathologie
Macroscopische afwijking
op de stemband
HER2 expressie en gen amplificatie in borstkanker
?
Maligniteit
Invasie-diepte
Lymfo-infiltratie
Groeipatroon
Differentiatiegraad
Pathologisch T-volume
Angiogenese
Apoptose/necrose
immunofenotypering
Moleculaire veranderingen
?
?
‘0’ (negatief)
‘1+’ (negatief)
Ernstige dysplasie
hrHPV-positief ~10-30%
papilloom
carcinoom
‘2+’ (twijfelachtig)
normaal
(23-43%)
‘3+’ (positief)
Wesseling, Nederlof, Bart
HPV6/11-positief
Amplificatie (clusters/ > 10x)
HER2 expressie en gen amplificatie in borstkanker
FISH
Her2/neu test-algorithme
mammacarcinoom
AMPLIFICATIE: <5%
AMPLIFICATIE: 5-15%
Interfase kernen
IHC
ISH
metafase
‘0’ (negatief)
‘1+’ (negatief)
0
1+
2+
3+
-
Amplificatie her2
= her2/neu gen (1 kopie)
+
Amplificatie her2
AMPLIFICATIE: 15-50%
ISH
AMPLIFICATIE: 80-100%
-
‘2+’ (twijfelachtig)
Wesseling, Nederlof, Bart
(23-43%)
‘3+’ (positief)
Herceptin®
Therapie
Herceptin®
Therapie
1 kopie
+
Herceptin®
Therapie
J Wesseling
ASCO, Arch Pathol Lab Med 2007 (Guideline recommendations)
BRISH
cluster
FISH
SISH Ventana
4
HER2-testing in borstkanker voor
behandeling met Herceptin
Een belangrijke voordeel van helderveld ISH (BRISH):
amplificatie detectie in relatie tot de morfologie
De diagnostiek van een patiënt met een maligne lymfoom
GEEN HER2-amplificatie
in het carcinoom
FISH
FISH
Carcinoom-in-situ
Invasief
carcinoom
BRISH
BRISH
HER2-amplificatie
in niet-maligne CIS
Wesseling
Lymfeklier
zwelling bij
patiënt met
folliculair
lymfoom
Folliculair lymfoom
FISH geeft duidelijk signalen
Maar geen morfologie
Wesseling
FISH
clonaliteitsanalyse
Moleculaire Pathologie in Nederland
Anno 2009 beschikken we over heel veel moleculaire methode
om genetische afwijkingen te detecteren
EBER-ISH
Folliculair lymfoom
1)
welke bepalingen komen in aanmerking voor
moleculaire diagnostiek binnen de Pathologie ?
2)
welke technieken zijn daarvoor nodig ?
3)
wat zijn de randvoorwaarden voor een hoog
kwalitatieve moleculaire diagnostiek ?
Moleculaire diagnostiek
Diagnostische uitslag door de
patholoog is de integratie van
de verschillende applicaties
immunofenotypering
normaal
Folliculair lymfoom
Klinische achtergond
Anamnese
Voorgeschiedenis
histopathologie
normaal
Folliculair lymfoom
5
Het materiaal dat bij de pathologie voorhande is:
Het materiaal dat bij de pathologie voorhande is:
• Formaldehyde-gefixeerd/paraffine-ingebed weefsel
• Vriesmateriaal
• Cytologisch materiaal (urine, beenmerg, ruggemergvocht,
BAL, puncties)
* Bijzondere fixatieven (ontkalkt, plastic coupes)
• Formaldehyde-gefixeerd/paraffine-ingebed weefsel
• Vriesmateriaal
• Cytologisch materiaal (urine, beenmerg, ruggemergvocht,
BAL, puncties)
* Bijzondere fixatieven (ontkalkt, plastic coupes)
60-70% tumorcellen
Voor diagnose van maligniteiten is mbt moleculaire
pathologie van verrijking van tumorweefsel noodzakelijk
Kwaliteit van DNA verschilt enorm geïsoleerd uit
verschillende voorhande zijnde weefsels
Op geleide van de patholoog macro- of microdissectie
< 30% tumorcellen
BioMed
multiplex
DNA
Quality
Control
PCR
M
M
600 bp
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp
600 bp
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp
M
DNA extracted from formaldehyde-fixed/
paraffin-embedded tissue blocks
600 bp
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp
“Ladder” PCR op DNA om kwaliteit te testen
DNA extracted from freshly frozen tissues
vries
***
Kwaliteit van DNA uit paraffine-materiaal is veel slechter
mc
T02-36613
bl
T03-12964
T03-65591
L
T04-31990
L
M
vries
par1
par2
vries
par1
Belangrijkste technieken in de moleculaire
diagnostiek van de Pathologie:
par2
Steeds achtereenvolgend onverdund, 1/10, 1/100 en 1/1000 verdund.
* Standarisatie van de DNA-extractie methode
* Optimale verrijking van tumormateriaal
* Kleine hoeveelheden cellen
* Aangepaste PCR condities
Hybrid Capture
In situ hybridizatie (FISH/BRISH)
PCR-sequencing
PCR/fragment-analyse
RT-PCR
High-melting-resolution
(expression-array-analysis)
Next-generation-global sequencing
6
Moleculaire Pathologie in Nederland
1)
welke bepalingen komen in aanmerking voor
moleculaire diagnostiek binnen de Pathologie ?
2)
welke technieken zijn daarvoor nodig ?
3)
wat zijn de randvoorwaarden voor een hoog
kwalitatieve moleculaire diagnostiek ?
Werkgroep Moleculaire Diagnostiek in
de Pathologie (NVVP)
Doel:
Werkgroep Moleculaire Diagnostiek in
de Pathologie (NVVP)
Activiteiten:
• stimuleren moleculaire diagnostiek binnen pathologie in NL
• borging en verbetering van kwaliteit
• vernieuwing moleculaire diagnostiek
• inventarisatie en afstemming
• advies
• informatie uitwisseling
• opleiding en training
4 pathologen, 4 moleculairmoleculair-biologen en
2 analisten allen werkzaam bij pathologie
Jaarlijkse rondzending moleculaire diagnostiek
Jaarlijkse Moleculaire dag (met accreditatie)
Opstellen van protocollen/richtlijnen voor kankertypes
Organisatie internationale HPVHPV-rondzending
Voorstel opleidingseisen pathologen
Voorstel opleidingsplan voor klinisch moleculair bioloog
Kwaliteitsrichtlijn BVOBVO-HPVHPV-triage
Kwaliteitsrichtlijn moleculaire pathologie (2006)
www.moleculaire-pathologie.nl
Voorwaarden om optimale kwaliteitscontrole
(richtlijnen van NVVP-WMDP 2006)
Voor kwaliteitsborging is nodig:
* Interne experimentele controles
* Interne toetsing van analyses
* Verslaglegging volgens praktijkrichtlijnen
* Voldoende kwantiteit
* Specifieke expertise (moleculair-bioloog, HLO-analisten en pathologen)
* Bijscholing en training
* Fysiek gescheiden ruimtes (voorkomen van contaminaties)
* Specifieke inrichting laboratoria
* Protocolering werkwijze (SOP)
* (verplicht) participeren aan QC-rondzendingen moleculaire pathologie
* Actieve interactie tussen verschillende PA-labs
laatste opmerkingen
Aanbevelingen van de NVvP-taakgroep Moleculair
Diagnostische Pathologie (1998)
Moleculaire diagnostiek:
Het gebruik van moleculair-biologische technieken om
genetische veranderingen (op RNA/DNA niveau) te detecteren
Deze moleculaire veranderingen te gebruiken als aanvullende
informatie in de differentiaal diagnostiek
* Daarin heeft elke discipline zijn eigen specifieke expertise en
inbreng en vereist een optimaal samenspel tussen patholoog en
(klinisch) moleculair bioloog.
[email protected]
www.moleculaire-pathologie.nl
Indicaties bot-/weke delen tumoren
target
Ewing/PNET
Rhambdomyosarcoom (alv)
Rhambdomyosarcoom (emb)
Desmoplastische rondceltumor
MF synoviosarcoom
Zenuwschede tumor
Myxoid liposarcoom
Myxoid chondrosarcoom
Clear cell sarcoom
BF synoviosarcoom
Neuroblastoom
t(11;22), t(21;22), t(7;22)
t(1;13), t(2;13)
+2q, +8, +20, del 11p15
t(11;22)
t(X;18)
NF1-mutatie
t(12;16)
t(9;22)
t(12;22)
t(X;18)
N-MYC amplificatie
www.moleculaire-pathologie.nl
7
Aanbevelingen van de NVvP-taakgroep Moleculair
Diagnostische Pathologie (1998)
Aanbevelingen van de VNV-taakgroep Moleculair
Diagnostische Pathologie (1998)
Indicaties voor epitheliale tumoren
target
Indicaties hereditaire problematiek
target
MRD bij prostaatcarcinoom
MRD bij colon-/maagcarcinoom
MRD mammacarcinoom
Maligne mesothelioom vs reactief
DD Bowen/ bowenoide papulose
DD endometrium/cervix adenocarc
Nasopharynx carcinoom
PSA-expressie
CK20; CEA epxressie
CEA expressie
del 1p, 3p, 6q, 22q
HPV
HPV
EBV
HNPCC/AFAP
MSI, LOH
www.moleculaire-pathologie.nl
Indicaties divers
Multiple tumoren (primair vs metastase)
Verwisseling materiaal
Floaters
Tweelingidentificatie
Partieel Mola onderzoek
p53, LOH, X-inactivatie
allelotypering, XY-ISH
allelotypering
allelotypering
tri/tetrasomie
www.moleculaire-pathologie.nl
Aanbevelingen van de NVvP-taakgroep Moleculair
Diagnostische Pathologie (1998)
Indicaties voor cytologie/biopt
target
PapII/IIIa (cervix)
Cervix CINI/II vs CINIII
Reactief vs maligniteit (pancreas)
primair/follow-up (blaas/urine)
primaire longcarcinoom
HPV
HPV
RAS-mutatie
LOH, p53
KRAS-mutatie
Indicaties melanoom
MRD en micrometastase
Spitz naevus vs nodulair melanoom
numeriek, LOH
TCR
www.moleculaire-pathologie.nl
Aanbevelingen van de NVvP-taakgroep Moleculair
Diagnostische Pathologie (1998)
Indicaties voor niet kweekbare microorganismen
Pseudolymfoom vs huis BNHL
Lymfoepithelioma vs maagcarcinoom
Oesofagitis
Granulomateuze ontsteking
Kattekrab ziekte
Virale myo/endocarditis
Chlamydia urogenitale infectie
Onbegrepen intra-uteriene vruchtdood
Onbegrepen luchtweginfecties
target
Borrelia burgdorferi
EBV
CMV
TBC
Bartonella henselae
enterovirus
Chlamydia trachomatis
PARVO, CMV, HSV
Ch. Pneumoniae, M.
Pneum, TBC, HSV
www.moleculaire-pathologie.nl
8